CN113717934A

CN113717934A - 脐带间充质干细胞外泌体提取方法

Info

Publication number: CN113717934A
Application number: CN202110950701.1A
Authority: CN
Inventors: 伯古; 刘招
Original assignee: Wuhan Wanhai Cell Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Wanhai Cell Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明涉及干细胞外泌体提取方法，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，该方法包括以下步骤：S1，得到脐带间充质干细胞单细胞悬液，待细胞的融合度达到70～80％时，离心去除死细胞和沉淀，过滤得到上清液；S2，在上清液中加入聚乙二醇6000提取液，颠倒混匀后静置≥10h，离心去除上清，得到沉淀；S3，向沉淀中加入蔗糖溶液，离心，即得外泌体沉淀。该方法采用简单常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单、提取效率高、纯度高的特点，可以节省更多的实验时间和样本；提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白质分析等下游应用实验。

Description

脐带间充质干细胞外泌体提取方法

技术领域

本发明涉及干细胞外泌体提取方法，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多功能的自我更新细胞，在再生医学中具有巨大的应用潜力，这些间充质干细胞可以用于再生研究的临床试验，其可以来源于骨髓、牙髓、脂肪组织和沃顿果冻。最初，有关其生物学功能的机制，如归巢、转分化和免疫调节等已有报道，然而，最近的研究表明，间充质干细胞的旁分泌作用通过分泌胞外小泡(外泌体)在修复和再生中起着重要作用。

外泌体是一种微小囊泡，直径在40～100nm，含有蛋白质、mRNAs、miRNAs和DNA，与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定、安全，保存更方便，外泌体已被证明与干细胞本身具有相似的生物活性，这些来源于MSC的外泌体已成为无细胞治疗的新灯塔，对同种异体给药具有较低的免疫排斥风险。

目前，外泌体的分离最常用的有离心法、色谱法和密度梯度离心法，色谱法存在难易大规模生产、效率低的问题；密度梯度离心法由于操作比较复杂、耗时，同样不适合进行大规模生产；而基于超速离心的外泌体分离方法存在产量和纯度低、膜完整性损失等，且每次最多只能处理6个样品，且往往需要30～70min，同样存在耗时的问题。

因此，如何开发一种操作简单、省时、提取纯度高的外泌体制备方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，该方法操作简单、提取得到的外泌体纯度高。

本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：

本发明提供一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其不同之处在于，包括以下步骤：

S1，得到脐带间充质干细胞单细胞悬液，待细胞的融合度达到70～80％时，离心去除死细胞和沉淀，过滤得到上清液；

S2，在上清液中加入20～40％聚乙二醇6000提取液，颠倒混匀后静置≥10h，离心去除上清，得到沉淀；

S3，向沉淀中加入蔗糖溶液，离心，即得外泌体沉淀。

本发明仅仅通过添加提取液、离心和添加蔗糖溶液、离心几个步骤即可完成脐带间充质干细胞外泌体的提取，操作简单，提取效率高。

作为一种优选的实施方式，所述S3中蔗糖溶液的浓度为0.3～0.6g/mL。

发明人经过大量的研究实验发现，当控制蔗糖的浓度为0.3～0.6g/mL之间时，提取得到的外泌体浓度含量较高，尤其当蔗糖浓度为0.57g/mL时，提取效果最佳，当蔗糖的浓度大于0.6g/mL或者小于0.3g/mL时，提取得到的外泌体浓度均显著降低。

作为一种优选的实施方式，步骤S1中步骤S1中脐带间充质干细胞单细胞悬液的制备方法如下：将新生儿脐带先用生理盐水清洗后，剥出华通胶，将得到的胶体在完全培养基中培养，原代培养至细胞融合度达到85～90％进行传代P1，继续传代培养，获得二次贴壁细胞的P2代到P5代；取第5代干细胞，离心，弃上清，加入PBS重悬细胞，并加入抗体，室温避光孵育离心，PBS洗涤并重悬，即得。

作为一种优选地实施方式，脐带间充质干细胞单细胞悬液制备过程中加入的抗体包括CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、CD34、CD45和HLADR抗体。

作为一种优选地实施方式，步骤S1中离心去除死细胞和沉淀的步骤为：先300g，4℃离心10min去除死细胞，再2000g，4℃离心10min去除沉淀，最后再10000g，4℃离心30min。

经过三步离心，先在300g的离心条件下离心去除细胞碎片，然后再在2000g的离心条件下去除沉淀，最后再进一步10000g的离心条件下去除沉淀获得上清，经过三步离心，杂质能最大限度的被去除，最后得到的外泌体纯度更高。

作为一种优选地实施方式，步骤S1中去除死细胞和沉淀后采用0.22μm滤器过滤。

作为一种优选地实施方式，步骤S2中离心条件为：10000g，4℃，离心60min。

作为一种优选地实施方式，步骤S3中离心条件为：10000g，4℃，离心60min。

本发明采用聚乙二醇6000和蔗糖缓冲液，简单常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单、提取效率高、纯度高的特点，可以节省更多的实验时间和样本；提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白质分析等下游应用实验。

附图说明

图1为原代P0培养的脐带间充质干细胞的细胞形态图，其中A为干细胞P0代复种后培养第6天时的细胞状态图，B为干细胞P0代复种后第10天时的细胞状态图，C为干细胞P0代复种后培养第15天时的细胞状态图，D为干细胞P0代复种后培养第21天时的细胞状态图；

图2为P2代脐带间充质干细胞的细胞形态，其中A为P2代脐带间充质干细胞肪干细胞P2代培养第2天时的细胞状态图，B为P2代脐带间充质干细胞肪干细胞培养第4天时的细胞状态图，C为P2代脐带间充质干细胞肪干细胞P2代培养第7天时的细胞状态图；

图3为P2代脐带间充质干细胞表面标志物CD90的流式细胞；

图4为P2代脐带间充质干细胞表面标志物CD73的流式细胞；

图5为P2代脐带间充质干细胞表面标志物CD34的流式细胞；

图6为电镜下观察到的脐带间充质干细胞外泌体，其中A为分辨率为200nm的电镜下观察结果，B为分辨率为1.0μm的电镜下观察结果；

图7为WB鉴定实施例1和对比例1中脐带间充质干细胞外泌体蛋白表达水平，泳道1为对比例1中P2代脐带间充质干细胞培养第7天的外泌体蛋白表达水平，泳道2为对比例1中P3代脐带间充质干细胞培养第7天的外泌体蛋白表达水平，泳道3为实施例1中P2代脐带间充质干细胞培养第7天的外泌体蛋白表达水平，泳道4为实施例1中P3代脐带间充质干细胞培养第7天的外泌体蛋白表达水平；

图8为实施例1和对比例3中脐带间充质干细胞外泌体总RNA表达水平；

图9为实施例2和对比例1中脐带间充质干细胞外泌体总RNA表达水平；图10为实施例3和对比例2中脐带间充质干细胞外泌体总RNA表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

试验材料：

人脐带组织取自健康足月顺产胎儿，置于含有1％双抗的无菌PBS溶液中，8h内使用；

FITC或PE标记的小鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR抗体及各相关同型对照购自美国eBioscience公司；

LONZA进口培养基、胎牛血清FBS和0.25％胰蛋白酶购自美国Gibco公司。

30％聚乙二醇6000的配制：称取300gPEG，溶于一定量0.1M磷酸钠缓冲溶液中(pH7.4)，并用该缓冲液定容至1000mL。

实施例1

脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

脐带间充质干细胞的分离和培养：将10～15cm新生儿脐带，首先核对采集信息表与采集瓶信息一致无误，相对应的母血标本送检：HIV、HBV、HCV、TP、CMV、HTLV、EBV等。将脐带加生理盐水清洗其外表面，清洗两遍，清洗时先用止血钳夹紧固定脐带扎线位置，另一止血钳从固定位置外开始顺着脐带清洗到另一端，测量脐带长度并记录，采集并取2mL脐带保存液送支原体检测，洗涤脐带后，移入新培养基中，移入加油过滤的75％医用酒精中，浸泡2min，消毒处理后，移入加有生理盐水的培养皿中，再重复清洗2～3次，去除血清，移入新培养皿中用手术剪剪去脐带结扎处的两端，用止血钳将两端放入2mL冻存管中，标记避光放置-80℃冰箱中保存，剩下中间段的脐带剪成约2～3cm/节，加入适量生理盐水洗涤血凝块，重复洗涤直至基本去除血清，洗涤液较清澈，移入加有生理盐水的培养基中剥离胶体。首先，用两把组织聂将脐带展开，去除两条脐静脉和一条脐动脉，用组织聂将华通胶放入加有5～10mL生理盐水的培养皿中，将得到的胶体转移至50mL离心管，并加生理盐水定容至45mL，离心，将1～2mm³组织匀到T75培养瓶中，每瓶中加入4mL完全培养基(包括LONZA进口培养基和胎牛血清FBS)，平置培养瓶使组织尽量均匀分布于整个底面并放入饱和水份、37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

原代制备后的第5天，每3d进行全量换液操作，细胞融合度达到85～90％时，进行传代P0代传代P1代，去除组织块，补加培养基到15mL，1～2天后观察新的细胞从组织块周围爬出，融合度达到70～80％左右时进行传代，记为P1，持续传代操作，取第5代细胞在倒置显微镜下观察，用于后续实验。

脐带间充质干细胞的鉴定：取第5代干细胞，0.25％胰酶消化并调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，每离心管中加入1mL细胞悬液，用生理盐水洗涤2次，1000g离心5min，弃上清，100μL生理盐水重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入100μLCD90、CD105、CD73、CD14、CD19、CD34、CD45和HLADR抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000g离心5min，PBS洗涤2次，加入500μL PBS重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。

脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备：

S1，当细胞的融合度达到70～80％时，将上述上清液放入离心机300g，4℃离心10min，去除细胞碎片；将提取的上清液继续在2000g，4℃离心10min去除沉淀获得上清液，获得上清继续放入离心机10000g，4℃离心30min去除沉淀，再用0.22μm滤器过滤提取的上清液；

S2，收集提取的培养基样品，在4mL上清中加入1mL30％聚乙二醇6000提取液，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，充分混匀静置保存时间不小于10h；在4℃条件下，10000g离心60min，小心移除上清，收集沉淀，尽可能吸干上清，吸取时小心，防止吸掉沉淀；

S3，弃上清，将沉淀用PBS 4℃，10000g，离心60min洗涤外泌体；

S4，向沉淀中加入0.57g/mL蔗糖缓冲液，在4℃离心60分钟，即得外泌体沉淀；

S5，取外泌体保存液或预冷PBS将沉淀重悬，即得到外泌体样品。

留取30μL重悬液用于透射电镜观察和10μL用于BCA浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存。

实施例2

该实施例与实施例1的区别在于，脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备步骤与实施例1存在区别，具体为步骤S4中所用的蔗糖浓度为0.43g/mL。

实施例3

该对比例与实施例1的区别在于，脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备步骤与实施例1存在区别，具体为：步骤S1中，当细胞的融合度达到70～80％时，将上述上清液放入离心机300g，4℃离心10min，去除细胞碎片；将提取的上清液放入离心机10000g，4℃离心30min去除沉淀，再用0.22μm滤器过滤提取的上清液。

对比例1

该对比例与实施例1的区别在于，脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备步骤如下：

S2，收集4mL待提取的样品，置2～8℃保存，将样品在4℃条件下，3000g离心15min，弃沉淀，收集上清，小心将上清移入另一干净离心管中；将样品在4℃条件下，10000g离心20min，弃沉淀，收集上清，小心将上清移入另一干净离心管中，在4mL上清中加入1mL30％聚乙二醇6000提取液，盖紧离心管，上下颠倒混匀1min左右，使液体充分混匀，置于2～8℃冰箱静置过夜，在4℃条件下，10000g离心60min，小心移除上清，收集沉淀，取50～100μL外泌体保存液将沉淀重悬浮，即得到外泌体样品。

对比例2

该对比例与实施1的区别在于，脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备步骤与实施例1存在区别，具体为：步骤S4中所用的蔗糖浓度为0.13g/mL。

对比例3

该对比例与实施例1的区别在于，脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备时采用超速离心法进行提取，具体步骤如下：

S2，将上清液放入超速离心机离心弃上清，将沉淀用PBS离心60min清洗外泌体，沉淀再用预冷的PBS重悬，即获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液，标记后储存。

对实施例1～3和对比例1～3得到的外泌体重悬液进行分析和检测，其中实施例1和对比例3的WB鉴定结果如图7所示，实施例1得到的脐带间充质干细胞外泌体蛋白总RNA表达水平的浓度为176.12ng/ml，实施例2得到的脐带间充质干细胞外泌体蛋白总RNA表达水平的浓度为127.63ng/ml，实施例3得到的脐带间充质干细胞外泌体蛋白总RNA表达水平的浓度为152.56ng/ml，对比例1得到的脐带间充质干细胞外泌体蛋白总RNA表达水平为118.26ng/ml，对比例2得到的脐带间充质干细胞外泌体蛋白总RNA表达水平为99.52ng/ml，对比例3得到的脐带间充质干细胞外泌体蛋白总RNA表达水平为129.23ng/ml。

检测分析方法

Western Blot法测外泌体蛋白CD63的表达水平

利用RIPA裂解提取外泌体总蛋白，将提取的蛋白质放冰上裂解30min，用BCA法测定蛋白浓度，再加入5×上样缓冲液，100℃煮沸10min，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入Albumin、AFP及GAPDH一抗，4℃孵育过夜。TBST反复洗膜后，HRP标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，用凝胶成像系统拍照，Image J软件分析灰度值。

外泌体RNA的分离及分析

1、外泌体加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。此时可放入-70℃长期保持；

2、12000g离心5min，弃沉淀；

3、按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。(氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相)；

4、在4℃12,000g离心15min；

5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相；

6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇(沉淀RNA)混匀，室温放置5-10min；

7、4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

8、按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇(沉淀RNA)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

9、4℃8000g离心5min，尽量弃上清；

10、室温晾干或真空干燥5-10min；

11、用50μl TE buffer溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA，用于酶切反应不能使用SDS；

12、测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备脐带间充质干细胞单细胞悬液，待细胞的融合度达到70～80％时，离心去除死细胞和沉淀，过滤得到上清液；

S3，向沉淀中加入蔗糖溶液，离心，即得外泌体沉淀。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述S3中蔗糖溶液的浓度为0.3～0.6g/mL。

3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述S3中蔗糖溶液的浓度为0.57g/mL。

4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤S1中脐带间充质干细胞单细胞悬液的制备方法如下：将新生儿脐带先用生理盐水清洗后，剥出华通胶，将得到的胶体在完全培养基中培养，原代培养至细胞融合度达到85～90％进行传代P1，继续传代培养，获得二次贴壁细胞的P2代到P5代；取第5代干细胞，离心，弃上清，加入PBS重悬细胞，并加入抗体，室温避光孵育离心，PBS洗涤并重悬，即得。

5.根据权利要求4所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，脐带间充质干细胞单细胞悬液制备过程中加入的抗体包括CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、CD34、CD45和HLADR抗体。

6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤S1中离心去除死细胞和沉淀的步骤为：先300g，4℃离心10min去除死细胞，再2000g，4℃离心10min去除沉淀，最后再10000g，4℃离心30min。

7.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤S1中去除死细胞和沉淀后采用0.22μm滤器过滤。

8.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤S2中离心条件为：10000g，4℃，离心60min。

9.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，步骤S3中离心条件为：10000g，4℃，离心60min。