CN109355259A - 一种脐带间充质干细胞外泌体培养以及分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及外泌体富集和分离领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞外泌体培养以及分离方法。本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体培养方法，包括以下步骤：脐带间充质干细胞传代培养8‑14h，吸走培养液和未贴壁的细胞，并进行清洗，然后加入外泌体专用完全培养液进行培养；72‑96h后收集培养液到离心管中，得到富含间充质干细胞外泌体的培养液。本发明采用外泌体专用完全培养液对传代后培养一段时间的脐带间充质干细胞进行培养，有效提升外泌体的含量，得到较多的间充质干细胞外泌体。然后对富含间充质干细胞外泌体的培养液进行分离，得到间充质干细胞外泌体，方法简便易行，为间充质干细胞外泌体的应用提供良好的基础。

Description

一种脐带间充质干细胞外泌体培养以及分离方法
技术领域
本发明涉及外泌体富集和分离领域，具体而言，涉及一种脐带间充质干细胞外泌体培养以及分离方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是中胚层来源的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。事实上，MSC广泛存在于全身多种组织中，几乎来源于机体所有的组织器官，如骨髓、骨膜、脂肪组织、牙髓、滑膜、脐带、胎盘、羊水及胎儿组织等。不同来源的间充质干细胞具有相似的形态，表达相同的表面标记，具有相似的生物学特性方面，如可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多组织系统的细胞。MSC除了具有多向组织细胞分化能力之外，还在造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能中起重要调节作用。
脐带间充质干细胞(UC-MSC)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。脐带间充质是一类低免疫原性细胞，且具有很强的免疫调节功能。脐带间充质干细胞拥有MSC的全部特性，并且含量丰富，易于分离培养。
与其他来源的MSC相比，UC-MSC更原始，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，其增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成体干细胞。
脐带间充质干细胞具有多分化潜能，在特定的诱导条件下，UC-MSC不仅能分化为骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层细胞，而且能够向内胚层组织细胞(如心肌细胞、肝细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化。UC-MSC不具致瘤性，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，具有修复各种组织和器官的能力。
外泌体(exosomes)是一种脂质分子膜包裹的小囊泡。电镜下观察呈杯状，直径约为40-100nm，密度约为1.13-1.19g/mL。外泌体含有来源细胞的胞质和脂质包膜成分，外泌体内部包含有丰富的mRNA，microRNA和蛋白质成分。
外泌体形成是通过多囊泡胞内体(MVE)的细胞区室向内出芽的形式形成，内囊泡内含有蛋白质、microRNA及mRNA。当MVE与细胞膜融合时，内囊泡就被释放到细胞外成为外泌体，释放出来的外泌体能够运行到距离较远的组织而影响细胞的行为和生理上的改变。
因外泌体携带来源细胞的RNA，microRNA及蛋白成分，参与细胞与细胞间的信息传递，因此在干细胞治疗过程中，干细胞来源的外泌体在组织重建上起到了很重要的作用，尤其是外泌体内所包含的蛋白或RNA成分与受损细胞进行信息交流的功能，可以对靶细胞进行生物学功能的调控，达到修复的目的，也因此外泌体在再生医学方面得到了广泛的实验研究。
由于外泌体及其微小，且与细胞培养组分类似，因此，非常难于分离。现有的分离方法分别是超速离心法、过滤离心法、免疫亲和或分子排阻色谱法、多聚沉淀法和微流控技术。超速离心法是外泌体分离的金标准，能够在实验室通过超速离心机方便快捷分离出外泌体。其他方法均需要购买特定的仪器和分离柱等耗材，成本高，操作复杂，且分离的外泌体纯度没有超速离心法高。
另外，分泌体的获得来源有限，限制了其应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供无外泌体FBS的制备方法，通过离心和过滤的方式得到，方法简便。
本发明的第二目的在于提供外泌体专用完全培养基，有效提高脐带间充质干细胞外泌体的量。
本发明的第三目的在于提供脐带间充质干细胞外泌体培养方法，能得到更多量的脐带间充质干细胞外泌体。
本发明的第四目的在于提供脐带间充质干细胞外泌体分离方法，高效，成本低，纯度高。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种无外泌体FBS的制备方法，FBS于100000g-120000g的转速离心8-14h；
吸取上层澄清血清，并用0.22μm滤膜过滤，滤液即为无外泌体FBS。
本发明提供的无外泌体FBS的制备方法，采用一定的转速和时间进行离心，然后再进行过滤，滤液即为无外泌体FBS。该方法简便，易于操作得到的无外泌体FBS中，未检出外泌体。
进一步地，得到的滤液确保无菌状态，封口，备用。
本发明还提供了一种外泌体专用完全培养基，以无酚红的α-MEM为基准，添加以下组分：无外泌体FBS体积百分数为10％±2％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％±0.05％，bFGF浓度为20±2ng/mL，EGF浓度为20±2ng/mL。
本发明提供的外泌体专用完全培养基，有效提高脐带间充质干细胞外泌体的量。
本发明还提供了脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，包括以下步骤：
脐带间充质干细胞传代培养8-14h，吸走培养液和未贴壁的细胞，并进行清洗，然后加入上述的外泌体专用完全培养液进行培养；
72-96h后收集培养液到离心管中，得到富含间充质干细胞外泌体的培养液。
本发明采用外泌体专用完全培养液对传代后培养一段时间的脐带间充质干细胞进行培养，有效提升外泌体的含量，提升25％以上。
进一步地，培养P3代脐带间充质干细胞，待细胞长至85％±10％融合时进行传代。
该步骤中，P3代脐带间充质干细胞培养以及传代所用的培养基的组分如下：以α-MEM为基准，添加以下组分：FBS体积百分数为10％±2％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％±0.05％，bFGF浓度为20±2ng/mL，EGF浓度为20±2ng/mL。
进一步地，所述传代按照扩培3-5倍的比例进行。也就是说，一瓶细胞传代得到3-5瓶细胞。
进一步地，用PBS小心清洗2-3次。清洗是为了进一步去除未去除的残液以及其他碎片。
进一步地，每个培养瓶中添加4％-6％体积的外泌体专用完全培养液。
如T75细胞培养瓶(250mL)中，加入10-15mL的外泌体专用完全培养液，如T75细胞培养瓶(250mL)中可以为10mL、12mL、15mL等等。
本发明还提供了脐带间充质干细胞外泌体分离方法，包括以下步骤：
上述富含间充质干细胞外泌体的培养液低温离心，去除死细胞和碎片，然后过滤去除囊泡；
得到的液体进行超速离心，弃上清，得到间充质干细胞外泌体。
本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体分离方法，通过特定的方法处理脐带间充质干细胞，得到富含间充质干细胞外泌体的培养液，然后对其进行分离，得到浓度较高、纯度较高的间充质干细胞外泌体。
进一步地，所述低温离心为4±2℃下以2000-2200g离心。通过该速率进行离心，去除死细胞和碎片。
进一步地，所述离心的时间为5-10min。
进一步地，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.22μm。通过过滤，去除较大囊泡。
进一步地，得到的液体进行超速离心步骤中，离心的转速为100000-120000g，离心时间为4-8h。
通过超速离心，外泌体沉淀下来。
进一步地，所述弃上清后还包括将离心容器管壁上的液体去除，离心容器底部的物质即为间充质干细胞外泌体。
通过去除液体，得到更纯净的间充质干细胞外泌体。
离心容器一般为离心管。
进一步地，还包括以下步骤：得到的间充质干细胞外泌体用PBS重悬，保存。如可在-80℃进行保存。
即得到的容器底部的间充质干细胞外泌体加入PBS重悬，保存。
对本发明分离得到的间充质干细胞外泌体进行检测，如电镜下以及表面标记蛋白的检测，均符合间充质干细胞外泌体的特性，说明本发明分离得到的间充质干细胞外泌体是稳定可靠的。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的无外泌体FBS的制备方法，方法简便易行，易于产业化生产。
(2)本发明提供的外泌体专用完全培养基，有效提高脐带间充质干细胞培养过程中外泌体的含量25％以上。
(3)本发明提供的间充质干细胞外泌体的培养方法，有效提高外泌体的含量，为外泌体的分离提供良好的基础。
(4)本发明提供的间充质干细胞外泌体的分离方法，方法简便易行，分离得到的间充质干细胞外泌体稳定可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实验例1中对间充质干细胞外泌体的电镜观察图；
图2为本发明实验例1中对间充质干细胞外泌体的表面标记蛋白CD9的检测图；
图3为本发明实验例1中对间充质干细胞外泌体的表面标记蛋白CD63的检测图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1.1脐带间充质干细胞外泌体分离方法
1)无外泌体FBS制备：无菌条件下将FBS倒入专用超离离心管中，每管38.6mL，4管，确认配平后，放入超速离心机中，120000g，离心12h。
2)第二天，小心吸取上层澄清血清到新的无菌离心管中，0.22μm滤膜过滤至另一离心管中，确保血清的无菌状态，封口，备用。
1.2脐带间充质干细胞培养基
1)普通完全培养基
以α-MEM为基准，添加以下组分：FBS体积百分数为10％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％，bFGF浓度为20ng/mL，EGF浓度为20ng/mL。
2)外泌体专用完全培养基
以无酚红的α-MEM为基准，添加以下组分：无外泌体FBS体积百分数为10％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％，bFGF浓度为20ng/mL，EGF20浓度为20ng/mL。
1.3脐带间充质干细胞外泌体分离方法，步骤如下：
T75细胞培养瓶，普通完全培养基培养P3代脐带间充质干细胞，待细胞长至95％融合时，按照1:5进行传代。
第二天，用无外泌体FBS配制外泌体专用完全培养基。小心吸走普通完全培养基和未贴壁的细胞，用PBS小心清洗3次，每瓶加入10mL外泌体专用完全培养基。
72h后收集培养基到离心管中，即得到富含间充质干细胞外泌体的培养基。
提前打开普通低温离心机和超速离心机，预冷至4℃左右。
2000g，离心7min，去除死细胞和碎片。
0.22μm滤膜过滤去除较大囊泡。
上清转至超速离心管中，用PBS配平，100000g，离心4h。
弃去上清，用无菌滤纸小心吸走管壁残留液体，管底即为间充质干细胞外泌体。
用1mLPBS将各管外泌体重悬，混合，-80℃保存。
实施例2
1.1脐带间充质干细胞外泌体分离方法
1)无外泌体FBS制备：无菌条件下将FBS倒入专用超离离心管中，每管38.6mL，4管，确认配平后，放入超速离心机中，100000g，离心14h。
2)第二天，小心吸取上层澄清血清到新的无菌离心管中，0.22μm滤膜过滤至另一离心管中，确保血清的无菌状态，封口，备用。
1.2脐带间充质干细胞培养基
1)普通完全培养基
以α-MEM为基准，添加以下组分：FBS体积百分数为10％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％，bFGF浓度为20ng/mL，EGF浓度为20ng/mL。
2)外泌体专用完全培养基
以无酚红的α-MEM为基准，添加以下组分：无外泌体FBS体积百分数为10％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％，bFGF浓度为20ng/mL，EGF浓度为20ng/mL。
1.3脐带间充质干细胞外泌体分离方法，步骤如下：
T75细胞培养瓶，普通完全培养基培养P3代脐带间充质干细胞，待细胞长至90％融合时，按照1:4进行传代。
第二天，用无外泌体FBS配制外泌体专用完全培养基。小心吸走普通完全培养基和未贴壁的细胞，用PBS小心清洗3次，每瓶加入10mL外泌体专用完全培养基。
80h后收集培养基到离心管中，即得到富含间充质干细胞外泌体的培养基。
提前打开普通低温离心机和超速离心机，预冷至4℃。
2000g，离心10min，去除死细胞和碎片。
0.22μm滤膜过滤去除较大囊泡。
上清转至超速离心管中，用PBS配平，120000g，离心5h。
弃去上清，用无菌滤纸小心吸走管壁残留液体，管底即为间充质干细胞外泌体。
用1mLPBS将各管外泌体重悬，混合，保存。
实施例3
1.1脐带间充质干细胞外泌体分离方法
1)无外泌体FBS制备：无菌条件下将FBS倒入专用超离离心管中，每管38.6mL，4管，确认配平后，放入超速离心机中，120000g，离心8h。
2)第二天，小心吸取上层澄清血清到新的无菌离心管中，0.22μm滤膜过滤至另一离心管中，确保血清的无菌状态，封口，备用。
1.2脐带间充质干细胞培养基
1)普通完全培养基
以α-MEM为基准，添加以下组分：FBS体积百分数为10％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％，bFGF浓度为20ng/mL，EGF浓度为20ng/mL。
2)外泌体专用完全培养基
以无酚红的α-MEM为基准，添加以下组分：无外泌体FBS体积百分数为10％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％，bFGF浓度为20ng/mL，EGF20浓度为20ng/mL。
1.3脐带间充质干细胞外泌体分离方法，步骤如下：
T75细胞培养瓶，普通完全培养基培养P3代脐带间充质干细胞，待细胞长至85％融合时，按照1:3进行传代。
第二天，用无外泌体FBS配制外泌体专用完全培养基。小心吸走普通完全培养基和未贴壁的细胞，用PBS小心清洗2次，每瓶加入15mL外泌体专用完全培养基。
96h后收集培养基到离心管中，即得到富含间充质干细胞外泌体的培养基。
提前打开普通低温离心机和超速离心机，预冷至4℃左右。
2200g，离心5min，去除死细胞和碎片。
0.22μm滤膜过滤去除较大囊泡。
上清转至超速离心管中，用PBS配平，120000g，离心8h。
弃去上清，用无菌滤纸小心吸走管壁残留液体，管底即为间充质干细胞外泌体。
用1mLPBS将各管外泌体重悬，混合，保存。
对比例1
与实施例2不同的是，普通完全培养基中的α-MEM替换为DMEM，外泌体专用完全培养基中的无酚红的α-MEM替换为无酚红的DMEM，其他均相同。
对比例2
与实施例2不同的是，普通完全培养基中的α-MEM替换为RPMI 1640，外泌体专用完全培养基中的无酚红的α-MEM替换为无酚红的RPMI 1640，其他均相同。
对比例3
与实施例2不同的是，普通完全培养基中的α-MEM替换为DMEM/F12，外泌体专用完全培养基中的无酚红的α-MEM替换为无酚红的DMEM/F12，其他均相同。
对比例4
与实施例2不同的是，外泌体专用完全培养基替换为以下组分的培养基：以无酚红的α-MEM为基准，添加以下组分：PDGF-BB的浓度为30ng/mL，EPO的浓度为2U/mL。
需要说明的是，本发明中未提及的培养条件，均视为在37℃，5％的CO2饱和湿度条件下培养。
实验例1
使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定：
1)配制蛋白标准溶液：将0.8mL蛋白标准配制液加入到20mg BSA中，使其充分溶解后进一步稀释至终浓度为0.5mg/mL。
2)BCA工作液的配置：BCA试剂A：试剂B＝50:1，根据样品数加标准品数配制适量体积BCA工作液。
3)取96孔板，分别将0，1，2，4，8，12，16，20μL蛋白标准品(0.5mg/mL)及待测样品适量，用标准品稀释液PBS将各孔体积补足至20μL。
4)以上每孔各加入200μL BCA工作液，37℃放置20-30min。
5)酶标仪上选择波长562nm，测定标准曲线并根据标准曲线计算各组别制得的外泌体浓度。并推算为按细胞数量计算外泌体浓度，结果如表1所示。
表1不同组别中制得的外泌体浓度
从上述内容可知，相对于对比例，本发明提供的方法，得到的间充质干细胞外泌体含量至少提升25％以上。
本发明提供的方法所提取的外泌体浓度很高，具有明显提升的得率。
另外，检测外泌体纯度，不同组别均在80％-90％之间，实施例与对比例没有明显差别。
此外，对本发明分离得到的间充质干细胞外泌体进行检测，如电镜下以及表面标记蛋白的检测，均符合间充质干细胞外泌体的特性，其中，电镜图如图1所示，表面标记蛋白检测图如图2和图3所示。说明本发明分离得到的间充质干细胞外泌体是稳定可靠的。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种无外泌体FBS的制备方法，其特征在于，FBS于100000g-120000g的转速离心8-14h；
吸取上层澄清血清，并用0.22μm滤膜过滤，滤液即为无外泌体FBS。
2.外泌体专用完全培养基，其特征在于，以无酚红的α-MEM为基准，添加以下组分：无外泌体FBS体积百分数为10％±2％，200mM谷氨酰胺体积百分数为1％±0.05％，bFGF浓度为20±2ng/mL，EGF浓度为20±2ng/mL。
3.脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
脐带间充质干细胞传代培养8-14h，吸走培养液和未贴壁的细胞，并进行清洗，然后加入权利要求2所述的外泌体专用完全培养液进行培养；
72-96h后收集培养液到离心管中，得到富含间充质干细胞外泌体的培养液。
4.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其特征在于，培养P3代脐带间充质干细胞，待细胞长至85％±10％融合时进行传代；
进一步地，所述传代按照扩培3-5倍的比例进行。
5.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其特征在于，用PBS小心清洗2-3次；
进一步地，每个培养瓶中添加4％-6％体积的外泌体专用完全培养液。
6.脐带间充质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
权利要求3-5任一项得到的富含间充质干细胞外泌体的培养液低温离心，去除死细胞和碎片，然后过滤去除囊泡；
得到的液体进行超速离心，弃上清，得到间充质干细胞外泌体。
7.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，所述低温离心为4±2℃下以2000-2200g离心；
进一步地，所述离心的时间为5-10min；
进一步地，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.22μm。
8.根据权利要求6-7任一项所述的脐带间充质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，得到的液体进行超速离心步骤中，离心的转速为100000-120000g，离心时间为4-8h。
9.根据权利要求8所述的脐带间充质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，所述弃上清后还包括将离心容器管壁上的液体去除，离心容器底部的物质即为间充质干细胞外泌体。
10.根据权利要求9所述的脐带间充质干细胞外泌体分离方法，其特征在于，还包括以下步骤：得到的间充质干细胞外泌体用PBS重悬，保存。
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