CN114134109A - Egf间充质干细胞外泌体的纯化方法 - Google Patents

Egf间充质干细胞外泌体的纯化方法 Download PDF

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CN114134109A CN202111509707.1A CN202111509707A CN114134109A CN 114134109 A CN114134109 A CN 114134109A CN 202111509707 A CN202111509707 A CN 202111509707A CN 114134109 A CN114134109 A CN 114134109A
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Abstract

本发明涉及一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，包括如下步骤：步骤1：将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液离心，取上清液；步骤2：将步骤1中收集的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩，得浓缩液；步骤3：将步骤2中的浓缩液用阴离子交换层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液；步骤4：将步骤3中收集的洗脱峰溶液用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体。该方法能够特异性分离提纯EGF间充质干细胞外泌体，可有效分离携带EGF蛋白和未携带EGF蛋白的外泌体，提取的EGF间充质干细胞外泌体与传统超速离心方法相比，EGF蛋白含量更高，并且可以保持外泌体的完整性和生物学功能。

Description

EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法
技术领域
本发明涉及外泌体提取分离技术领域，具体涉及一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法。
背景技术
间充质干细胞在再生医学领域具有重大应用前景，能够用于包括肝，心脏，骨骼，软骨，神经和皮肤在内的多种组织再生和治疗。间充质干细胞分泌的外泌体是一种纳米级的细胞外囊泡，属于间充质干细胞的旁分泌介质之一。外泌体能够将携带间充质干细胞中的miRNA和mRNA分子、多肽、蛋白质、细胞因子和脂质等功能性物质，可将这些内容物递送到受体细胞，发挥细胞通讯功能，调节受体细胞的生理功能，有助于受伤或患病组织和器官的愈合。在许多实验模型中都有报道间充质干细胞的治疗作用主要是由其分泌的外泌体发挥作用。因此，在再生医学领域，间充质干细胞来源的外泌体可以用于治疗各种疾病，例如：在皮肤伤口愈合中，其能够促进血管生成，减少炎症，促进皮肤细胞的增殖迁徙等。间充质干细胞来源的外泌体与间充质干细胞相比更稳定，能够减少给药活细胞的安全风险，例如具有低免疫原性，避免微血管阻塞风险等。除了上述提及的作用外，外泌体作为一种纳米级的脂质双分子囊泡还能够被分离并在低温条件下长期保存，不需要考虑成活率，体积微小容易循环，内容物稳定性较好。
生长因子EGF能刺激上皮细胞的增殖和迁移以及介导角质形成细胞向上皮细胞的分化进而促进伤口发生上皮化重建上皮屏障，在创伤愈合的过程中具有重要的作用。间充质干细胞来源的外泌体富含各种内容物，也包括生长因子EGF，但其一般表达于外泌体的膜内，EGF在外泌体中的含量较少，在受损部位中，外泌体携带的EGF虽然也能够被递送到受体细胞中发挥作用，但是由于是表达在膜内，因此EGF不能发挥特异靶向性作用，并且含量较低，其生物活性作用不是很显著。
CN113088496A公开了一种EGF间充质干细胞外泌体，EGF间充质干细胞外泌体是指通过基因工程改造后使间充质干细胞分泌的外泌体膜上锚定有EGF生长因子的外泌体。该EGF间充质干细胞外泌体的EGF表达量得到很大提高，此外由于EGF被表达在外泌体的细胞膜的表面，将这类EGF间充质干细胞外泌体递送到损伤组织，作用于该部位的多种细胞，能针对受损部位的肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、上皮细胞、角质形成细胞以及表皮细胞等发挥特异性靶向作用，促进细胞的增殖迁徙，从而能够更好地促进损伤组织的愈合。
但是，目前针对EGF间充质干细胞外泌体还没有一种特异性的纯化方法，导致EGF间充质干细胞外泌体还无法得到大规模生产和应用。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，该方法实现了EGF间充质干细胞外泌体的特异性分离提纯，提取的EGF间充质干细胞外泌体与传统超速离心方法相比，EGF蛋白含量更高。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，包括如下步骤：
步骤1：将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液离心，取上清液；
步骤2：将步骤1中收集的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩，得浓缩液；
步骤3：将步骤2中的浓缩液用阴离子交换层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液；
步骤4：将步骤3中收集的洗脱峰溶液用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体。
在其中一些实施例中，步骤1所述离心包括：先通过低速离心去除细胞，再通过高速离心去除细胞碎片和大颗粒杂质；所述低速离心的转速为2500rpm～3500rpm，离心时间为20分钟～40分钟；所述高速离心的转速为8000rpm～10000rpm，离心时间为20分钟～40分钟。
在其中一些实施例中，所述低速离心的转速为2900rpm～3100rpm，离心时间为28分钟～32分钟；所述高速离心的转速为8500rpm～9500rpm，离心时间为28分钟～32分钟。
在其中一些实施例中，所述低速离心的离心力为3000rpm，离心时间为30分钟；所述高速离心的离心力为9000rpm，离心时间为30分钟。
在其中一些实施例中，步骤2所述切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为200KDa～400KDa。
在其中一些实施例中，步骤2所述切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为250KDa～350KDa。
在其中一些实施例中，步骤2所述切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为300KDa。
在其中一些实施例中，步骤3所述阴离子交换层析柱中的层析介质为：Q-琼脂糖凝胶6FF(Q-sepharose 6FF)、Q Bestarose Fast Flow、Diamond Q和Diamond DEAE中的至少一种。
在其中一些实施例中，步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为5mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.05mol/L～0.2mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为7.0～8.5；
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为5mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.4mol/L～1.5mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液的pH为7.0～8.5。
在其中一些实施例中，步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为45mmol/L～55mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.08mol/L～0.12mol/L的NaCl，浓度为15mmol/L～25mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为7.8～8.2；
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为45mmol/L～55mmol/L的Tris缓冲液，浓度为0.7mol/L～0.9mol/L的NaCl，浓度为15mmol/L～25mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液的pH为7.8～8.2。
在其中一些实施例中，步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，浓度为0.1mol/L的NaCl，浓度为20mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为8.0；
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为50mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.8mol/L的NaCl，浓度为20mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液的pH为8.0。
在其中一些实施例中，步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化的上样速度为1mL/min～2mL/min；所述用阴离子交换层析柱分离纯化采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为20min～30min，洗脱流速为0.5～1.5ml/min。
在其中一些实施例中，步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化的上样速度为1mL/min～2mL/min；所述用阴离子交换层析柱分离纯化采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为23min～25min，洗脱流速为0.8～1.2ml/min。
在其中一些实施例中，步骤4所述肝素亲和层析柱的层析介质为HeparinBestarose HP和/或HeparinBestarose FF。
在其中一些实施例中，步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为10mmol/L～30mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为0.4mol/L～1.0mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为5.8～6.5；
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为10mmol/L～30mmol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为0.8mol/L～2.0mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为5.8～6.5。
在其中一些实施例中，步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为18mmol/L～22mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为0.5mol/L～0.7mol/L的NaCl，浓度为18mmol/L～22mmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为6.0～6.2；
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为18mmol/L～22mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为1.5mol/L～1.7mol/L的NaCl，浓度为18mmol/L～22mol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为6.0～6.2。
在其中一些实施例中，步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为20mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为0.6mol/L的NaCl，浓度为20mmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为6.0；
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为1.6mol/L的NaCl，浓度为20mmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为6.0。
在其中一些实施例中，步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化的上样速度为1mL/min～2mL/min；所述用肝素亲和层析柱分离纯化采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为20min～30min，洗脱流速为0.5～1.5ml/min。
在其中一些实施例中，步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化的上样速度为1mL/min～2mL/min；所述用肝素亲和层析柱分离纯化采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为23min～25min，洗脱流速为0.8～1.2ml/min。
在其中一些实施例中，步骤4包括：将步骤3中收集的洗脱峰溶液先用与所述洗脱峰溶液等体积的平衡液稀释，得到上样样品，再将所述上样样品用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体；所述用于稀释的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为10mmol/L～30mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为0.1mol/L～0.4mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na，其pH为5.8～6.5。
在其中一些实施例中，所述用于稀释的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为18mmol/L～22mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为0.25mol/L～0.35mol/L的NaCl，浓度为18mmol/L～22mmol/L的EDTA-2Na，其pH为6.0～6.2。
在其中一些实施例中，所述用于稀释的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，浓度为0.3mol/L的NaCl，浓度为20mmol/L的EDTA-2Na，其pH为6.0。
本发明针对EGF间充质干细胞外泌体，提出了一种切向流超滤法与亲和层析法联合的特异性分离EGF间充质干细胞外泌体的方法，该方法先将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液通过离心去除细胞、细胞碎片和大颗粒杂质，再用切向流超滤系统进行过滤浓缩，再将浓缩液依次用阴离子交换层析柱和肝素亲和层析柱进行分离纯化以特异性吸附分离携带EGF蛋白的外泌体，收集的洗脱峰溶液即所述EGF间充质干细胞外泌体。该方法通过各步骤按照一定的顺序紧密结合，实现了EGF间充质干细胞外泌体的特异性分离提纯，提取的EGF间充质干细胞外泌体与传统超速离心方法相比，EGF蛋白含量更高，并且可以保持外泌体的完整性和生物学功能，有利于EGF间充质干细胞外泌体的大规模生产和应用。
附图说明
图1为EGF间充质干细胞外泌体Western Blot检测结果，图中MSC-EXO为间充质干细胞外泌体；EGF-MSC-EXO-way1为对比例1提取的EGF间充质干细胞外泌体，EGF-MSC-EXO-way2为实施例1提取的EGF间充质干细胞外泌体。
图2为EGF间充质干细胞外泌体EGF浓度检测结果，图中MSC-EXO为间充质干细胞外泌体；EGF-MSC-EXO-way1为对比例1提取的EGF间充质干细胞外泌体，EGF-MSC-EXO-way2为实施例1提取的EGF间充质干细胞外泌体。
图3为EGF间充质干细胞外泌体的电镜图片。
图4为EGF间充质干细胞外泌体的粒径检测结果。
图5为EGF间充质干细胞外泌体的体外生物功能检测结果；其中，
A为未添加外泌体的阴性对照，B为添加EGF间充质干细胞外泌体的实验组；C为添加间充质干细胞泌体的对照组。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下为具体实施例。
实施例1EGF间充质干细胞外泌体的分离纯化
本实施例提供的EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法包括如下步骤：
步骤1：参照专利CN113088496A中的方法获得含EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液：将间充质干细胞用10％FBS完全培养基培养至70％的密度后，更换为0.5％EV FreeFBS培养基，48小时之后，收获含EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液。
步骤2：取1L含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液在转速为3000rpm的条件下离心30min以去除细胞，收集上清液，上清液在转速为9000rpm的条件下离心30min以去除大颗粒杂质及细胞碎片，收集上清液。
步骤3：将离心后的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩，超滤膜的截留分子量为300KDa，浓缩10倍，收集浓缩液约100ml。
步骤4：将浓缩后的浓缩液用5ml柱体积的阴离子交换层析柱分离纯化；层析介质为Q-Bestarose Fast Flow；平衡液由如下浓度的组分组成：50mmol/L Tris-HCl+0.1mol/LNaCl+20mmol/L EDTA-2Na，其pH为8.0；洗脱液由如下浓度的组分组成：50mmol/LTris-HCl+0.8mol/LNaCl+20mmol/L EDTA-2Na，其pH为8.0。上样速度控制在1～2ml/min，采用梯度洗脱方式进行洗脱，设置洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为25min，洗脱流速为1ml/min。设置紫外检测波长260nm和280nm，收集洗脱峰的溶液，约10ml。
步骤5：
步骤5.1：将步骤3收集的洗脱峰溶液与等体积平衡液制备成用于肝素亲和层析的上样样品，约40ml；所用平衡液由如下浓度的组分组成：20mmol/L PB+0.3mol/LNaCl+20mmol/L EDTA-2Na，其pH为6.0。
步骤5.2：将用于肝素亲和层析的上样样品40ml用5ml柱体积的肝素亲和层析柱分离纯化，其层析介质为Heparin Bestarose FF，其平衡液由如下浓度的组分组成：20mmol/LPB+0.6mol/LNaCl+20mmol/L EDTA-2Na，平衡液的pH为6.0；洗脱液由如下浓度的组分组成：20mmol/L PB+1.6mol/L NaCl+20mmol/L EDTA-2Na，其pH为6.0。上样速度控制在1ml/min，采用梯度洗脱方式进行洗脱，设置洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为25min，洗脱流速为1ml/min。设置紫外检测波长为260nm和280nm，收集洗脱峰，约10ml，即为纯化后的EGF间充质干细胞外泌体。
对比例1EGF间充质干细胞外泌体的分离纯化
本对比例提供的EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法采用超速离心的方法，具体包括如下步骤：
参照专利CN113088496A中的方法获得含EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液，将间充质干细胞用10％FBS完全培养基培养至70％的密度后，更换为0.5％EVFree FBS培养基，48小时之后，收获细胞培养基上清100ml。离心，4℃，500×g，10min，取上清。离心，4℃，2000×g，20min，取上清。离心，4℃，10000×g，40min，取上清。离心，4℃，100000×g，90min，取沉淀。用PBS重悬后，离心，4℃，100000×g，90min，取沉淀，即为EGF间充质干细胞外泌体，将外泌体用1ml PBS重悬。
实施例2EGF间充质干细胞外泌体的总蛋白检测
通过BCAProtein Quantification Kit BCA蛋白浓度测定试剂盒对实施例1和对比例1纯化后的EGF间充质干细胞外泌体中的总蛋白质含量进行测定(检测方法参照试剂盒的说明书进行)，同时以PBS作为阴性对照。检测结果显示：实施例1和对比例1提供的方法提取的EGF间充质干细胞外泌体的蛋白浓度分别为2.159μg/μl、1.209μg/μl。
实施例3EGF间充质干细胞外泌体的Western Blot检测
对实施例1和对比例1纯化后的EGF间充质干细胞外泌体进行Western Blot检测，将野生型间充质干细胞外泌体(MSC-EXO)、对比例1提取的EGF间充质干细胞外泌体(EGF-MSC-EXO-way1)，以及本发明实施例1的纯化方法纯化的EGF间充质干细胞外泌体(EGF-MSC-EXO-way2)，加入5×Loading buffer，100℃加热20min。通过10％SDS-PAGE凝胶，进行电泳2h。转膜，300mA，90min。封闭，1h。用ALIX、EGF、GAPDH一抗在4℃进行孵育过夜。用二抗孵育2h后，用化学发光液孵育几分钟后用化学发光仪进行曝光。以间充质干细胞外泌体为阴性对照，以EGF与间充质干细胞外泌体的混合物为阳性对照，其检测结果如图1所示，本发明实施例1制备的EGF间充质干细胞外泌体(EGF-MSC-EXO-way2)的ALIX/CD81/CD63/EGF条带均清晰可见，相比于MSC-Exo和MSC-Exo+EGF-way1，EGF-MSC-Exo-way2中EGF蛋白含量更高。
实施例4ELISA检测间EGF充质干细胞外泌体的EGF的浓度
通过ELISA检测试剂盒，检测EGF间充质干细胞外泌体中的EGF的浓度。分别将100μL野生型间充质干细胞外泌体(MSC-EXO)、对比例1提取的EGF间充质干细胞外泌体(EGF-MSC-EXO-way1)，以及本发明实施例1的纯化方法纯化的EGF间充质干细胞外泌体(EGF-MSC-EXO-way2)和不同浓度的标准品加入到已经用抗体包被过的板条中，每组三个孔。设置空白对照组。37℃放置30min。用1×Washingbuffer工作液洗板5次。每孔内加入100μL酶结合物，37℃放置30min。扣去孔内液，用1×Washing buffer工作液洗板5次。每孔加入100μLstrptavidin-HRP工作液，盖上封板膜，37℃放置30min。洗板5次。每孔加入100μL TMB，37℃，15min。每孔加入100μL stop solution终止反应。用检测波长450nm读值，计算EGF的浓度。结果如图2所示，本发明实施例1提取的EGF间充质干细胞外泌体中相比对比例1含有更高浓度的EGF。
实施例5EGF间充质干细胞外泌体的透射电镜(TEM)检测
将带有碳涂层Formvar膜的400目铜网格用镊子悬空固定，使其正面水平朝上，在网格上滴加10μL实施例1制备的EGF间充质干细胞外泌体的PBS重悬液，静置5min后小心吸走悬液，重复上述操作一次。在网格上滴加10μL 2％的多聚甲醛和1％的戊二醛进行固定，静置10min后小心吸走悬液。避光环境中，在网格上滴加10μL 2％乙酸铀溶液进行负染，静置5min后小心吸走染液。避光环境中，在网格上滴加10μL去离子水洗涤，小心吸走洗涤液，重复操作一次，风干。使用透射电镜观察外泌体的形态、大小和特征，并拍照记录。结果如图2所示，EGF间充质干细胞外泌体在电镜下呈圆形，结构完整。
实施例6EGF间充质干细胞的纳米粒径检测
采用纳米粒子颗粒跟踪分析仪(NTA)对EGF间充质干细胞外泌体的粒径进行分析。首先用超纯水将EGF间充质干细胞外泌体样品稀释到颗粒浓度在1×107/mL和1×109/mL范围内。再通过ZetaView PMX110仪器，设置激光在405nm处，测定样本中粒子数量和大小，以30张/秒拍摄照片，持续时间为1分钟。分析结果如图3所示，实施例1制备的EGF间充质干细胞外泌体的粒径分布在100nm左右。
实施例7EGF间充质干细胞外泌体的体外生物功能检测
将人类永生化表皮细胞HaCaT细胞铺在24孔板上，当细胞长到70％时，用200μL的枪头在每个孔的中间划一条直直的横线，然后去掉培养基，用PBS洗细胞两次，加入新鲜的无FBS并包含了实例施1分离纯化得到的EGF间充质干细胞外泌体(1ug/ml)的培养基作为实验组；以添加普通间充质干细胞外泌体(1ug/ml)的培养基为对照组；以无FBS的培养基为阴性对照。每组设置3个孔。将刚划痕后以及培养24h后的每个孔里的细胞划痕情况用显微镜拍照记录保存，结果如图4所示。实验结果证明本发明的纯化方法分离的EGF间充质干细胞外泌体与普通外泌体相比，EGF间充质干细胞外泌体能够更有效地促进HaCaT细胞的迁徙。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液离心，取上清液；
步骤2：将步骤1中收集的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩，得浓缩液；
步骤3：将步骤2中的浓缩液用阴离子交换层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液；
步骤4：将步骤3中收集的洗脱峰溶液用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤1所述离心包括：先通过低速离心去除细胞，再通过高速离心去除细胞碎片和大颗粒杂质；所述低速离心的离心力为2500rpm～3500rpm，离心时间为20分钟～40分钟；所述高速离心的转速为8000rpm～10000rpm，离心时间为20分钟～40分钟。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤2所述切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为200KDa～400KDa。
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，骤2所述切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为250KDa～350KDa。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤3所述阴离子交换层析柱中的层析介质为：Q-sepharose 6FF、Q Bestarose Fast Flow、Diamond Q和Diamond DEAE中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为5mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.05mol/L～0.2mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为7.0～8.5；
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为5mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.4mol/L～1.5mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液的pH为7.0～8.5。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为45mmol/L～55mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.08mol/L～0.12mol/L的NaCl，浓度为15mmol/L～25mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为7.8～8.2；
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为45mmol/L～55mmol/L的Tris-HCl，浓度为0.7mol/L～0.9mol/L的NaCl，浓度为15mmol/L～25mmol/L的EDTA-2Na；步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液的pH为7.8～8.2。
8.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化的上样速度为1mL/min～2mL/min；所述用阴离子交换层析柱分离纯化采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为20min～30min，洗脱流速为0.5～1.5ml/min。
9.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤4所述肝素亲和层析柱的层析介质为Heparin Bestarose HP和/或Heparin Bestarose FF。
10.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为10mmol/L～30mol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为0.4mol/L～1.0mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为5.8～6.5；
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为10mmol/L～30mmol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为0.8mol/L～2.0mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为5.8～6.5。
11.根据权利要求10所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为18mmol/L～22mol/Lmol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为0.5mol/L～0.7mol/L的NaCl，浓度为18mmol/L～22mol/Lmmol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为6.0～6.2；
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成：浓度为18mmol/L～22mol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为1.5～1.7mol/L的NaCl，浓度为18mmol/L～22mol/L的EDTA-2Na；步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为6.0～6.2。
12.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化的上样速度为1mL/min～2mL/min；所述用肝素亲和层析柱分离纯化采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度为50％～100％，洗脱时间为20min～30min，洗脱流速为0.5～1.5ml/min。
13.根据权利要求1-12任一项所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，步骤4包括：将步骤3中收集的洗脱峰溶液先用与所述洗脱峰溶液等体积的平衡液稀释，得到上样样品，再将所述上样样品用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体；所述用于稀释的平衡液由如下浓度的组分组成：浓度为10mmol/L～30mol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为0.1mol/L～0.4mol/L的NaCl，浓度为5mmol/L～50mmol/L的EDTA-2Na，其pH为5.8～6.5。
14.根据权利要求13所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，所述用于稀释的平衡液由如下浓度的组分组成：18mmol/L～22mol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为0.25mol/L～0.35mol/L的NaCl，浓度为18mmol/L～22mmol/L的EDTA-2Na，其pH为6.0～6.2。
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