CN113088496A - Egf间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种EGF间充质干细胞外泌体，其是间充质干细胞分泌的、在间充质干细胞膜上能表达EGF融合蛋白的外泌体。所述EGF融合蛋白，其从N端起，依次是N端信号肽，目的EGF蛋白，连接肽和间充质干细胞跨膜区，本发明通过将生长因子EGF改造成膜蛋白并使其锚定在间充质干细胞的细胞膜中过表达，收集过表达膜蛋白EGF间充质干细胞的外泌体并研究其在组织修复中的用途。经过细胞水平以及动物实验水平的验证，除了EGF蛋白能大量表达之外，我们还发现表达EGF的间充质干细胞来源的外泌体更能够促进表皮细胞的增殖以及迁移，加速小鼠皮肤伤口的愈合，对组织创伤有着良好的治疗效果。

Description

EGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及EGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤的伤口愈合是一个组织修复的过程，涉及到了一系列的生物学反应，最初是止血，涉及炎症反应，结缔组织的形成，伤口上皮的覆盖，以及伤口的重塑。皮肤损伤之后，表皮屏障遭受破坏，角质形成细胞释放预先储存的IL-1，作为细胞屏障损伤的信号，同时，血液成分被释放到伤口，激活凝血级联反应。血小板脱粒释放α颗粒，这些颗粒可以分泌EGF，PDGF以及TGF-β等生长因子。生长因子EGF也可以由募集到伤口的巨噬细胞以及成纤维细胞分泌，它能刺激上皮细胞的增殖和迁移以及介导角质形成细胞向上皮细胞的分化进而促进伤口发生上皮化重建上皮屏障。鉴于EGF在创伤愈合的过程中具有重要的作用，已有公司将EGF开发成治疗创伤的产品，且多为局部外敷给药。但是由于EGF是由53个氨基酸组成的多肽，经皮渗透性较差，难以有效的通过表皮层到达真皮层，因此提高生长因子EGF的有效利用率是改良EGF制剂的主要方向。
间充质干细胞近年来因为其分化能力强，具备有免疫调节能力，以及易于培养和操作等特点，在再生医学领域受到广泛关注。有研究表明间充质干细胞的多效性作用与其分化能力无关，并且其由于具有较强的免疫调节性以及分化能力，可能会引起过度的免疫反应以及引起肿瘤的发生发展等风险，因此直接使用间充质干细胞应用于治疗具有一定的风险，因此开发一种无细胞疗法是很有必要的。间充质干细胞的再生能力其实主要是由可溶性旁分泌因子的分泌介导的，可以调节受损部位的细胞增殖，迁徙，促进损伤组织的修复。其中，间充质干细胞分泌的外泌体是一种纳米级的细胞外囊泡，属于间充质干细胞的旁分泌介质之一。外泌体能够将携带间充质干细胞中的miRNA和mRNA分子、多肽、蛋白质、细胞因子和脂质等功能性物质，可将这些内容物递送到受体细胞，发挥细胞通讯功能，调节受体细胞的生理功能，有助于受伤或患病组织和器官的愈合。在许多实验模型中都有报告间充质干细胞的治疗作用主要是由外泌体发挥作用。因此，在再生医学领域，间充质干细胞来源的外泌体可以被认为是可应用于建立一种新的无细胞治疗方法，用于治疗各种疾病，例如在皮肤伤口愈合中，其能够促进血管生成，减少炎症，促进皮肤细胞的增殖迁徙等。间充质干细胞来源的外泌体与间充质干细胞相比更稳定，能够减少了给药活细胞的安全风险，例如具有低免疫原性，避免微血管阻塞风险等。除了上述提及的作用外，外泌体作为一种纳米级的脂质双分子囊泡还能够被分离并在低温条件下长期保存，不需要考虑成活率，体积微小容易循环，内容物稳定性较好。
目前主要是通过将EGF生长因子与细胞共孵育后来增加细胞中该因子的表达量，但是孵育后的细胞是否能够增加其分泌的外泌体中的EGF的表达量还未知。间充质干细胞来源的外泌体富含各种内容物，包括EGF，其表达于外泌体的膜内，EGF在外泌体中的含量较少，可能即便和EGF生长因子共孵育后也并不能增加细胞分泌的外泌体中EGF的含量。并且在受损部位中，外泌体携带的EGF虽然也能够被递送到受体细胞中发挥作用，但是由于是表达在膜内，因此EGF不能发挥特异靶向性作用，并且含量较低，其生物活性作用不是很显著。
为了能够提高生长因子EGF在天然外泌体的功能和利用率，我们考虑将生长因子EGF以膜融合蛋白的形式锚定在间充质干细胞的细胞膜的表面，在间充质干细胞生成外泌体的过程中，这些锚定在细胞膜表面的EGF也会被表达在外泌体的膜表面，这样将增加外泌体的EGF的表达量，此外由于EGF被表达在外泌体的细胞膜的表面，那么外泌体在递送到受损部位的细胞过程中能够特异性靶向上皮细胞、角质形成细胞以及表皮细胞等，促进皮肤细胞的增殖迁徙，更好地促进损伤皮肤的愈合。目前还未见将EGF与外泌体结合用于组织伤口修复的报道。
发明内容
本发明的目的之一提供一种EGF间充质干细胞外泌体，其能稳定高表达EGF蛋白，且能应用于加速伤口愈合并改善瘢痕形成。
上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种EGF间充质干细胞外泌体，其是间充质干细胞分泌的在间充质干细胞膜上能表达EGF融合蛋白的外泌体。
在其中一些实施例中，所述EGF融合蛋白，其从N端起，依次是N端信号肽，目的EGF蛋白，连接肽和间充质干细胞跨膜区。所述N端信号肽是间充质干细胞表面标记物CD44的信号肽。在其中一些实施例中，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ IDNO.1所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
在其中一些实施例中，所述目的EGF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQID NO.2所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
在其中一些实施例中，所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，或SEQ IDNO.4所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供上述EGF间充质干细胞外泌体的制备方法。
上述EGF间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
构建含有目的EGF蛋白基因的慢病毒表达载体；
所述慢病毒表达载体感染间充质干细胞；
所述间充质干细胞分泌EGF间充质干细胞外泌体。
本发明的另一目的是提供所述EGF间充质干细胞外泌体的应用。
实现上述目的的技术方案如下。
所述EGF间充质干细胞外泌体在制备治疗组织创伤的药物或者产品的应用。
所述EGF间充质干细胞外泌体在制备治疗由于皮肤慢性炎症导致的组织损伤的药物或者产品的应用。
所述EGF间充质干细胞外泌体在制备促进表皮细胞生长的药物或者产品的应用。
所述EGF间充质干细胞外泌体在制备促进组织再生的药物或者产品的应用。所述组织优选为皮肤组织。
本发明另一目的一种治疗组织创伤的药物或者产品。
一种组织创伤的药物或者产品，其包含了EGF间充质干细胞外泌体以及药学上可接受的辅料。
在其中一些实施例中，所述药物或者产品的剂型为注射剂和经皮给药制剂。通过将上述制剂注射或涂抹于伤口处，可以加速伤口愈合和减少瘢痕形成。
在其中一些实施例中，所述产品可以是医美用品，护肤品，或者美容产品。在其中一些实施例中，所述产品是液体或者是霜剂或者是凝露剂等相关剂型，只要能施与皮肤或者皮下组织即可。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明为了获得高表达EGF的间充质干细胞，创造性地过基因工程将生长因子EGF改造成膜蛋白并使其锚定在间充质干细胞的细胞膜中过表达，成功收集到过表达膜蛋白EGF间充质干细胞的外泌体并研究其在组织修复中的用途。经过细胞水平以及动物实验水平的验证，除了EGF蛋白能大量表达之外，我们还发现表达EGF的间充质干细胞来源的外泌体更能够促进表皮细胞的增殖以及迁移，加速小鼠皮肤伤口的愈合，对组织创伤有着良好的治疗效果。
本发明采用间充质干细胞表面标志物CD44的信号肽序列和跨膜序列来设计EGF融合蛋白的相应序列，将其重组为EGF质粒后感染间充质干细胞，成功获取锚定并高表达EGF在间充质干细胞以及其分泌的外泌体的膜上。在体外实验和动物实验中证明了EGF间充质干细胞能够促进表皮细胞的增殖和迁移，促进组织再生和加速伤口愈合。在保留间充质干细胞外泌体的促再生能力和EGF的组织修复能力的同时，发挥特异靶向性，增强了EGF稳定性和到达伤口的能力，对伤口的修复有着叠加的作用，具有较大的应用潜能。
本发明首次将EGF以融合蛋白的形式表达到间充质干细胞和间充质干细胞外泌体的膜上，增强了间充质干细胞外泌体的特异靶向性，显著提高了伤口修复的作用，减少瘢痕的形成。本发明提供了一种新的安全高效的促组织修复的药物或者医用制剂或医美产品。
附图说明
图1为构建的整合EGF序列慢病毒质粒的结构。
图2是间充质干细胞感染整合EGF序列慢病毒后的验证情况：图2A为利用qPCR技术检测野生型间充质干细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)以及感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞(EGF MSC)的EGF mRNA水平；图2B为利用ELISA方法检测野生型间充质干细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)以及感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞(EGF MSC)分泌的EGF；图2C为利用western blot方法检测野生型间充质干细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)以及感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞(EGF MSC)的EGF以及GAPDH的蛋白质表达情况。
图3为间充质干细胞分泌的外泌体的表征情况：图3A为使用透射电镜来检测野生型间充质干细胞获取的外泌体(MSC-Exo)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞分泌的外泌体(MSC+EGF-Exo)以及感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞分泌的外泌体(EGF MSC-Exo)的形态，标尺为100nm。图3B为使用粒径仪来检测野生型间充质干细胞获取的外泌体(MSC-Exo)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞分泌的外泌体(MSC+EGF-Exo)以及感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞分泌的外泌体(EGF MSC-Exo)的粒径分布；图3C为检测野生型间充质干细胞获取的外泌体(MSC-Exo)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞分泌的外泌体(MSC+EGF-Exo)以及感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞分泌的外泌体(EGFMSC-Exo)的zeta电位；图3D为利用Western blot方法检测野生型间充质干细胞获取的外泌体(MSC-Exo)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞分泌的外泌体(MSC+EGF-Exo)以及感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞分泌的外泌体(EGF MSC-Exo)的EGF，外泌体标志性蛋白ALIX以及内参GAPDH的表达情况。
图4为验证EGF间充质干细胞外泌体的体外生物功能。图4A为感染整合EGF序列慢病毒后间充质干细胞分泌的外泌体(EGF MSC-Exo)能够被HaCaT细胞摄取的情况，标尺为10μm。图4B为HaCaT细胞划痕实验，24小时后各组细胞迁移的迁移情况；图4C为各组细胞迁移率情况。图4D为细胞增殖实验，用CCK-8检测试剂盒来测EGF间充质干细胞外泌体对细胞促进增殖的情况。
图5是小鼠皮肤创伤模型中EGF间充质干细胞外泌体的作用：图5A为伤口面积图，分为3组，对照组(Ctrl)，间充质干细胞来源外泌体组(MSC-Exo)和EGF间充质干细胞来源外泌体组(EGF MSC-Exo)；图5B为比较各组伤口面积变化率；图5C为对照组(Ctrl)，间充质干细胞来源外泌体组(MSC-Exo)和EGF间充质干细胞来源外泌体组(EGF MSC-Exo)在第10天取样后皮肤的HE和IHC图，组织免疫荧光检测α-SMA；图5D为利用qPCR检测对照组(Ctrl)，间充质干细胞来源外泌体组(MSC-Exo)和EGF间充质干细胞来源外泌体组(EGF MSC-Exo)在第10天取样后皮肤中的α-SMA、TGF-β1的mRNA水平；图5E为利用ELISA实验检测对照组(Ctrl)，间充质干细胞来源外泌体组(MSC-Exo)和EGF间充质干细胞来源外泌体组(EGF MSC-Exo)的血清中的EGF水平。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1慢病毒载体的构建
1.设计融合蛋白EGF的慢病毒载体，创新性地根据间充质干细胞表面标志物CD44的信号肽序列和跨膜序列设计融合蛋白的相应序列，各序列如下所示：N端信号肽：
ATGGACAAGTTTTGGTGGCACGCAGCCTGGGGACTCTGCCTCGTGCCGCT GAGCCTGGCG(SEQ IDNO.1)
目的基因EGF：
ATGCTGCTCACTCTTATCATTCTGTTGCCAGTAGTTTCAAAATTTAGTTTTGTTAGTCTCTCAGCACCGCAGCACTGGAGCTGTCCTGAAGGTACTCTCGCAGGAAATGGGAATTCTACTTGTGTGGGTCCTGCACCCTTCTTAATTTTCTCCCATGGAAATAGTATCTTTAGGATTGACACAGAAGGAACCAATTATGAGCAATTGGTGGTGGATGCTGGTGTCTCAGTGATCATGGATTTTCATTATAATGAGAAAAGAATCTATTGGGTGGATTTAGAAAGACAACTTTTGCAAAGAGTTTTTCTGAATGGGTCAAGGCAAGAGAGAGTATGTAATATAGAGAAAAATGTTTCTGGAATGGCAATAAATTGGATAAATGAAGAAGTTATTTGGTCAAATCAACAGGAAGGAATCATTACAGTAACAGATATGAAAGGAAATAATTCCCACATTCTTTTAAGTGCTTTAAAATATCCTGCAAATGTAGCAGTTGATCCAGTAGAAAGGTTTATATTTTGGTCTTCAGAGGTGGCTGGAAGCCTTTATAGAGCAGATCTCGATGGTGTGGGAGTGAAGGCTCTGTTGGAGACATCAGAGAAAATAACAGCTGTGTCATTGGATGTGCTTGATAAGCGGCTGTTTTGGATTCAGTACAACAGAGAAGGAAGCAATTCTCTTATTTGCTCCTGTGATTATGATGGAGGTTCTGTCCACATTAGTAAACATCCAACACAGCATAATTTGTTTGCAATGTCCCTTTTTGGTGACCGTATCTTCTATTCAACATGGAAAATGAAGACAATTTGGATAGCCAACAAACACACTGGAAAGGACATGGTTAGAATTAACCTCCATTCATCATTTGTACCACTTGGTGAACTGAAAGTAGTGCATCCACTTGCACAACCCAAGGCAGAAGATGACACTTGGGAGCCTGAGCAGAAACTTTGCAAATTGAGGAAAGGAAACTGCAGCAGCACTGTGTGTGGGCAAGACCTCCAGTCACACTTGTGCATGTGTGCAGAGGGATACGCCCTAAGTCGAGACCGGAAGTACTGTGAAGATGTTAATGAATGTGCTTTTTGGAATCATGGCTGTACTCTTGGGTGTAAAAACACCCCTGGATCCTATTACTGCACGTGCCCTGTAGGATTTGTTCTGCTTCCTGATGGGAAACGATGTCATCAACTTGTTTCCTGTCCACGCAATGTGTCTGAATGCAGCCATGACTGTGTTCTGACATCAGAAGGTCCCTTATGTTTCTGTCCTGAAGGCTCAGTGCTTGAGAGAGATGGGAAAACATGTAGCGGTTGTTCCTCACCCGATAATGGTGGATGTAGCCAGCTCTGCGTTCCTCTTAGCCCAGTATCCTGGGAATGTGATTGCTTTCCTGGGTATGACCTACAACTGGATGAAAAAAGCTGTGCAGCTTCAGGACCACAACCATTTTTGCTGTTTGCCAATTCTCAAGATATTCGACACATGCATTTTGATGGAACAGACTATGGAACTCTGCTCAGCCAGCAGATGGGAATGGTTTATGCCCTAGATCATGACCCTGTGGAAAATAAGATATACTTTGCCCATACAGCCCTGAAGTGGATAGAGAGAGCTAATATGGATGGTTCCCAGCGAGAAAGGCTTATTGAGGAAGGAGTAGATGTGCCAGAAGGTCTTGCTGTGGACTGGATTGGCCGTAGATTCTATTGGACAGACAGAGGGAAATCTCTGATTGGAAGGAGTGATTTAAATGGGAAACGTTCCAAAATAATCACTAAGGAGAACATCTCTCAACCACGAGGAATTGCTGTTCATCCAATGGCCAAGAGATTATTCTGGACTGATACAGGGATTAATCCACGAATTGAAAGTTCTTCCCTCCAAGGCCTTGGCCGTCTGGTTATAGCCAGCTCTGATCTAATCTGGCCCAGTGGAATAACGATTGACTTCTTAACTGACAAGTTGTACTGGTGCGATGCCAAGCAGTCTGTGATTGAAATGGCCAATCTGGATGGTTCAAAACGCCGAAGACTTACCCAGAATGATGTAGGTCACCCATTTGCTGTAGCAGTGTTTGAGGATTATGTGTGGTTCTCAGATTGGGCTATGCCATCAGTAATGAGAGTAAACAAGAGGACTGGCAAAGATAGAGTACGTCTCCAAGGCAGCATGCTGAAGCCCTCATCACTGGTTGTGGTTCATCCATTGGCAAAACCAGGAGCAGATCCCTGCTTATATCAAAACGGAGGCTGTGAACATATTTGCAAAAAGAGGCTTGGAACTGCTTGGTGTTCGTGTCGTGAAGGTTTTATGAAAGCCTCAGATGGGAAAACGTGTCTGGCTCTGGATGGTCATCAGCTGTTGGCAGGTGGTGAAGTTGATCTAAAGAACCAAGTAACACCATTGGACATCTTGTCCAAGACTAGAGTGTCAGAAGATAACATTACAGAATCTCAACACATGCTAGTGGCTGAAATCATGGTGTCAGATCAAGATGACTGTGCTCCTGTGGGATGCAGCATGTATGCTCGGTGTATTTCAGAGGGAGAGGATGCCACATGTCAGTGTTTGAAAGGATTTGCTGGGGATGGAAAACTATGTTCTGATATAGATGAATGTGAGATGGGTGTCCCAGTGTGCCCCCCTGCCTCCTCCAAGTGCATCAACACCGAAGGTGGTTATGTCTGCCGGTGCTCAGAAGGCTACCAAGGAGATGGGATTCACTGTCTTGATATTGATGAGTGCCAACTGGGGGAGCACAGCTGTGGAGAGAATGCCAGCTGCACAAATACAGAGGGAGGCTATACCTGCATGTGTGCTGGACGCCTGTCTGAACCAGGACTGATTTGCCCTGACTCTACTCCACCCCCTCACCTCAGGGAAGATGACCACCACTATTCCGTAAGAAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCACGCTGGCCACGGGCAGCAGCAGAAGGTCATCGTGGTGGCTGTCTGCGTGGTGGTGCTTGTCATGCTGCTCCTCCTGAGCCTGTGGGGGGCCCACTACTACAGGACTCAGAAGCTGCTATCGAAAAACCCAAAGAATCCTTATGAGGAGTCGAGCAGAGATGTGAGGAGTCGCAGGCCTGCTGACACTGAGGATGGGATGTCCTCTTGCCCTCAACCTTGGTTTGTGGTTATAAAAGAACACCAAGACCTCAAGAATGGGGGTCAACCAGTGGCTGGTGAGGATGGCCAGGCAGCAGATGGGTCAATGCAACCAACTTCATGGAGGCAGGAGCCCCAGTTATGTGGAATGGGCACAGAGCAAGGCTGCTGGATTCCAGTATCCAGTGATAAGGGCTCCTGTCCCCAGGTAATGGAGCGAAGCTTTCATATGCCCTCCTATGGGACACAGACCCTTGAAGGGGGTGTCGAGAAGCCCCATTCTCTCCTATCAGCTAACCCATTATGGCAACAAAGGGCCCTGGACCCACCACACCAAATGGAGCTGACTCAGTGA(SEQ ID NO.2)
连接区：
TCCGCTTGTTACTGTGAGCTTTCC(SEQ ID NO.3)
连接区即连接肽，其可以是常规用于连接多肽的接头序列，其能够连接两个多肽并将其自然折叠成所期望结构，通常其是具有一段有疏水性和一定伸展性的短肽。所述连接肽可以是柔性的，在其中一些实施例中，柔性的连接肽是有利的，其能够连接两种蛋白，并且保持其各自的活性和功能。
跨膜区：
TGGCTGATCATCTTGGCATCCCTCTTGGCCTTGGCTTTGATTCTTGCAGTTTGCATTGCAGTC(SEQID NO.4)
2.获取EGF融合蛋白的基因片段，设计EGF的PCR引物:
正向引物F：5’-ggatcttccagagatATGCTGCTCACTCTTATCATTCTGTT(SEQ ID NO.5)
反向引物R：5’-ctgccgttcgacgatTCACTGAGTCAGCTCCATTTGG(SEQ ID NO.6)
采用trizol提取间充质干细胞的mRNA，使用逆转录试剂盒间充质干细胞的cDNA，再根据EGF的PCR引物对cDNA进行扩增，通过凝胶电泳纯化获得的EGF cDNA之后，交由公司合成融合蛋白的信号肽片段，连接区片段和跨膜区片段，使融合蛋白从N端到C端的顺序依次是信号肽，目的片段EGF，连接区和跨膜区。
3.构建EGF融合蛋白的慢病毒载体，以pcDNA3.1作为空载体，酶切位点为NheI和NotI,设计的引物序列如下：
正向引物F：5’-tgaaccgtcagatccgctagcCGATGGACAAGTTTTGGTGGC(SEQ ID NO.7)
反向引物R：5’-aactctagaggatccgcggccgcGACTGCAATGCAAACTGCAAGA(SEQ IDNO.8)
使用限制性核酸内切酶试剂盒，根据设计的引物获得慢病毒表达载体的序列。
实施例2间充质干细胞感染病毒后的表征
1.细胞感染的方法，取10ug构建成功的EGF质粒加至无血清的DMEM培养基中，再向其中加入30μL的lipo3000，混匀之后静置20min，加至细胞数为4×106的HEK 293T细胞中，轻轻混匀，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱，6h后，将5％FBS完全培养基换成10mL 30％FBS完全培养基，48h后取细胞上清，常温4000rpm离心15min。取上清加至细胞数为4×106的间充质干细胞中，加入终浓度为8ug/ml的polybrene，混匀，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱，12h后换成10％FBS完全培养基。
2.将感染后的细胞在24h之后加入终浓度2ug/ml的嘌呤霉素，筛选具有抗性的细胞。
3.提取野生型间充质细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)和经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)的RNA，用PrimeScriptRT-PCR Kit(TaKaRa)将RNA进行反转录实验得到cDNA。接着用qPCR的方法检测EGF在mRNA水平的变化，以β-actin作为内参：
荧光定量PCR检测内参β-actin的PCR引物序列为：
正向引物F:5’-AGAAAATCTGGCACCACACC(SEQ ID NO.9)
反向引物R:5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA(SEQ ID NO.10)
荧光定量PCR检测EGF的PCR引物序列为:
正向引物F：5’-TCTTGCTGTGGACTGGATTG(SEQ ID NO.11)
反向引物R：5’-AGCAATTCCTCGTGGTTGAG(SEQ ID NO.12)。
实验结果如图2A显示，与野生型间充质细胞(MSC)以及和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)相比，经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)的EFG在mRNA水平上有所提升，能够显著性地增加EGF的表达量。
4.利用ELISA检测间充质干细胞分泌的EGF的浓度。将野生型间充质细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)和经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)分别培养在培养皿中，当细胞融合度达到80～90％时，取细胞的培养上清液，6000rpm，5min，取上清。将100μL培养上清液和不同浓度的标准品加入到已经用抗体包被过的板条中，每组三个孔。设置空白对照组。用封板胶纸封住板条，37℃，90min。用1×Washing buffer工作液洗板5次。50μL/well加入生物素化抗体工作液，盖上封板膜，37℃，90min。扣去孔内液，用1×Washing buffer工作液洗板5次。100μL/well加入strptavidin-HRP工作液，盖上封板膜，37℃，30min。洗板5次。100μL/well加入TMB，37℃，15min。100μL/well加入stop solution终止反应。用检测波长450nm读值，计算浓度。结果如图2B所示，说明感染EGF慢病毒后的间充质干细胞(EGF MSC)相比于野生型间充质细胞(MSC)以及和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)能够分泌更多的EGF。
5.利用Westernblot检测间充质干细胞的EGF的蛋白表达情况。分别取107个野生型间充质细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)和经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)，分别加入200μL RIPA，冰上裂解30min，4℃，12000g离心15min，取上清得到细胞蛋白样品。通过BCA的方法检测蛋白浓度。然后经过定量的方法将这三种蛋白加入到10％SDS-PAGE凝胶中进行电泳，再用PEVF膜进行转膜，330mA，90min。转膜完成后，按照EGF和内参GAPDH在膜上的大概位置进行切膜。将膜用封闭液进行封闭1h。然后用TBST洗三次后，加入按照说明书上的稀释比例稀释后的一抗EGF、GAPDH，在4℃中孵育过夜，然后再用TBST洗三次，在用相应的二抗孵育2h后，再用TBST洗三次，在膜上孵化学发光液几分钟后，利用化学发光膜进行曝光。结果如图2C所示，相比于野生型间充质干细胞(MSC)来源的蛋白，和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)能稍微增加EGF蛋白的表达，但是用慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)的EGF蛋白表达更高。这说明利用整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞能够在蛋白水平上高表达EGF。
实施例3感染慢病毒后的间充质干细胞来源的外泌体的表征
1.提取野生型间充质细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)以及经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)的外泌体。将细胞用10％FBS完全培养基培养至70％的密度后，更换为0.5％EVFree FBS培养基，48小时之后，收获细胞培养基上。离心，4℃，500×g，10min，取上清。离心，4℃，2000×g，20min，取上清。离心，4℃，10000×g，40min，取上清。离心，4℃，100000×g，90min，取沉淀。用PBS重悬后，离心，4℃，100000×g，90min，取沉淀沉淀即为间充质干细胞外泌体，将外泌体用100μLPBS重悬后保存于-80℃冰箱中以备后用。
2.TEM表征外泌体。将野生型间充质细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)以及经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)获取的外泌体用少量PBS重悬之后，取10μL滴加到铜网上，10min后，去掉PBS，用醋酸双氧铀进行染色，10min后，用滤纸去除醋酸双氧铀，用10μL去离子水洗涤铜网，重复洗涤一次，晾干，用透射电镜观察，找到直径在50-150nm并具有脂质双分子层膜结构的外泌体进行拍照保存，结果如图3A所示，所提取的纳米颗粒符合外泌体的形态特征。
3.用动态光散射仪检测外泌体的粒径和Zeta电位。将10μL野生型间充质细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)以及经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)获取的外泌体用2mLPBS重悬之后，放入比色皿中，将比色皿放入到粒度仪的检测槽中，利用粒度仪对于外泌体的粒径分布以及Zeta电位进行检测，结果如图3B和3C所示。从野生型间充质干细胞和EGF过表达间充质干细胞获取的外泌体的粒径分布主要集中于100nm左右，电位是在-5mV～-20mV左右，符合外泌体的特征。
4.Westernblot鉴定外泌体。将从野生型间充质细胞(MSC)、和EGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+EGF)以及经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞(EGF MSC)获取的外泌体在经过超速离心后直接用RIPA裂解液进行裂解，经过BCA蛋白定量后，加入5×Loading buffer进行100℃煮20min。将各组外泌体蛋白在10％SDS-PAGE凝胶中上样，蛋白总量一样。电泳，2h。转膜，330mA，90min。封闭，1h。用ALIX、EGF、GAPDH一抗在4℃进行孵育过夜。用二抗孵育2h后，用化学发光液孵育几分钟后用化学发光仪进行曝光。结果如图3D所示，从MSC、MSC+EGF和EGF MSC获取的外泌体都表达一样的ALIX和GAPDH，但是相比于MSC-Exo和MSC+EGF-Exo，EGF MSC-Exo能够明显地表达更多的EGF蛋白。
实施例4 EGF外泌体的体外生物功能检测
1.检测外泌体被皮肤细胞摄取的情况。将经过整合EGF序列慢病毒感染后的间充质干细胞分泌的外泌体(EGF MSC-Exo)用WGA488染料进行染色，然后将外泌体与HaCaT细胞进行共孵育，将孵育后的HaCaT细胞的细胞核用DAPI进行染色，用激光共聚焦显微镜拍摄HaCaT细胞对于EGF MSC-Exo的摄取情况。结果如图4A所示，发现随着孵育时间的增长，细胞能不断摄取EGF MSC-Exo，在孵育24h时，荧光强度最强。证明了EGF MSC-Exo能够被HaCaT皮肤细胞所摄取。
2.将人类永生化表皮细胞HaCaT细胞铺在24孔板上，当细胞长到70％时，用200μL的枪头在每个孔的中间划一条直直的横线，然后去掉培养基，用PBS洗细胞两次，加入新鲜的无FBS并包含了100ug/mL来自于间充质干细胞分泌的外泌体的培养基作为实验组，设置对照组，用无FBS的培养基培养细胞。每组设置3个孔。将刚划痕后以及培养24h后的每个孔里的细胞划痕情况用显微镜拍照记录保存，如图4B所示。计算这两种细胞的迁徙率，算细胞迁徙率＝(0h划痕面积-24划痕面积)/0h划痕面积×100％，如4C所示。实验结果证明相比于野生型间充质干细胞分泌的外泌体，来自于稳定高表达EGF的间充质干细胞分泌的外泌体能够促进HaCaT细胞的迁徙。
3.将人类永生化表皮细胞HaCaT细胞分别铺在96孔板上培养至融合度达到30％。设置实验组，将100ug/mL来自于间充质干细胞分泌的外泌体加入到细胞中。设置对照组，在孔中已经铺了细胞，但是只加培养基。设置空白组，即没有加细胞，只加了培养基。每组5个孔。在培养24h以及48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃孵育1h后，用酶标仪检测450nm波长的吸光度。计算细胞的增殖率＝[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100％。实验结果如图4D所示，相比于野生型间充质干细胞分泌的外泌体，来自于稳定高表达EGF的间充质干细胞分泌的外泌体能够促进HaCaT细胞的增殖。
实施例5 EGF间充质干细胞外泌体对于皮肤创伤的作用
1.构建动物模型的方法：从广东省中山大学东校区实验室动物中心购买6～8周龄BALB/c小鼠，无菌环境中饲养。将小鼠经过1％戊巴比妥钠麻醉后，用脱毛膏将小鼠背部进行脱毛，然后在小鼠背部的正中脊线位置画1个直径0.8cm的圆，沿着圆圈用消毒过的剪刀小心地将皮肤剪下，然后用棉花进行止血后拍照。
2.分组情况及给药方式。将小鼠分成三组，对照组(ctrl)，野生型间充质干细胞分泌的外泌体组(MSC-Exo)，稳定高表达EGF的间充质干细胞分泌的外泌体组(EGF MSC-Exo)，每组5只。在造模后的第三天开始进行每日尾静脉给药。对照组小鼠尾静脉给药PBS 100μL，实验组小鼠尾静脉给药外泌体(25mg/kg)。给药到day 10进行麻醉后拍照观察，小鼠的伤口面积变化图如5A所示，经过与day 0比较后的伤口面积变化率如图5B所示。MSC-Exo组和EGFMSC-Exo组相比于对照组，能更好的地促进创面收缩，并且相比于MSC-Exo组，EGF MSC-Exo组可显著促进创面收缩。
3.病理组织学检查。在day 10时，对小鼠进行麻醉后取样并将小鼠的背部皮肤一部分放入到装有4％多聚甲醛的离心管中进行固定，固定后进行石蜡包埋、切片以及HE染色，并用α-SMA抗体进行免疫组化。结果如图5C所示。MSC-Exo组和EGF MSC-Exo组相比于对照组，能更好的地完成创面上皮化以及增加皮肤细胞的增殖，EGF MSC-Exo组尤为显著。
4.在day 10时，对小鼠进行麻醉后并将小鼠的一部分背部皮肤用于提取RNA。将皮肤放到ep管中，加入700μLTRIzoll裂解液，用组织研磨仪进行研磨。研磨至无明显颗粒物后，加入140μL氯仿，混匀后离心，12000rpm，10min，取上清，转移到新的ep管中。加入等体积的异丙醇，离心，12000rpm，10min，弃上清。加入700μL 75％乙醇，离心，12000rpm，5min，弃上清，再加入700μL 75％乙醇，离心，12000rpm，5min，弃上清。将沉淀物风干后，加入DEPC水，用Nanodrop检测RNA浓度。用试剂盒进行逆转录后进行荧光定量PCR检测各组α-SMA和TGF-β1水平，
其中，荧光定量PCR检测以β-actin为内参基因。
荧光定量PCR检测β-actin内参基因的PCR引物序列为：
正向引物F：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG(SEQ ID NO.13)
反向引物R：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT(SEQ ID NO.14)
荧光定量PCR检测α-SMA的转录水平的引物序列为：
正向引物F：5’-GGCACCACTGAACCCTAAGG(SEQ ID NO.15)
反向引物R：5’-ACAATACCAGTTGTACGTCCAGA(SEQ ID NO.16)
荧光定量PCR检测TGF-β1的转录水平的引物为：
正向引物F：5’-CCACCTGCAAGACCATCGAC；(SEQ ID NO.17)
反向引物R：5’-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC(SEQ ID NO.18)。
荧光定量PCR结果如图5D所示，MSC-Exo组和EGF MSC-Exo组相比于Ctrl组，能够增加皮肤α-SMA和TGF-β1的表达，说明其能够促进肌成纤维细胞的增殖，促进伤口收缩，EGFMSC-Exo组比MSC-Exo组的α-SMA和TGF-β1量更多，说明其促进伤口收缩的能力更强。
5.在day10时，对小鼠进行麻醉后对小鼠进行心脏采血，将血液静置5h后分层，离心，12000rpm，10min，取上清后作为实验样品。将100μL实验样品和不同浓度的标准品加入到已经用抗体包被过的板条中，每组三个孔。设置空白对照组。用封板胶纸封住板条，37℃，90min。用1×Washing buffer工作液洗板5次。50μL/well加入生物素化抗体工作液，盖上封板膜，37℃，90min。扣去孔内液，用1×Washing buffer工作液洗板5次。100μL/well加入strptavidin-HRP工作液，盖上封板膜，37℃，30min。洗板5次。100μL/well加入TMB，37℃，15min。100μL/well加入stop solution终止反应。用检测波长450nm读值，计算浓度。结果如图5E所示，相比于Ctrl以及MSC-Exo组，静脉注射EGF MSC-Exo的小鼠的血液中的EGF更多，说明EGF MSC-Exo能够提升体内的EGF水平。
综上所述，将间充质干细胞和EGF生长因子共孵育后所分泌的外泌体并不能很好地提升EGF的表达量，但是我们创新性的采用间充质干细胞表面标志物CD44的信号肽序列和跨膜序列设计融合蛋白的相应序列，获取的EGF质粒能够将EGF蛋白锚定到间充质干细胞的细胞膜上，并且成功获取在膜上稳定高表达EGF的间充质干细胞来源的外泌体。这类外泌体在体内和体外的实验中能够促进皮肤细胞的增殖，增加伤口处生长因子的表达，促进皮肤创口的收缩，有效地改善创伤后的皮肤愈合。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州远想生物科技有限公司
<120> EGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60
<210> 2
<211> 3624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgctgctca ctcttatcat tctgttgcca gtagtttcaa aatttagttt tgttagtctc 60
tcagcaccgc agcactggag ctgtcctgaa ggtactctcg caggaaatgg gaattctact 120
tgtgtgggtc ctgcaccctt cttaattttc tcccatggaa atagtatctt taggattgac 180
acagaaggaa ccaattatga gcaattggtg gtggatgctg gtgtctcagt gatcatggat 240
tttcattata atgagaaaag aatctattgg gtggatttag aaagacaact tttgcaaaga 300
gtttttctga atgggtcaag gcaagagaga gtatgtaata tagagaaaaa tgtttctgga 360
atggcaataa attggataaa tgaagaagtt atttggtcaa atcaacagga aggaatcatt 420
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agagaaggaa gcaattctct tatttgctcc tgtgattatg atggaggttc tgtccacatt 720
agtaaacatc caacacagca taatttgttt gcaatgtccc tttttggtga ccgtatcttc 780
tattcaacat ggaaaatgaa gacaatttgg atagccaaca aacacactgg aaaggacatg 840
gttagaatta acctccattc atcatttgta ccacttggtg aactgaaagt agtgcatcca 900
cttgcacaac ccaaggcaga agatgacact tgggagcctg agcagaaact ttgcaaattg 960
aggaaaggaa actgcagcag cactgtgtgt gggcaagacc tccagtcaca cttgtgcatg 1020
tgtgcagagg gatacgccct aagtcgagac cggaagtact gtgaagatgt taatgaatgt 1080
gctttttgga atcatggctg tactcttggg tgtaaaaaca cccctggatc ctattactgc 1140
acgtgccctg taggatttgt tctgcttcct gatgggaaac gatgtcatca acttgtttcc 1200
tgtccacgca atgtgtctga atgcagccat gactgtgttc tgacatcaga aggtccctta 1260
tgtttctgtc ctgaaggctc agtgcttgag agagatggga aaacatgtag cggttgttcc 1320
tcacccgata atggtggatg tagccagctc tgcgttcctc ttagcccagt atcctgggaa 1380
tgtgattgct ttcctgggta tgacctacaa ctggatgaaa aaagctgtgc agcttcagga 1440
ccacaaccat ttttgctgtt tgccaattct caagatattc gacacatgca ttttgatgga 1500
acagactatg gaactctgct cagccagcag atgggaatgg tttatgccct agatcatgac 1560
cctgtggaaa ataagatata ctttgcccat acagccctga agtggataga gagagctaat 1620
atggatggtt cccagcgaga aaggcttatt gaggaaggag tagatgtgcc agaaggtctt 1680
gctgtggact ggattggccg tagattctat tggacagaca gagggaaatc tctgattgga 1740
aggagtgatt taaatgggaa acgttccaaa ataatcacta aggagaacat ctctcaacca 1800
cgaggaattg ctgttcatcc aatggccaag agattattct ggactgatac agggattaat 1860
ccacgaattg aaagttcttc cctccaaggc cttggccgtc tggttatagc cagctctgat 1920
ctaatctggc ccagtggaat aacgattgac ttcttaactg acaagttgta ctggtgcgat 1980
gccaagcagt ctgtgattga aatggccaat ctggatggtt caaaacgccg aagacttacc 2040
cagaatgatg taggtcaccc atttgctgta gcagtgtttg aggattatgt gtggttctca 2100
gattgggcta tgccatcagt aatgagagta aacaagagga ctggcaaaga tagagtacgt 2160
ctccaaggca gcatgctgaa gccctcatca ctggttgtgg ttcatccatt ggcaaaacca 2220
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ggaactgctt ggtgttcgtg tcgtgaaggt tttatgaaag cctcagatgg gaaaacgtgt 2340
ctggctctgg atggtcatca gctgttggca ggtggtgaag ttgatctaaa gaaccaagta 2400
acaccattgg acatcttgtc caagactaga gtgtcagaag ataacattac agaatctcaa 2460
cacatgctag tggctgaaat catggtgtca gatcaagatg actgtgctcc tgtgggatgc 2520
agcatgtatg ctcggtgtat ttcagaggga gaggatgcca catgtcagtg tttgaaagga 2580
tttgctgggg atggaaaact atgttctgat atagatgaat gtgagatggg tgtcccagtg 2640
tgcccccctg cctcctccaa gtgcatcaac accgaaggtg gttatgtctg ccggtgctca 2700
gaaggctacc aaggagatgg gattcactgt cttgatattg atgagtgcca actgggggag 2760
cacagctgtg gagagaatgc cagctgcaca aatacagagg gaggctatac ctgcatgtgt 2820
gctggacgcc tgtctgaacc aggactgatt tgccctgact ctactccacc ccctcacctc 2880
agggaagatg accaccacta ttccgtaaga aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac 2940
gatgggtact gcctccatga tggtgtgtgc atgtatattg aagcattgga caagtatgca 3000
tgcaactgtg ttgttggcta catcggggag cgatgtcagt accgagacct gaagtggtgg 3060
gaactgcgcc acgctggcca cgggcagcag cagaaggtca tcgtggtggc tgtctgcgtg 3120
gtggtgcttg tcatgctgct cctcctgagc ctgtgggggg cccactacta caggactcag 3180
aagctgctat cgaaaaaccc aaagaatcct tatgaggagt cgagcagaga tgtgaggagt 3240
cgcaggcctg ctgacactga ggatgggatg tcctcttgcc ctcaaccttg gtttgtggtt 3300
ataaaagaac accaagacct caagaatggg ggtcaaccag tggctggtga ggatggccag 3360
gcagcagatg ggtcaatgca accaacttca tggaggcagg agccccagtt atgtggaatg 3420
ggcacagagc aaggctgctg gattccagta tccagtgata agggctcctg tccccaggta 3480
atggagcgaa gctttcatat gccctcctat gggacacaga cccttgaagg gggtgtcgag 3540
aagccccatt ctctcctatc agctaaccca ttatggcaac aaagggccct ggacccacca 3600
caccaaatgg agctgactca gtga 3624
<210> 3
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<400> 3
tccgcttgtt actgtgagct ttcc 24
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<213> Artificial Sequence
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tggctgatca tcttggcatc cctcttggcc ttggctttga ttcttgcagt ttgcattgca 60
gtc 63
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggatcttcca gagatatgct gctcactctt atcattctgt t 41
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<213> Artificial Sequence
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ctgccgttcg acgattcact gagtcagctc catttgg 37
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<400> 7
tgaaccgtca gatccgctag ccgatggaca agttttggtg gc 42
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aactctagag gatccgcggc cgcgactgca atgcaaactg caaga 45
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agaaaatctg gcaccacacc 20
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agaggcgtac agggatagca 20
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tcttgctgtg gactggattg 20
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agcaattcct cgtggttgag 20
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ggctgtattc ccctccatcg 20
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ccagttggta acaatgccat gt 22
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ggcaccactg aaccctaagg 20
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acaataccag ttgtacgtcc aga 23
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ccacctgcaa gaccatcgac 20
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ctggcgagcc ttagtttgga c 21

Claims (14)

1.一种EGF间充质干细胞外泌体，其特征是，其是间充质干细胞分泌的、在间充质干细胞膜上能表达EGF融合蛋白的外泌体。
2.根据权利要求1所述的EGF间充质干细胞外泌体，其特征是，所述EGF融合蛋白，其从N端起，依次是N端信号肽，目的EGF蛋白，连接肽和间充质干细胞跨膜区，优选地，所述N端信号肽是间充质干细胞表面标记物CD44的信号肽。
3.根据权利要求2所述的EGF间充质干细胞外泌体，其特征是，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ ID NO.1所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的EGF间充质干细胞外泌体，其特征是，所述目的EGF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
5.根据权利要求2-4任一项所述的EGF间充质干细胞外泌体，其特征是，所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，或SEQ ID NO.4所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
6.权利要求1-5任一项所述EGF间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
构建含有EGF融合蛋白的基因的慢病毒表达载体，所述EGF融合蛋白，其从N端起，依次是N端信号肽，目的EGF蛋白，连接肽和间充质干细胞跨膜区；
所述慢病毒表达载体感染间充质干细胞；
所述间充质干细胞分泌EGF间充质干细胞外泌体。
7.权利要求1-5任一项所述EGF间充质干细胞外泌体在制备治疗组织创伤的药物或者产品的应用。
8.权利要求1-5任一项所述EGF间充质干细胞外泌体在制备治疗由于皮肤慢性炎症导致的组织损伤的药物或者产品的应用。
9.权利要求1-5任一项所述EGF间充质干细胞外泌体在制备促进表皮细胞生长的药物或者产品的应用。
10.权利要求1-5任一项所述EGF间充质干细胞外泌体在制备促进组织再生的药物或者产品的应用。
11.一种防治皮肤创伤的药物或者产品，其特征是，其包含了EGF间充质干细胞外泌体以及药学上可接受的辅料。
12.根据权利要求11所述的防治组织创伤的药物或者产品，其特征是，所述药物或者产品的剂型为注射剂和经皮给药制剂。
13.根据权利要求11所述的防治组织创伤的药物或者产品，其特征是，所述产品是医美用品，护肤品，或者美容产品。
14.根据权利要求13所述的防治组织创伤的药物或者产品，其特征是，所述产品是液体制剂或者是霜剂或者是凝露剂。
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