ES2861453T3

ES2861453T3 - Terapia génica para la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva utilizando queratinocitos autólogos corregidos genéticamente

Info

Publication number: ES2861453T3
Application number: ES17704327T
Authority: ES
Inventors: Zurab Siprashvili; Ngon T Nguyen; M Peter Marinkovich; Jean Tang; Alfred T Lane; Paul A Khavari
Original assignee: Leland Stanford Junior University; US Department of Veterans Affairs VA
Current assignee: Leland Stanford Junior University; US Department of Veterans Affairs VA
Priority date: 2016-01-04
Filing date: 2017-01-03
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2037-01-03
Also published as: ZA201803962B; CN114699558B; CN108473952A; EP3842520A1; IL293465A; EP3400287A1; AU2020239779A1; AU2017205925B2; IL293465B2; CN108473952B; WO2017120147A1; JP2023002634A; AU2017205925A1; NZ743682A; IL260038A; RU2018127524A; IL260038B; EP3400287B1; US20190382724A1; RU2021121824A

Abstract

Una lámina de queratinocitos para su uso en el tratamiento de la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR) en un sujeto, en donde un injerto de la lámina de queratinocitos se trasplanta a un lecho de la herida de la piel en el sujeto que padece EADR y la lámina de queratinocitos se prepara mediante un proceso que comprende las etapas de: obtener del sujeto que padece EADR una población de células cutáneas; corregir ex vivo las células de la piel mediante la integración de una construcción genética que codifica una proteína funcional de colágeno VII (COL7A1); en donde las células cutáneas se corrigen mediante transducción con un virus que comprende la construcción genética y en donde el número de copias del genoma provírico (NCGP) de la célula cutánea transducida no es superior a 3 y, opcionalmente, inferior a 2, 1,5, 1 o 0,5 y, opcionalmente, en donde la proteína COL7A1 funcional es una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa; y cultivar las células corregidas genéticamente para formar una lámina de queratinocitos.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia génica para la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva utilizando queratinocitos autólogos corregidos genéticamente

Campo

La presente divulgación se refiere generalmente a métodos y composiciones para tratar la epidermólisis ampollosa (EA).

Antecedentes

La epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR) es un trastorno genético de la piel con ampollas hereditario causado por mutaciones en el gen COL7A1 (colágeno VII, C7) que lleva a la falta de función del C7. Los pacientes con este trastorno se caracterizan por ampollas y erosiones generalizadas de la piel y los tejidos de las mucosas, incluyendo la orofaringe, la conjuntiva, el esófago, así como aspectos distales del tracto genitourinario y gastrointestinal. Las ampollas y las erosiones dolorosas son una discapacidad importante; sin embargo, las cicatrices de las heridas curadas también causan una morbilidad significativa, incluidas las deformidades en manopla (pseudosindactilia), simbléfaron de los ojos, estenosis esofágicas, microstomía, anquiloglosia y estenosis de las extremidades. Se sabe que las heridas crónicas y las cicatrices predisponen a la invasión invasiva del carcinoma de células escamosas, y este es un problema grave en la EADR, siendo el carcinoma invasivo de células escamosas la principal causa de muerte en esta población a partir de la segunda década. Por lo tanto, una terapia óptima para esta enfermedad sería una que se podría implementar temprana para evitar que se produzcan cicatrices incapacitantes, además de prevenir la formación de ampollas. Asimismo, la capacidad de corregir sistémicamente tanto la piel como los tejidos de las mucosas sería muy deseable en un enfoque terapéutico de EADR.

El colágeno de tipo VII (C7) es una gran molécula de colágeno de triple hélice homotrimérica, que sufre la formación de dímeros antiparalelos en su extremo NC2, seguido de ensamblaje supramolecular en estructuras de unión denominadas fibrillas de anclaje, que conectan la lámina densa de la zona de la membrana basal (ZMB) a la dermis papilar. C7 contiene un gran dominio NCl, que une laminina-332 en la lámina densa y un dominio de colágeno, que envuelve las fibrillas de colágeno intersticial en la dermis papilar. Por lo tanto, la falta de C7 en EADR produce ampollas entre la dermis papilar y la lámina densa.

A pesar de los avances en el diagnóstico molecular de esta enfermedad, la terapia actual se limita a los cuidados paliativos. Si bien se han propuesto varios enfoques para reemplazar el C7, todos tienen sus limitaciones. Aplicado tópicamente, el rC7 no puede penetrar la piel intacta y se limita a las zonas heridas. Las inyecciones intradérmicas de proteína rC7 para pacientes con EADR son otra alternativa; sin embargo, la difusión limitada de la inyección con aguja convencional requiere el suministro de matriz de microagujas de rC7, que aún no está disponible para uso clínico.

Para los fines terapéuticos, es deseable el suministro local del C7 a la piel. La presente invención aborda este problema. La terapia sistémica del C7 puede causar toxicidad sistémica. (Véase Hou et al. (2015), Journal of Investigative Dermatology 135, 3060-3067.)

Sumario

La invención en el presente documento se define en las reivindicaciones.

Se proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento de la epidermólisis ampollosa (EA) en un sujeto humano. En los métodos de tratamiento de la divulgación, se modifica por ingeniería genética una población de queratinocitos humanos para expresar el C7 mediante la integración de una construcción genética que codifica el C7 humano de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el nivel de expresión es mayor que los niveles de expresión de queratinocitos humanos normales. En alguna realización, el nivel de expresión es menor, similar o igual a los niveles normales de expresión de queratinocitos humanos, En la divulgación se incluye una población aislada de queratinocitos manipulados mediante los métodos de la divulgación para expresar el c 7 de tipo silvestre, que se puede proporcionar en una composición farmacéutica de dosis unitaria. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano que padece un defecto genético en el C7 que causa la Epidermólisis ampollosa (EA). En las realizaciones, el defecto genético es EADR.

En algunas realizaciones, los queratinocitos utilizados en el tratamiento son queratinocitos autólogos. Los métodos de ingeniería ex vivo se pueden seleccionar de, sin limitación, promovidos por virus, que incluyen, entre otros, retrovirus (por ejemplo, gammarretrovirus), virus AAV y lentivirus, o métodos integradores libres de virus, que incluyen vectores no víricos, transposones, integración de minicírculos, sistema de edición del genoma CRJSPR/Cas9 y similares. En algunas realizaciones, el gammarretrovirus comprende, consiste esencialmente en, o además consiste en, el virus de la leucemia murina (MLV o MuLV), virus de la leucemia felina (FeLV), virus de la leucemia del mono gibón (GALV) y virus xenotrópico relacionado con el virus de la leucemia murina (XMRV). En algunas realizaciones, los vectores no víricos comprenden, consisten esencialmente en, o aún más consisten en, vectores episomales o vectores integradores con capacidad de las características de edición del genoma. En algunas realizaciones, se usa el virus LZRSE-COL7A1 pseudotipado GalV de grado GMP que contiene ADNc de COL7A1 bajo el control de la LTR del MLV para integrar el gen C7 en los queratinocitos. En algunas realizaciones, el ADNc funcional de COL7A1 es un ADNc de COL7A1 humano de tipo silvestre de longitud completa. En una realización, el ADNc funcional de COL7A1 incluye una modificación genética del ADNc de COL7A1 humano de tipo silvestre de longitud completa. En algunas realizaciones, la transducción vírica se realiza superponiendo el sobrenadante vírico sobre el cultivo celular. En algunas realizaciones, los queratinocitos así tratados cumplen los criterios previos a la liberación de eficacia de transducción del virus (ETV)> 50 % y número de copias del genoma provírico (NCGP) < 3. En algunas realizaciones, el NCGP es más de 3, 10, 20, 40 o 60. En alguna realización, el Nc Gp es menor que 2, 1,5, 1 o 0,5.

En alguna realización, el gen endógeno mutado, disfuncional o truncado de C7 se sustituye, usando un sistema CRISPR/Cas (o vector que codifica dicho sistema CRIPSR/Cas) tal como se describe en el presente documento y una secuencia "donadora" (por ejemplo, un ADNc de COL7A1 funcional o gen C7) que se inserta en el gen después de la escisión dirigida.

En algunas realizaciones de la divulgación se proporciona un método para el tratamiento de la EA, comprendiendo el método, que consiste esencialmente en, o que además consiste en, obtener una población de queratinocitos de un sujeto que padece EA, modificando los queratinocitos por transducción retrovírica para expresar C7 humano de tipo silvestre, y reintroduciendo los queratinocitos en el individuo. En algunas realizaciones, los queratinocitos se obtienen a partir de biopsias cutáneas por bisturí circular, que son cultivados in vitro en medios de queratinocitos con o sin suero. En algunas realizaciones, los queratinocitos se cultivan en un medio con o sin la capa alimentadora de células. La epidermis se separa de la capa dérmica y los queratinocitos se obtienen de la capa epidérmica. Se usan al menos alrededor de 106 células, al menos alrededor de 2 x 106, y/o al menos 4 x 106 las células para la transducción para proporcionar una población de células corregidas genéticamente. Las células se cultivan para generar una lámina de unos 25 cm2 a unos 100 cm2 para injertos. Las láminas de queratinocitos corregidos genéticamente se colocan en sitios de heridas no infectados, erosionados o con cicatrices que carecían de evidencia clínica de carcinoma de células escamosas (SCC). Los sitios de la herida pueden ser de unos 50 cm2, desde unos 100 cm2, y/o desde unos 200 cm2. En algunas realizaciones, se generan heridas para injertos. En algunas de estas realizaciones, la herida se electrocauteriza para extirpar los queratinocitos residuales no corregidos del lecho de la herida. Los injertos se fijan a los lechos de la herida mediante suturas solubles después de la preparación del lecho de la herida.

En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende, que consiste esencialmente en, o que además consiste en una población de queratinocitos corregidos genéticamente para expresar C7 humano de tipo silvestre a una dosis eficaz para reducir los síntomas de EA, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto de la divulgación, la composición está congelada. En algunas realizaciones, los queratinocitos son autólogos en relación con un individuo seleccionado para el tratamiento.

En otra realización, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende, que consiste esencialmente en una lámina de queratinocitos, o que además consta de ella, que comprende, consiste esencialmente en células de la piel o aún más consiste en ellas integradas ex vivo con una construcción genética que codifica una proteína COL7A1 funcional. En algunas realizaciones, la lámina de queratinocitos se coloca sobre un equivalente de piel de bioingeniería. En algunas realizaciones, la lámina de queratinocitos se coloca sobre una matriz acelular, una matriz de colágeno, una proteína de la MEC o una capa química, o una malla biocompatible. En una realización, la matriz acelular está hecha de dermis humana y/o animal. En algunas realizaciones, la malla biocompatible está hecha de resina termoplástica, polietileno, polietileno de peso molecular ultra alto, poliolefina de alto peso molecular, polipropileno monofilamento sin recubrimiento, poliéter éter cetona, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno, politetrafluoroetileno expandido, nailon, silicio o cualquier combinación de los mismos.

En el presente documento se muestra, que se aislaron queratinocitos de EADR autólogos de biopsias de piel y se transdujeron con el retrovirus que porta la COL7A1 humana funcional (por ejemplo, de longitud completa). Para cada sujeto, se fabricaron e injertaron láminas epidérmicas autólogas (~ 35 cm2) en lechos de heridas preparados. Los criterios de valoración incluyeron seguridad, eficacia como porcentaje de cicatrización de heridas en comparación con la línea de base y evidencia de expresión de C7 a los 3 y 6 meses después del trasplante. Todos los injertos fueron bien tolerados por todos los sujetos y no se informaron eventos adversos graves (infección vírica sistémica, autoinmunidad, aparición de cáncer de piel dentro de los injertos). A los 3-6 meses, la mayoría de los injertos mostró un 75 % de curación. Las biopsias de los sitios de injerto mostraron una fuerte expresión de C7 en la unión dermoepidérmica a los 3 meses y a los 6 meses la presencia de fibrillas de anclaje normales. La transferencia ex vivo del gen COL7A1 tuvo un perfil de seguridad favorable y mostró una eficacia alentadora en sujetos con EADR heredada.

Breve descripción de los dibujos

FIG 1. (A) Diagrama de flujo de corrección genética de la EADR. KC - queratinocitos epidérmicos, LEAES - injertos de láminas epidérmicas autólogas diseñadas LZRSE-COL7A1. (B) Inmunofluorescencia indirecta (IIF) de Kc de EADR transducidos con LZRSE-COL7A1 por virus. Anticuerpo policlonal anti-colágeno de tipo VII (naranja); núcleos con Hoechst 33342 (azul). Barra de escala, 100 pm. (C) Cuantificación de la eficacia de transducción del virus (ETV) en KC corregidos de 4 sujetos con EADR. (D) Cuantificación de un número de copias províricas promedio (NCGP) en KC corregidos de 4 sujetos con EADR. (E) Representación clínica del fenotipo EADR antes y después del trasplante del injerto. Téngase en cuenta las ampollas antes del trasplante de piel corregida y en las heridas no tratadas, compárese con 3 y 6 meses después del injerto de LEAES. (F) Análisis IIF de la expresión de colágeno de tipo VII en injertos de piel. Mab anti-NC2 de colágeno de tipo VII LH24 y Pab de NC1 FNC1 (verde); núcleos con Hoechst 33342 (azul); Nótese la tinción verde lineal del colágeno de tipo VII en la unión dermoepidérmica de los injertos de tejido corregidos. Barra de escala, 100 pm. (G) Análisis inmuno-ME de injertos de piel con EADR corregidos. Las secciones de tejido se etiquetaron en conjunto con Mab anti-NC2 de colágeno de tipo VII LH24, seguido de anti-IgM de ratón conjugadas con partículas de inmunogold (puntos negros indicados por flechas). Barra de escala, 200 nm.

FIG. 2. Diagrama CONSORT de inscripción de sujetos en el ensayo de Fase I.

FIG. 3. Análisis por transferencia de Western del sobrenadante de KC cultivado utilizando anticuerpo policlonal anti-colágeno de tipo VII específico para el dominio NC1. Téngase en cuenta la expresión de la proteína C7 truncada que contiene el dominio NC1 en todos los sujetos incluidos en el ensayo.

FIG. 4. LEAES maduras antes de la recolección, se muestra el injerto de LEAES ensamblado y final.

FIG. 5. (A) Representación clínica del fenotipo EADR antes y después del trasplante de injerto. (B) Análisis IIF de la expresión de colágeno de tipo VII en injertos de piel. Mab anti-NC2 de colágeno de tipo VII LH24 (verde); núcleos con Hoechst 33342 (azul); queratina 14 (Pab anti-K14, naranja); queratina 1 (Pab anti-Kl, naranja) y loricrina (Pab anti-loricrina, naranja). Nótese la tinción verde lineal del colágeno de tipo VII en la unión dermoepidérmica de los injertos de tejido corregidos en todos los puntos temporales. Barra de escala, 100 pm.

FIG. 6. Heridas del sujeto 2 antes y después del injerto. (A) Representación clínica del fenotipo EADR antes y después del trasplante de injerto. (B) Análisis IIF de la expresión de colágeno de tipo VII en injertos de piel. Mab anti-NC2 de colágeno de tipo VII LH24 (verde); núcleos con Hoechst 33342 (azul); queratina 14 (Pab anti-K14, naranja); queratina 1 (Pab anti-Kl, naranja) y loricrina (Pab anti-loricrina, naranja). Nótese la tinción verde lineal del colágeno de tipo VII en la unión dermoepidérmica de los injertos de tejido corregidos a los 3 meses. Barra de escala, 100 pm.

FIG. 7. Heridas del sujeto 3 antes y después del injerto. (A) Representación clínica del fenotipo EADR antes y después del trasplante de injerto. (B) Análisis IIF de la expresión de colágeno de tipo VII en injertos de piel. Mab anti-NC2 de colágeno de tipo VII LH24 (verde); núcleos con Hoechst 33342 (azul); queratina 14 (Pab anti-K14, naranja); queratina 1 (Pab anti-Kl, naranja) y loricrina (Pab anti-loricrina, naranja). Nótese la tinción verde lineal del colágeno de tipo VII en la unión dermoepidérmica de los injertos de tejido corregidos en todos los puntos temporales. Barra de escala, 100 pm.

FIG. 8. Heridas del sujeto 4 antes y después del injerto. (A) Representación clínica del fenotipo EADR antes y después del trasplante de injerto. (B) Análisis IIF de la expresión de colágeno de tipo VII en injertos de piel. Mab anti-NC2 de colágeno de tipo VII LH24 (verde); núcleos con Hoechst 33342 (azul); queratina 14 (Pab anti-K14, naranja); queratina 1 (Pab anti-Kl, naranja) y loricrina (Pab anti-loricrina, naranja). Nótese la tinción verde lineal del colágeno de tipo VII en la unión dermoepidérmica de los injertos de tejido corregidos a los 3 meses con Mab LH24 y a los 6 meses con Pab de NC1. Barra de escala, 100 pm.

FIG. 9. Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-C7 LH24. Análisis por transferencia de Western del C7 digerido enzimáticamente que muestra reactividad cruzada de Mab LH24 con el péptido de carboxilo terminal que contiene el dominio NC2. La presencia del dominio NC2 en la fracción C7 digerida con pepsina se confirmó con pAb específico de NC2 (NC2-10) 5. El dominio NC1 en la fracción C7 digerida con colagenasa se identificó usando pAb de FNC1 6.

FIG. 10. Representación clínica de heridas no corregidas del sujeto 4. Desarrollo característico de ampollas espontáneas en heridas no tratadas.

FIG. 11. Reactividad del suero del sujeto 4 al colágeno de tipo VII. (A) Análisis por transferencia de Western que muestra reactividad cruzada del suero del sujeto 4 con el C7 de longitud completa antes y después del trasplante del injerto (3 meses). (B) El suero del sujeto 4 obtenido antes y 3 meses después del injerto es específico para la proteína C7 digerida enzimáticamente (pepsina) que contiene el dominio NC2. El control (carril derecho) confirma la presencia del dominio NC2 en la fracción C7 digerida usando Pab específico de NC2 (NC2-10) 5.

FIG. 12. Heridas del sujeto 1 antes y 12 meses después del injerto. Representación clínica de heridas al inicio del estudio y 12 meses después del injerto. Análisis IIF de la expresión de colágeno de tipo VII en injertos de piel. Pab anti-NC1 de colágeno de tipo VII (verde); núcleos con Hoechst 33342 (azul); queratina 14 (Pab anti-K14, naranja); queratina 1 (Pab anti-Kl, naranja) y loricrina (Pab anti-loricrina, naranja). Nótese la tinción verde lineal del colágeno de tipo VII en la unión dermoepidérmica del injerto de tejido corregido. Barra de escala, 100 pm.

La FIG. 13 representa el mapa del plásmido retrovírico pLZRSE-COL7A1.

Descripción detallada

Debe entenderse que la presente invención no se limita a la metodología particular, los protocolos, las líneas celulares, las especies o los géneros animales, y los reactivos descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene la finalidad única de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/una", y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia al "cultivo" incluye la referencia a uno o más cultivos y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende normalmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención, a menos que se indique claramente lo contrario.

Cualquier realización de cualquiera de los presentes métodos, dispositivos y sistemas pueden consistir en, o consistir esencialmente en, en lugar de comprender/incluir/contener/tener, las etapas y/o características descritas. Por lo tanto, en cualquiera de las reivindicaciones, la expresión "que consiste en" o "que consiste esencialmente en" se puede sustituir por cualquiera de los verbos de enlace abiertos enumerados anteriormente, para cambiar el alcance de una afirmación determinada de lo que de otro modo estaría usando el verbo de enlace abierto.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse solo a alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y a "y/o".

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar de error para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor.

Las condiciones de interés para el tratamiento con queratinocitos modificados genéticamente de la presente invención incluyen, sin limitación, diversas formas de epidermólisis ampollosa, incluidas las formas adquiridas y congénitas, éstas últimas de las cuales puede ser recesivo o dominante.

Basado en el sistema de clasificación reciente, la epidermólisis ampollosa distrófica (EAD) incluye tres subtipos: EAD recesiva, grave generalizada (EADR-sev gen) (antes llamada tipo Hallopeau-Siemens (EADR-HS); EAD recesiva, otra generalizada (EADR-O) (antes llamada tipo no Hallopeau-Siemens (EADR-no HS); y EAD dominante (EADD). En la EADR-sev gen, las ampollas que afectan a todo el cuerpo pueden estar presentes en el período neonatal. La afectación oral puede producir ampollas en la boca, fusión de la lengua con el suelo de la boca y disminución progresiva del tamaño de la cavidad bucal. Las erosiones esofágicas pueden provocar membranas y estenosis que pueden causar disfagia grave. Por consiguiente, son comunes la deficiencia nutricional grave y los problemas secundarios. Las erosiones corneales pueden provocar cicatrices y pérdida de visión. La formación de ampollas en las manos y los pies seguida de cicatrices fusiona los dedos en manos y pies de "manoplas", un sello distintivo de este trastorno. El riesgo de por vida de carcinoma de células escamosas agresivo es superior al 90 %. En la EADD, la formación de ampollas suele ser leve y se limita a las manos, los pies, las rodillas y los codos, pero sin embargo cura con cicatrices. Las uñas distróficas, especialmente las uñas de los pies, son comunes y pueden ser la única manifestación de la EADD.

El tratamiento convencional de las manifestaciones es principalmente de apoyo, incluyendo vendaje para heridas y apoyo nutricional. La terapia ocupacional puede ayudar a prevenir las contracturas de las manos. A menudo es necesario repetir la liberación quirúrgica de los dedos.

Los queratinocitos diseñados para expresar C7 de tipo silvestre pueden encontrar uso en la terapia para la Epidermólisis Ampollosa Distrófica.

Además de las formas heredadas de EA, la forma adquirida de Epidermólisis ampollosa (EAA) implica patología en el colágeno de tipo VII y se puede tratar con los queratinocitos manipulados de la divulgación. Los autoanticuerpos en circulación en pacientes con EAA reconocen epítopos en moléculas de colágeno de tipo VII, y la clonación molecular de los ADNc de colágeno de tipo VII ha proporcionado las herramientas para identificar los inmunoepítopos predominantes dentro del dominio NC-1 amino-terminal del colágeno de tipo VII. Las propiedades antigénicas del dominio NC-1 (VII) se destacan aún más por el hecho de que los anticuerpos monoclonales, tales como H3A y L3D, que se utilizan clínicamente para mapear el colágeno tipo VII en la piel de pacientes con formas hereditarias de EA, también identifican epítopos en esta porción de la proteína. Además de los autoanticuerpos en circulación que reconocen los epítopos de colágeno tipo VII en eAa , las lesiones ampollosas en algunos pacientes con lupus eritematoso sistémico también se han asociado con anticuerpos anti-colágeno tipo VII.

Colágeno. Tal como se usa en el presente documento, el término "colágeno" se refiere a composiciones en las que al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o más de la proteína presente es colágeno en una configuración de triple hélice. El plegamiento de las cadenas a individuales en la conformación de triple hélice se basa en la secuencia primaria característica, incluyendo secuencias repetidas de triplete Gly-X-Y. Los colágenos se encuentran ampliamente en especies de vertebrados y se han secuenciado para muchas especies diferentes. Debido al alto grado de similitud de secuencia entre especies, el colágeno de diferentes especies se puede utilizar con fines biomédicos, por ejemplo, entre especies de mamíferos, aunque se puede preferir la proteína humana.

Los colágenos FACIT (colágenos asociados a fibrillas con hélices triples interrumpidas) incluyen los tipos IX, XII, XIV, XIX, XX y XXI. Varios de los últimos tipos de colágenos se asocian con fibras de colágeno más grandes y sirven como puentes moleculares, estabilizando la organización de la matriz extracelular. El colágeno VII, (COL7A1, cromosoma 3, NC_000003.10 (48576510..48607689, complemento)) es de particular interés. El colágeno tipo VII es un componente importante de las fibrillas de anclaje.

El colágeno de tipo VII es un dominio de triple hélice largo, 424 nm, con secuencias flanqueantes no de colágeno. Las moléculas de colágeno de tipo VII incluyen un segmento de triple hélice de colágeno central flanqueado por los dominios NC-1 y NC-2 no de colágeno. A diferencia de los colágenos intersticiales, la secuencia repetida Gly-X-Y está interrumpida por 19 imperfecciones debido a inserciones o deleciones de aminoácidos en la secuencia repetida Gly-X-Y. De la manera más destacable, en el medio del dominio de triple hélice, hay una región de "bisagra" no de colágeno de 39 aminoácidos que es susceptible de digestión proteolítica con pepsina. El dominio NC-1 amino-terminal de tipo VII, aproximadamente de 145 kDa de tamaño, incluye submódulos con homología con proteínas adhesivas conocidas, incluyendo segmentos con homología con la proteína de la matriz del cartílago (PMC), nueve dominios consecutivos de tipo fibronectina tipo III (FN-III), un segmento con homología con el dominio A del factor von Willebrand y una región corta rica en cisteína y prolina. El dominio no colágeno de carboxi-terminal, NC-2, es relativamente pequeño, ~ 30 kDa, y contiene un segmento con homología con la molécula inhibidora de proteasa de Kunitz.

El gen del colágeno humano de tipo VII, COL7A1 tiene una estructura compleja con un total de 118 exones separados. El gen es, sin embargo, relativamente compacto, y la mayoría de los intrones son relativamente pequeños; por consiguiente, el tamaño de todo el gen COL7A1 humano es de solo ~ 32 kb, que codifica un ARN mensajero de ~ 8,9 kb. COL7A1 se ha asignado al brazo corto del cromosoma 3 humano, región 3p21.1. La estructura del gen del colágeno de tipo VII y la secuencia primaria codificada de la proteína están bien conservadas y, por ejemplo, el gen del ratón muestra el 84,7 % de homología en el nucleótido y el 90,4 % de identidad a nivel de proteína.

El colágeno de tipo VII es sintetizado tanto por queratinocitos epidérmicos como por fibroblastos dérmicos en cultivo. Tras la síntesis de polipéptidos pro-a1(VII) completos, tres polipéptidos se asocian a través de sus extremos carboxiterminales a una molécula de trímero que en su porción de colágeno se pliega en la formación de triple hélice. Las moléculas de triple hélice se secretan luego al medio extracelular donde dos tipos de moléculas de colágeno VII se alinean en un dímero antiparalelo con los dominios amino-terminales presentes en ambos extremos de la molécula. Este ensamblaje de dímero se acompaña de la eliminación proteolítica de una parte del extremo carboxi-terminal de ambas moléculas de colágeno de tipo VII y la estabilización mediante la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. Posteriormente, un gran número de estos dímeros antiparalelos se agregan lateralmente para formar fibrillas de anclaje.

Las mutaciones por sustitución de glicina en el dominio de triple hélice de COL7A1 (especialmente en los exones 73, 74 y 75) predominan en la epidermólisis ampollosa distrófica dominante (EADD). Las mutaciones p.Gly2034Arg y p.Gly2043Arg son las mutaciones que causan EADD más comunes, constituyendo el 50 % de las mutaciones dominantes documentadas en la cohorte más grande de EE.UU. Las sustituciones de glicina, así como otras sustituciones de aminoácidos y mutaciones de unión de corte y empalme fuera de esta región, también se pueden encontrar en EAD dominante.

Se han descrito más de 400 mutaciones recesivas que causan EAD que abarcan todo el gen para todas las formas de EAD. Cada mutación, sin embargo, representa no más del 1 % - 2 % del número total de mutaciones. Las mutaciones nulas predominan en la EADR, aunque se han descrito sustituciones de glicina y otras sustituciones de aminoácidos. Las formas más leves de EADR a menudo son causadas por mutaciones en la unión de corte y empalme u otras mutaciones sin sentido.

Un polipéptido de "secuencia natural" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido que proviene de la naturaleza. Dichos polipéptidos de secuencia natural se pueden producir por medios recombinantes de acuerdo con los métodos expuestos en el presente documento. Por lo tanto, un polipéptido de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, polipéptido humano de origen natural, polipéptido murino o polipéptido de cualquier otra especie de mamífero y similares. La expresión "proteína de colágeno VII de secuencia natural" incluye las proteínas naturales con o sin la metionina N-terminal de iniciación (Met).

Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo como se define a continuación que tiene menos del 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de secuencia natural. Dichas variantes incluyen polipéptidos en los que se añaden uno o más restos de aminoácidos en el extremo N-terminal o C-terminal de, o dentro de, la secuencia natural; se delecionan de aproximadamente uno a cuarenta restos de aminoácidos, y opcionalmente se sustituyen con uno o más restos de aminoácidos; y derivados de los polipéptidos anteriores, en donde un resto de aminoácido se ha modificado covalentemente de modo que el producto resultante tenga un aminoácido de origen no natural. Normalmente, una variante de colágeno VII biológicamente activa tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido de colágeno VII de secuencia natural, preferentemente al menos aproximadamente el 95%, más preferentemente al menos aproximadamente el 99 %.

Un "derivado funcional" de un colágeno de secuencia natural, el polipéptido VII es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido VII de colágeno de secuencia natural. Los "derivados funcionales" incluyen, aunque no de forma limitativa, fragmentos de una secuencia natural y derivados de un polipéptido de colágeno VII de secuencia natural y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de colágeno VII de secuencia natural correspondiente. El término "derivado" abarca tanto las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de colágeno VII como las modificaciones covalentes del mismo.

La expresión "lecho de la herida" se refiere a la capa superior viable de la herida. En una realización, el lecho de la herida está cubierto por esfacelo o escara. En otra realización, el lecho de la herida se puede evaluar para detectar la presencia de tejido de granulación, esfacelo de fibrina, escara, hueso, tendón y/u otras estructuras subyacentes.

La expresión "prueba de eficacia de transducción de virus (ETV)" es una prueba para medir la proporción entre el número de células transducidas con virus y el total de células sujetas a la transducción. En una realización, la ETV se mide mediante tinción inmunofluorescente con un anticuerpo dirigido a una proteína expresada en el virus transducido. En otra realización, la ETV se mide mediante PCR en tiempo real o PCR cuantitativa.

La expresión "número de copias del genoma provírico" o "NCGP" se refiere al número de copias de ADN províricas en las células transducidas con virus. Por lo tanto, la prueba NCGP mide el número de copias de ADN provírico en una célula después de una transducción o una infección vírica. En una realización, el número de copias se mide mediante PCR en tiempo real o PCR cuantitativa. En otra realización, El NCGP se mide por análisis por transferencia de Southern o un método de alto rendimiento. En alguna realización, el NCGP es menor que 3, 2, 1, 0,5. En alguna realización, el NCGP es más de 3, 10, 100 o 1.000.

La expresión "prueba de esterilidad" se refiere a una prueba que intenta revelar la presencia o ausencia de microorganismos contaminantes viables en una muestra, y se utiliza a menudo para eliminar resultados falsos positivos. En una realización, los resultados falsos positivos se generan por contaminación del medio ambiente o errores.

El término "endotoxina" se refiere a una toxina asociada con las membranas externas de ciertas bacterias gram negativas, incluyendo, pero sin limitación, especies de Brucella, Neisseria, y Vibrio. En una realización, las endotoxinas no se secretan sino que se liberan sólo cuando las células se rompen. La endotoxina se puede medir o analizar mediante un método de coágulo de gel, un método cromogénico, un método turbidimétrico, o una combinación de los mismos.

El término "micoplasma" se refiere a una población de bacterias que carecen de una pared celular alrededor de su membrana celular, de modo que las bacterias se ven menos afectadas o no se ven afectadas por ciertos tipos de antibióticos. La prueba de micoplasma incluye, pero sin limitación, procedimiento de agar y caldo, detección de ADN, métodos enzimáticos y ELISA y PCR.

La expresión "prueba de esterilidad por tinción de Gram" se refiere a un procedimiento para detectar bacterias y/u hongos en la muestra. En una realización, la prueba de esterilidad por tinción de Gram puede mostrar la presencia o ausencia de bacterias u hongos en la muestra y/o sus tipos generales.

La expresión "prueba de viabilidad" se refiere a una prueba para determinar la capacidad de los órganos, de las células o de los tejidos para mantener o recuperar la viabilidad, lo que incluye, pero sin limitación, actividad mecánica, motilidad, contracción, actividad mitótica de los órganos, células o tejidos. En una realización, la prueba de viabilidad de las láminas epidérmicas autólogas diseñadas LZRSE-COL7A1 (LEAES, por sus siglas en inglés) es para probar la capacidad de las células o tejidos en LEAES para mantener o recuperar la viabilidad.

La expresión "retrovirus competente en replicación (RCR)", en la presente divulgación, se refiere al retrovirus que es capaz de replicarse, aunque los vectores retrovíricos estén diseñados para ser defectuosos en la replicación. En una realización, el RCR se genera durante la fabricación mediante recombinación homóloga o no homóloga entre el vector de transferencia, los componentes de empaquetado y los elementos retrovíricos endógenos en células productoras. Una prueba de RCR es para detectar el RCR en una muestra.

La expresión "ensayo de linfocitos T citotóxicos" se refiere a un ensayo para evaluar funciones inmunitarias mediadas por células.

La expresión "prueba posterior a la liberación" en la presente divulgación, se refiere a una o más pruebas después de que la lámina epidérmica se suelta de la placa, incluyendo, pero sin limitación, prueba de esterilidad, prueba del RCR, prueba del micoplasma, prueba de viabilidad y prueba de esterilidad por tinción de Gram.

La expresión "modificación genética" se refiere a un proceso de alterar un gen de un organismo o insertar un gen de un organismo en otro organismo. En una realización, la modificación genética comprende, consiste esencialmente en, o aún consiste en, inserción, deleción y/o mutación. El término "inserción" significa la adición de uno o más pares de bases de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos. El término "deleción" se refiere a una parte de un cromosoma o una secuencia de nucleótidos que se elimina o falta. El término "mutación" es la alteración de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, secuencia de ADN). La mutación puede tener lugar en varios tamaños, incluyendo, pero sin limitación, un solo par de bases (es decir, mutación puntual), varios pares de bases, o hasta un gran segmento del cromosoma.

La expresión "modificación genética conservativa" se refiere a la modificación genética que mantiene propiedades bioquímicas iguales o similares de un polipéptido codificado por el gen modificado genéticamente. Por ejemplo, tanto el ácido aspártico como el ácido glutámico son restos pequeños cargados negativamente. En alguna realización, es una modificación genética conservativa por mutación del ácido aspártico en ácido glutámico en un polipéptido.

La prolil 4-hidroxilasa (P4HA; EC 1.14.11.2) juega un papel central en la síntesis de colágeno. Cataliza la formación de 4-hidroxiprolina en colágenos por hidroxilación de residuos de prolina en enlaces peptídicos. Los restos de 4-hidroxiprolina son esenciales para el plegamiento de la cadena polipeptídica de procolágeno recién sintetizada en moléculas de triple hélice. La enzima activa es un tetrámero de 2 subunidades alfa y 2 beta con un peso molecular de aproximadamente 240.000. La subunidad beta (P4HB) es idéntica a la enzima disulfuro isomerasa (EC 5.3.4.1) y una proteína de unión a la tiroides celular importante. La subunidad alfa contribuye a una parte importante del sitio catalítico de la enzima. El polipéptido tiene 517 restos de aminoácidos y un péptido señal de 17 aminoácidos.

El gen P4HA cubre más de 69 kilobases y consta de 16 exones. Previamente se habían presentado pruebas de un corte y empalme alternativo mutuamente excluyente de los transcritos de ARN del gen. Los datos actuales indicaron que las secuencias mutuamente excluyentes que se encuentran en los ARNm están codificadas por 2 exones homólogos consecutivos de 71 pb, 9 y 10. Estos exones son idénticos en sus primeros 5 pares de bases y la identidad global entre ellos es del 61 % al nivel de nucleótidos y del 58 % al nivel de los aminoácidos codificados. Se descubrió que ambos tipos de ARNm se expresan en todos los tejidos estudiados, pero en algunos tejidos el tipo que codifica las secuencias del exón 9 o del exón 10 era más abundante que el otro tipo.

Por "construcción de ácido nucleico" se entiende una secuencia de ácido nucleico que se ha construido para comprender una o más unidades funcionales que no se encuentran juntas en la naturaleza. Los ejemplos incluyen moléculas de ADN circular, lineal, bicatenario, extracromosómico (plásmidos), cósmidos (plásmidos que contienen secuencias COS del fago lambda), genomas víricos que comprenden secuencias de ácido nucleico no naturales y similares.

En los métodos actuales, el colágeno VII se produce introduciéndolo en una población celular en una construcción de expresión integradora, generalmente vírica. El ADN que codifica el polipéptido de colágeno VII se puede obtener de cualquier biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que exprese el ARNm del polipéptido de colágeno VII, preparado a partir de diversas fuentes. El gen que codifica el polipéptido del colágeno VII también se puede obtener de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos. Un medio alternativo para aislar el gen que codifica es utilizar la metodología de la PCR.

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el polipéptido de colágeno VII se inserta en una construcción para la expresión, operativamente unida a los elementos necesarios para la expresión. Muchas de estas construcciones están disponibles. Los componentes generalmente incluyen, aunque no de forma limitativa, uno o más de los siguientes: la secuencia codificante, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Un "vector" es capaz de transferir secuencias de ácido nucleico a células diana. Por ejemplo, un vector puede comprender una secuencia codificante capaz de expresarse en una célula diana. Para los fines de la presente invención, "construcción de vectores", "vector de expresión", y "vector de transferencia génica", generalmente se refieren a cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que es útil para transferir el gen de interés a las células diana. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.

Un "casete de expresión" comprende cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de cualquier transcrito de ARN, incluido el gen/secuencia codificante de interés, así como los ARN no traducidos, tales como ARNhc, microARN, ARNip, ARN antisentido y similares. Estos casetes se pueden construir en un "vector", "construcción de vectores", "vector de expresión", o "vector de transferencia de genes", para transferir el casete de expresión a las células diana. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores víricos.

Los ácido nucleicos están "unidos operativamente" cuando se pone en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una secuencia señal está unido operativamente con ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante conexión en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Los vectores de expresión contendrán un promotor que es reconocido por el leucocito autólogo, o una célula hospedadora para la expresión de ARNm, y está operativamente unido a la secuencia codificante del colágeno VII. Los promotores son secuencias sin traducir ubicadas aguas arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 pb a 1000 pb) que controlan la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico particular a la que están operativamente enlazados. Tales promotores normalmente se dividen en dos clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician mayores niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Se conoce bien un gran número de promotores, reconocidos por diversas posibles células hospedadoras. Se prefieren promotores heterólogos, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos.

La transcripción a partir de vectores en células hospedadoras de mamífero puede estar controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, hepatitis B, virus del simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina, PGK (fosfoglicerato quinasa) o un promotor de inmunoglobulina, de los promotores de choques térmicos, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación del virus SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E.

La transcripción de eucariotas superiores a menudo aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, generalmente alrededor de 10 pb a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiendo sido encontrado en 5' y 3' a la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificante. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucarióticas. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede sufrir corte y empalme en el vector de expresión en una posición 5' o 3' de la secuencia codificante, pero preferentemente se localiza en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión usados en las células hospedadoras eucariotas también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o vírico. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm.

Los vectores y sistemas para la integración de un casete de expresión en una célula son conocidos en la técnica y pueden incluir, sin limitación, vectores retrovíricos. Se encuentran disponibles diversos vectores útiles para transferir genes exógenos a células de mamífero diana. Se ha demostrado que los vectores basados en retrovirus son particularmente útiles. Se pueden usar combinaciones de retrovirus y una línea empaquetadora adecuada, en los casos donde las proteínas de la cápside serán funcionales para infectar a las células diana. Habitualmente, las células y virus se incuban durante al menos aproximadamente 24 horas en el medio de cultivo. Después, se deja que las células crezcan en el medio de cultivo durante intervalos cortos en algunas aplicaciones, por ejemplo, 24-73 horas o durante al menos dos semanas y pueden dejarse crecer durante cinco semanas o más, antes de su análisis. Los vectores retrovíricos comúnmente usados son "defectuosos", es decir, incapaces de producir proteínas víricas requeridas para una infección productiva. La replicación del vector requiere el crecimiento en la línea celular empaquetadora.

La especificidad de célula hospedadora del retrovirus se determina mediante la proteína de envoltura, env (p120). La proteína de envoltura se proporciona por la línea celular empaquetadora. Las proteínas de envoltura son de al menos tres tipos, ecotrópicas, anfotrópicas y xenotrópicas. Los retrovirus que portan proteína de envoltura anfotrópica, por ejemplo, 4070A (Danos et al, anteriormente citado), son capaces de infectar a la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, incluyendo ser humano, perro y ratón. Las líneas celulares de empaquetamiento anfotrópicas incluyen PA12 (Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431B437); PA317 (Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895B2902); GRIP (Danos et al. (1988) PNAS 85:6460B6464). Los retrovirus empaquetados con proteína de envoltura xenotrópica, por ejemplo, AKR env, son capaces de infectar a la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, excepto a las células murinas. Las secuencias en los extremos terminales 5' y 3' del retrovirus son repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés). Se conocen en la técnica varias secuencias de LTR y se pueden usar, incluida la MMLV-LTR; VIH-LTR; AKR-LTR; FIV-LTR; ALV-LTR; etc. La 5' LTR actúa como un fuerte promotor, que dirige la transcripción del gen introducido después de la integración en el genoma de una célula diana.

Queratinocitos. Se pueden recolectar queratinocitos primarios recién recolectados, aislados de una biopsia cutánea con bisturí circular y transducidos después de un período de cultivo para aislar los queratinocitos de las células dérmicas. In vitro, los queratinocitos epiteliales expandidos pueden formar una lámina. En algunas realizaciones, las células transducidas se administran al paciente en aproximadamente 1 a 100 días, 1 a 50 días, 1 a 20 días, 1 a 10 días, 1 a 5 días, 1 a 3 días, 1 a 2 días o 1 día desde el momento en que se transdujeron las células.

Cualquiera de varios medios de cultivo se puede usar en los presentes métodos como sería conocido por el experto en la materia (véase, por ejemplo, Current Protocols in Cell Culture, 2000-2009 por John Wiley y Sons, Inc.). Los medios ilustrativos también incluyen, pero sin limitación, medio de queratinocitos, que puede estar libre de suero y puede contener suplementos de queratinocitos apropiados.

La divulgación proporciona un método para tratar la epidermólisis ampollosa (EA) en un sujeto, comprendiendo el método, que consiste alternativamente esencialmente en, o que además consiste en obtener para el sujeto una población de células de la piel; corregir las células de la piel ex vivo mediante la integración de una construcción genética que codifica la proteína de colágeno humano VII (COL7A1) funcional (por ejemplo, de tipo silvestre de longitud completa); cultivar las células corregidas genéticamente para formar una lámina de queratinocitos; y trasplantar un injerto de la lámina de queratinocitos a un lecho de herida cutánea. La divulgación también se refiere al uso de una población de células de la piel para tratar la Epidermólisis ampollosa (EA) en un sujeto, en donde la población de células cutáneas se corrige mediante transducción con un virus que comprende una construcción genética que codifica una proteína de colágeno VII humano de tipo silvestre (COL7A1) de longitud completa para obtener una población de células cutáneas transducidas que tienen un número de copias del genoma provírico (NCGP) y en donde el NCGP de la población transducida de células cutáneas no es más de 3. En algunas realizaciones, las células corregidas genéticamente se cultivan en un medio DFF31 que comprende, que consiste alternativamente esencialmente en, o aún más que consiste en medio Eagle modificado de Dulbecco y medio F12. En una realización, las células de la piel se corrigen por transducción con un virus que comprende, que consiste alternativamente esencialmente en, o aún más que consiste en la construcción de expresión, en donde el virus comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o aún más consiste en retrovirus, AAV (virus adenoasociado) o lentivirus. En otra realización, el retrovirus es el virus LZRSE. En una realización, el retrovirus está pseudotipado con GalV. En una realización adicional, los queratinocitos así tratados cumplen los criterios previos a la liberación de eficacia de transducción del virus (ETV) > 50 % y número de copias del genoma provírico (NCGP) < 3. En algunas realizaciones, el NCGP es menor que 2,5, 2, 1,5 o 1. En otra realización, el NCGP está entre 3-20, 20-40, 40-60, 60-80 u 80-100. En otra realización, el NCGP es más de 100. En algunas realizaciones, la lámina de queratinocitos difiere en tamaño. Un experto en la técnica puede determinar el tamaño de la lámina de queratinocitos.

En alguna realización, el gen endógeno mutado, disfuncional o truncado de C7 se sustituye, utilizando un sistema CRISPR/Cas (o vector que codifica dicho sistema CRIPSR/Cas) tal como se describe en el presente documento y una secuencia "donadora" (por ejemplo, un ADNc de COL7A1 o gen C7 o un gen o ADNc de tipo ancho de longitud completa COL7A1) que se inserta en el gen después de la escisión dirigida. Los sistemas CRISPR/Cas se encuentran en el 40 % de las bacterias y el 90 % de las arqueas y difieren en la complejidad de sus sistemas. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 8.697.359. Los loci CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas) es una región dentro del genoma del organismo donde se integran segmentos cortos de ADN extraño entre secuencias palindrómicas de repetición corta. Estos loci se transcriben y las transcripciones de ARN ("pre-ARNcr") se procesan en ARN de CRISPR cortos (ARNcr). Hay tres tipos de sistemas CRISPR/Cas que incorporan todos estos ARN y proteínas conocidas como proteínas "Cas" (asociadas a CRISPR). Los tipos I y III tienen endonucleasas Cas que procesan los pre-ARNcr, que, cuando se procesa completamente en ARNcr, ensamblan un complejo de proteínas multi-Cas que es capaz de escindir los ácidos nucleicos que son complementarios al ARNcr. El sistema CRISPR/Cas que se une al sitio diana en una región de interés en un gen endógeno (por ejemplo, un gen endógeno o de puerto seguro, o un gen regulador o su ADN diana) en un genoma, en donde el sistema CRISPR/Cas comprende uno o más ARN guía únicos diseñados que reconocen el gen diana y un dominio funcional (por ejemplo, un dominio regulador transcripcional y/o un dominio nucleasa). En alguna realización, el sistema CRISPR/Cas tal como se describe en el presente documento se puede unir y/o escindir la región de interés (por ejemplo, el gen C7 endógeno de tejidos de EA) en una región codificante o no codificante dentro o adyacente al gen, tal como, por ejemplo, una secuencia líder, una secuencia de remolque o intrón, o dentro de una secuencia no transcrita, bien aguas arriba o aguas abajo de la región codificante. En ciertas realizaciones, el CRISPR/Cas se une y/o escinde un gen, por ejemplo, el gen C7 mutado, disfuncional o truncado.

En un aspecto, la herida está libre de queratinocitos del lecho de la herida no corregidos. En una realización, la herida se trata para extirpar los queratinocitos del lecho de la herida no corregidos. En otro aspecto, el sujeto padece epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR). En un aspecto diferente, el sujeto es un ser humano.

En otra realización, la lámina de queratinocitos está sujeta a una o más pruebas seleccionadas de un grupo que consta de prueba de ETV, prueba del p Gc N, prueba de esterilidad, prueba de endotoxinas, prueba del micoplasma, prueba de esterilidad por tinción de Gram, prueba de viabilidad de l Ea ES, prueba posterior a la liberación, prueba del RCR, ensayo de linfocitos T citotóxicos, caracterización de mAb anti-C7 LH24, microscopía electrónica, microscopía inmunoelectrónica, tinción de inmunofluorescencia, expresión de C7 y análisis de AF. En un aspecto, la tinción por inmunofluorescencia comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o aún además consiste en tinción por inmunofluorescencia directa o indirecta.

En algunas realizaciones, la lámina de queratinocitos se coloca sobre una matriz acelular, una matriz de colágeno o una malla biocompatible. En una realización, la malla biocompatible está hecha de resina termoplástica, polietileno, polietileno de peso molecular ultra alto, poliolefina de alto peso molecular, polipropileno monofilamento sin recubrimiento, poliéter éter cetona, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno, politetrafluoroetileno expandido, nailon, silicio o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las células de la piel comprenden, consisten alternativamente esencialmente en, o aún además consisten en queratinocitos. En una realización, las células de la piel comprenden, consisten alternativamente esencialmente en, o aún consisten además en células madre. En otra realización, el método comprende adicionalmente, consiste alternativamente esencialmente en, o además consiste en diferenciar las células madre en queratinocitos. En un aspecto, las células madre se diferencian antes, después o durante la transducción. En algunas realizaciones, las células madre se diferencian (por ejemplo, en queratinocitos o células epiteliales de la córnea) antes de la transducción. En algunas realizaciones, las células madre se diferencian después de la transducción. En una realización adicional, las células madre se diferencian durante la transducción.

Los pacientes con EADR pueden desarrollar con frecuencia una erosión corneal dolorosa y debilitante. Por lo tanto, en la divulgación se proporciona también un método para tratar la erosión corneal en un sujeto, comprendiendo el método, que consiste alternativamente esencialmente en, o que además consiste en obtener del sujeto una población de células corneales; corregir las células de la córnea ex vivo mediante la integración de una construcción genética que codifica la proteína de colágeno humano VII (COL7A1) funcional (por ejemplo, de tipo silvestre de longitud completa); cultivar las células corregidas genéticamente para formar una lámina de células de la córnea; y trasplantar un injerto de la lámina de células de la córnea a una superficie corneal. En algún aspecto, las células de la córnea comprenden, consisten alternativamente esencialmente en, o aún consisten además en células epiteliales de la córnea. En otro aspecto, las células de la córnea comprenden, consisten alternativamente esencialmente en, o aún consisten además en células madre. En alguna realización, el método comprende adicionalmente, consiste alternativamente esencialmente en, o además consiste en diferenciar las células madre en células epiteliales de la córnea.

En algunos aspectos de la divulgación, las células de la córnea se corrigen mediante transducción con un virus que comprende la construcción genética, en donde el virus comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o aún más consiste en retrovirus, lentivirus o AAV. En una realización, el retrovirus es el virus LZRSE. En algunas realizaciones, el retrovirus está pseudotipado con GalV. En algunas realizaciones, las células de la córnea así transducidas cumplen los criterios previos a la liberación de eficacia de transducción del virus (ETV) > 50 % y el número de copias del genoma provírico (NCGP) < 3. En algunas realizaciones, el NCGP es menor que 2,5, 2. 1,5 o 1. En otra realización, el NCGP está entre 3-20, 20-40, 40-60, 60-80 u 80-100. En otra realización, el NCGP es más de 100. En algún aspecto, el sujeto padece epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR). En un aspecto diferente, el sujeto es un ser humano.

En un aspecto, de la divulgación, la lámina de células de la córnea está sujeta a una o más pruebas seleccionadas de un grupo que consiste en la prueba de ETV, prueba del PGCN, prueba de esterilidad, prueba de endotoxinas, prueba del micoplasma, prueba de esterilidad por tinción de Gram, prueba de viabilidad de LEAES, prueba posterior a la liberación, prueba del RCR, ensayo de linfocitos T citotóxicos, caracterización de mAb anti-C7 LH24, microscopía electrónica, microscopía inmunoelectrónica, tinción de inmunofluorescencia, expresión de C7 y análisis de AF. En una realización, la tinción por inmunofluorescencia comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o aún además consiste en tinción por inmunofluorescencia directa o indirecta. En algunas realizaciones, la lámina de células de la córnea se coloca sobre una matriz acelular, la matriz de colágeno o una malla biocompatible.

En un aspecto, la malla biocompatible puede estar hecha de materiales no reabsorbibles, incluyendo, pero sin limitación, metales biocompatibles tales como aleaciones de titanio, acero inoxidable, aleaciones de cobalto-cromo y aleaciones de níquel-titanio. En otro aspecto, la lámina de malla biocompatible puede estar hecha de materiales poliméricos no reabsorbibles, incluyendo, pero sin limitación, resinas termoplásticas, polietilenos, polietileno de peso molecular ultra alto, poliolefinas de alto peso molecular, polipropileno monofilamento sin recubrimiento, poliéter éter cetona, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno, politetrafluoroetileno expandido, nailon, cualquier polímero o hidrocarburos alifáticos que contengan uno o más dobles enlaces, cualquier otro material poroso apropiado, o cualquier otro material poroso apropiado que pueda doblarse o moldearse de otra manera en una forma.

En otro aspecto, la malla biocompatible puede estar compuesta de un material polimérico reabsorbible sintético o biológico, incluyendo, pero sin limitación, ácido poliglicólico, ácido poli-L-láctico (PLLA), ácido poli-D,L-láctico (PDLA), carbonato de trimetileno (TMC), poli-£-caprolactona, poli-P-dioxanona, copolímeros de lactida y glicólido (PLGA), polihidroxi-3-butirato, colágeno, ácido hialurónico, seda, biocelulosa, otros polímeros a base de proteínas, polisacáridos, poli(carbonato DTE), poliarilatos, mezclas de PLLA, PLDA o PLGA con TMC y otras combinaciones de estos polímeros.

En una realización, la malla biocompatible está hecha de resina termoplástica, polietileno, polietileno de peso molecular ultra alto, poliolefina de alto peso molecular, polipropileno monofilamento sin recubrimiento, poliéter éter cetona, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno, politetrafluoroetileno expandido, nailon, silicio o cualquier combinación de los mismos.

También se proporciona en la presente divulgación una composición que comprende, que consiste alternativamente esencialmente en, o aún más que consiste en una lámina de queratinocitos, en donde la lámina de queratinocitos se prepara mediante un proceso que comprende, que consiste alternativamente esencialmente en, o aún más que consiste en las etapas de: obtener una población de células de la piel de un sujeto; corregir las células de la piel ex vivo mediante la integración de una construcción genética que codifica la proteína de colágeno humano VII (COL7A1) funcional (por ejemplo, de tipo silvestre de longitud completa); cultivar las células corregidas genéticamente para formar la lámina de queratinocitos. En algunas realizaciones, las células de la piel comprenden, consisten alternativamente esencialmente en, o aún además consisten en queratinocitos. En una realización, las células de la piel comprenden, consisten alternativamente esencialmente en, o aún consisten además en células madre. En otra realización, las células madre se diferencian en queratinocitos. En algunas realizaciones, las células madre se diferencian antes, después o durante la transducción.

Se proporciona además una composición farmacéutica que comprende, que consiste alternativamente esencialmente en, o aún más que consiste en una lámina de queratinocitos, comprendiendo dicha lámina de queratinocitos, que consiste alternativamente esencialmente en células de la piel o aún más, que consiste en ellas integradas ex vivo con una construcción genética que codifica una proteína COL7A1 funcional. En un aspecto, las células de la piel se obtienen de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, las células de la piel se diferencian de las células madre ex vivo integradas con la construcción genética que codifica la proteína COL7A1 funcional. En una realización, el sujeto padece EADR. En alguna realización, las células de la piel o las células madre se transducen con un virus que comprende la construcción genética, en donde el virus comprende el retrovirus, el lentivirus o el AAV.

En una realización, la proteína COL7A1 funcional es una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa. En un aspecto, la proteína funcional COL7A1 comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o aún además consiste en una modificación genética de una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa. En otro aspecto, la proteína funcional COL7A1 comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o aún además consiste en una modificación genética de una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa, en donde la modificación genética es conservativa. En un aspecto adicional, la modificación genética comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o además consiste en inserción, deleción y/o mutación.

También se proporciona en la presente divulgación una composición farmacéutica que comprende, que consiste alternativamente esencialmente en, o aún más que consiste en una lámina células de la córnea, comprendiendo dichas células de la córnea, células de la córnea integradas ex vivo con una construcción genética que codifica una proteína COL7A1 funcional. En algunas realizaciones, las células de la córnea se diferencian de las células madre ex vivo integradas con la construcción genética que codifica la proteína COL7A1 funcional. En otra realización, las células de la córnea se obtienen de un sujeto. En una realización, el sujeto padece EADR. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, las células de la córnea o las células madre se transducen con un virus que comprende la construcción genética, en donde el virus comprende el retrovirus, el lentivirus o el AAV. En una realización, el retrovirus es el virus LZRSE. En alguna realización, el retrovirus está pseudotipado con GalV. En una realización adicional, las células transducidas cumplen los criterios previos a la liberación de eficacia de transducción del virus (ETV) > 50 % y el número de copias del genoma provírico (NCGP) < 3.

En un aspecto, la proteína COL7A1 funcional es una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa.

En ciertas realizaciones, las células se cultivan durante 1-21 días. En realizaciones adicionales, las células se cultivan durante 7, 14, 21 días o más. Por lo tanto, las células se pueden cultivar en condiciones apropiadas durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o más días. Las células se vuelven a sembrar y se pueden añadir o cambiar medios y suplementos según sea necesario usando técnicas conocidas en la materia.

En ciertas realizaciones, los queratinocitos alterados genéticamente se pueden cultivar en condiciones y durante períodos de tiempo suficientes de modo que al menos el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de las células expresan el transgén C7.

En una realización, las composiciones celulares de la presente divulgación comprenden, consisten alternativamente esencialmente en, o aún más consisten en una población de queratinocitos autólogos genéticamente alterada, que expresa una proteína C7 humana natural en una cantidad eficaz para el tratamiento de la EA. Las poblaciones de células diana se cultivan en láminas para su injerto en un sujeto, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextrano, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes.

Las composiciones celulares de la presente divulgación se administran de una manera apropiada para el tratamiento de EA. La cantidad y frecuencia de administración vendrá determinada por factores tales como el estado del paciente y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis apropiadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos.

Las células se pueden administrar al sujeto mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia, normalmente en forma de injerto de piel. Un médico podrá determinar una vía de administración adecuada para un sujeto en particular basándose, en parte, en el tipo y la ubicación de la enfermedad. Las células transfectadas se pueden administrar localmente en el sitio de una herida.

La presente invención contempla preparaciones farmacéuticas de células modificadas genéticamente para su administración a un sujeto. Un experto en la materia estaría familiarizado con las técnicas para administrar células a un sujeto. Además, un experto en la materia estaría familiarizado con las técnicas y los reactivos farmacéuticos necesarios para la preparación de estas láminas de células antes de la administración a un sujeto.

En determinadas realizaciones de la presente invención, la preparación farmacéutica es una composición acuosa que comprende, consiste alternativamente esencialmente en, o aún además consiste en células manipuladas que se han modificado para sobreexpresar C7 y opcionalmente prolil-4-hidroxilasa. En ciertas realizaciones, la célula transducida se prepara utilizando células que se han obtenido del sujeto (es decir, células autólogas).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de una solución de las células transfectadas en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "preparación farmacéutica" o "composición farmacéutica" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares. En la técnica se conoce bien el uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las células, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar principios activos complementarios en las composiciones. Para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por el Centro de Biológicos de la FDA.

Un experto en la materia estaría familiarizado con las técnicas para generar soluciones estériles para su aplicación por cualquier otra vía. La determinación del tamaño del injerto celular y el número de células en el injerto la realizará un experto en la técnica. En determinados aspectos, se pueden administrar múltiples dosis durante un período de días, semanas, meses o años. Un sujeto puede recibir, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 piezas de injerto en el mismo área o en un área diferente. En una realización, el sujeto puede volver a injertarse en el mismo área o en un área diferente. En otra realización, la muestra biológica del sujeto (por ejemplo, queratinocitos o células de la córnea) se almacena en condiciones adecuadas. Una vez almacenada la muestra biológica, no es necesaria una biopsia con bisturí circular si el sujeto requiere un nuevo injerto. Las muestras biológicas almacenadas pueden proporcionar información suficiente o complementaria para determinar el injerto que necesita el sujeto.

Cuando se indica "una cantidad eficaz" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente divulgación que se administrarán se puede determinar por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso y el estado del paciente (sujeto). En general, se puede afirmar que una composición celular que comprende las células descritas en el presente documento se puede administrar en la cantidad de 1-100, 1-103, 1-104, 1-105, 1-106, 1-107, o más de 107 células, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones celulares también se pueden administrar varias veces a estas dosis. Las células se pueden administrar mediante técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). Un experto en la técnica de la medicina puede determinar fácilmente la dosificación y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente particular mediante el seguimiento del paciente para detectar signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.

En determinadas realizaciones de la presente divulgación, los queratinocitos que se manipulan genéticamente usando los métodos descritos en este documento u otros métodos conocidos en la técnica, se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes.

Ejemplos de trabajo

Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgación y descripción completa de cómo producir y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención y tampoco pretenden representar que los experimentos presentados a continuación sean todos o los únicos experimentos llevados a cabo. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio ponderal, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

La presente invención se ha descrito en términos de realizaciones particulares encontradas o propuestas por el autor de la presente invención para que comprenda modos preferidos para la práctica de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que, a la luz de la presente divulgación, pueden hacerse numerosas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin alejarse del alcance pretendido de la invención. Por ejemplo, debido a la redundancia de codones. se pueden realizar cambios en la secuencia de ADN subyacente sin afectar a la secuencia de proteínas. Además, debido a consideraciones de equivalencia funcional biológica, pueden hacerse cambios en la estructura proteica sin afectar a la acción biológica en términos de tipo o cantidad. Se pretende que todas estas modificaciones estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

Reprogramación celular de células autólogas como tratamiento para la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR).

La epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR) es una enfermedad cutánea con ampollas graves causada por mutaciones de pérdida de función de COL7A1, el gen que codifica el colágeno de tipo VII (C7). El C7 es el componente principal de las fibrillas de anclaje (FA), que estabilizan la zona de la membrana basal epidérmica (ZMB) a la dermis. El C7 realiza esta función mediante el uso de múltiples dominios, incluyendo un dominio NCl no colagenoso en amino terminal que se une a ligandos de la ZMB, un dominio de colágeno central, que se ensambla en una triple hélice y un dominio NC2, que cataliza el ensamblaje de C7 en las FA. La pérdida de estos dominios C7 funcionales en la EADR da como resultado una separación grave de la ZMB. Esto produce ampollas extensas y dolorosas, erosiones y cicatrices que a su vez pueden conducir a una forma agresiva y a menudo letal de SCC que aparece en la segunda y tercera décadas. A pesar de los avances en el diagnóstico molecular de esta enfermedad, la terapia actual se limita a los cuidados paliativos. Ensayos clínicos de fibroblastos alogénicos (Venugopal et al, J. Am. Acad. Dermatol. 2013-69 (6): 898-908), trasplante de médula ósea (Wagner et al, N. Engl. J. Med. 2010; 363 (7): 629-639), administración intradérmica e intravenosa de células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (Conget et al., Cytotherapy 2010;12(3):429-431: Petrof et al, J Investig. Dermatol. 2015;135 (9):2319-2321, Gorell et al, Pediatr. Dermatol. 2015;32 (2):220-225) y sustitutos de la piel (Falabella et al, Arch Dermatol, 2000;136(10): 1225-342) se han realizado con tasas variables de eficacia y seguridad. Los estudios preclínicos han explorado posibles modalidades de tratamiento, incluyendo C7 intravenoso y tópico, células madre pluripotentes inducidas y aminoglucósidos.

La terapia génica es una herramienta potencialmente poderosa para el tratamiento de enfermedades monogénicas tales como la EADR. Sin embargo, se plantearon serias preocupaciones de seguridad tras la transferencia de genes en pacientes con inmunodeficiencia combinada grave y síndrome de Wiskott-Aldrich. Aunque la mutagénesis insercional sigue siendo una posible preocupación, una ventaja de la terapia génica cutánea es la capacidad de evaluar clínicamente neoplasias más fácilmente debido a la colocación superficial del tejido injertado. Además, los injertos de piel modificados genéticamente se han utilizado con éxito para tratar a un paciente con EA de la unión, con corrección a largo plazo y sin efectos secundarios adversos. La plataforma para la expresión de C7 a largo plazo en la epidermis humana regenerada se estableció para ser injertada en ratones inmunodeficientes (Siprashvili et al, Hum. Gene Ther., 2010, 21(10):1299-1310). La presente divulgación ahora proporciona los resultados de un ensayo clínico de fase I de transferencia genética ex vivo de láminas epidérmicas autólogas diseñadas LZRSE-COL7A1 (LEAES) injertadas en sujetos con EADR grave.

RESULTADOS CLÍNICOS

Sujetos y tratamiento. De 38 sujetos examinados, 8 fueron consentidos en el estudio y 4 sujetos fueron inscritos y recibieron injertos (Figura 2). Los sujetos portaban varias mutaciones heterocigóticas compuestas de COL7A1 que daban como resultado la expresión de C7 truncado (dominio NC1) que se detectó en medio de queratinocitos mediante análisis por transferencia de Western (Figura 3), pero no en tejido por IIF (Figura IF, Figura 5B, 6B, 7B, 8B, 12). Todos los sujetos eran hombres, con una edad media de 23 (intervalo: 18-32), y una afectación de la superficie corporal total afectada del 4 % - 30 %. Cada uno tenía una enfermedad grave con manifestaciones extracutáneas, incluyendo antecedentes de anemia, estenosis esofágicas y pseudosindactilia (Tabla 1).

Los queratinocitos primarios de EADR se aislaron de la piel sin heridas y se transdujeron con el vector retrovírico LZRSE-COL7A1 con una eficacia media del 70 % y 0,8 copias del genoma provírico por célula (Figura 1B-D). Se injertaron en cada paciente cinco heridas con cicatrices y/o erosionadas y una herida inducida. La mayoría de las heridas crónicas injertadas habían estado presentes durante > 5 años (Tabla 3). Los 24 injertos se controlaron en serie para determinar el porcentaje de cicatrización de la herida, infección, dolor y prurito.

Eficacia. Todos los sujetos informaron de una mejora en la cicatrización de las heridas y la fuerza de la piel, así como una disminución del dolor y la picazón en los sitios del injerto. Los injertos mostraron una disminución de la formación de ampollas en comparación con el valor inicial; se muestran fotografías representativas de cada sujeto (Figura IE, Figura 5A, 6A, 7A, 8A, 12). Por el contrario, las heridas no tratadas mostraron una formación continua de ampollas (Figura 10).

1 mes después del trasplante, 20/24 heridas (83 %) mostraron > 75 % de curación, mientras que solo 4 heridas mostraron el 50 % - 74 % de curación (Tabla 3). A los 3 meses, 21/24 (87 %) heridas se curaron a > 75 %, mientras que 3/24 (13 %) fueron curadas al 50 % - 74 % (Tabla 3). A los 6 meses, 16/24 (67 %) fueron curadas a > 75 %, 5/24 (21%) fueron curadas al 50 % - 75 %, y solo 3/24 (13 %) de los sitios injertados mostraron ampollas y se consideraron fracasos del injerto (curadas al 0 % - 49 %).

Los análisis moleculares de los injertos LEAES revelaron una fuerte expresión de C7 en 9/10 (90 %) muestras a los 3 meses y en 8/12 (66 %) a los 6 meses. El análisis IIF de LEAES mostró una localización apropiada de C7 en la unión epidérmica-dérmica (Figuras IF, Figura 5B, 6B, 7 B, 8B, 12) en contraste con el control de piel sin corregir. Los injertos LEAES mostraron epidermis totalmente diferenciada con capas espinosas y granulares positivas para marcadores epidérmicos queratina 14, queratina 1 y loricrina que se asemeja a la piel normal (Figuras IF, Figura 5B, 6B, 7 B, 8B, 12). Entre las muestras negativas, C7 fue indetectable en biopsias analizadas obtenidas del sujeto 2 a los 6 meses; sin embargo, las fibrillas de anclaje (FA) estaban presentes en una biopsia paralela. A los 6 meses, se identificó C7 en el sujeto 4 usando anticuerpos específicos para el dominio NC1 (Figura iF).

Para evaluar la estructura molecular de la ZMB en muestras corregidas, las biopsias obtenidas de injertos LEAES también se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (métodos). A los 3 meses, 5/7 muestras (71%) revelaron una apariencia y frecuencia morfológicamente normales de FA reactivas a NC2 (Figuras 1G). A los 6 meses, se detectaron FA en 4/12 (33 %) biopsias, sin FA detectadas en biopsias obtenidas del sujeto 4 (Figura 1G).

Seguridad. No hubo eventos graves documentados. El prurito en el lugar del injerto (n = 3) seguido de un mayor drenaje del lugar del injerto (n = 2) fueron los eventos adversos más comunes (Grado 1 o 2) y no se observaron signos clínicos de malignidad. Los ensayos de RCR y de linfocitos T citotóxicos fueron negativos en todos los puntos temporales (Tabla 2).

Se observó un mayor drenaje de la herida en 2/24 heridas, sin embargo, no se observaron signos de infección, incluida la falta de eritema, edema, dolor o sensibilidad en los sitios. A los 6 meses, el sitio Z para el sujeto 3 tenía colonización de la herida (Grado 2) y se consideró un fallo del injerto (Tabla 3). Se observó prurito en 3/24 sitios de injerto y 2 áreas de injerto (Grado 1).

Las respuestas inmunitarias C7 se controlaron de cerca durante todo el estudio. Ningún sujeto presentó síntomas autoinmunitarios sistémicos o aumento de la formación de ampollas fuera de las áreas injertadas. En el sujeto 1, no se observaron anticuerpos en circulación o unidos a tejidos por IIF o DIF (Tabla 2). El sujeto 2 a los 3 meses mostró IgG lineal 1+ (leve), IgM, IgA, sin complemento en el análisis DIF de 2 heridas (A y E). Estos inmunorreactivos no se observaron 6 meses después del injerto. El sujeto 3 mostró una elevación transitoria de IgA sérica lineal (1:320) en el mes 3 en IIF con solo traza de tinción tisular lineal 1+ de IgM e IgA en el mes 6 en DIF. Por el contrario, el sujeto 4 reveló un título de 1:160 de anticuerpos IgG lineales en circulación en los meses 1 y 3 en IIF junto con tinción 1 a 2+ de IgG, IgA, C3 e IgM detectada en 3 injertos en el mes 3 por DIF (Tabla 2). Sin embargo, no se observaron síntomas autoinmunitarios sistémicos o aumento de la formación de ampollas fuera de los injertos y los resultados del ensayo de linfocitos T citotóxicos específicos de C7 fueron negativos. En el mes 6, los niveles séricos de anticuerpos IgG y C3 se redujeron (1:40) sin que se detectaran complejos inmunes unidos al tejido en los injertos (Tabla 2). Tras el descubrimiento de los depósitos inmunitarios lineales subepidérmicos en el sujeto 4, los presentes inventores reevaluaron los niveles iniciales de anticuerpos anti-C7 en plasma del sujeto 4 usando análisis de transferencia Western de la proteína C7 purificada. En contraste con los datos de IIF de referencia negativos, el análisis de transferencia de Western mostró que tanto el suero inicial (1:300) como el suero 3 meses después del injerto (1:1000) eran reactivos a C7 purificado, lo que indica que el sujeto 4 estaba sensibilizado al C7 exógeno antes de la colocación del injerto (Figura 11A). La reactividad del anticuerpo sérico del sujeto 4 se confirmó dentro de un fragmento de pepsina C7 en carboxilo terminal previamente caracterizado, tanto antes como después de la colocación del injerto, (Figura 11B).

Discusión. La corrección genética de EADR impone un desafío sustancial ya que requiere la administración eficaz de un gran transgén que abarque > 9 kb de ADNc de COL7A1. En este caso, la divulgación proporciona el estudio en humanos de injertos de queratinocitos epidérmicos autólogos corregidos genéticamente con una eficacia alentadora y una seguridad aceptable en 4 sujetos con EADR. Las células epidérmicas corregidas genéticamente regeneraron una epidermis funcional, autorrenovable en más del 67 % de los sitios injertados probados 6 meses después del injerto con C7 detectable hasta un año para un sujeto (Figura 12). Esta fue una mejora notable con respecto a los injertos de queratinocitos alogénicos donde solo 2/9 (22 %) de las heridas crónicas se curaron a las 18 semanas. Los injertos de LEAES también produjeron mejores resultados de curación de heridas en comparación con las inyecciones de fibroblastos alogénicos, que mostraron alguna mejora inicial en la curación de heridas, pero ninguna diferencia a largo plazo en comparación con el placebo o las inyecciones intradérmicas o intravenosas de BM-MSC. Un informe de caso de terapia génica para la epidermólisis ampollosa de la unión, utilizando una metodología similar, indicó una corrección de hasta 6 años, proporcionando precedencia para el efecto terapéutico a largo plazo. Los seis meses de expresión continua de C7 que ven los presentes inventores en sus injertos de LEAES abarcan la duración de 6 ciclos de renovación epidérmica, lo que implica que los presentes inventores han direccionado con éxito a las células madre con su técnica de transferencia de genes.

En este estudio, la curación mejorada de las heridas y el aumento de la durabilidad de la piel se asociaron directamente con la producción detectable de C7 de longitud completa y la formación de las FA en la ZMB. Aunque estaban ausentes antes del injerto, ambos estuvieron presentes en cada punto de tiempo del estudio, aunque se detectaron con una eficiencia variable: el 66-90 % para la expresión de C7 y el 33-71 % para la formación de las FA. La variabilidad de la muestra de biopsia podría atribuirse a una población heterogénea de células epidérmicas corregidas o a una captación parcial del injerto. En algunas realizaciones, el área del injerto puede ser el área donde el sujeto sintió que sería beneficioso para su calidad de vida. Sin embargo, durante los primeros días críticos de la colocación del injerto, algunas de las áreas eran difíciles de inmovilizar o proteger contra la fricción mecánica (por ejemplo, el sitio lumbar E del sujeto 2, el sitio hombro izquierdo B, Tabla 3, el sitio del hombro posterior D, Figura6A). Además, un tiempo de inmovilización más corto después del injerto, tal como se observa, puede afectar negativamente a la absorción del injerto, tal como lo indica la curación de heridas reducida en general y la ausencia de C7 detectable por IF en biopsias muestreadas a los seis meses para el sujeto 2, ya que el sujeto tuvo la inmovilización posterior al trasplante más corta en comparación con los otros participantes del estudio (Tabla 1). Además, aunque las heridas inducidas mostraron buena capacidad de curación, mostraron la menor expresión de C7. Es posible que, sin un método destructivo como la electrocauterización, los queratinocitos residuales del lecho de la herida no corregidos podrían haber interrumpido el establecimiento de los injertos LEAES suprayacentes. Estos hallazgos sugieren que las técnicas mejoradas de preparación del lecho de la herida que extirpan de manera más eficaz los queratinocitos del lecho de la herida podrían mejorar la captación del injerto.

En cuanto a seguridad, se documentaron pocos eventos adversos y los que se observaron fueron todos leves. Ningún sujeto mostró evidencia de RCR en la sangre o carcinoma de células escamosas en los injertos en ningún momento, sin embargo, se está realizando un seguimiento a largo plazo de posibles efectos adversos. Todos los enfoques de reemplazo molecular, incluida la transferencia de genes, plantean el riesgo de respuestas inmunitarias no deseadas contra el producto terapéutico, particularmente en sujetos con mutaciones nulas. En este estudio, todos los sujetos expresaron una molécula C7 truncada que contiene el dominio NC1, que se cree que es la porción antigénica de la proteína, minimizando así el riesgo de una posible reacción inmunitaria. No se observó evidencia de actividad de linfocitos T citotóxicos asociada a C7 en ningún momento en todos los sujetos durante el estudio. Sin embargo, los estudios de IIF y DIF en el sujeto 4 revelaron IgG reactiva a la ZMB al mes y a los tres meses, la fijación del complemento C3 a los tres meses con un título de IgG sérico más bajo a los seis meses después del trasplante (Tabla 2). Aunque, se ha documentado que el dominio NC1 es la porción más antigénica de C7, el dominio NC2 de carboxilo terminal también contiene epítopos antigénicos menores y la presencia de autoanticuerpos anti-C7 en pacientes con EADR se documentó ampliamente en trabajos anteriores. Los hallazgos de que el sujeto 4 tenía anticuerpos anti-C7 detectables antes del trasplante utilizando un análisis de transferencia Western que no se identificó durante el proceso de selección con un ensayo de IIF certificado por CLIA sugiere que se deben desarrollar métodos estandarizados más sensibles para evaluar la reactividad cruzada inmunitaria inicial en futuros estudios terapéuticos.

En conclusión, los injertos de piel epidérmica autóloga corregidos genéticamente mostraron un aumento de la deposición de C7 y una reducción de las ampollas en pacientes con EADR grave, una población de pacientes que tiene pocas otras opciones de tratamiento específicas. Se planean estudios más grandes que involucren a sujetos más jóvenes con EADR para evaluar la eficacia y seguridad a largo plazo de este enfoque.

Tabla 2. Criterios de valoración del inerto de tera ia énica de se uridad sistémica

Tabla 3. Características iniciales del sitio del injerto, Resultados de la respuesta clínica y del seguimiento de la i i i l1

1 Gris indica que el injerto está curado al > 75 %, Lt Horizontal indica curación del 50-74 %, negro indica curación del < 49 % según la evaluación clínica y fotográfica de los investigadores

2 ± 3 semanas

MÉTODOS

Diseño del estudio. Este es un ensayo clínico de Fase I sin enmascaramiento (NCT01263379). Los principales objetivos del estudio fueron obtener datos de seguridad y eficacia en sujetos con EADR injertados con queratinocitos autólogos genéticamente modificados transducidos con un vector retrovírico que contiene la secuencia codificante de COL7A1 de longitud completa (Figura 1A). Entre octubre de 2013 y febrero de 2015, 4 sujetos adultos de EADR fueron injertados con LEAES. Los datos de todos los sujetos se recopilan con al menos seis meses de seguimiento. Este estudio fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (IND N.° 13708) y Stanford IRB (Protocolo N.° 14563).

Sujetos. Los sujetos tenían 18 años o más y estaban diagnosticados clínicamente con EADR, tenían de 100 cm2 a 200 cm2 de áreas de erosiones abiertas adecuadas para injertos de LEAES. Los sujetos también pudieron someterse a anestesia general y fueron seleccionados basándose en un protocolo de selección en el que la EADR se confirmó mediante pruebas genéticas (GeneDx, Gaithersburg, MD). La presencia del dominio NC1 de C7 se evaluó mediante análisis por transferencia de Western de sobrenadante de queratinocitos cultivados (KC) y mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta (IIF) de muestras de biopsia de piel. La ausencia de C7 de longitud completa y FA maduras en las muestras de biopsia se confirmó mediante IIF y microscopía inmunoelectrónica (MIE) utilizando anticuerpo LH24 específico para el dominio NC2 de carboxilo terminal de c 7 (Figura 9). Las IgG, IgA, IgM y C3 en circulación y unidas a tejidos se analizaron mediante IIF utilizando suero en esófago de primates e inmunofluorescencia directa (IFD) de las secciones de biopsia del sujeto, respectivamente. Los sujetos con complicaciones médicas importantes no relacionadas con la EADR, incluido el VIH, hepatitis, infecciones sistémicas o anomalías cardíacas fueron excluidos. La anemia clínicamente significativa se trató antes del injerto.

Tratamientos de estudio. Se obtuvieron dos biopsias con bisturí circular de 8 mm para la fabricación de LEAES de áreas de piel sin heridas y sin cicatrices. Se obtuvieron muestras de sangre de referencia para CBC (hemograma completo), panel metabólico completo (PMC), así como el retrovirus competente para la replicación (RCR) y el ensayo de linfocitos T citotóxicos sensibles a C7. Se transdujeron queratinocitos autólogos derivados de biopsia de piel con LZRSE-COL7A1 y se utilizaron para producir ocho injertos de LEAES (Figura 4). Se aplicaron seis injertos a sitios de heridas no infectados, erosionados y/o con cicatrices que carecían de evidencia clínica de SCC. De seis sitios de heridas injertados (A, B, C, D, E, Z, Tabla 3), se creó una herida en cada sujeto en el momento de la cirugía por fricción mecánica ("sitio Z"). Bajo anestesia general, los lechos de las heridas se cauterizaron para minimizar la posibilidad de retención de células madre epidérmicas. Los injertos de LEAES se fijaron a los lechos de la herida mediante suturas solubles después de la preparación del lecho de la herida. Los sujetos 3 y 4 consintieron en que se les colocara un pequeño tatuaje de tinta china en la esquina de cada injerto para ayudar en la identificación del injerto de seguimiento. Los injertos se cubrieron con apósitos estándar para heridas y mupirocina tópica, que se retiraron 5-7 días después del injerto.

Criterios de valoración y evaluaciones. Los sujetos fueron seguidos a los 1, 3, 6 y 12 meses después del injerto. En cada visita del estudio, las muestras de suero se evaluaron para anticuerpos en circulación mediante IIF, para el ensayo de linfocitos T citotóxicos sensibles a C7, CBC y PMC. Se evaluó la presencia de RCR en suero a los 3 y 6 meses. En cada visita, se realizaron biopsias de injertos representativos para evaluar las inmunoglobulinas unidas al tejido y el complemento mediante IFD, expresión de C7 por IIF y presencia de fibrillas de anclaje por MIE. Las heridas se evaluaron clínicamente y se clasificaron como: curadas al 100 % - 75 % (definido como curación significativa de heridas), curadas al 74 % - 50 %, curadas al 49 % - 25 %, curadas a menos del 25 % en comparación con los valores iniciales utilizando fotografía digital y/o la cámara Canfield Vectra.

MATERIALES Y REACTIVOS

Todos los materiales y reactivos utilizados durante la fabricación de LEAES estaban libres de virus adventicios según la certificación de los análisis proporcionados por el fabricante. Cada lote de medio de cultivo de tejidos que incluía reactivos de origen bovino se probó mediante pruebas comerciales de hemadsorción 9CFR para virus adventicios (American BioResearch, Pullman, WA) y resultaron negativas.

Aislamiento y expansión de queratinocitos de EADR. Las muestras de piel se obtuvieron como dos biopsias en bisturí circular de 8 mm y se transfirieron a 35 ml de medio de recolección de biopsias 50/50A (50 % de medio de queratinocitos 154 con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (Life Technologies, Carlsbad, CA) y 50 % de medio libre de suero de queratinocitos definido con suplemento (Life Technologies, Carlsbad, CA)) con 30 pg/ml de amikacina (HIkma Pharmaceuticals, Londres, Reino Unido), 20 pg/ml de vancomicina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y 0,5 pg/ml de anfotericina B (USBiological, Salem, MA). Para separar la epidermis de la dermis, la muestra de piel se colocó en una solución de dispasa que contiene 25 unidades caseinolíticas/ml de dispasa (Life Technologies, Carlsbad, CA) durante 16-20 horas a 5 °C. Al día siguiente, la epidermis se despegó cuidadosamente de la dermis y se colocó en solución TrypLE Select 10X (Life Technologies, Carlsbad, CA) a 37 °C durante 20-30 minutos. La solución se centrifugó a 1200 rpm para obtener un sedimento de queratinocitos. Las células se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Life Technologies, Carlsbad, CA) y los queratinocitos se colocaron en placas de cultivo mimético de colágeno I PureCoat (Coming Life Sciences, Tewksbury, MA), en medio 50/50A. Después de que los queratinocitos alcanzaron un 60-70 % de confluencia, las células se trataron con TrypLE Select 10X y se sembraron para la transducción vírica. Se requirieron al menos 4x106 células para iniciar el proceso de transducción.

Corrección de queratinocitos. El virus LZRSE-COL7A1 pseudotipado GalV de grado GMPc que contiene el ADNc COL7A1 de longitud completa bajo el control del MLV LTR fue producido por la instalación de producción de vectores de la Universidad de Indiana utilizando las buenas prácticas de fabricación actuales, tal como se describe en Siprashvili et al 2010. El mapa del plásmido pLZRSE-COL7A1 se muestra en la Fig.13, con su secuencia completa mostrada en la SEQ ID NO: 1. La transducción vírica se realizó superponiendo 12 ml de sobrenadante vírico para cada placa y centrifugando las células a 1250 rpm y 32 °C durante 1 hora. Tras la centrifugación, el sobrenadante vírico se eliminó lavando con PBS y medio 50/50V utilizado para corregir la expansión de queratinocitos. La transducción se repitió según fuera necesario, siempre que el KC corregido siguiera cumpliendo los criterios previos a la liberación de eficacia de transducción del virus (ETV) > 50% y número de copias del genoma provírico (NCGP) < 3.

Pruebas previas al lanzamiento. Prueba de ETV. La prueba de ETV se realizó mediante técnicas IF con anticuerpo monoclonal anti-colágeno tipo VII NP32, NP185 o anticuerpo policlonal anti-colágeno tipo VII FNC1. Las células se fijaron en una solución de mezcla de metanol/acetona, se permeabilizó en detergente y se incubó con anticuerpo primario anti-C7 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavados extensos, se añadió el anticuerpo secundario conjugado con el colorante Alexa Flúor 555 y se incubó durante otra 1 hora. Los núcleos de células se marcaron con Hoechst 33342 durante 10 minutos, se lavaron y se montaron con reactivo antifade Prolong Gold (Life Technologies, Carlsbad, CA). La ETV se determinó contando la proporción de núcleos azules frente a células C7 positivas. Para cumplir con los criterios previos al lanzamiento, al menos el 50 % de las células fueron positivas para la expresión de C7.

Prueba de NCGP. La prueba de NCGP se realizó mediante análisis de qPCR del ADN genómico aislado de la transducción post-retrovírica de KC de la EADR corregida. El ADN genómico se purificó a partir de 3x106 células corregidas usando el kit Qiagen DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Alemania). El ADN se cuantificó utilizando técnicas espectrofotométricas estándar y se utilizó para el análisis de qPCR. La dosis provírica se determinó usando el ciclo umbral (Cu) del molde y la curva estándar de dependencia del Cu a partir de la cantidad de control de ADN plasmídico. El NCGP promedio se calculó a partir de: NCg P = (NTCP x 6,16pg)/(Cmolde X 103pg), donde, NTCP = Número total de copias provisionales. 6.16pg = Cantidad de ADN genómico en la célula somática. Cmolde. = Cantidad de molde utilizada en PCR en nanogramos. Para cumplir con los criterios previos al lanzamiento, no hubo más de 3 copias del genoma provírico en promedio para cada genoma de queratinocitos.

Prueba de esterilidad. Se analizó la esterilidad de una muestra de sobrenadante de cultivo mediante filtración por membrana utilizando el sistema Millipore Steritest, diseñado para eliminar posibles falsos negativos de los antibióticos presentes en los medios de cultivo (Pacific BioLabs, Hercules, CA). Después de la filtración y los lavados, la muestra se colocó en una caja de soja en medio de digestión y medio de tioglicolato fluido y se incubó durante 14 días. Las muestras se observaron diariamente en busca de evidencia de contaminación microbiana.

Prueba de endotoxinas. La muestra del sobrenadante cultivado se evaluó mediante el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) QCL-1000 (Lonza, Basilea, Suiza) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los resultados de esta prueba fueron <1,0 UE/ml para satisfacer los requisitos de lanzamiento del producto.

Prueba de micoplasma. Se analizó el sobrenadante del cultivo celular para detectar micoplasmas utilizando el kit de detección de micoplasmas MycoAlert (Lonza, Basilea, Suiza) de acuerdo con los requisitos del fabricante. Los resultados de esta prueba fueron < 0,9 para satisfacer los requisitos de lanzamiento del producto.

Iniciación y procesamiento de LEAES. Una vez que los queratinocitos corregidos alcanzaron el 100 % de confluencia, se inició el proceso de iniciación de LEAES y se cambió el medio de cultivo de 50/50V al medio de producción de láminas epidérmicas DFF31, que consiste en el medio Eeagle modificado de Dulbecco (Life Technologies, Carlsbad, CA) y medio F12 (Lonza, Basilea, Suiza) que contiene suero bovino fetal al 10 % (Lonza, Basilea, Suiza), 36 ng/ml de hidrocortisona (Spectrum, New Brunswick, NJ), 25 pg/ml de adenina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 5 pg/ml de insulina humana recombinante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 2 ng/ml de liotironina (Spectrum, New Brunswick, NJ), 5 pg/ml de transferrina bovina (Millipore, Billerica, MA), 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) y 30 pg/ml de amikacina (Hikma Pharmaceuticals, Londres, Reino Unido) y 20 pg/ml de vancomicina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

Ensamblaje y transporte de LEAES. El ensamblaje de LEAES se inició el día del injerto. Las láminas epidérmicas se liberaron de la superficie de la placa mediante digestión enzimática con dispasa (Life Technologies, Carlsbad, CA) durante 20-30 min a 37 °C. Para eliminar cantidades residuales de medio y dispasa, las láminas epidérmicas se lavaron al menos 5 veces con 50/50VC. Se aseguró a la gasa de petróleo del mismo tamaño con hemoclips quirúrgicos y se marcó el lado basal con una sutura negra estéril. Las LEAES ensambladas se sumergieron en medio de transporte 50/50VC y se sellaron con una película estéril permeable al gas. Los injertos epidérmicos de LEAES fueron luego transportados al quirófano para su trasplante.

Prueba de lanzamiento. Prueba de esterilidad por tinción de Gram. En el día de la liberación de LEAES, se envió una muestra de medio de cultivo al Laboratorio Clínico del Hospital de Stanford para una prueba rápida de tinción de Gram. Se utilizó un resultado negativo de la prueba como criterio de lanzamiento de lotes de LEAES.

Prueba de viabilidad de LEAES. Se realizó una prueba de viabilidad en la que la muestra de LEAES se incubó con una mezcla de tintes de núcleos que contenía Hoechst 33342 y tinción SYTOX Green durante 20 minutos. La proporción de tinte verde SYTOX frente a tinte Hoechst 33342 se calculó en > 70 % para el lanzamiento del producto.

Pruebas posteriores al lanzamiento. Se enviaron muestras del medio de cultivo y del injerto de LEAES para la prueba de envío, con la expectativa de obtener los resultados de la prueba después del trasplante del injerto debido a la larga duración del proceso de prueba. Se estableció un plan de seguridad en caso de que los resultados de las pruebas "posteriores al lanzamiento" estuvieran fuera de la memoria descriptiva. Los criterios posteriores al lanzamiento incluyeron pruebas de esterilidad adicionales (véase Prueba de esterilidad en las pruebas previas al lanzamiento), pruebas de RCR (instalación de producción de vectores de la Universidad de Indiana) y pruebas de micoplasma (Bionique Testing Laboratories, Saranac Lake, Nueva York).

Prueba de RCR. Una muestra de LEAES y sobrenadante cultivado de LEAES se sometieron al ensayo extendido de placa de células PG-4 S+L en la instalación de producción de vectores de la Universidad de Indiana siguiendo sus recomendaciones y el resultado de la prueba "sin evidencia de RCR" se utilizó como criterio de lanzamiento. Las muestras de sangre fueron analizadas al inicio, a los 3 meses y a los 6 meses por la instalación de producción de vectores de la Universidad de Indiana para determinar el nivel de secuencias de la envoltura de g AlV (GALV-E) presentes usando una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (Q-PCR). La idoneidad de la cantidad de muestra de sangre se evaluó mediante una segunda sonda y un conjunto de cebadores para las secuencias del gen de la apolipoproteína B humana. Se utilizó como control positivo una curva estándar que usa ADN genómico 12/22/15 8 que contiene 105, 104, 103, 102 y 10 copias de la secuencia de GALV-E por 0,12 |jg de ADN genómico. Los controles negativos incluyeron ADN genómico humano no transducido y agua.

Ensayo de linfocitos T citotóxicos. Se recogieron 15 ml de sangre completa al inicio, a 1 mes, 3 meses y 6 meses para el ensayo de linfocitos T citotóxicos. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de capas leucocíticas o sangre completa usando centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (GE Healthcare). A continuación, se recuperaron los monocitos adherentes después de 2 horas de incubación en placas de Petri. Los linfocitos T CD4+ y CD8+ se purificaron juntos usando kits de clasificación de células magnéticas MACS (Miltenyi Biotech), incubando las células no adherentes con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 conjugados con microperlas paramagnéticas. Se recubrieron placas de filtro de PVDF de 96 pocillos (Millipore) con anticuerpo monoclonal contra IFN-y (BD Pharmingen) o IL-4 (BD Pharmingen), bloqueado usando medio RPMI con suero AB humano al 5 % y lavado con RPMI libre de suero. Los linfocitos T CD4+ y c D8+ (2x105 células/pocillo) y monocitos irradiados con y (2,5x104 células/pocillo) se coincubaron en la placa en presencia de 20 IU/ml de IL-2 durante 40 horas a 37 °C, en una incubadora de aire humidificado, con el 5 % de CO². El medio contenía 10 jg/m l de colágeno de tipo VII recombinante o 3 jg/m l de Concanavalina A (Sigma) para estimular los linfocitos. Las placas se lavaron y se detectaron el IFN-y o IL-4 secretado por células individuales in situ haciendo reaccionar sucesivamente cada pocillo con anticuerpo monoclonal anti-IFN-Y o anti-IL-4 biotinilado (BD Pharmingen) a 1 jg/ml, seguido con una dilución a 1:1000 de fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (Roche). La detección se realizó utilizando sustrato cromogénico BCIP/NBT (Promega). La reacción se detuvo lavando con agua y se contaron los puntos usando un lector de CTL ELISPOT. Los controles negativos se ejecutaron en paralelo utilizando linfocitos T sin antígeno, y las puntuaciones correspondientes se restaron de las de las incógnitas.

Caracterización del mAb anti-C7 LH24. Se identificó previamente que el mAb LH24 reaccionaba con la membrana basal epidérmica 2. Su ausencia específica en la piel del paciente con EADR C7 nula en el estudio de los presentes inventores indicó que reconocía un epítopo en C7. Para localizar aún más la reactividad de LH24 en la molécula de C7, La reactividad de LH24 a digestiones enzimáticas de C7 que contienen los dominios NC1 y NC2 se ensayó mediante análisis por transferencia de Western. El dominio NC1 que contiene el fragmento de C7 se produjo a partir de la digestión de C7 purificado con colagenasa bacteriana altamente purificada (Worthington) tal como se describió previamente. 3 NC2 12/22/159 que contenía el fragmento C7 se produjo después de la digestión con pepsina de C7 purificado tal como se describió previamente.

Microscopía electrónica. Se preparó una biopsia con bisturí circular de piel de 3 mm para microscopía electrónica mediante inmersión en glutaraldehído al 1,5 % / paraformaldehído al 1,5 % en medio sin suero (SFM) de Dulbecco que contenía ácido tánico al 0,05 % durante un mínimo de una hora seguido de un enjuague extenso en SFM, luego post-fijación en OsO4 al 1 % durante 60 minutos. Las muestras se lavaron en SFM y luego se deshidrataron en una serie graduada de etanol al 100 %, se enjuagaron en óxido de propileno y se infiltraron en epoxi de Spurr durante un tiempo total de dos horas, se aceleraron a través de la energía de microondas. Las muestras se polimerizaron a 70 °C durante 18 horas.

Microscopía inmunoelectrónica. Se preparó una muestra de biopsia por punción cutánea de 3 mm para microscopía electrónica inmunitaria mediante enjuague extensivo en SFM y luego sumergiéndolo en anticuerpo IgM LH24 de ratón específico para la región NC2 del colágeno VII diluido a 1:5 en SFM durante la noche a 4 °C, se enjuagó extensamente en SFM, luego se incubó durante la noche a 4 °C en anti-IgM de ratón en cabra conjugado con oro coloidal ultrapequeño (Aurion) diluido a 1:3 en SFM. Después de un enjuague extenso en SFM, las muestras se expusieron a una solución de mejora de oro (Nanoprobes) durante 15 minutos en hielo, luego se calentaron rápidamente a 25 °C y se incubaron durante 5 minutos más. A continuación, las muestras se enjuagaron después con SFM helado, luego se fijaron y embebieron como anteriormente. Inmunofluorescencia indirecta (IIF): Se depositaron sueros humanos sobre el esófago de los monos y se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra la IgA, IgM, IgG y C3 de humano. La señal detectada en diluciones de anticuerpos de 1:40 y superiores se consideraron por encima del fondo.

Inmunofluorescencia directa (IFD). Se cortó tejido 12/22/1510 a 5 micrómetros y se tiñó con anticuerpos conjugados con fluoróforo para IgA, IgM, IgG, C3 y fibrinógeno de humano. Los controles normales se ejecutaron en paralelo. Expresión de C7 y análisis de AF: Se cortó una muestra de biopsia cutánea de 3 mm a 8 micrómetros y se analizó por IIF usando anticuerpo policlonal anti-FNC1 de colágeno de tipo VII (producido contra el dominio NC1 de C7) o

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una lámina de queratinocitos para su uso en el tratamiento de la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR) en un sujeto, en donde un injerto de la lámina de queratinocitos se trasplanta a un lecho de la herida de la piel en el sujeto que padece EADR y la lámina de queratinocitos se prepara mediante un proceso que comprende las etapas de:

obtener del sujeto que padece EADR una población de células cutáneas;

corregir ex vivo las células de la piel mediante la integración de una construcción genética que codifica una proteína funcional de colágeno VII (COL7A1); en donde las células cutáneas se corrigen mediante transducción con un virus que comprende la construcción genética y en donde el número de copias del genoma provírico (NCGP) de la célula cutánea transducida no es superior a 3 y, opcionalmente, inferior a 2, 1,5, 1 o 0,5 y, opcionalmente, en donde la proteína COL7A1 funcional es una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa; y cultivar las células corregidas genéticamente para formar una lámina de queratinocitos.

2. Una lámina de queratinocitos que comprende una población de células de la piel, en donde las células de la piel se transducen con un virus que comprende una construcción genética que codifica una proteína funcional de colágeno VII (COL7A1), en donde cada una de las células de la piel tiene un número de copias del genoma provírico (NCGP) de no más de 3, y opcionalmente menos de 2, 1,5, 1 o 0,5, y opcionalmente en donde la proteína COL7A1 funcional es una proteína Co L7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa.

3. La lámina para el uso de la reivindicación 1, o la lámina de la reivindicación 2, en donde el virus es un retrovirus, un AAV (virus adenoasociado) o un lentivirus.

4. La lámina para el uso o la lámina de la reivindicación 3, en donde el retrovirus es virus LZRSE.

5. La lámina para el uso o la lámina de la reivindicación 4, en donde el retrovirus está pseudotipado con GalV.

6. La lámina para el uso de la reivindicación 1 o la lámina de la reivindicación 2, en donde las células de la piel así transducidas cumplen los criterios previos al lanzamiento de eficacia de transducción del virus (ETV) > 50 %.

7. La lámina para el uso de la reivindicación 1, en donde el lecho de la herida de la piel está libre de queratinocitos del lecho de la herida no corregidos.

8. La lámina para el uso de la reivindicación 7, en donde el lecho de la herida de la piel se trata para extirpar los queratinocitos del lecho de la herida no corregidos.

9. La lámina para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-8, en donde las células son autólogas para el sujeto.

10. La lámina para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-9, en donde el sujeto es un ser humano.

11. La lámina para el uso de la reivindicación 1, o la lámina de la reivindicación 2, en donde la lámina de queratinocitos está sujeta a una o más pruebas seleccionadas de prueba de ETV, prueba del PGCN, prueba de esterilidad, prueba de endotoxinas, prueba del micoplasma, prueba de esterilidad por tinción de Gram, prueba de viabilidad de LEAES, prueba posterior a la liberación, prueba del RCR, ensayo de linfocitos T citotóxicos, caracterización de mAb anti-C7 LH24, microscopía electrónica, microscopía inmunoelectrónica, tinción de inmunofluorescencia, expresión de C7 o análisis de FA.

12. La lámina para el uso o la lámina de la reivindicación 11, en donde la tinción por inmunofluorescencia comprende tinción por inmunofluorescencia directa o indirecta.

13. La lámina para el uso de la reivindicación 1, o la lámina de la reivindicación 2, en donde la lámina de queratinocitos está colocada sobre una matriz acelular, una matriz de colágeno o una malla biocompatible.

14. La lámina para el uso o la lámina de la reivindicación 13, en donde la malla biocompatible está hecha de resina termoplástica, polietileno, polietileno de peso molecular ultra alto, poliolefina de alto peso molecular, polipropileno monofilamento sin recubrimiento, poliéter éter cetona, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno, politetrafluoroetileno expandido, nailon, silicio o cualquier combinación de los mismos.

15. La lámina para el uso de la reivindicación 1, o la lámina de la reivindicación 2, en donde las células de la piel comprenden células madre.

16. Un método para producir la lámina de queratinocitos de la reivindicación 2, que comprende

corregir ex vivo una población de células de la piel obtenidas del sujeto mediante la transducción de las células con un virus que comprende una construcción genética que codifica una proteína funcional de colágeno VII (COL7A1), en donde cada una de las células de la piel corregidas tiene un número de copias del genoma provírico (NCGP) de no más de 3, y opcionalmente menos de 2, 1,5, 1 o 0,5, y opcionalmente en donde la proteína COL7A1 funcional es una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa; y

cultivar las células corregidas genéticamente para formar la lámina de queratinocitos.

17. Una lámina de queratinocitos para su uso en el tratamiento de la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (EADR) en un sujeto, en donde un injerto de la lámina de queratinocitos se trasplanta a un lecho de la herida de la piel en el sujeto y la lámina de queratinocitos se prepara mediante un procesamiento que comprende las etapas de:

obtener del sujeto que padece EADR una población de células cutáneas;

corregir ex vivo las células de la piel mediante la integración de una construcción genética que codifica una proteína funcional de colágeno VII (COL7A1), en donde, opcionalmente, la proteína COL7A1 funcional es una proteína COL7A1 humana de tipo silvestre de longitud completa;

en donde las células de la piel se corrigen mediante transducción con un virus LZRSE-COL7A1 que comprende la construcción genética;

en donde el número de copias del genoma provírico (NCGP) de la célula de la piel transducida no es más de 3 y, opcionalmente, menos de 2, 1,5, 1 o 0,5; y

cultivar las células corregidas genéticamente para formar una lámina de queratinocitos.