CN116529361B - 使用多顺反子sox2、klf4和任选的c-myc产生诱导多能干细胞 - Google Patents

使用多顺反子sox2、klf4和任选的c-myc产生诱导多能干细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN116529361B
CN116529361B CN202080087087.4A CN202080087087A CN116529361B CN 116529361 B CN116529361 B CN 116529361B CN 202080087087 A CN202080087087 A CN 202080087087A CN 116529361 B CN116529361 B CN 116529361B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sox2
klf4
cells
cell
reprogramming
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202080087087.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116529361A (zh
Inventor
刘鹏
丁胜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd filed Critical Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd
Publication of CN116529361A publication Critical patent/CN116529361A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116529361B publication Critical patent/CN116529361B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/088—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system neural stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本文中描述了多顺反子表达盒和表达载体，其包含与编码Sox2和Klf4多肽的核酸区段可操作地连接的启动子。所述核酸区段也可以编码c‑Myc多肽。这样的多顺反子表达盒/载体在宿主细胞中的表达可将所述宿主细胞重编程成干细胞或其他类型的重编程细胞。

Description

使用多顺反子SOX2、KLF4和任选的C-MYC产生诱导多能干细胞
本申请要求于2019年10月18日提交的美国临时申请序列No.62/916,830的申请日的优先权权益，其内容通过引用整体明确地并入本文。
通过引用以Text文件提供的序列表并入
序列表作为text文件“373038WOSEQ LIST.txt”在此提供，其创建于2020年10月16日，并且大小为53,248字节。text文件的内容通过引用整体并入本文。
背景技术
首次表明分化的体细胞可以重编程成诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cell，iPSC)，其利用了四种因子的异位表达：Oct4(O)、Sox2(S)、Klf4(K)和c-Myc(M)(Takahashi和Yamanaka，2006)。多年来，Oct4一直被认为在重编程过程中不可或缺，因为其是这四个中唯一一个足以单独诱导多能性，并且其家族成员无法替代其功能(Kim et al.，2009a；Kim et al.，2009b；Nakagawa et al.，2008)。机制研究表明重编程由以下启动：三个先驱因子Oct4、Sox2和Klf4的整体协作接合，随后是全基因组表观遗传重塑和两个转录波(Chen et al.，2016；Chronis et al.，2017；Polo et al.，2012；Smith et al.，2016；Soufi et al.，2012；Sridharan et al.，2009)，这些研究强调了Oct4、Sox2和Klf4的协同效应(Chronis et al.，2017；Sridharan et al.，2009)，但没有解释为什么Oct4是独特的，并且Sox2和Klf4在这个过程中的功能仍然未被充分认识。
发明概述
本文中描述了用于通过使用多顺反子盒在细胞重编程期间精确控制因子化学计量的方法和组合物。出人意料地，本文中描述的数据表明，在不存在异位Oct4的情况下、多顺反子Sox2、Klf4和c-Myc(例如，被称为S2AK2AM多顺反子构建体)足以在数种类型的分化体细胞中建立多能性。在一些情况下，c-Myc是任选的并且使用多顺反子Sox2和Klf4(例如S2AK)是足够的。Sox2和Klf4的化学计量对于这种重编程(例如，相比于c-Myc的化学计量)更重要，因为Sox2和Klf4因子平衡的破坏导致iPSC产生显著减少或失效。全基因组研究揭示了Sox2和Klf4的协同结合，导致多能性网络的逐渐激活和建立。此外，用次级S2AK2AM胚胎成纤维细胞(2°MEF)和神经祖细胞(2°NPC)进行的平行转录组分析表明趋同性重编程轨迹和类似的效率。本文中示出的结果说明了在没有异位Oct4的情况下，Sox2和Klf4在多能性诱导中的化学计量充分性。本文中提供的数据表明了Sox2和Klf4在多能性诱导中的核心功能。
附图简述
图1A至1P示出了多顺反子S2AK2AM表达盒(表达Sox2、Klf4和Myc-C，以及在Sox2与Klf4之间以及在Klf4与Myc-C之间的2A可切割接头)将小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast，MEF)重编程成诱导多能干细胞(iPSC)。图1A示出了描绘S2AK2AM多顺反子表达系统和重编程程序的示意图。图1B示出了从S2AK2AM重编程获得的集落图像，其示出了在重编程第7天集落的EGFP表达(比例尺，100μm)。PH，相位衬度(phase contrast)。MEF表达Oct4-GFP(OG2细胞)作为多能性的标志物，其中Oct4启动子与编码增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)的区段可操作地连接。图1C示出了S2AK2AM集落的图像，其示出了在原位和第1和20代的EGFP信号(比例尺，100μm)。图1D示出了S2AK2AM诱导多能干细胞(iPSC)在Oct4启动子处显示出完全的DNA去甲基化。图1E示出了在S2AK2AM iPSC中检出了Nanog、Sox2和SSEA1蛋白(比例尺，100μm)。图1F图示性地示出了S2AK2AM iPSC中的总体基因表达与R1胚胎干细胞(ESC)的相关性。图1G示出了通过将S2AK2AMiPSC注射到植入假孕雌性体内的囊胚中产生的嵌合小鼠的图像，作为S2AK2AM iPSC是多能性的证实。图1H示出了通过四倍体互补测定建成的小鼠胚胎，该测定涉及对细胞阶段CD1(ICR)胚胎进行电融合以产生四倍体胚胎，并将S2AK2AM iPSC注射到胚胎中以形成重建的四倍体囊胚，将其植入到假孕CD1(ICR)雌性小鼠中。图1I示出了S2AK2AM iPSC有助于植入的囊胚中的生殖细胞。图1J示出了显示用于O2AS2AK2AM、O2AS2AM、O2AK2AM和S2AK2AM的另外的多顺反子盒的示意图，其中O是指Oct4，S是指Sox2，K是指Klf4，并且M是指c-Myc。图1K示出了显示当诱导表达48小时时来自O2AS2AM、O2AK2AM和S2AK2AM表达盒的MEF中的蛋白质表达的western印迹。图1L示出了在长时间暴露之后显示出多顺反子多肽在转导的MEF中的2A位点处的有效切割的western印迹。图1M-1至1M-4图示性地示出了在100,000个起始OG2 MEF中O2AS2AK2AM、O2AS2AM、O2AK2AM和S2AK2AM的14天诱导期间的Oct4-EGFP集落数。图1M-1图示性地示出了在O2AS2AK2AM诱导之后的Oct4-EGFP集落数。图1M-2图示性地示出了在O2AS2AM诱导之后的Oct4-EGFP集落数。图1M-3图示性地示出了在O2AK2AM诱导之后的Oct4-EGFP集落数。图1M-4图示性地示出了在S2AK2AM诱导之后的Oct4-EGFP集落数。图1N图示性地示出了与相同标志物的胚胎干细胞(ESC)表达相比，S2AK2AM iPSC中的多能性基因标志物表达。图1O示出了用S2AK2AM从重编程神经祖细胞(NPC)产生的EGFP阳性集落(比例尺，100μm)。图1P图示性地示出了来自神经祖细胞(NPC)重编程的S2AK2AM iPSC中的多能性基因标志物表达。
图2A至2S示出了次级S2AK2AM MEF(2°MEF)可以有效地重编程成具有多能性。图2A示出了显示由从四倍体互补测定获得的胚胎中衍生S2AK2AM 2°MEF和NPC的示意图。图2B是示出了在S2AK2AM次级(2°)MEF中多西环素诱导多蛋白表达之后在指定时间的Sox2和Klf4蛋白表达的western印迹。图2C示出了显示在2°MEF和NPC中Sox2和Klf4激活的细胞(比例尺，50μm)。图2D-1至2D-4示出了MEF在第0天和重编程的前3天期间的形态变化(比例尺，100μm)。图2D-1示出了在第0天的MEF图像。图2D-2示出了在第1天的MEF图像。图2D-3示出了在第2天的MEF图像。图2D-4示出了在第3天的MEF图像。图2E-1至2E-4图示性地示出了在重编程的前4天期间多种间充质上皮转化因子(mesenchymal epithelial transition，MET)基因的激活。图2E-1图示性地示出了在重编程的前4天期间的Cdh1激活。图2E-2图示性地示出了在重编程的前4天期间的EpCAM激活。图2E-3图示性地示出了在重编程的前4天期间的Krt8激活。图2E-4图示性地示出了在重编程的前4天期间的Ocln激活。图2F示出了当在正常ESC条件(DMSO)和AF条件(AF：含有A83-01+毛喉素的培养基)下培养时，Oct4-EGFP在2°MEF中的激活(比例尺，100μm)。图2G示出了通过流式细胞术检查的Oct4-EGFP的激活。图2H-1和2H-2图示性地示出了在MEF重编程期间Oct4和Nanog的激活。图2H-1图示性地示出了在MEF重编程期间Oct4的激活。图2H-2图示性地示出了在MEF重编程期间Nanog的激活。图2I图示性地示出了在有或没有小分子的情况下，EGFP阳性集落形成效率(A：A83-01；F：毛喉素)。将三个条件(A、F和AF)与对照样品(DMSO)进行了比较。图2J图示性地示出了在不同细胞密度下的EGFP阳性集落形成效率。图2K图示性地示出了通过初始核计数测量的EGFP阳性集落形成效率。图2L图示性地示出了通过单细胞接种测量的EGFP阳性集落形成效率。图2M示出了在重编程结束时对Oct4和Nanog蛋白免疫荧光染色的细胞。图2N图示性地示出了由S2AK2AM在2°MEF中诱导的EGFP阳性集落形成(即iPSC产生)的时间。图2E、2I和2J中的数据代表平均值+SD(n≥3)。p值通过单因素ANOVA与Bonferroni事后检验确定。*p＜0.05；**p＜0.01；ns，不显著。图2O示出了通过重编程2°MEF获得的原位和P1 iPSC集落(比例尺，100μm)。图2P图示性地示出了与胚胎干细胞(ESC)相比，S2AK2AM 2°iPSC中多能性基因标志物的表达。图2Q图示性地示出了在有或没有AF的情况下由2°NPC产生的集落数(AF：A83-01，毛喉素)。图2R图示性地示出了如在添加多西环素之前和之后通过计数细胞核数目所测量的由2°NPC形成EGFP阳性集落的效率。图2S图示性地示出了从表达S2AK2AM的2°NPC产生iPSC的时间。多西环素对多蛋白表达的诱导已在所示的天数内被去除。
图3A至3O示出了Sox2和Klf4化学计量对S2AK2AM重编程的重要性。图3A示出了显示三个因子组合S+K2AM、K+S2AM、M+S2AK和S+K+M的示意图，其中加号表示单个(“单顺反子”)因子在多顺反子因子或在其他单个(“单顺反子”)因子下表达。图3B-1和3B-2示出了用多顺反子S2AK2AM和单顺反子S+K+M表达载体转导的Sox2和Klf4免疫荧光染色细胞(比例尺，100μm)。在左图中显示的三个单细胞被放大并在右突出显示。图3B-1示出了用单独的多顺反子S2AK2AM表达载体转导的Sox2和Klf4免疫荧光染色细胞(比例尺，100μm)。图3B-2示出了用单顺反子S+K+M表达载体转导的Sox2和Klf4免疫荧光染色细胞(比例尺，100μm)。图3C-1和3C-2示出了显示在单细胞中Sox2和Klf4荧光强度的散点图。y和x轴分别代表Sox2和Klf4的强度，并且每个点代表一个细胞。RFU：相对荧光单位(relative fluorescence unit)。图3C-1示出了显示在多顺反子S2AK2AM表达载体下的单细胞中Sox2和Klf4荧光强度的散点图。图3C-2示出了显示在单顺反子S2AK2AM表达载体下的单细胞中Sox2和Klf4荧光强度的散点图。图3D图示性地示出了S2AK2AM、S+K2AM、K+S2AM、M+S2AK和S+K+M转导的细胞类型的EGFP阳性集落数。图3E是示出了在图3F中的S2AK2AM 2°MEF内用于添加Sox2(+Sox2)或Klf4(+Klf4)表达的表达盒的示意图。图3F-1至3F-3示出了显示图3E中所示的对照、+Sox2和+Klf4细胞类型的单细胞的Sox2和Klf4信号强度的散点图。y和x轴分别代表Sox2和Klf4的强度。图3F-1示出了显示单个对照细胞的Sox2和Klf4信号强度的散点图。图3F-2示出了显示添加的+Sox2下单细胞的Sox2和Klf4信号强度的散点图。图3F-3示出了显示添加的+Klf4下单细胞的Sox2和Klf4信号强度的散点图。提供了图3F-1所示的等式以指示细胞的对角分布。该等式用于测量在图3E中所示的+Sox2和+Klf4条件下倾向于高Sox2或Klf4的细胞。高Sox2和Klf4细胞的百分比示出于图3F-1至3F-3中。RFU：相对荧光单位。图3G-1和3G-2图示性地示出了在第2天表达添加的Sox2(+Sox2)或添加的Klf4(+Klf4)的细胞系中的Sox2和Klf4表达水平。图3G-1图示性地示出了在第2天表达添加的Sox2(+Sox2)的细胞系中的Sox2表达水平。图3G-2图示性地示出了在第2天表达添加的Klf4(+Klf4)的细胞系中的Klf4表达水平。图3H图示性地示出了当使用图3E所示的表达系统时在第4天时在+Sox2和+Klf4细胞中的内源性Oct4激活。图3I图示性地示出了当使用图3E所示的表达系统时，在第12天对于+Sox2和+Klf4细胞培养物每8000个细胞的EGFP阳性集落数。示出了每种细胞类型的效率。图3J示出了描绘以下三个多顺反子表达盒K2AM、S2AM、S2AK和单顺反子表达盒S+K的示意图。图3K图示性地示出了K2AM、S2AM、S2AK和S+K细胞类型的每100，000个细胞的EGFP阳性集落数，作为产生iPSC的效率的量度。图3L图示性地示出了多能性基因标志物在S2AK iPSC中的表达。R1小鼠ESC用于对照。图3M示出了由S2AK表达产生的在原位和第1代中的Oct4-EGFP集落(比例尺，100μm)。图3D、3G、3H和3I中的数据代表平均值±SD(n≥3)。p值通过单因素ANOVA与Bonferroni事后检验确定。**p＜0.01。图3N-1至3N-3示出了在所示表达系统下的单细胞的Sox2和Klf4信号强度。图3N-1示出了单一S+K2AM细胞类型的Sox2和Klf4信号强度。图3N-2示出了单一K+S2AM细胞类型的Sox2和Klf4信号强度。图3N-3示出了单一M+S2AK细胞类型的Sox2和Klf4信号强度。y轴和x轴分别代表在多西环素诱导48小时之后Sox2和Klf4的强度，并且虚线代表Sox2和Klf4染色阳性信号的阈值。还提供了共表达Sox2和Klf4的细胞的数字百分比。RFU：相对荧光单位。图3O图示性地示出了在S2AK2AM、S+K2AM、K+S2AM、M+S2AK和S+K+M培养物中表达Sox2和Klf4二者的细胞的百分比(共表达效率)。
图4A至4I示出了MEF重编程中转录转换的鉴定以及MEF和NPC重编程中的趋同轨迹(Converging Trajectory)。图4A示出了显示在不同时间点收集用于RNA测序的RNA样品的示意图。图4B示出了显示从MEF到iPSC的重编程进程的MEF重编程的主成分分析(PrincipalComponents Analysis，PCA)。示出了第0(心形)、2(星形)、4(三角形)、8(五边形)、12(菱形)天和iPSC/ESC(圆形)样品的数据。除iPSC和ESC外，每个样品都有两个重复。图4C示出了MEF重编程中间体的层次聚类分析。图4D示出了MEF重编程中间体的相关性分析。对于每个时间点，使用两个重复。图4E图示性地示出了在MEF重编程期间在连续中间体之间发现的差异表达基因(differential expressed gene，DEG)数目。图4F图示性地示出了MEF和NPC重编程轨迹的比较。将细胞投影至主成分分析(PCA)的前两个(虚线)或三个主成分。圆圈和正方形分别代表MEF和NPC重编程中间体。示出了在第0(心形)、2(星形)、8(五边形)、12(菱形)天和iPSC/ESC(圆形)的样品数据。除iPSC和ESC外，每个样品都有两个重复。图4G图示性地示出了来自MEF和NPC重编程的相同时间点的中间体之间的差异表达基因(DEG)数目。图4H示出了MEF和NPC重编程随时间推移的趋同轨迹的示意模型。图4I图示性地示出了在MEF和NPC重编程期间来自EGFP阳性和EGFP阴性群体的EGFP阳性集落的数目。在第6天时对EGFP阳性和阴性群体进行分选并重新平板接种以继续重编程。
图5A至5G示出了在MEF重编程期间去除MEF身份和激活多能性网络。图5A示出了在第0天/第2天转录转换中改变的基因的表达谱。上调和下调的基因基于其进一步的表达变化还被分成两个亚组。基因编号示于括号中。图5B-1至5B-3示出了在MEF重编程期间在第2天Thy1、Col6a2和S100s4下调。图5B-1示出了在MEF重编程期间在第2天Thy1下调。图5B-2示出了在MEF重编程期间在第2天Col6a2下调。图5B-3示出了在MEF重编程期间在第2天S100s4下调。图5C示出了在MEF重编程期间上调的基因的表达谱。所述基因根据其第一次激活翻倍的时间进一步分组。激活的多能性基因根据其显示在左侧的激活时间列在右侧。图5D示出了显示在MEF重编程期间多能性基因的激活动力学的热图。重编程期间的最高水平设置为1(100％)以进行归一化。图5E图示性地示出了如通过qPCR在不同的重编程日所验证的Oct4、Zfp296和Lin28a/b的激活。图5F示出了借助于112个多能性相关基因，MEF和NPC重编程中间体的相关性分析。来自相同时间点的细胞群用方框突出显示。图5G示出了MEF和NPC重编程的趋同轨迹的示意模型。在第0天/第2天的转录转换期间去除了原始细胞身份，并在之后逐渐建立了多能性网络。
图6A至6M示出了Sox2和Klf4协作以在S2AK2AM重编程中激活多能性网络。图6A示出了在染色体免疫沉淀实验中由Sox2和Klf4结合的峰基序的从头发现(de novodiscovery)。图6B示出了在Sox2峰中Sox2和Klf4基序的距离分析。图6C示出了如通过在第2天重编程MEF中的共免疫沉淀所验证的Sox2和Klf4的直接相互作用。图6D示出了显示Sox2和Klf4峰位点重叠的维恩图。图6E示出了指定峰组的Sox2、Klf4和H2K27乙酰化ChIP-seq信号的热图，按Sox_Klf和Sox_solo中Sox2的强度以及按Klf_solo中Klf4的强度分选。图6F示出了来自图6E中数据的Sox2、Klf4和H3K27乙酰化的信号强度的量化。图6G-1至6G-3示出了显示与Sox_Klf、Sox_solo和Klf_solo峰相关的基因的表达的箱线图。图6G-1示出了显示与Sox_Klf峰相关的基因表达的箱线图。图6G-2示出了显示与Sox_solo峰相关的基因表达的箱线图。图6G-3示出了显示与Klf_solo峰相关的基因表达的箱线图。图6H示出了显示在S2AK2AM和Sox2_tetO条件下Sox2的结合重叠的维恩图。图6I示出了在Sox2_tetO条件下具有Sox2结合峰的基序的从头发现。图6J示出了在三个不同组的Sox2结合峰中Sox2和H3K27乙酰化的信号强度的量化。Sox2_co表示S2AK2AM和Sox2_tetO条件下的共享峰，Sox_SKM表示特定于S2AK2AM重编程的峰，Sox_tetO表示特定于Sox2_tetO条件的峰。在右上角，对于上部三个图，SKM(实线)代表S2AK2AM重编程，Sox2(虚线)代表Sox2_tetO条件。在右下角，对于底部三个图，实线表示重编程第0天，虚线表示重编程第2天。图6K示出了沿17号染色体Oct4调节区的Oct4增强子的Sox2和Klf4结合以及H3K27乙酰化位点。还示出了超级增强子和ChIP-qPCR扩增子(a至i)的位置。图6L示出了如在重编程第2天通过ChIP-qPCR检查的Oct4增强子处的Sox2和Klf4结合，其中a至i如图6K所示。图6M示出了如在重编程第5天通过ChIP-qPCR检查的Oct4增强子处的Sox2和Klf4结合，其中a至i如图6K所示。
发明详述
如本文中所述，在不存在异位Oct4表达的情况下，多顺反子Sox2、Klf4和c-Myc足以在数种类型的分化体细胞中建立多能性。在一些情况下，不需要c-Myc。Sox2和Klf4的化学计量对于这种重编程是重要的，因为因子平衡的破坏导致iPSC产生显著减少或失效。为了优化Sox2和Klf4的化学计量，本文中描述了多顺反子表达盒，其包含与编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的核酸区段可操作地连接的启动子。所述核酸区段还可以包含在Sox2、Klf4和任选的c-Myc编码区之间的一个或更多个肽接头。例如，2A“自切割”肽可用作Sox2、Klf4和任选的c-Myc编码区之间的肽接头。这样的接头在Sox2、Klf4和任选的c-Myc多肽之间提供切割。例如，多顺反子表达盒的一个实例可以包含含有Sox2、Klf4和c-Myc编码区的开放阅读框，其中在Sox2与Klf4编码区之间和与Sox2和Klf4编码区框内有可切割的2A肽接头，并且其中在Klf4与c-Myc编码区之间和与Klf4和c-Myc编码区框内有2A肽接头(称为S2AK2AM)。本文中提供了可切割接头序列的实例。
“Klf多肽”是指以下中的任一种：Krüppel样因子(Krüppel-like factor，Klf)家族(即含有与果蝇(Drosophila)胚胎模式调节物Krüppel的氨基酸序列类似的氨基酸序列的锌指蛋白)的天然存在的成员，或者与最近相关的天然存在的家族成员相比，保持类似转录因子活性(至少50％、80％或90％活性内)的天然存在成员的变体，或者至少包含天然存在家族成员的DNA结合结构域，并且还可包含转录激活结构域的多肽。参见Dang，D.T.，Pevsner，J.&Yang，V.W.Cell Biol.32，1103-1121(2000)。示例性Klf家族成员包括Klf1、Klf2、Klf3、Klf-4、Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Klf10、Klf11、Klf12、Klf13、Klf14、Klf15、Klf16和Klf17。Klf2和Klf-4被发现是能够在小鼠中产生iPS细胞的因子，并且相关基因Klf1和Klf5也是如此，尽管效率降低。参见Nakagawa，et al.，Nature Biotechnology 26：101-106(2007)。在一些实施方案中，与天然存在的Klf多肽家族成员相比(例如与以上所列的那些或例如Genbank中所列的相比)，变体在其整个序列中具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如Klf1、Klf4和Klf5)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，同一物种的蛋白质将与所操作的细胞物种一起使用。
Klf4多肽可以用作在多顺反子表达盒中编码的多能性因子。例如，所使用的Klf4多肽可以具有NCBI登录号CAX16088(小鼠Klf4)、NP_004226.3(GI：194248077)(人Klf4)或NP_001300981.1(GI：930697457)(人Klf4)。人Klf4登录号NP_004226.3(GI：194248077)的序列在以下示出为SEQ ID NO：1。
SEQ ID NO：1 Klf4多肽由例如NCBI登录号Klf4 NM_004235.6下的cDNA编码。
人Klf4登录号NP_001300981.1(GI：930697457)的序列在以下示出为SEQ ID NO：2。
SEQ ID NO：2 Klf4多肽由例如NCBI登录号Klf4 NM_001314052.2下的cDNA编码。
“Sox多肽”是指以下中的任一种：特征在于存在高迁移率族(high-mobilitygroup，HMG)结构域的SRY相关HMG-box(Sox)转录因子的天然存在的成员，或者其与最近相关天然存在的家族成员相比，保持类似的转录因子活性(至少50％、80％或90％活性内)的变体，或者至少包含天然存在家族成员的DNA结合结构域，并且还可包含转录激活结构域的多肽。参见，例如，Dang，D.T.，et al.，Int.J.Biochem Cell Biol.32：1103-1121(2000)。示例性Sox多肽包括例如Sox1、Sox-2、Sox3、Sox4、Sox5、Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Sox10、Sox11、Sox12、Sox13、Sox14、Sox15、Sox17、Sox18、Sox-21和Sox30。Sox1已被表明以与Sox2类似的效率产生iPS细胞，并且基因Sox3、Sox15和Sox18也被表明产生iPS细胞，尽管其效率略低于Sox2。参见Nakagawa，et al.，Nature Biotechnology 26：101-106(2007)。在一些实施方案中，与天然存在的Sox多肽家族成员相比(例如与上文所列的那些或例如Genbank中所列的相比)，变体在其整个序列中具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸序列同一性。Sox多肽(例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox18)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，同一物种的蛋白质将与所操作的细胞物种一起使用。Sox2多肽可用作多顺反子表达盒中编码的多能性因子。
例如，在多顺反子表达盒中编码的Sox2多肽可以具有登录号CAA83435(人Sox2)，其具有以下序列(SEQ ID NO：3)。
Sox2多肽由例如NCBI登录号NM_003106.4下的cDNA编码。
“Myc多肽”是指以下中的任一种：Myc家族的天然存在的成员(参见，例如，Adhikary，S.&Eilers，M.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.6：635-645(2005))，或者其与最近相关的天然存在的家族成员相比，保持类似的转录因子活性(至少50％、80％或90％活性内)的变体，或者至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域，并且还可以包含转录激活结构域的多肽。示例性的Myc多肽包括例如c-Myc、N-Myc和L-Myc。在一些实施方案中，与天然存在的Myc多肽家族成员相比(例如与上面所列的那些或例如Genbank中所列的相比)，变体在其整个序列中具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如c-Myc)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同物种的蛋白质将与所操作的细胞物种一起使用。Myc多肽可以是多能性因子。例如，在一些情况下，Myc多肽可以是具有登录号CAA25015的人Myc多肽(人Myc)，其具有以下序列(SEQ ID NO：4)。
SEQ ID NO：4下的Myc多肽例如由NCBI登录号X00196.1下的核酸部分编码。
“Oct多肽”是指以下中的任一种：八聚体转录因子家族(Octamer family oftranscription factor)的天然存在的成员，或者其与最近相关的天然存在的家族成员相比，保持类似的转录因子活性(至少50％、80％或90％活性内)的变体，或者至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域，并且还可以包含转录激活结构域的多肽。示例性Oct多肽包括Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9和Oct-11。例如，Oct3/4(本文中被称为“Oct4”)包含POU结构域，即在Pit-1、Oct-1、Oct-2和uric-86中保守的150个氨基酸序列。参见，Ryan，A.K.&Rosenfeld，M.G.Genes Dev.11，1207-1225(1997)。在一些实施方案中，与天然存在的Oct多肽家族成员(例如与上面所列的那些或例如在Genbank登录号NP002692.2(人Oct4)或NP038661.1(小鼠Oct4)中所列的相比)，变体在其整个序列中具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如Oct3/4)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同物种的蛋白质将与所操作的细胞物种一起使用。Oct多肽可以是多能性因子。
Oct4多肽序列的一个实例可在NCBI数据库中在登录号NP002692.2(人Oct4)下获得，在以下示出为SEQ ID NO：5。
对于具有SEQ ID NO：5的人Oct4多肽的cDNA核苷酸序列可在NCBI数据库中以登录号NM_002701.4(GI：116235483)获得，其在以下示出为SEQ ID NO：6。
编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的核酸区段被连接在一起以形成更大的多顺反子核酸区段。如本文中所示，多顺反子核酸内的Sox2、Klf4和任选的c-Myc编码区的位置可以变化。在一些情况下，Klf4编码区位于Sox2和任选c-Myc编码区的5’。在另一些情况下，Sox2编码区位于Klf4和任选c-Myc编码区的5’。在一些情况下，cMyc编码区不包含在多顺反子核酸中。通常，构建多顺反子核酸以使Sox2和Klf4多肽以大约相等的水平表达。
切割位点可以被包含在编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的区段之间的框内。在Klf4、Sox2和/或c-Myc编码区之间使用的可切割肽接头可以包括，例如，2A或LP4序列(deFelipe et al.，Trends Biotechnol 24(2)：68-75(2006)；Sun et al.Processing andtargeting of proteins derived from polyprotein with 2A and LP4/2A as peptidelinkers in a maize expression system，PLOS(2017))。
可切割接头可以具有多种序列。2A介导的“自切割”机制涉及核糖体跳过在2A的C端处形成甘氨酰-脯氨酰肽键。因此，可切割接头可以在其C端连接结点处具有Gly-Pro。保守序列GDVEXNPGP(SEQ ID NO：7)(其中X是任何氨基酸)在其C端处由不同的2A接头共享，并且是用于产生空间位阻和核糖体跳过所必需的。
最先发现的2A是F2A(口蹄疫病毒)，之后鉴定出E2A(马甲型鼻炎病毒)、P2A(猪捷申病毒-12A)和T2A(thosea asigna病毒2A)。LP4接头肽来自于凤仙花(Impatiensbalsamina)种子中存在的天然多蛋白，并可在翻译后加工期间在第一与第二氨基酸之间分裂。可用于将Sox2和Klf4以及任选的c-Myc蛋白连接在一起的可切割接头的实例包括(其中N端GSG可以存在但在一些情况下可以不需要)：
P2A接头：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：8)
T2A接头：GSGEGRGSLL TCGDVEENPGP(SEQ ID NO：9)
E2A接头：GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：10)
F2A接头：GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：11)
LP4接头：SNAADEVAT(SEQ ID NO：12)
LP4/2A接头：SNAADEVATQLLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：13)
2Am1接头：APVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：14)
2Am2接头：SGSGQLLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：15)
S2AK2AM多肽的氨基酸序列的一些实例在以下示出为SEQ ID NO：16。
/>
S2AK多肽的氨基酸序列的一个实例在以下示出为SEQ ID NO：17。
细胞转化
可将编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的多顺反子核酸区段引入到细胞中以促进细胞转化成干细胞(例如，多能干细胞)或转化成其他细胞类型。编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的核酸区段可以插入到任何合适的表达系统中或与任何合适的表达系统一起使用。多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc核酸可以是包含与编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的核酸区段可操作连接的启动子区段的表达盒或表达载体的一部分。
重组表达可使用载体有效地完成。载体包括但不限于质粒、病毒核酸、病毒、噬菌体核酸、噬菌体、黏粒和人工染色体。载体还可以包含用于转录所需的其它元件(如果载体中包含标志物基因或其它蛋白质编码的区段，则翻译)。这样的表达盒和/或表达载体可以表达足够量的Sox2、Klf4和任选的c-Myc，以提高起始细胞转化成干细胞或转化成另一表型谱系细胞。
编码多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc的表达载体和/或表达盒可以包含用于驱动多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc的表达(转录)的启动子。载体可以包含与编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的多顺反子核酸区段可操作地连接的启动子。表达可以包括转录激活，其中转录在靶起始细胞中比基础水平提高10倍或更高，提高100倍或更高，例如提高1000倍或更高。
本文中使用的载体是指含有外源DNA的任何载体。因此，载体是将外源核酸转运到细胞中而不降解的试剂，并且包括在其被递送到其中的细胞中产生多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc的表达的启动子。多种原核和真核表达载体适合于携带、编码和/或表达多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc mRNA。这样的表达载体包括例如TetO-fuw、pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC、病毒和酵母菌载体。载体可以用于例如多种体内和体外情况。例如，本文中示出的一些实验工作涉及TetO-FUW载体的使用和修饰。
表达盒、表达载体和在盒或载体中的序列可以是异源的。启动子和/或其他调节区段可以与编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的多顺反子区段异源。
本文中使用的术语“异源”当用于提及表达盒、表达载体、调节序列、启动子或核酸时，是指以一些方式已被操作的表达盒、表达载体、调节序列或核酸。例如，异源启动子可以是与目的核酸区段非天然连接的启动子，或已通过细胞转化程序引入到细胞中的启动子。异源核酸或启动子还包括生物体天然拥有但已以一些方式改变(例如，置于不同的染色体位置、突变、以多个拷贝添加、与非天然启动子或增强子序列连接等)的核酸或启动子。
异源编码区可以与内源编码区区分开，例如，当异源编码区与包含调节元件(例如未发现与编码区天然缔合的启动子)的核苷酸序列连接时，或当异源编码区与自然界中不存在的染色体部分(例如，由其中编码区编码的蛋白质通常不表达的基因座中表达的基因)缔合时。类似地，异源启动子可以是与天然不与其连接的编码区连接的启动子。
可以使用的病毒载体包括与慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养性病毒、辛德毕斯病毒和其他病毒相关的病毒载体。另外，可用的是具有这些病毒特性的任何病毒家族，所述特性使其适合于用作载体。可以使用的逆转录病毒载体包括在以下中描述的那些：Verma，I.M.，Retroviral vectors forgene transfer.In MICROBIOLOGY-1985，AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY，pp.229-232，Washington，(1985)。例如，这样的逆转录病毒载体可以包括鼠马洛尼白血病病毒(Murine Maloney Leukemia virus，MMLV)，和表达期望特性的其他逆转录病毒。通常来说，病毒载体包含非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录物、对复制和衣壳化所必需的反向末端重复以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当改造为载体时，病毒通常去除早期基因中的一个或更多个，并且基因或基因/启动子盒被插入到病毒基因组中以代替去除的病毒核酸。
表达盒和/或表达载体中可以包含多种调节元件，包括启动子、增强子、翻译起始序列、转录终止序列和其他元件。
“启动子”通常是处于相对于转录起始位点相对固定的位置时发挥作用的DNA的一个序列或多个序列。例如，启动子可以位于Sox2、Klf4和(任选地)c-Myc的编码区的上游。“启动子”包含RNA聚合酶和转录因子基本相互作用所需的核心元件，并且可以包含上游元件和响应元件。“增强子”通常是指在距转录起始位点无固定距离处发挥作用的DNA序列，并且可以在转录单元的5’或3’处。此外，增强子可以在内含子内以及在编码序列本身内。其长度通常为10至300个碱基，并且其以顺式发挥作用。增强子发挥作用以提高来自附近启动子的转录。与启动子一样，增强子通常也包含介导转录调节的响应元件。增强子通常确定表达的调节。
在真核宿主细胞(例如动物、入或有核细胞)中使用的表达载体也可以包含对于终止转录所必需的，可影响mRNA表达的序列。对于mRNA，这些区域在mRNA编码组织因子蛋白的非翻译部分中转录为多腺苷酸区段。3’非翻译区还包含转录终止位点。在表达构建体中鉴定和使用包含多聚腺苷酸化信号的3’非翻译区已得到很好的证实。
来自多顺反子表达盒或表达载体的Sox2、Klf4和任选的c-Myc的表达可以由能够在原核细胞或真核细胞中表达的任何启动子控制。这样的启动子可以包括普遍作用的启动子、诱导型启动子或发育调节型启动子。普遍作用的启动子包括例如CMV-β-肌动蛋白启动子。诱导型启动子可以包括在特定细胞群中具有活性的启动子或响应于药物例如四环素或多西环素的存在的启动子。可以使用的原核启动子的一些实例包括但不限于SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子。可以使用的真核启动子的一些实例包括但不限于组成型启动子，例如病毒启动子，例如CMV、SV40和RSV启动子，以及调节型启动子，例如，诱导型或抑制型启动子，例如tet启动子、hsp70启动子和受CRE调节的合成启动子。用于细菌表达的载体包括pGEX-5X-3，以及用于真核表达的载体包括pCIneo-CMV。
表达盒或载体可以包含编码标志物产物的核酸序列。该标志物产物用于确定基因是否已被递送至细胞并且一旦递送即被表达。优选标志物基因是荧光蛋白，例如红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。大肠杆菌(E.coli)lacZ基因也可以用作标志物。在一些实施方案中，标志物可以是可选择标志物。当这样的可选择标志物被成功地转移至宿主细胞中时，如果置于选择压力下，转化的宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的独特类别的选择性方案。第一类别是基于细胞的代谢和使用缺乏独立于补充培养基生长能力的突变体细胞系。第二类别是显性选择，其是指用于任何细胞类型的选择方案并且不需要使用突变体细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞将表达传递药物抗性的蛋白质，并将在选择中存活。这样的显性选择的一些实例使用药物新霉素(Southern P.和Berg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982))，霉酚酸(Mulligan，R.C.和Berg，P.Science 209：1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.et al.，Mol.Cell.Biol.5：410-413(1985))。
基因转移可以使用遗传物质的直接转移获得，包括但不限于质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、黏粒和人工染色体，或者通过将遗传物质转移至细胞或载体(例如阳离子脂质体)中获得。这样的方法在本领域中是公知的并且很容易适合用于本文中所述的方法中。转移载体可以是用于将基因递送至细胞中的任何核苷酸构建体(例如，质粒)，或作为递送基因的一般策略的一部分，例如，作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(Ramet al.Cancer Res.53：83-88，(1993))。用于转染的合适手段，包括病毒载体、化学转染子或物理-机械方法，例如电穿孔和DNA的直接扩散被描述于例如Wolff，J.A.，et al.，Science，247，1465-1468，(1990)；和Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)。
例如，多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc核酸区段、表达盒和/或载体可以通过任何方法(包括但不限于钙介导的转化、电穿孔、显微注射、脂转染、粒子轰击等)引入至细胞。细胞可以在培养物中扩增，并随后施用于对象，例如哺乳动物，例如人。施用的细胞的量或数目可以变化，但可以使用约106至约109个细胞范围内的量。细胞通常在生理溶液例如盐水或缓冲盐水中递送。细胞也可以在载剂例如脂质体、外排体或微囊的群中递送。
可将编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的多顺反子表达盒和/或表达载体引入到起始细胞中或经受本文中所述方法的任何细胞中。例如，细胞可以与包含表达盒的病毒颗粒接触。例如，逆转录病毒和/或慢病毒适合于Sox2、Klf4和任选的c-Myc的表达。常用的逆转录病毒载体是“缺陷型的”，即不能产生用于产生性感染所需的病毒蛋白质。相反，载体的复制需要在.包装细胞系中生长。为了产生包含目的核酸的病毒颗粒，将包含目的核酸的逆转录病毒核酸通过包装细胞系包装到病毒衣壳中。不同的包装细胞系提供不同的包膜蛋白以并入到衣壳中，这种包膜蛋白确定了病毒颗粒对细胞的特异性。包膜蛋白具有至少三种类型，即嗜亲性的、双嗜性的和嗜异性的。用嗜亲性包膜蛋白包装的逆转录病毒，例如MMLV，能够感染大多数鼠细胞类型和大鼠细胞类型，并通过使用嗜亲性包装细胞系例如BOSC23(Pearet al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：8392-8396)产生。带有双嗜性包膜蛋白(例如，4070A)的逆转录病毒(Danos et al，同上)，能够感染大多数哺乳动物细胞类型，包括人、狗和小鼠，并通过使用双嗜性包装细胞系例如PA12(Miller et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5：431-437)、PA317(Miller et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6：2895-2902)、GRIP(Danos etal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：6460-6464)产生。用嗜异性包膜蛋白(例如AKR env)包装的逆转录病毒能够感染除鼠细胞外的大多数哺乳动物细胞类型。可以使用合适的包装细胞系来确保目标细胞被包装的病毒颗粒靶向。将包含表达盒的逆转录病毒载体引入到包装细胞系中的合适方法和收集由包装细胞系产生的病毒颗粒的合适方法是本领域公知的。
可以将编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的多顺反子表达盒和/或表达载体整合到细胞的基因组中，或者可以将多顺反子表达载体游离地维持将细胞重定向成干细胞谱系所需的一段时间。多能性因子的游离型引入和表达是期望的，因为哺乳动物细胞基因组不会因游离型载体的插入而改变，而且因为游离型载体随时间损失。因此，使用游离型表达载体允许短时间表达将非多能性哺乳动物细胞转化成多能性细胞所需的多能性因子，同时在期望分化成另一种细胞类型时期间避免可能的染色体突变和随后的多能性因子表达。
可以将具有编码Sox2、Klf4和任选的c-Myc的多顺反子表达盒的游离型质粒载体引入到哺乳动物细胞中，如例如在以下中所述：Yu et al.，Human induced pluripotentstem cells free of vector and transgene sequences，Science 324(5928)：797-801(2009)；美国专利申请20120076762，和Okita et al.，A more efficient method togenerate integration-free human iPS cells，NATURE METHODS 8：409-412(2011)，其内容通过引用整体明确地并入本文。
例如，多顺反子表达盒可以包含在内，并且Sox2、Klf4和任选的c-Myc可以从这样的游离型载体中表达，其具有EBNA-1(Epstein-Barr核抗原-1)和oriP或Large T和SV40ori序列，使得载体可以游离地存在和复制而不并入到染色体中。
多顺反子表达盒和/或载体可以通过技术例如脂转染、与细胞膜可渗透肽结合、脂质体转移/融合或显微注射以DNA、蛋白质或成熟mRNA的形式引入到哺乳动物细胞中。当以DNA形式时，可以使用载体例如病毒、质粒或人工染色体。病毒载体的一些实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体(例如，根据Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell，126：663-676(2006)；Takahashi，K.et al.，Cell，131：861-872(2007)；Yu，J.et al.，Science，318：1917-1920(2007))，腺病毒载体(例如，Okita K，et al.，Science 322：949(2008))，腺相关病毒载体和仙台病毒载体(Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.85：348-62，2009)，其各自内容通过引用整体并入本文。此外，可以使用的人工染色体载体的一些实例包括人人工染色体(human artificial chromosome，HAC)、酵母菌人工染色体(yeast artificialchromosome，YAC)和细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC和PAC)载体。作为质粒，可以使用针对哺乳动物细胞的质粒(例如，OkitaK，et al.，Science 322：949(2008))。载体可以包含调节序列，例如启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子和多聚腺苷酸化位点，以便可以表达多能性因子。
起始细胞
起始细胞是通过多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc表达盒或表达载体转化所靶向的细胞。
起始细胞群可以基本上来源于任何来源并且可以是异质的或同质的。术语“选择的细胞”或“选择的多个细胞”也可用于指起始细胞。在某些实施方案中，如本文中所述待转化的细胞是成体细胞，包括基本上任何可获得的成体细胞类型。例如，细胞可以是自体的或同种异体的细胞(相对于待治疗的对象或可接受细胞的对象)。在一些情况下，起始细胞是成体祖细胞或成体体细胞。在另一些实施方案中，起始细胞包括来自新生儿的任何类型的细胞，包括但不限于新生儿脐带血、祖细胞和组织来源细胞(例如，体细胞)。在一些实施方案中，起始细胞群不包括多能干细胞。在另一些实施方案中，起始细胞群可包括多能干细胞。因此，由本文中所述的多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc表达盒或表达载体转化的起始细胞群可以基本上是任何活细胞类型，特别是体细胞类型。
如本文中所示，成纤维细胞可被重编程以跨越谱系边界并直接转化成多能干细胞。然而，多顺反子表达盒和载体可用于将起始细胞转化或启动转化成另一种细胞类型。已表明来自所有三个胚层的多种细胞类型适合于通过遗传操作进行体细胞重编程，包括但不限于对肝和胃(Aoi et al.，Science 321(5889)：699-702(2008))；胰腺β细胞(Stadtfeldet al.，Cell Stem Cell 2：230-40(2008))；成熟B淋巴细胞(Hanna et al.，Cell 133：250-264(2008))；人真皮成纤维细胞(Takahashi et al.，Cell 131，861-72(2007)；Yu etal.，Science 318(5854)(2007)；Lowry et al.，Proc Natl Acad Sci USA 105，2883-2888(2008)；Aasen et al.，Nat Biotechnol 26(11)：1276-84(2008))；脑膜细胞(meningiocyte)(Qin et al.，J Biol Chem 283(48)：33730-5(2008))；神经干细胞(DiSteffano et al.，Stem Cells Devel.18(5)：(2009))；和神经祖细胞(Eminli et al.，Stem Cells 26(10)：2467-74(2008))。任何起始细胞都可以用本文中所述的多顺反子Sox2、Klf4和任选的c-Myc表达盒或表达载体转化以启动重编程成其他细胞类型。
在一些实施方案中，起始细胞可以通过在细胞培养条件下孵育来瞬时或连续地表达Sox2、Klf4和任选地c-Myc。
重编程方法
起始细胞在足以将起始细胞跨谱系和/或分化边界转化以形成干细胞，尤其是多能干细胞或可以不完全多能的去分化干细胞的条件和时间下处理。这个过程被称为“重编程”。在一些情况下，如此形成的多能干细胞或去分化细胞的可以分化成其他类型的细胞(例如，神经、心脏、胰腺、肝和其他类型的细胞，或这样的细胞的祖细胞)。
用于将起始细胞转化成诱导多能干细胞或可以不完全多能的去分化干细胞的时间可以变化。例如，可以孵育起始细胞，直至干细胞标志物表达。这样的干细胞标志物可包括Nanog、SSEA1、Oct4及其组合。在另一个实例中，可以孵育起始细胞直至不同细胞类型的标志物表达。在一些情况下，将起始细胞孵育足以形成包含所有三个胚层的畸胎瘤，或者可以产生嵌合小鼠的时间。
因此，用于将起始细胞转化成诱导多能干细胞的时间可以变化。例如，起始细胞可以在细胞培养条件下孵育持续至少约3天，或至少约4天，或至少约5天，或至少约6天，或至少约7天，或至少约8天，或至少约9天，或至少约10天，或至少约11天，或至少约12天，或至少约13天，或至少约14天，或至少约15天，或至少约16天，或至少约17天，或至少约18天，或至少约19天。
在一些实施方案中，如此形成的干细胞可以在细胞培养条件下扩增或进一步孵育约5天至约35天，或约7天至约33天，或约10天至约30天，或约12天约27天，或约15天至约25天，或约18天至约23天。
实施例示出了在本发明的开发期间进行的一些实验和获得的结果。
实施例1：材料和方法
该实施例示出了用于开发本发明的一些材料和方法。
细胞培养
将HEK293T/17细胞(女性)在补充有10％FBS的DMEM(Invitrogen)中培养。
从E13.5胚胎制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(混合性别，组合雄性和雌性胚胎以产生原代细胞)，小鼠尾尖成纤维细胞(tail tip fibroblast，TTF)(雄性)来源于14个月龄的成年雄性小鼠。将MEF和TTF在MEF培养基(补充有10％FBS和非必需氨基酸(NEAA，Invitrogen)的DMEM)中培养。
从E13.5胚胎的头部制备小鼠原代神经祖细胞(neural progenitor cell，NPC)(混合性别，组合雄性和雌性胚胎以产生原代细胞)并将其以NPC培养基(Neuralbasal培养基(Invitrogen)、2％B27(Invitrogen)、1％GlutaMAXTM(Invitrogen)、1％青霉素/链霉素(Invitrogen)、2μg/ml肝素(Sigma Aldrich)、20ng/ml bFGF(Thermo Fisher Scientific)和20ng/ml EGF(R&D))维持在经基质胶(BD，356231)包被的板上。
将小鼠ESC(雄性)和iPSC(雄性)维持在ESC培养基(具有5％ES-FBS(Invitrogen)和15％Knock Out血清替代物(KSR，Invitrogen)的Knock Out-DMEM(Invitrogen)、1％GlutaMAXTM、1％NEAA、0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma Aldrich)、10ng/ml白血病抑制因子(LIF，Millipore)、3μM CHIR99021(Selleck)和1μM PD0325901(Selleck))中的饲养层(feeder)上。
对于显微注射，将iPSC(雄性)在无饲养层N2B27条件(50％DMEM/F12(Invitrogen)、50％Neurobasal培养基、0.5％N2(Invitrogen)、1％B27、0.1mM 2-巯基乙醇、10ng/ml LIF、25μg/ml BSA(Invitrogen)、3μM CHIR99021和1μM PD0325901)下维持。
小鼠
OG2小鼠(B6；CBA-Tg(Pou5f1-EGFP)2 Mnn/J)(雄性和雌性)来自Jackson实验室(004654)。CD-1(ICR)小鼠(雄性和雌性)来自Charles River(#022)。将OG2小鼠杂交以在胚胎第13.5天时获得所得胚胎中的OG2 MEF和NPC。将14个月的雄性OG2小鼠用于TTF的衍生。
使超排卵(super-ovulate)雌性CD1(ICR)小鼠与CD1(ICR)雄性交配用于囊胚制备和进一步的显微注射实验。四倍体互补测定的E13.5胚胎用于次级MEF和NPC的衍生。
所有动物程序均经清华大学(Tsinghua University)(北京)机构动物护理和使用委员会以及中国科学院(Chinese Academy of Science)动物研究所(北京)机构动物护理和使用委员会批准。
质粒构建
本研究中产生的质粒列于表1中。
表1：产生的质粒。与STAR方法相关。
/>
TetO-FUW-OSKM(目录号20321)、TetO-FUW-Oct4(目录号20323)、TetO-FUW-Sox2(目录号20326)、TetO-FUW-Klf4(目录号20322)、TetO-FUW-c-Myc(20324)和FUW-M2rtTA(目录号20342)均来自Addgene。另见Brambrink et al.Cell Stem Cell 2：151-159(Feb.2008)。本研究中的所有质粒均基于TetO-FUW骨架。对于克隆，将骨架用适当的酶消化，并通过凝胶提取回收每个插入物(例如，Sox2、Klf4和c-Myc编码区)。使用KOD XtremeHS聚合酶(Novagen，71975-3)通过PCR扩增所有插入物，并将其使用T4连接酶或Gibson组装主混合物(NEB，E2611)连接到多顺反子表达盒中。通过酶消化和测序确定所有质粒。
病毒制备和转导
对于慢病毒制备，提前1天平板接种HEK293T细胞以达到约70％的汇合度以用于转染，VSV-G包膜表达质粒pMD2.G(Addgene，12259)和psPAX2(Addgene，12260)用于慢病毒包装。对于六孔板中的每个孔，将具有目的基因的质粒(1.8μg)与psPAX2(1.35μg)和pMD2.G(0.45μg)混合，并且3000试剂(Thermo Fisher Scientific，L3000)用于转染。在五至八小时之后，将培养基更换为新鲜的MEF培养基。在48小时时收获含有病毒的上清液，使其通过0.45μM过滤器以去除细胞碎片，并与1体积的新鲜培养基混合用于立即使用。
对于感染，将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或神经祖细胞(NPC)与慢病毒上清液在存在5μg/ml聚凝胺(Millipore)的情况下孵育8小时或过夜。在感染之后将培养基换回为MEF或NPC培养基以使细胞恢复。
小鼠胚胎成纤维细胞的衍生
E13.5胚胎用于MEF衍生。在胚胎恢复之后，在解剖显微镜下去除头部、肢和内部器官，尤其是性腺。用两个刀片将剩余的胚胎体精细地切碎并在0.05％胰蛋白酶-EDTA中消化15分钟。然后添加MEF培养基以停止胰蛋白酶消化。通过上下吹吸数次进行对组织的进一步分离。然后通过离心收集细胞并将其平板接种到15 cm培养皿上以进行扩增(第0代，P0)。使用第4代之前的MEF进行所有测试。
小鼠神经祖细胞的衍生
在实验之前一天，制备聚-D-赖氨酸(Poly-D-lysine，PDL)/层黏连蛋白包被的板用于NPC培养。简言之，将12孔培养板填充有PDL(蒸馏水中10μg/ml)并在37℃培养箱中孵育过夜。在第二天，从板孔中去除溶液。然后将孔用蒸馏水洗涤3次并风干。然后添加层黏连蛋白(在蒸馏水中5μg/ml)并在37℃培养箱中孵育4小时至过夜。在使用板之前从孔中去除层黏连蛋白。
E13.5胚胎用于NPC衍生。用解剖钳将胚胎断头。将皮肤和头骨从头部向后剥落以暴露脑。使用弯曲的镊子将整个脑取出并将其置于冷DPBS中。在用DPBS冲洗两次之后，将脑置于35cm皿中，用锋利的剪刀精细地切碎。将切碎的组织转移至15ml离心管，并用1ml0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下消化7分钟。为了停止酶促反应，向管添加5ml NPC培养基，随后离心并去除上清液。通过上下吹吸数次，用1ml NPC培养基进一步分离组织颗粒，并用70μm细胞过滤器过滤。然后将细胞置于经PDL/层黏连蛋白包被的12孔板，并在NPC培养基中培养数天。在培养期间，NPC增殖并从板中分离以形成漂浮的神经球体(P0)。然后收集球体并将其用StemPro Accutase(Thermo Fisher Scientific)消化为单个NPC。从那之后，将NPC在经基质胶包被的板上附着培养，进行随后传代。使用第4代之前的NPC进行所有测试。
小鼠尾尖成纤维细胞的衍生
对于尾尖成纤维细胞(TTF)的衍生，使用了14个月龄的成体。将尾剥皮，切成1mm小块，并在60cm皿中培养。每3天更换一半培养基，直至成纤维细胞从移植块中迁移出来。然后将细胞传代并准备使用(P1)。
iPSC系的重编程和衍生
将Oct4-GFP(OG2)MEF或TTF以10,000个细胞/cm2的密度接种到经明胶包被的板上。在转导之后，使细胞在MEF培养基中恢复24至36小时。除非另有说明，否则然后将细胞以10,000个细胞/cm2的密度重新平板接种。对于NPC，将5,000个细胞/cm2接种在经聚-D-赖氨酸(PDL)/层黏连蛋白包被的六孔板上。在转导之后，使细胞在NPC培养基中恢复24至36小时。为了开始重编程，将培养物转换至具有1μg/ml多西环素的重编程培养基(不具有Chirr99021和PD0325901的ESC培养基)。多西环素用于从多顺反子表达盒诱导蛋白质表达。多西环素的引入表示为第0天。在整个过程期间，对于前10天每隔一天更新培养基，之后每天更新培养基。从第10天，使用具有1μg/ml多西环素的ESC培养基。EGFP阳性集落通常在第12天计数，并在第16天准备进行iPSC衍生。
对于iPSC系衍生，将重编程培养物与1mg/ml胶原酶B(Roche)在37℃下孵育20分钟。在显微镜下挑取单个集落并将其在0.05％胰蛋白酶中消化5至10分钟以获得单细胞悬液。然后将细胞接种在正常ESC培养基中的饲养层上，并且这些细胞被视为第0代(P0)iPSC。
EGFP阳性集落效率的评价
为了精确计算EGFP阳性集落效率，将2°MEF或NPC接种到48孔板中。在24小时之后(第0天)，将一半的孔用Heochest 33342(Thermo Fisher Scientific)染色，并通过计数染色的细胞核记录孔中的确切细胞数。将另一半细胞转换至具有1μg/ml多西环素的重编程培养基以进一步培养。在实验期间，每隔一天更换培养基，并在第12天对EGFP阳性集落进行计数。通过将EGFP阳性集落数除以第0天记录的初始细胞数来计算最终效率。
还使用了另一种方法。将单细胞接种到具有饲养层的96孔板孔中。在第二天，将MEF培养基转换为具有1μg/ml多西环素的重编程培养基(第0天)。在重编程过程期间，每4天更换培养基，并在第16天对EGFP阳性集落数进行计数。通过将总EGFP阳性集落数除以孔数目来计算效率。
囊胚显微注射
将iPSC在没有饲养层的N2B27条件下培养。在注射当天，将细胞悬浮在囊胚注射培养基(25mM HEPES缓冲的DMEM加10％FBS，pH 7.4)中。
为了产生嵌合小鼠，使超排卵雌性CD1(ICR)小鼠(4周龄)与CD1(ICR)雄性交配。收集桑椹胚(morulae)(交配之后(post-coitum)2.5天)并将其在KSOM培养基(Millipore)中在37℃下5％CO2中培养过夜。第二天早上，准备囊胚进行iPSC注射，并且对于每个囊胚注射大约10个细胞。将经注射囊胚在KSOM培养基中在37℃下5％CO2中培养1至2小时，并随后植入到交配之后2.5天的假孕CD1(ICR)雌性小鼠的子宫中。
对于四倍体互补测定，将两个细胞阶段CD1(ICR)胚胎电融合以产生四倍体胚胎，并将大约10个iPSC注射到重建的四倍体囊胚中。将经注射囊胚在KSOM培养基中在37℃下5％CO2中培养1至2小时，并随后植入到交配之后0.5天的假孕CD1(ICR)雌性小鼠的子宫中。解剖E13.5胚胎以产生次级MEF和NPC(2°MEF和NPC)。
对于性腺的贡献，经注射胚胎在植入之后13天(E13.5)恢复。收集每个胚胎的性腺区域并在显微镜下显现EGFP信号。
次级重编程系统的检查
为了验证对重编程因子的诱导，将2°MEF和NPC以20,000个细胞/cm2的密度接种在24孔板上。在具有1μg/ml多西环素的重编程培养基中培养48小时之后，将细胞固定以进行免疫荧光染色以检测Sox2和Klf4的表达。
为了测试原始细胞密度对最终重编程效率的影响，将2°MEF和NPC分别以500个细胞/孔、1,000个细胞/孔、2.000个细胞/孔、4,000个细胞/孔的密度平板接种在12孔板中的饲养层上。如前所述对细胞进行重编程。在重编程第12天，在荧光显微镜下对EGFP阳性集落数进行计数。
为了验证重编程期间对多西环素的需求，将2°MEF和NPC以1,000个细胞/孔的密度平板接种在12孔板中的饲养层上。从第0天至第12天从重编程培养基中去除多西环素。在第16天对EGFP阳性集落数进行计数。
为了测试用小分子的重编程动力学，将2°MEF和NPC以1,000个细胞/孔的密度平板接种在12孔板中的饲养层上。将细胞在具有1μg/ml多西环素、1μM A83-01和10μM毛喉素的重编程培养基中培养12天。记录细胞形态用于重编程动力学。所有条件均一式三份重复。
早期EGFP阳性细胞的重编程
将次级(2°)MEF和NPC被接种在饲养层上并如前所述进行重编程。在重编程第6天，通过流式细胞仪对EGFP阳性和EGFP阴性细胞进行分选，并将相同数目的细胞分别重新平板接种至具有饲养层的新6孔板。将细胞在具有1μg/ml多西环素的重编程培养基中再培养另一个6天，并对EGFP阳性集落数进行计数。
畸胎瘤形成
为了产生畸胎瘤，将维持在饲养层上的iPSC转换至经基质胶包被的板，并在没有Chirr99021和PD0325901的ESC培养基中培养。然后将iPSC胰蛋白酶消化并悬浮在含有2％基质胶的培养基中。然后将1.0×106个细胞皮下注射到SCID小鼠的后肢中。在注射之后5周，将肿瘤解剖并在4％聚甲醛(Sigma Aldrich)中固定，随后进行石蜡切片和苏木精-伊红(HE)染色。
亚硫酸氢盐测序
用EpiTect Bisulfite试剂盒(Qiagen，59104)按照为培养细胞提供的方案精确地进行亚硫酸氢盐处理。使用靶向Oct4启动子的引物通过两轮PCR扩增回收的DNA，并将PCR产物与T载体pMD20(Clontech，3270)连接。对十个随机选择的克隆进行测序。使用的PCR引物列于表2中。
核型分析
在Cell Line Genetics通过分析Giemsa结合(Meisner和Johnson，2008)进行iPS细胞系的核型分析。简言之，将经历活跃分裂的iPSC在中期用0.1μg/ml秋水仙酰胺阻断。然后通过0.05％胰蛋白酶-EDTA将iPSC胰蛋白酶消化为单细胞。使用KCL低张溶液(0.075M)来重悬iPSC并通过轻轻旋转并在室温下孵育20分钟而使iPSC膨胀。随后，将iPSC在固定剂(甲醇与乙酸的v/v比为3∶1)中固定，随后制备载片以进行核型分析。
流式细胞术
根据细胞密度，用1mg/ml胶原酶B处理重编程细胞10至30分钟，随后用0.05％胰蛋白酶进行5分钟胰蛋白酶消化。然后将细胞悬浮在培养基中并通过40μm细胞过滤器过滤。在BD FACS Aria III上进行流式细胞术分析或分选。用胶原酶B处理、过滤和分选通常会导致EGFP阳性集落的产生降低30至50倍。所有数据均用FlowJo v10分析。
western印迹和定量
将细胞裂解样品或免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)样品加载到10％SDS-PAGE凝胶上进行分离，并随后转移至0.45μm硝酸纤维素膜(BioRad，1620115)。以下抗体用于免疫印迹(immuno-blotting，IB)：抗Oct4(Abcam ab19857)、抗Sox2(Millipore AB5603用于IP，Abcam ab79351用于IB)、抗Klf4(Stemgent 09-0021)和抗肌动蛋白(Santa Cruzsc-47778)。
免疫共沉淀
将次级MEF(10,000个细胞/cm2)平板接种到经明胶包被的10cm皿上，并在具有1μg/ml多西环素的重编程培养基中培养2天。将细胞用500μL冰冷的IP缓冲液(50mM Tris-HClpH 7.4、150mM NaCl、1％TritonX-100、0.1％NP-40和1.5mM EDTA)在冰上裂解20分钟。蛋白A dynabead浆液(20μL，Life Sciences Technologies，10001D)用于每次IP测试。用SDS样品缓冲液洗脱靶蛋白和co-IP蛋白以用于直接western检测。
免疫荧光染色和图像分析
将细胞用DPBS洗涤3次，并在4℃下用4％PFA固定30分钟。使用具有1％BSA的驴血清(在DPBS中10％)以在4℃下封闭1小时。在染色细胞核定位蛋白时在封闭期间添加Triton-X100(0.3％)。将抗体在具有1％BSA的DPBS中稀释。以下一抗用于染色：抗Sox2(Millipore，AB5603；Abcam，ab79351)，抗Klf4(Stemgent，09-0021；R&D，AF3158)，抗c-Myc(epitomics，1472-1)，抗Nanog(Abcam，80892)和抗SSEA-1(Stemgent，09-0095)。
用荧光显微镜(IX83，Olympus)进行单视野成像；使用CellSens Dimension拍摄和分析图像。对于多视野成像和分析，使用自动显微镜(Lionheart FX，BioTek)扫描细胞培养板。使用Gen5软件对图像进行衔接合成和分析。
RNA提取
对于培养的细胞，裂解样品，并用RNeasy Plus mini试剂盒(Qiagen，74136)和QiaShredder(Qiagen，79656)根据制造商说明提取总RNA。对于分选的细胞，收集指定时间点的样品并将其在TRIzolTM试剂(Invitrogen，15596026)中裂解。按照以下程序提取总RNA。将线性丙烯酰胺(Thermo Fisher Scientific，AM9520)添加至裂解的细胞样品以增强RNA沉淀。然后添加氯仿，并将混合物与裂解的样品一起剧烈摇动以提取RNA。在离心之后，将溶解在水相中的RNA小心转移到无RNase的管中，并与1体积的异丙醇(Sigma Aldrich)充分混合。然后将样品置于-20℃过夜以沉淀RNA。在第二天，在离心之后小心去除异丙醇，并使RNA沉淀在管底部。然后用75％乙醇洗涤RNA沉淀，以消除可能残余的微量胍。然后在离心之后通过移液管端部去除乙醇，并风干10分钟。最后，如有必要，通过上下吹吸数次将总RNA溶解在20μl无核酸酶水中。
定量PCR
为了测试基因表达水平，使用总RNA进行qPCR实验。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)进行基因组DNA消除和逆转录，并在CFX384实时PCR系统(Bio-Rad)上用iQTM SYBRGreen Supermix(Bio-Rad)进行qPCR。所有反应均一式四份进行。在Prism 7中用内置分析方法对所有数据进行统计学分析。
重编程MEF和NPC的RNA测序
使用指定时间下样品的总RNA进行测序。使用的/>UltraTMRNA Library Prep试剂盒(NEB#E7530L)根据制造商说明，产生测序文库。将总量为2μgRNA/样品用作文库制备的输入物质。将文库片段用QiaQuick PCR试剂盒(Qiagen，28106)纯化，通过Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies，CA，USA)进行品质控制，并通过qPCR进行定量。然后使用Illumina HiSeq 2500平台对文库进行测序，并产生150bp配对末端(PE150)读段。
染色质免疫沉淀
所有ChIP实验均用EZ-ChIP染色质免疫沉淀试剂盒(Millipore，17-371)遵循试剂盒提供的方案在稍作修改下进行。简言之，将15cm皿中的第0天或第2天重编程细胞(约1.0×107)用0.55ml 37％甲醛在20ml生长培养基中交联。添加1ml 2.5 M甘氨酸(20×)以淬灭未反应的甲醛。收集每个15cm板中的细胞并将其重悬于830μl裂解缓冲液中。然后在Covaris S220超声发生器上在优化的条件下将基因组DNA剪切至100至500bp的长度。对于Sox2或Klf4 ChIP，将1.0×107重编程细胞和10μg抗体用于每个实验，并且对于H3K27acChIP，使用5.0×106个重编程细胞和2μg抗体。最后，用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-up试剂盒(MAGHEREY-NAGEL，740609)回收DNA片段，并将其用于qPCR或文库制备。使用的一抗如下：抗Sox2(Millipore，AB5603)、抗Klf4(R&D，AF3158)和抗H3K27ac(Abcam，ab4729)。
用于测序的DNA文库的制备
使用用于Illumina的UltraTM II DNA Library Prep试剂盒(E7645S)根据制造商说明产生测序文库。简言之，将4ng ChIP DNA和40ng Input DNA用于文库制备。将用于Illumina的NEBNext Multiplex Oligos(集合1，NEB#E7335集合2，NEB#E7500)用于PCR扩增衔接子连接的DNA。将文库用/>Reagent试剂盒(BeckmanCoulter，Inc.#B23317)进行纯化，通过Bioanalyzer 2100进行品质控制，并通过qPCR进行定量。使用单端50bp读段在Illumina NextSeq 550AR上进行测序。
统计学分析
在GraphPad Prism 7中进行统计学分析。用每个图例中所指的方法计算n的值和显著性。数据表示为平均值±SD。*p＜0.05；**p＜0.01；ns，不显著。
RNA-Seq数据的比对和处理
在比对之前，使用FastQC去除低品质读段和包含衔接子或poly-N的那些。使用STAR(2.5.1b)对齐器中的默认参数将剩余的读段映射至组装mm9基因组。
RNA-Seq数据的聚类
为了对不同重编程时间点的样品进行聚类，使用Manhattan方法以求出距离，并随后使用hclust应用层次聚类。
差异表达基因分析
使用DESeq2 R包(1.10.1)进行两组的差异表达基因(differentially expressedgene，DEG)。DESeq2提供了用于使用基于负二项分布的模型从数字基因表达数据中确定差异表达的统计学程序。使用Beniamini和Hochberg方法调整所得P值以控制错误发现率。由DESeq2发现的具有经调整P值＜0.05的基因被指定为差异表达的。
主成分分析
用R包gmodels(2.16.2)以R进行主成分分析(PCA)。Fast.prcomp用于有效计算主成分和奇异值分解。
本体注释
使用DAVID 6.8功能注释生物信息学工具来计算重编程期间DEG的基因本体(geneontology，GO)富集(参见david.ncifcrf.gov的网站)。P值＜0.05的项目被定义为显著富集的。
SKM样品的相关性分析
在不同重编程时间下MEF或NPC样品之间的所有RNA测序数据的相关性，使用pheatmap(1.0.10)以R进行分析。使用corrplot(0.84)来分析重编程NPC与MEF之间112个多能性相关基因的相关性。
ChIP-Seq数据的比对和处理
使用Bowtie2以小鼠基因组构建mm9进行ChIP-seq读段的比对，然后用smtools通过MAPQ(0.1.19)评分过滤结果以仅保持MAPQ大于10的读段(Langmead et al.，2009)。为了鉴定相对于背景的ChIP-Seq富集区域，通过MACS2(2.1.0)使用相应的输入DNA作为每个样品的对照进行峰识别(peak calling)(Zhang et al.，2008)。使用MACS中的默认参数。以每个峰和该峰的相应输入对照计算每百万映射读段的读段(RPM)数。
基序分析
收集从MACS识别的峰区域的fasta序列，并将其用作基序查找算法MEME-Chip的输入(最大基序宽度＝30，假设每个序列有任意数目的基序)(Machanick和Bailey，2011)。
峰分布分析
使用注释工具的基因组区域富集(Genomic Regions Enrichment ofAnnotations Tool，GREAT)来分析峰分布(McLean et al.，2010)。对于每个峰，计算峰与附近基因转录起始位点(Transcription Start Site，TSS)之间的最小距离(TSS上游峰的负距离)。对来自不同样品的峰的距离分布进行比较。Bedtools用于将来自Sox2和Klf4的峰相交以鉴定共定位的(Sox_Klf)峰、Sox_solo和Klf_solo峰。
结合谱的比较
对Sox_Klf、Sox_solo和Klf_solo峰的Sox2、Klf4和H3K27乙酰化ChIP-seq信号进行分析和定量测量，按Sox_Klf和Sox_solo中Sox2的强度以及按Klf_solo中Klf4的强度分选。Ngsplots用于围绕三组峰中心创建在图6E和6F中的热图和平均剖面图(profile plot)(Shen et al.，2014)。
Sox2靶基因分析
鉴定了具有TSS在Sox_Klf、Sox_solo和Klf_solo峰的+/-5kb内的基因。进行曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)以测量每组基因的归一化读段之间差异的统计学显著性。
结合谱分析
在IGV(2.4.10)中使多能性相关区域中Sox2、Klf4和H3K27乙酰化结合峰的富集显现。进一步进行了ChIP-qPCR以检测从Oct4的第一外显子至远端增强子的Sox2和Klf4结合特性。用于qPCR的引物列于表2中。
表2：PCR引物序列
/>
/>
数据和代码可用性
RNA-seq数据和ChIP-seq数据的登录号为NCBI GEO：GSE98280。
实施例2：S2AK2AM将成纤维细胞重编程成iPSC
该实施例描述了使用多顺反子表达盒在单细胞水平上精确和方便地控制多种因子的化学计量。
用2A肽切割序列(de Felipe et al.，2006)在编码重编程因子(例如，Oct4、Klf4、Sox2和/或c-Myc)的区段之间构建多顺反子盒。最初测试了两种先驱因子的多种组合，并且c-Myc(M)包含在所有组合中，因为其据称在通过转录扩增增强重编程效率中发挥作用(Linet al.，2012；Nie et al.，2012)。
因此，多顺反子Oct4、Sox2和c-Myc(O2AS2AM)、Oct4、Klf4和c-Myc(O2AK2AM)以及Sox2、Klf4和c-Myc(S2AK2AM)均来源于先前的O2AS2AK2AM质粒(Carey et al.，2009)。将这些盒转导到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中(图1A和1J)，并通过western印迹评估蛋白质表达，确定了多顺反子肽加工的高效率(图1K至1L)。
根据广泛使用的方法，首先测试了三种组合其在OG2 MEF中诱导重编程的能力(Takahashi和Yamanaka，2006)。OG2 MEF含有内源性Oct4启动子控制下的EGFP报道子，因此EGFP信号可用作重编程效率的标志物(Szabo et al.，2002)。在2周重编程期间，在第4、7、10和14天对EGFP阳性集落进行计数。出人意料地，在S2AK2AM条件下第7天观察到EGFP阳性集落，并在第14天，每100,000个起始MEF产生了约60个EGFP阳性集落(0.06％)(图1B和1M)。该效率高于在O2AS2AM和O2AK2AM条件下观察到的效率，虽然仍比O2AS2AK2AM条件下的效率低10倍(图1M)。
S2AK2AM产生了典型的iPSC样集落，并且iPSC系来源于这些集落。当这些细胞系在ESC培养基中传代时，其形成了ESC样的半球形集落(domed colony)，并且是Oct4-EGFP阳性的，这即使在20次传代之后也保持不变(图1C)。与这种稳定的标志物表达一致，亚硫酸氢盐测序表明Oct4启动子在这些细胞中完全去甲基化(图1D)。免疫荧光分析显示这些细胞对Nanog、Sox2和SSEA1呈阳性，并且总体基因表达与R1小鼠ESC系非常类似(图1E、1F和1N)。这些数据表明，在S2AK2AM iPSC中已经建立了多能性网络。
然后这些细胞系的功能多能性通过检查其形成畸胎瘤和嵌合体的能力来测试。S2AK2AM iPSC能够形成包含所有三个胚层的畸胎瘤，并且成功用于产生嵌合小鼠(图1G)。然后使用最严格的方法，即四倍体互补测定(4N)测试这些细胞系的多能性。对于E13.5，恢复了正常的活胚胎，表明iPSC在体内正确分化成所有组织。可以在胚胎的性腺区中观察到EGFP信号(图1H和1I)，表明成功传递至种系。
实施例3：S2AK2AM将多种分化的细胞类型重编程成具有多能性
本实施例描述了举例说明S2AK2AM重编程不同细胞类型以形成多能干细胞的能力的实验。
将表达NPC标志物Nestin、Sox2和Pax6并形成神经球体的OG2神经祖细胞(NPC)用S2AK2AM转导并暴露于类似的重编程方案。OG2 MEF含有内源性Oct4启动子控制下的EGFP报道子，因此EGFP信号可用作重编程效率的标志物(Szabo et al.，2002)。在2周之后获得EGFP阳性集落，并建立了稳定的iPSC系(图1O至1P)，表明来自外胚层的细胞也可以通过S2AK2AM重编程。
接下来，检查了更分化的细胞类型OG2成年小鼠尾尖成纤维细胞(TTF)。类似地，在S2AK2AM转导和重编程方案之后，从EGFP阳性集落中获得iPSC系，并且其多能性基因表达与R1 ESC没有区别。
实施例4：S2AK2AM 2°MEF和NPC可以被有效地重编程成具有多能性
本实施例描述了S2AK2AM介导的来自通过用S2AK2AM iPSC 4N测定产生的胚胎的MEF和NPC的重编程。这些胚胎来源MEF和NPC被称为次级S2AK2AM细胞(或S2AK2AM 2°MEF和NPC)，因为这些细胞是100％iPSC来源的(图2A)。
这些2°MEF和NPC稳健地响应于多西环素。在诱导12小时之后，容易地检出Sox2和Klf4蛋白(图2B)。免疫染色显示在24小时之后2°MEF或NPC普遍地表达Sox2和Klf4(图2C)，证实了所有细胞均来源于S2AK2AM iPSC。
然后，本发明人评价了2°MEF是否可以被重编程。在2天之后，所有细胞同时发生剧烈的形态变化，其在第3天变得更加显著(图2D)。如图2E所示，观察到间充质向上皮转化(mesenchymal-to-epithelial transition，MET)基因的上调，包括Cdh1、EpCAM、Krt8和Ocln。在第4天，观察到EGFP阳性细胞簇，并且到第10天可以容易地确定iPSC样集落(图2F和2G)，这与Oct4和Nanog的上调一致，虽然在第12天Nanog水平相对较低，表明这些EGFP阳性细胞仍未完全重编程(图2H)。随着进一步培养，从这些集落中建立了2°NPC系(图2O至2P)。用2°NPC进行重编程以类似的动力学发生，除了直到2天之后，即第6天才观察到EGFP信号。
在MEF重编程期间，大约3％的细胞被重编程以形成EGFP阳性集落(图2I)。这与另一项研究中观察到的OSKM 2°重编程的效率(2％至4％)相当(Wernig et al.，2008)。本发明人还测试了是否可以通过优化培养条件来实现更高的效率。首先，两种小分子(毛喉素和A83-01)可用于通过在抑制TGF-β途径的同时激活cAMP产生来促进重编程。当将毛喉素和A83-01添加到培养基中时，观察到EGFP阳性集落提高了三倍(图2I)，而一般重编程动力学没有变化(图2F)。其次，测试了细胞密度的影响。观察到培养物中较高密度的细胞显著降低了重编程效率(图2J)。
采用优化的条件，然后精确计算产生EGFP阳性集落的效率。在重编程之前和在12之天后计数确切的细胞数。如图2K中所示，15％的细胞群导致EGFP阳性集落。重要的是，这些EGFP阳性集落中近100％在进一步培养之后对于Nanog呈阳性(图2M)，表明多能性网络的建立。作为一种替代方法，采用流式细胞术并将单细胞接种到单独孔中；从接种的288个细胞中，获得了44个集落(15.28％)，并且其中41个(14.24％)为EGFP阳性的(图2L)。
最后，检查了外源因素对MEF重编程的时间要求。从第1天至第12天去除多西环素(图2N)。EGFP阳性集落产生需要最少4天的诱导，其与最早的EGFP阳性簇的观察结果一致。在第10天之后，获得的集落数不再进一步提高。这表明10天的诱导已经达到最大集落数。
对于2°NPC也观察到了类似的结果(图2Q至2S)。总之，这些数据表明2°S2AK2AM MEF和2°S2AK2AM NPC可以很容易地以高效的方式重编程。
实施例5：S2AK2AM使Sox2和Klf4化学计量优化以进行重编程
该实施例举例说明了，除了提供Sox2、Klf4和c-Myc的同时表达之外，S2AK2AM的另一个优点是来自多顺反子盒的Sox2、Klf4和c-Myc化学计量在单细胞水平上是稳定的。
通过观察Sox2和Klf4的信号强度验证了最佳的Sox2、Klf4和c-Myc化学计量，如通过免疫染色分析的。在用S2AK2AM转导的单细胞中，Sox2和Klf4表达信号通常是等同的，其与用单独表达Sox2、Klf4和c-Myc的三个载体(S+K+M)转导的细胞中观察到的镶嵌图案(mosaic pattern)形成鲜明对比(图3B至3C)。
然后通过将一个因子移动至单顺反子盒来测试破坏因子化学计量的影响，产生了单顺反子Sox2加多顺反子Klf4和c-Myc(S+K2AM)、单顺反子Klf4加多顺反子Sox2和c-Myc(K+S2AM)和单顺反子c-Myc加多顺反子Sox2和Klf4(M+S2AK)的组合(图3A)。图3N-1至3N-3示出了在S+K2AM和K+S2AM细胞类型中Sox2和Klf4协同表达的丧失。
然后，本发明人测试了Sox2和Klf4化学计量的破坏将如何影响重编程结果。为了便于比较重编程效率，对病毒滴定进行了调整以在所有条件下实现共表达Sox2和Klf4的细胞的相当百分比(图S3C和S3D)。在重编程16天之后，在分离Sox2和Klf4时的条件下，集落数目显著地降低，相比于在S2AK2AM条件下，在S+K2AM和K+S2AM组合中分别降低了90％和80％，而在M+S2AK中，集落数目仅比对照低30％(图3N至3O)。这些结果表明因子化学计量，特别是Sox2和Klf4的化学计量对于S2AK2AM重编程是至关重要的。
本发明人还研究了Sox2和Klf4的化学计量如何通过操纵这两个因子的比例来影响S2AK2AM重编程。Sox2(+Sox2)或Klf4(+Klf4)在2°MEF中单独过表达(图3E)。由于S2AK2AM已经在这些细胞中表达，因此过表达Sox2或Klf4会导致+Sox2细胞中Sox2/Klf4的比例提高，以及在+Klf4细胞中Sox2/Klf4的比例降低，如通过单细胞荧光分析(图3F)和qPCR(图3G)所验证的。在重编程结束时，对于+Sox2条件，EGFP阳性集落数较小，而对于+Klf4条件较大(图3I)。与这些结果一致，在第4天，当Sox2过表达时，Oct4激活降低，而当Klf4过表达时，Oct4激活增强(图3H)。这些数据表明，较高的Klf4/Sox2比促进更有效的重编程。
然后，本发明人检查了多顺反子Sox2和Klf4是否足以在没有共表达c-Myc的情况下产生iPSC。将双因子组合S2AK、S2AM和K2AM用于重编程(图3J)。令人感兴趣地，仅在S2AK条件下获得了EGFP阳性集落，并建立了iPSC系(图3K至3M)。然而，当Sox2和Klf4从单顺反子质粒中分别表达时，没有产生EGFP阳性集落。这些结果再次确定了Sox2和Klf4化学计量是在将细胞重编程成具有多能性的因素。
实施例6：在2°MEF和NPC重编程期间第0天/第2天和第12天/iPSC的转录转换标志转变
该实施例描述了旨在了解转录网络如何从不同的分化谱系途径转变为多能性的实验，以深入了解S2AK2AM重编程。
由于Oct4在多能性诱导中的充分表征的功能及其在MEF和NPC重编程中的早期检出，本发明人使用内源性Oct4的激活来监测S2AK2AM重编程成多能性。如图4I所示，EGFP阳性细胞群对于产生iPSC样集落的效率远高于其EGFP阴性对应物。在第0、2、4、8和12天对细胞进行了RNA测序(RNA-seq)(图4A)。
与第0天MEF相比，在第2、4、8和12天，在重编程中间体和iPSC中检出的差异表达基因(DEG)的数目分别为1941、3523、3910、2972和3969。图4B示出了如由主成分分析(PCA)提供的从MEF至iPSC的重编程进程。不同时间点的细胞明显分离，表明这些群体在转录上是不同的。特别地，第2天的细胞远离第0天的MEF，表明重编程前2天内存在稳健的转录转换。
层次聚类使第2天至第12天的重编程中间体彼此靠近，表明在第0天与第2天(第0天/第2天)之间以及第12天与成熟iPSC(第12天/iPSC)之间发生了两个主要的转录转换(图4C)。为了验证这一点，使用了相关性分析和DEG(图4D至4E)。在第0天/第2天和第12天/iPSC转变期间观察到更大数目的DEG，并且这反映在第0天与第2天样品之间以及第12天样品与iPSC之间的低相关性。这些数据支持了第0天/第2天和第12天/iPSC转录转换的存在。
接下来，本发明人评价了在NPC重编程期间是否发生了类似的转换。因为在第4天EGFP阳性细胞是未显现的，所以仅在第8天和第12天进行了分选(图4A)。RNA-seq揭示了在重编程NPC中，DEG数目与除第4天之外所有时间点的MEF中观察到的DEG数目类似。令人感兴趣地，在NPC重编程期间还确定了第0天/第2天和第12天/iPSC的转录转换。
实施例7：MEF和NPC重编程细胞的分子轨迹是趋同性的
在MEF重编程中在第0天/第2天转换期间有699个上调基因。GO分析揭示了上皮基因的过表达，表明涉及间充质向上皮转化(MET)。令人感兴趣地，上皮基因在NPC重编程第0天/第2天转换期间上调的880个基因中也高度富集。这表明到第2天，MEF和NPC二者都在向具有上皮细胞特征的中间体重编程。这些分析表明S2AK2AM重编程可导致在两种细胞类型中在第0天/第2天转录转换之后的趋同性分子轨迹。
本发明人比较了第0天MEF和NPC的转录谱。图4G示出了2165个基因差异表达，其中1066个和1099个基因分别在MEF和NPC中高度表达。与胚胎成纤维细胞相关的生物过程在MEF中富集，而NPC富集的基因包括与神经系统发育相关的基因，确定了这两种细胞类型的原始身份。
出人意料地，在第2天，重编程MEF与NPC之间的DEG数目急剧下降了93.8％至174，表明MEF和NPC中间体的转录类似性。细胞类型在重编程过程中继续趋同，在第12天没有可检出的基因表达差异(图4G)。
PCA和相关性分析清楚地支持了细胞类型之间转录差异的消失(图4F)。从第2天开始，MEF和NPC重编程中间体聚集在一起，并基于前三个主要成分无法区分，覆盖总基因的55％。这些数据表明，通过类似基因(例如上皮基因)的显性激活，MEF和NPC重编程的分子轨迹在第0天/第2天转录转换之后趋同(图4H)。
实施例8：第0天/第2天转换去除细胞类型身份标志物
该实施例描述了控制两个转录转换的主要分子事件。
对于第0天/第2天转换，许多基因差异表达，其中在MEF中，699个上调相对于1242个下调，而在NPC中，880个上调相对于1245个下调(图5A)。在下调的基因中，71.33％(1242个中886个)和72.93％(1245个中908个)分别在MEF和NPC中其余重编程过程中沉默，表明这种抑制是诱导多能性中的关键第一步。
在MEF基因集中，基因本体(GO)分析表明下调的基因主要负责组织发育，并且组织表达分析揭示了与成纤维细胞和间充质干细胞相关的基因的富集(表3A至3B)。
表3A：图5A中所示下调的886个基因的生物过程GO分析
GO项目 P值
系统发育 1.20E-43
多细胞生物体发育 5.70E-42
解剖结构形态发生 5.90E-41
血管发育 9.10E-37
多细胞生物体发育的调节 2.40E-34
组织发育 2.60E-34
细胞运动性的调节 2.00E-33
细胞组分移动的调节 2.30E-33
表3B：具有图5A所示下调的886个基因的组织中的基因富集。
/>
这些分析表明MEF程序在第0天/第2天转换期间沉默。通过qPCR确定了成纤维细胞标志物的下调(图5B)。
类似地，在NPC重编程中，908个下调基因主要与神经系统发育相关，包括Nestin、Lhx2、Nlgn1等。在脑、下丘脑和小脑中表达的基因过表达。因此，通过MEF和NPC二者的重编程，我们的数据表明原始细胞身份的去除标志着第0天/第2天的转录转换。
实施例9：驱动MEF和NPC重编程的多能性网络逐步激活
该实施例通过显示多能性基因表达显著上调来示出在S2AK2AM重编程期间如何建立多能性网络。
在MEF重编程成iPSC期间，1615个基因上调。将这些基因基于其达到两倍上调阈值的时间分组，并且建立了基因进行性激活的模式(图5C)。如图5D所示，Lin28a、Lin28b、Zfp296、Sox21和Cdh1早在第2天就已经上调，并且到第4天，另外三个多能性因子Oct4、Utf1和Zsacn10的表达升高。这些结果通过qPCR分析得到确定(图5E)。到第8天，一大组多能性因子升高，包括Nanog、Sall4、Zfp42、Fgf4、Nr5a2、Dppa5/4/3、Esrrb、Tcl1、Tdgf1、Gdf3、Tex19.1、Fbxo15，并且到第12天，还有一些基因也被激活(例如，Nodal、Dppa2、Eras、Tet1和Dnmt3l)。这些基因显示出逐渐激活流(图5D)。
对NPC重编程进行了类似的分析。到第4天，Lin28a、Lin28b、Zfp296、Cdh1、Oct4、Zscan10上调。在那之后，Nanog、Sall4、Tcl1、Fgf4、Zpf42、Gdf3、Utf1、Fbxo15、Esrrb、Dppa4/5和Nodal在第8天激活。到第12天发现激活了一些基因，包括Tdgf1、Dppa3、Eras和Tex19.1。该列表与MEF重编程的列表类似，其中主要激活了Oct4、Lin28a/b、Zfp296和Chd1，随后是一组其他关键多能性因子。这些观察表明，与原始细胞身份无关，多能性网络在MEF和NPC重编程期间以类似的方式逐渐建立。
为了进一步验证MEF和NPC中多能性激活的类似动力学，选择了112个多能性相关基因，并平行比较了其在MEF和NPC重编程中间体中的表达水平。该相关性分析揭示，每个时间点的中间体高度类似(图5F)，表明在MEF和NPC重编程中多能性建立的共享机制(图5G)。
在第12天/iPSC转换方面，图5F示出了大多数关键多能性基因在这个时间点在MEF和NPC重编程中进一步上调。这些数据验证了多能性网络在第12天/iPS转录转换期间是稳定和成熟的。
实施例10：Sox2和Klf4协同结合并激活其靶标
该实施例示出了Sox2和Klf4的基因组结合模式，其举例说明了S2AK2AM如何促进重编程。
对第2天重编程的MEF进行染色质免疫沉淀随后测序(ChIP-seq)。过表达的蛋白质倾向于在整个基因组中混杂地结合，因此为捕获真正的结合事件，进行了两个独立的实验，并且在本研究中仅使用了一致观察到的那些峰(Sox2为31236，Klf4为1175)。从头基序发现表明，Sox2和Klf4基序在免疫沉淀的DNA片段中高度富集，验证了我们实验的有效性(图6A)。尽管Sox2和Klf4结合的基因组分布在重编程细胞中与ESC中的类似，但在占据的位点之间几乎没有重叠，表明过表达的Sox2和Klf4在早期重编程期间几乎无法接近其ESC靶标。
令人感兴趣地，Klf4基序在Sox2峰中过表达，反之亦然(图6A)。Klf4基序出现在约一半Sox2峰中，而Sox2基序出现在20％Klf4峰中。如图所示。本发明人发现杂合基序出现在Sox2和Klf4二者结合区域中，其在30个碱基对内包含至少一个Sox2和一个Klf4基序。此外，Sox2和Klf4基序倾向于彼此接近(图6B)。总之，这些数据表明Sox2和Klf4与其靶标协同地结合。事实上，本发明人通过免疫共沉淀确定了Sox2和Klf4的直接相互作用(图6C)。
为了进一步研究其协同性，分析了基因组中Sox2和Klf4的全局共定位(globalcolocalization)。约80％的Klf4峰与Sox2结合(Sox_Klf峰)(图6D)。对于称作仅Sox2或Klf4结合的峰(Sox_solo或Klf_solo峰)，我们仍然分别观察到低水平的Klf4或Sox2富集(图6E)。这通过信号强度的量化得到确定(图6F)。这一现象表明，Sox2和Klf4以略有不同的偏好在基因组中协同结合其靶标。
然后，本发明人检查了这种协同结合是否促进了其靶基因的激活。Sox2结合(Sox2_Klf和Sox2_solo)在第2天导致H3K27乙酰化提高，但对于Klf4(Klf4_solo)没有观察到类似的作用(图6E和6F)。这可能是因为Klf4结合区域已经高度乙酰化。一致地，到第2天，Sox2靶基因的表达也显著上调(图6G)。
实施例11：Klf4过表达导致Sox2结合移位
然后，本发明人研究了在S2AK2AM条件与单独的Sox2或Klf4过表达之间，Sox2和Klf4结合是否相同。用于单独的Sox2或Klf4过表达(Sox2_tetO或Klf4_tetO)的样品来自之前的数据(Chronis et al.，2017)。尽管结合基序类似(图6I)，但Sox2结合区在S2AK2AM和Sox2_tetO条件下发生了根本性变化，仅有约10％重叠(图6H)，而Klf4结合区在S2AK2AM与Klf4_tetO条件之间显示出高类似性(77％重叠)。由于在S2AK2AM条件下Sox2结合基因座中Klf4基序的过度呈现，本发明人推断较高的Klf4可能是Sox2结合移位的原因。此外，S2AK2AM相关峰(Sox_co和Sox_SKM)的H3K27乙酰化升高，但特定于Sox2_tetO条件(Sox_tetO)的Sox2峰则没有(图6J)。然而，没有发现Klf4峰的结合移位。
实施例12：Sox2和Klf4协同结合并激活多能性相关区域
该实施例示出了Sox2和Klf4如何在结合和激活多能性基因座中协作。此前，本发明人已经表明Oct4、Lin28a/b、Zfp296和Sox21在MEF重编程期间早期上调。在本实施例中，本发明人研究了Sox2和Klf4是否共同占据这些基因。
图6K示出了在启动子以及这些基因座附近的一些远端元件处观察到Sox2和Klf4结合峰，并且H3K27乙酰化水平相应升高。
由于Oct4在多能性诱导和维持中的关键作用，本发明人用ChIP-qPCR单独研究了这种情况。设计引物以覆盖沿17号染色体Oct4调节区从Oct4的第一外显子到远端增强子的大区域(图6K)。与ChIP-seq数据类似，早在第2天就能看到Sox2和Klf4在远端增强子处的结合，而在近端增强子和启动子区域发现Sox2和Klf4的结合要少得多(图6L)。这些结合到第5天变得更加显著(图6M)。因此，该区域的H3K27乙酰化水平显著升高。因此，在检出Oct4转录之前，Sox2和Klf4已经与Oct4基因座结合。
更令人感兴趣地，我们注意到Sox2和Klf4的共结合发生在Oct4上游的231个ESC特异性超级增强子之一上。这些超级增强子由Whyte及其同事在2013年报道，并与附近多能性基因的高表达相关(Whyte et al.，2013)。本发明人搜索了其他ESC特异性超级增强子是否也与Sox2或Klf4结合。令人感兴趣地，Sox2结合也发生在接近Nanog和Sox2的四个超级增强子上，并且已表明这些超级增强子对Nanog和Sox2在ESC中的表达至关重要(Blinka etal.，2016；Li et al.，2014；Zhou et al.，2014)。Fgf4超级增强子也与Sox2结合。这些结果表明，在S2AK2AM重编程的第2天，Sox2和Klf4协同结合并重塑了一些多能性基因座，甚至在其转录激活之前也是如此，表明了其在早期向多能性启动中发挥作用。
参考文献：
An et al.(2019)Sox2 and Klf4 as the Functional Core in PluripotencyInduction without Exogenous Oct4.Cell Rep 29(7)：1986-2000.
Blinka，S.，Reimer，M.H.，Jr.，Pulakanti，K.，and Rao，S.(2016).Super-Enhancers at the Nanog Locus Differentially Regulate NeighboringPluripotency-Associated Genes.Cell Rep 17，19-28.
Brambrink，T.，Foreman，R.，Welstead，G.G.，Lengner，C.J.，Wernig，M.，Suh，H.，and Jaenisch，R.(2008).Sequential expression of pluripotency markers duringdirect reprogramming of mouse somatic cells.Cell Stem Cell 2，151-159.
Carey，B.W.，Markoulaki，S.，Hanna，J.，Saha，K.，Gao，Q.，Mitalipova，M.，andJaenisch，R.(2009).Reprogramming of murine and human somatic cells using asingle polyci stronic vector.Proc Natl Acad Sci U S A 106，157-162.
Carey，B.W.，Markoulaki，S.，Hanna，J.H.，Faddah，D.A.，Buganim，Y.，Kim，J.，Ganz，K.，Steine，E.J.，Cassady，J.P.，Creyghton，M.P.，et al.(2011).Reprogrammingfactor stoichiometry influences the epigenetic state and biologicalproperties of induced pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 9，588-598.
Chen，J.，Chen，X.，Li，M.，Liu，X.，Gao，Y.，Kou，X.，Zhao，Y.，Zheng，W.，Zhang，X.，Huo，Y.，et al.(2016).Hierarchical Oct4 Binding in Concert with PrimedEpigenetic Rearrangements during Somatic Cell Reprogramming.Cell Rep 14，1540-1554.
Chronis，C.，Fiziev，P.，Papp，B.，Butz，S.，Bonora，G.，Sabri，S.，Ernst，J.，andPlath，K.(2017).Cooperative Binding of Transcription Factors OrchestratesReprogramming.Cell 168，442459 e420.
de Felipe，P.，Luke，G.A.，Hughes，L.E.，Gani，D.，Halpin，C.，and Ryan，M.D.(2006).E unum pluribus：multiple proteins from a self-processingpolyprotein.Trends Biotechnol 24，68-75.
Dobin，A.，Davis，C.A.，Schlesinger，F.，Drenkow，J.，Zaleski，C.，Jha，S.，Batut，P.，Chaisson，M.，and Gingeras，T.R.(2013).STAR：ultrafast universal RNA-seqaligner.Bioinfonnatics 29，15-21.
Fritz，A.L.，Adil，M.M.，Mao，S.R.，and Schaffer，D.V.(2015).cAMP and EPACSignaling Functionally Replace OCT4 During Induced Pluripotent Stem CellReprogramming.Mol Ther 23，952-963.
Gao，Y.，Chen，J.，Li，K.，Wu，T.，Huang，B.，Liu，W.，Kou，X.，Zhang，Y.，Huang，H.，Jiang，Y.，et al.(2013).Replacement of Oct4 by Tetl during iPSC inductionreveals an important role of DNA methylation and hydroxymethylation inreprogramming.Cell Stem Cell 12，453-469.
Heng，J.C.，Feng，B.，Han，J.，Jiang，J.，Kraus，P.，Ng，J.H.，Orlov，Y.L.，Huss，M.，Yang，L.，Lufkin，T.，et al.(2010).The nuclear receptor Nr5a2 can replace Oct4in the reprogramming of murine somatic cells to pluripotent cells.Cell StemCell 6，167-174.
Hockemeyer，D.，Soldner，F.，Cook，E.G.，Gao，Q.，Mitalipova，M.，and Jaenisch，R.(2008).A Drug-Inducible System for Direct Reprogramming of Human SomaticCells to Pluripotency.Cell Stem Cell 3，346-353.
Kim，J.B.，Greber，B.，Arauzo-Bravo，M.J.，Meyer，J.，Park，K.I.，Zaehres，H.，and Scholer，H.R.(2009a).Direct reprogramming of human neural stem cells byOCT4.Nature 461，649-643.
Kim，J.B.，Sebastiano，V.，Wu，G.，Arauzo-Bravo，M.J.，Sasse，P.，Gentile，L.，Ko，K.，Ruau，D.，Ehrich，M.，van den Boom，D.，et al.(2009b).Oct4-inducedpluripotency in adult neural stem cells.Cell 136，411-419.
Kim，S.I.，Oceguera-Yanez，F.，Hirohata，R.，Linker，S.，Okita，K.，Yamada，Y.，Yamamoto，T.，Yamanaka，S.，and Woltjen，K.(2015).KLF4 N-terminal variancemodulates induced reprogramming to pluripotency.Stem Cell Reports 4，727-743.
Langrnead，B.，and Salzberg，S.L.(2012).Fast gapped-read alignment withBowtie 2.Nat Methods 9，357-359.
Langmead，B.，Trapnell，C.，Pop，M.，and Salzberg，S.L.(2009).Ultrafast andmemory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.GenomeBiol 10，R25.
Li，Y.，Rivera，C.M.，Ishii，H.，Jin，F.，Selvaraj，S.，Lee，A.Y.，Dixon，J.R.，andRen，B.(2014).CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2expression in mouse embryonic stem cells.PLoS One 9，e114485.
Lin，C.Y.，Loven，J.，Rahl，P.B.，Paranal，R.M.，Burge，C.B.，Bradner，J.E.，Lee，T.I.，and Young，R.A.(2012).Transcriptional amplification in tumor cells withelevated c-Myc.Cell 151，56-67.
Liu，P.，Chen，M.，Liu，Y.，Qi，L.S.，and Ding，S.(2018).CRISPR-BasedChromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus EnablesReprogramming to Pluripotency.Cell Stem Cell 22，252-261 e254.
Love，M.I.，Huber，W.，and Anders，S.(2014).Moderated estimation of foldchange and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol 15，550.
Machanick，P.，and Bailey，T.L.(2011).MEME-ChIP：motif analysis of largeDNA datasets.Bioinformatics 27，1696-1697.
McLean，C.Y.，Bristor，D.，Hiller，M.，Clarke，S.L.，Schaar，B.T.，Lowe，C.B.，Wenger，A.M.，and Bejerano，G.(2010).GREAT improves functional interpretation ofcis-regulatory regions.Nat Biotechnol 28，495-501.
Meisner，L.F.，and Johnson，J.A.(2008).Protocols for cytogenetic studiesof human embryonic stem cells.Methods 45，133-141.
Nakagawa，M.，Koyanagi，M.，Tanabe，K.，Takahashi，K.，Ichisaka，T.，Aoi，T.，Okita，K.，Mochiduki，Y.，Takizawa，N.，and Yamanaka，S.(2008).Generation of inducedpluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.NatBiotechnol 26，101-106.
Nefzger，C.M.，Rossello，F.J.，Chen，J.，Liu，X.，Knaupp，A.S.，Firas，J.，Paynter，J.M.，Pflueger，J.，Buckberry，S.，Lim，S.M.，et al.(2017).Cell Type ofOrigin Dictates the Route to Plufipotency.Cell Rep 21，2649-2660.
Nie，Z.，Hu，G.，Wei，G.，Cui，K.，Yamane，A.，Resch，W.，Wang，R.，Green，D.R.，Tessarollo，L.，Casellas，R.，et al.(2012).c-Myc is a universal amplifier ofexpressed genes in lymphocytes and embryonic stem cells.Cell 151，68-79.
Papapetrou，E.P.，Tomishima，M.J.，Chambers，S.M.，Mica，Y.，Reed，E.，Menon，J.，Tabar，V.，Mo，Q.，Studer，L.，and Sadelain，M.(2009).Stoichiometric and temporalrequirements of Oct4，Sox2，Klf4，and c-Myc expression for efficient human iPSCinduction and differentiation.Proc Natl Acad Sci U S A 106，12759-12764.
Polo，J.M.，Anderssen，E.，Walsh，R.M.，Schwarz，B.A.，Nefzger，C.M.，Lim，S.M.，Borkent，M.，Apostolou，E.，Alaei，S.，Cloutier，J.，et al.(2012).A molecular roadmapof reprogramming somatic cells into iPS cells.Cell 151，1617-1632.
Quinlan，A.R.，and Hall，I.M.(2010).BEDTools：a flexible suite ofutilities for comparing genomic features.Bioinformatics 26，841-842.
Redmer，T.，Diecke，S.，Grigoryan，T.，Quiroga-Negreira，A.，Birchmeier，W.，and Besser，D.(2011).E-cadherin is crucial for embryonic stem cellpluripotency and can replace OCT4 during somatic cell reprogramming.EMBO Rep12，720-726.
Robinson，J.T.，Thorvaldsdottir，H.，Winckler，W.，Guttman，M.，Lander，E.S.，Getz，G.，and Mesirov，J.P.(2011).Integrative genomics viewer.Nat Biotechnol 29，24-26.
Shen，L.，Shao，N.，Liu，X.，and Nestler，E.(2014).ngs.plot：Quick mining andvisualization of next-generation sequencing data by integrating genomicdatabases.BMC Genomics 15，284.
Shu，J.，Wu，C.，Wu，Y.，Li，Z.，Shao，S.，Zhao，W.，Tang，X.，Yang，H.，Shen，L.，Zuo，X.，et al.(2013).Induction ofpluripotency in mouse somatic cells with lineagespecifiers.Cell 153，963-975.
Smith，Z.D.，Sindhu，C.，and Meissner，A.(2016).Molecular features ofcellular reprogramming and development.Nat Rev Mol Cell Biol 17，139-154.
Soufi，A.，Donahue，G.，and Zaret，K.S.(2012).Facilitators and impedimentsof the pluripotency reprogramming factors′initial engagement with thegenome.Cell 151，994-1004.
Sridharan，R.，Tchieu，J.，Mason，M.J.，Yachechko，R.，Kuoy，E.，Horvath，S.，Zhou，Q.，and Plath，K.(2009).Role of the murine reprogramming factors in theinduction of pluripotency.Cell 136，364-377.
Szabo，P.E.，Hubner，K.，Scholer，H.，and Mann，J.R.(2002).Allele-specificexpression of imprinted genes in mouse migratory primordial germ cells.MechDev 115，157-160.
Takahashi，K.，and Yamanaka，S.(2006).Induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors.Cell 126，663-676.
Tan，F.，Qian，C.，Tang，K.，Abd-Allah，S.M.，and Jing，N.(2015).Inhibition oftransforming growth factor beta(TGF-beta)signaling can substitute for Oct4protein in reprogramming and maintain pluripotency.J Biol Chem 290，4500-4511.
Tiemann，U.，Sgodda，M.，Warlich，E.，Ballmaier，M.，Scholer，H.R.，Schambach，A.，and Cantz，T.(2011).Optimal reprogramming factor stoichiometry increasescolony numbers and affects molecular characteristics of murine inducedpluripotent stem cells.Cytometry A 79，426-435.
Wernig，M.，Lengner，C.J.，Hanna，J.，Lodato，M.A.，Steine，E.，Foreman，R.，Staerk，J.，Markoulaki，S.，and Jaenisch，R.(2008).A drug-inducible transgenicsystem for direct reprogramming of multiple somatic cell types.Nat Biotechnol 26，916-924.
Whyte，W.A.，Orlando，D.A.，Hnisz，D.，Abraham，B.J.，Lin，C.Y.，Kagey，M.H.，Rahl，P.B.，Lee，T.I.，and Young，R.A.(2013).Master transcription factors andmediator establish super-enhancers at key cell identity genes.Cell 153，307-319.
Zhang，Y.，Liu，T.，Meyer，C.A.，Eeckhoute，J.，Johnson，D.S.，Bernstein，B.E.，Nusbaum，C.，Myers，R.M.，Brown，M.，Li，W.，et al.(2008).Model-based analysis ofChlP-Seq(MACS).Genome Biol 9，R137.
Zhou，H.Y.，Katsman，Y.，Dhaliwal，N.K.，Davidson，S.，Macpherson，N.N.，Sakthidevi，M.，Collura，F.，and Mitchell，J.A.(2014).A Sox2 distal enhancercluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.Genes Dev 28，2699-2711.
本文中引用或提及的所有专利和出版物均表明本发明所属领域的技术人员的技能水平，并且每个这样的所引专利或出版物均在此通过引用明确地并入，其程度就如同通过引用整体单独地并入或以整体在本文中陈述。申请人保留将来自任何这样的引用的专利或出版物的任何和所有材料和信息实际并入到本说明书中的权利。
以下陈述旨在根据说明书中的前述描述来描述和总结本发明的多个实施方案。
陈述：
1.多顺反子表达盒，其包含与编码Sox2多肽、Klf4多肽和任选的c-Myc多肽的核酸区段可操作地连接的启动子。
2.陈述1所述的多顺反子表达盒，其中所述核酸区段编码与Klf4多肽同框的Sox2多肽，并且任选地与c-Myc多肽同框，作为单个连续开放阅读框。
3.陈述1或2所述的多顺反子表达盒，其中所述核酸区段还编码在所述Sox2多肽、所述Klf4多肽和/或所述任选的c-Myc多肽之间的一个或更多个可切割肽接头。
4.陈述1、2或3所述的多顺反子表达盒，其中所述启动子与编码所述Sox2多肽、所述Klf4多肽和所述任选的Myc多肽的核酸区段异源。
5.陈述1至3或4所述的多顺反子表达盒，其中所述启动子是诱导型启动子。
6.陈述1至3或4所述的多顺反子表达盒，其中所述启动子是组成型启动子。
7.宿主细胞，其包含陈述1至5或6的多顺反子表达盒。
8.陈述7所述的宿主细胞，其是成体细胞。
9.陈述7或8所述的宿主细胞，其对于选择的患者或动物是自体的。
10.陈述9所述的宿主细胞，其中所述动物是实验性(例如实验室)动物、驯养动物、濒危动物或动物园动物。
11.陈述9或10所述的宿主细胞，其中所选患者患有疾病或医学病症。
12.陈述7至10或11所述的宿主细胞，其在细胞群内。
13.方法，其包括使选择的细胞与陈述1至4或5的多顺反子表达盒接触，从而产生包含多顺反子表达盒的宿主细胞。
14.陈述13所述的方法，其还包括在重编程培养基中孵育宿主细胞以产生重编程细胞。
15.陈述13或14所述的方法，其中在重编程培养基中孵育所述宿主细胞使所述宿主细胞重编程以跨越细胞谱系边界，使得重编程细胞具有与所述宿主细胞不同的表型。
16.陈述14或15所述的方法，其中所述重编程培养基不具有Chirr99021、PD0325901或Chirr99021和PD0325901的组合。
17.陈述14、15或16所述的方法，其中所述重编程培养基包含诱导剂。
18.陈述14至16或17所述的方法，其中所述重编程培养基包含多西环素。
19.陈述14至17或18所述的方法，其中所述重编程培养基包含多西环素、A83-01、毛喉素或其组合。
20.陈述14至18或19所述的方法，其还包括将所述重编程细胞在培养基中孵育足以产生重编程细胞群的时间。
21.陈述14至19或20所述的方法，其中将宿主细胞群用所述重编程培养基孵育。
22.陈述21所述的方法，其中所述宿主细胞群中至少1％、至少3％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％或至少15％重编程为重编程细胞。
23.陈述14至21或22所述的方法，其中一个或更多个重编程细胞是干细胞。
24.陈述14至22或23所述的方法，其中所述重编程细胞是多能干细胞。
25.陈述23或24所述的方法，其还包括使所述干细胞或多能干细胞分化成外胚层细胞、中胚层细胞或内胚层细胞。
26.陈述23、24或25所述的方法，其还包括使所述干细胞或多能干细胞分化成神经元细胞、心肌细胞、胰腺细胞、肝细胞、真皮细胞、软骨细胞、或其祖细胞。
27.陈述24所述的方法，其还包括从所述多能干细胞产生动物胚胎。
28.陈述14至24或25所述的方法，其还包括向患者或动物施用所述重编程细胞或所述干细胞或所述细胞。
29.陈述26所述的方法，其还包括向患者或动物施用所述神经元细胞、心肌细胞、胰腺细胞、肝细胞、真皮细胞、软骨细胞、或其祖细胞。
本文中描述的具体方法和组合物代表一些优选实施方案，并且是示例性的并且并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书之后将想到其他目的、方面和实施方案，并且所述其他目的、方面和实施方案均涵盖在由权利要求书的范围所限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可对本文中公开的本发明进行多种替换和修改。本文中举例说明性地描述的本发明可在不存在本文中未将其具体公开为必要要素的任何一个或更多个要素或一个或更多个限制的情况下适当地实践。本文中举例说明性地描述的方法和过程可以以不同的步骤顺序来实践，并且方法和过程不一定限于本文或权利要求书中指出的步骤顺序。
已经使用的术语和表述用作描述性而非限制性术语，并且无意使用这样的术语和表述来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但认识到在所要求保护的本发明的范围内可进行多种修改。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和任选特征具体公开，但由本领域技术人员可以对本文中公开的概念进行修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是本发明所附权利要求和陈述所定义的本发明的范围内。在任何情况下，均不能将本专利解释为限于本文中具体公开的具体实施例或实施方案或方法。在任何情况下，均不能将本专利解释为受任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员所作的任何陈述的限制，除非这样的陈述在申请人的回应性书面文件中明确地且无条件或保留地明确采纳。

Claims (17)

1.多顺反子表达盒，其包含核酸区段和启动子，所述启动子与所述核酸区段可操作地连接，所述核酸区段编码同框的Klf4多肽和Sox2多肽，作为单个连续开放阅读框。
2.权利要求1所述的多顺反子表达盒，其中所述核酸区段还编码在所述Sox2多肽与所述Klf4多肽之间的一个或更多个可切割肽接头。
3.权利要求1所述的多顺反子表达盒，其中所述启动子与编码所述Sox2多肽和所述Klf4多肽的核酸区段异源。
4.权利要求1所述的多顺反子表达盒，其中所述启动子是诱导型启动子。
5.宿主细胞，其包含权利要求1所述的多顺反子表达盒。
6.权利要求5所述的宿主细胞，其中所述多顺反子表达盒在载体内。
7.权利要求6所述的宿主细胞，其中所述载体游离地维持在所述宿主细胞中。
8.权利要求5所述的宿主细胞，其是成体细胞。
9.权利要求5所述的宿主细胞，其对于选择的患者或动物是自体的。
10.权利要求9所述的宿主细胞，其具有与疾病或病症相关的突变。
11.方法，其包括使选择的细胞与权利要求1所述的多顺反子表达盒接触从而产生包含所述多顺反子表达盒的宿主细胞。
12.权利要求11所述的方法，其还包括在重编程培养基中孵育所述宿主细胞以产生重编程多能干细胞。
13.权利要求12所述的方法，其中所述重编程培养基包含毛喉素和A83-01。
14.权利要求11所述的方法，其中所述核酸区段还编码在所述Sox2多肽与所述Klf4多肽之间的一个或更多个可切割肽接头。
15.权利要求11所述的方法，其中所述启动子与编码所述Sox2多肽和所述Klf4多肽的核酸区段异源。
16.权利要求11所述的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。
17.权利要求12所述的方法，其还包括使所述重编程多能干细胞分化成分化细胞。
CN202080087087.4A 2019-10-18 2020-10-16 使用多顺反子sox2、klf4和任选的c-myc产生诱导多能干细胞 Active CN116529361B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962916830P 2019-10-18 2019-10-18
US62/916,830 2019-10-18
PCT/US2020/055943 WO2021076866A1 (en) 2019-10-18 2020-10-16 Generation of induced pluripotent stem cells with polycistronic sox2, klf4, and optionally c-myc

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116529361A CN116529361A (zh) 2023-08-01
CN116529361B true CN116529361B (zh) 2024-01-26

Family

ID=75538652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080087087.4A Active CN116529361B (zh) 2019-10-18 2020-10-16 使用多顺反子sox2、klf4和任选的c-myc产生诱导多能干细胞

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220372447A1 (zh)
EP (1) EP4081258A4 (zh)
CN (1) CN116529361B (zh)
WO (1) WO2021076866A1 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010030003A1 (ja) * 2008-09-12 2010-03-18 協和発酵キリン株式会社 細胞のリプログラミングに用いられる複数遺伝子の発現制御システム
CN103160540A (zh) * 2013-04-01 2013-06-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5962670A (en) * 1997-07-15 1999-10-05 The Regents Of The University Of California Promoters for enhancing plant productivity
EP3060649A4 (en) * 2013-10-23 2017-07-12 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established under The Will of J. David Gladstone Reprogramming cardiomyocytes with one transcription factor
EP3272858A4 (en) * 2015-03-18 2018-08-08 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Method for producing naïve pluripotent stem cells
KR101782488B1 (ko) * 2015-05-19 2017-09-28 주식회사 스템랩 Oct4가 도입된 인간체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통한 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법
MX2018007986A (es) * 2016-01-04 2018-11-09 Univ Leland Stanford Junior Terapia genica para epidermolisis ampollosa distrofica recesiva con queratinocitos autologos geneticamente corregidos.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010030003A1 (ja) * 2008-09-12 2010-03-18 協和発酵キリン株式会社 細胞のリプログラミングに用いられる複数遺伝子の発現制御システム
CN103160540A (zh) * 2013-04-01 2013-06-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Excluding Oct4 from Yamanaka Cocktail Unleashes the Developmental Potential of iPSCs;Sergiy Velychko;Cell Stem Cell;第25卷(第6期);第737–753页 *
Sox2 and Klf4 as the Functional Core in Pluripotency Induction without Exogenous Oct4;Zhaojun An等;Cell Reports;第29卷(第7期);第1986–2000页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220372447A1 (en) 2022-11-24
WO2021076866A1 (en) 2021-04-22
EP4081258A1 (en) 2022-11-02
EP4081258A4 (en) 2024-04-17
CN116529361A (zh) 2023-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230282445A1 (en) Method of nuclear reprogramming
US12012615B2 (en) Method of making induced pluripotent stem cells using p53 inhibitors
Hernandez et al. Dppa2/4 facilitate epigenetic remodeling during reprogramming to pluripotency
US9556454B2 (en) Generation of induced pluripotent stem (iPS) cells
JP5626619B2 (ja) 効率的な核初期化方法
An et al. Sox2 and Klf4 as the functional core in pluripotency induction without exogenous Oct4
JPWO2007069666A1 (ja) 核初期化因子
JP2013517758A (ja) 人工多能性幹細胞の樹立効率改善方法
US20130065814A1 (en) Inductive production of pluripotent stem cells using synthetic transcription factors
US20200339958A1 (en) Generation of induced pluripotent cells by crispr activation
US20150252330A1 (en) Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US20210189352A1 (en) Enhanced reprogramming of somatic cells
Rajasingh Reprogramming of somatic cells
CN116529361B (zh) 使用多顺反子sox2、klf4和任选的c-myc产生诱导多能干细胞
WO2017126616A1 (ja) ユーイング肉腫ファミリー腫瘍モデル細胞とそれを用いた抗腫瘍剤のスクリーニング方法
US9234180B2 (en) Method for inducing pluripotency in human somatic cells with PRDM14 or NFRKB
Maza Frequent and transient acquisition of pluripotency during somatic cell trans-differentiation with iPSC reprogramming factors
Borkent Roadblocks and Facilitators of Reprogramming to Pluripotency
Zapata-Linares Identification and Characterization of pluripotency associated IncRNAs in human iPS cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40089154

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant