JP5626619B2 - 効率的な核初期化方法 - Google Patents
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Description
本発明の方法は、人工多能性幹細胞の製造方法であり、miRNAの存在下で核初期化因子により核初期化する工程を含み、該miRNAが該miRNAの存在下において該miRNAの非存在下の場合よりも高い核初期化効率を与える性質を有するmiRNAであることを特徴としている。
(a) Octファミリーメンバー及びSoxファミリーメンバーからなる2種の初期化因子をコードするDNAの組み合わせ;
(b) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、及びSoxファミリーメンバーからなる3種の初期化因子をコードするDNAの組み合わせ;
(c) Octファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanogからなる4種の初期化因子をコードするDNAの組み合わせ;
(d) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる4種の初期化因子をコードするDNAの組み合わせ;
(e) Octファミリーメンバーからなる1種の初期化因子をコードするDNA;
(f) Octファミリーメンバー及びKlfファミリーメンバーからなる2種の初期化因子をコードするDNAの組合せ;
(g)Octファミリーメンバー及びNanogからなる2種の初期化因子をコードするDNAの組合せ;
(h) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる3種の初期化因子をコードするDNAの組合せ;
などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
(1)Oct3/4からなる1種の初期化因子をコードするDNA;
(2)Oct3/4及びKlf4からなる2種の初期化因子をコードするDNAの組み合わせ;
(3)Oct3/4及びNanogからなる2種の初期化因子をコードするDNAの組み合わせ;
(4)Oct3/4、Klf4及びc-Mycからなる3種の初期化因子をコードするDNAの組み合わせ;
などである。
実施例1:マウス胎児線維芽細胞の核初期化による人工多能性幹細胞の調製
マウス由来Oct3/4、Sox2、及びKlf4の3種の遺伝子、コントロール用のDsRed、及び18種類のmiRNAのそれぞれをコードするpMXsレトロウイルスベクターをPLAT-E細胞にFugene6 (Roche)を用いてトランスフェクトした。翌日、Nanog遺伝子のプロモーター領域の下流にEGFPとpuromycinの耐性遺伝子をコードした配列をつないだトランスジェニックマウス由来の胎児線維芽細胞(Nanog GFP MEF、WO2007/69666)を6 well plateに1×105個ずつまいた。翌日、この細胞にOct3/4、Sox2、及びKlf4、並びに18種類のmiRNAから選ばれる各1種類のmiRNAを発現するレトロウイルスを3因子の発現ウイルスの混合液1 ml+miRNA発現ウイルス液1 mlの割合で感染させ核初期化により人工多能性幹細胞の調製を行った。
マウス由来Oct3/4、Sox2、及びKlf4の3種の遺伝子、DsRed(コントロール)、mmu-miR-295のそれぞれをコードするpMXsレトロウイルスベクターをPLAT-E細胞にFugene6 (Roche)を用いてトランスフェクトした。翌日、Nanog遺伝子のプロモーター領域の下流にEGFPとpuromycinの耐性遺伝子をコードした配列をつないだトランスジェニックマウス尻尾の線維芽細胞(Nanog GFP tail tip fibroblasts)を6ウエルプレートに1×105個ずつまいた。翌日、この細胞にOct3/4、Sox2、及びKlf4の3遺伝子とDsRedあるいはmmu-miR-295を発現するレトロウイルスを(1:1:1:1)の割合で感染させ核初期化により人工多能性幹細胞の調製を行った。
ヒト由来OCT3/4、SOX2、及びKLF4の3種の遺伝子に加え、コントロール用のDsRedと23種類のmiRNA又はmiRNAクラスターをコードするpMXsレトロウイルスベクターをPLAT-E細胞にFugene6 (Roche)を用いてトランスフェクトした。翌日、マウスレトロウイルスのレセプターであるSlc7a1を発現させたヒト成人皮膚線維芽細胞(adult human dermal fibroblasts;aHDF-Slc7a1)を6cmディッシュに3×105個ずつまいた。翌日、この細胞にOCT3/4、SOX2、及びKLF4の3種の遺伝子と各種miRNAを発現するレトロウイルスを1:1:1:1の割合で感染させ核初期化による人工多能性幹細胞の生成を試みた。
3x105 aHDF-Slc7a1 細胞を、60mmゼラチンをコートしたディッシュ上で平板培養し、さらに種々のmiRNAの各々の存在下で、DsRed、4遺伝子(OCT3/4, SOX2, c-MYC, KLF4)又は3遺伝子 (OCT3/4, SOX2, KLF4)を発現するレトロウイルスで感染させた。感染6日後に、5x105個の aHDF-Slc7a1 細胞をマイトマイシン-C処理STO細胞上にまきなおした。感染40日後に、ヒトES細胞様の形態を示すコロニーの数を数えた。これと同じ実験を3回繰り返した。
図4Bは、顕微鏡下で観察されたiPS細胞のES細胞様コロニーの形態を示す。
5x104個のFbNg TTF (Fbx15-βgeo/Nanog-IRES-Puror レポーターマウス由来のTTF) 細胞を、ゼラチンをコーティングした6ウエルプレート上で平板培養し、さらに3遺伝子(Oct3/4, Sox2, Klf4)+DsRed (Myc(-)3f+DsRed)、mmu-miR-295/295* (Myc(-)3f+mmu-miR-295/295*)又はc-Myc (4 遺伝子)を発現するレトロウイルス感染により導入した。感染4日後に、すべての細胞(Myc(-)3f + DsRed; Myc(-)3f + mmu-miR-295/295*)又は20倍希釈した細胞(4遺伝子)を、ピューロマイシン及びハイグロマイシン耐性MSTO (PH-MSTO)細胞上にまきなおした。7, 14, 21, 28日目に、ピューロマイシンによる選択を開始した。
1x105個のNanog MEF(Nanog-IRES-Purorレポーターマウス由来のMEF)細胞を、ゼラチンをコーティングした6ウエルプレート上で平板培養し、さらに3遺伝子 (Oct3/4, c-MycWT(野生型), Klf4)及びmmu-miR-290-295クラスター, 290-5p/290-3p (mmu-miR-290), 291a-5p/291a-3p (mmu-miR-291a), 292-5p/292-3p (mmu-miR-292), 293/293* (mmu-miR-293), 294/294*(mmu-miR-294)又は295/295* (mmu-miR-295) miRNA (1:1)を発現するレトロウイルスを感染させることで導入した。感染4日後に、細胞の半分をピューロマイシン及びハイグロマイシン-C耐性MSTO (PH-MSTO) 細胞上にまきなおした。感染後14日目からピューロマイシンによる選択を開始した。
1x105個のFb-Ng MEF(Fbx15-βgeo/Nanog-IRES-Purorレポーターマウス由来のMEF)細胞を、ゼラチンをコーティングした6ウエルプレート上で平板培養し、さらに3遺伝子 (Oct3/4, c-MycWT(野生型), Klf4) + miR-295/295*又はhsa-miR-302-367クラスターmiRNAを発現するレトロウイルスを感染させることにより導入した。感染4日後に、細胞を、6ウエル又は 10cmディッシュ中のピューロマイシン及びハイグロマイシン-C処理STO 細胞(PH-MSTO)上にまきなおした。感染後7日目からピューロマイシンによる選択を開始した。
3x105個のaHDF-Slc7a1 細胞を、60mmゼラチンコーティングしたディッシュ上で平板培養し、 4 遺伝子(OCT3/4, SOX2, c-MYC, KLF4 (OSMK))、miRNA(OMK:mock又はmiRNAs=2.5:1.5)の存在下あるいは非存在下で3 遺伝子(OCT3/4, c-MYC, KLF4;SOX(-)3遺伝子 (OMK))、又はmiRNAの存在下あるいは非存在下で2遺伝子(OCT3/4 + KLF4 (OK) )のそれぞれの組み合わせの遺伝子がレトロウイルスにより導入された。また、対照としてDsRedが導入された。導入6日後に、5x105aHDF-Slc7a1細胞を、マイトマイシン-C処理STO 細胞 (MSTO細胞)上にまきなおし、感染後40日目にES細胞様コロニー数を計測した。図8においては、観察されたコロニーの形態、及びOK+miRNA導入により得られたiPS細胞がアルカリフォスファターゼ陽性を示し、未分化状態であることが確認された解析結果を示す。
OCT3/4,KLF4,c-MYC(SOX(-)3F)及びhsa-miR-302-367クラスター導入により得られたヒトiPS細胞(61N2)をSCIDマウスの背側の側腹部へ皮下接種した。接種後9週目に腫瘍を採取、固定後、パラフィン包埋し、薄切切片をヘマトキシリン・エオジン染色した。組織学的観察により、神経管(外胚葉)、心筋細胞様構造(中胚葉)、腸管様上皮組織(内胚葉)、軟骨(中胚葉)を含む様々な組織がテラトーマに含まれていることが示され、iPS細胞(61N2)が三胚葉に分化しうる多能性を示すことが確認された(図9)。
aHDF-Slc7a1を6ウエルプレートに1ウエルあたり1x105個ずつまいた。翌日、この細胞に、以下のいずれかの組み合わせの遺伝子をレトロウイルスにより導入した。
1. GFP遺伝子(ネガティブコントロール)
2. OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、c-MYC遺伝子、KLF4遺伝子(1:1:1:1)
3. OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子(1:1:1)
4.OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、mock遺伝子(pMSx空ベクター)(1:1:1)
5.OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、hsa-miR-302-367クラスター(1:1:1)
6. OCT3/4遺伝子、mock遺伝子(1:1)
7. OCT3/4遺伝子、hsa-miR-302-367クラスター(1:1)
8. KLF4遺伝子、mock遺伝子(1:1)
9. KLF4遺伝子、hsa-miR-302-367クラスター(1:1)
10. hsa-miR-302-367クラスター
Claims (9)
- 少なくとも1種の外因性miRNAの存在下で外因性核初期化因子により体細胞を核初期化する工程を含む、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、
(1) 前記核初期化因子は、Soxファミリーメンバーを含まないが、
(i) Oct3/4、又は
(ii) Oct3/4及び、Klf1、Klf2、Klf4及びKlf5から選択されるKlfファミリーメンバー
を含み、前記miRNAは、hsa-miR-302-367クラスターのmiRNA又はその成熟miRNAである、或いは、
(2) 前記核初期化因子は、Soxファミリーメンバーを含まないが、Oct3/4、Klf1、Klf2、Klf4及びKlf5から選択されるKlfファミリーメンバー、並びに、c-Myc、N-Myc及びL-Mycから選択されるMycファミリーメンバーを含み、前記miRNAは、hsa-miR-371-373クラスターのmiRNA、hsa-miR-302-367クラスターのmiRNA、mmu-miR-291a又はmmu-miR-291a-5p/291a-3p、mmu-miR-294又はmmu-miR-294/294*、mmu-miR-295又はmmu-miR-295/295*、並びに、それらの成熟miRNAから選択されるmiRNAである、
ことを特徴とする、前記方法。 - 外因性核初期化因子により体細胞を核初期化することにおいて少なくとも1種の外因性miRNAの存在下で核初期化を行うことを特徴とする核初期化の効率を高める方法であって、
(1) 前記核初期化因子は、Soxファミリーメンバーを含まないが、
(i) Oct3/4、又は
(ii) Oct3/4及び、Klf1、Klf2、Klf4及びKlf5から選択されるKlfファミリーメンバー
を含み、前記miRNAは、hsa-miR-302-367クラスターのmiRNA又はその成熟miRNAである、或いは、
(2) 前記核初期化因子は、Soxファミリーメンバーを含まないが、Oct3/4、Klf1、Klf2、Klf4及びKlf5から選択されるKlfファミリーメンバー、並びに、c-Myc、N-Myc及びL-Mycから選択されるMycファミリーメンバーを含み、前記miRNAは、hsa-miR-371-373クラスターのmiRNA、hsa-miR-302-367クラスターのmiRNA、mmu-miR-291a又はmmu-miR-291a-5p/291a-3p、mmu-miR-294又はmmu-miR-294/294*、mmu-miR-295又はmmu-miR-295/295*、並びに、それらの成熟miRNAから選択されるmiRNAである、
前記方法。 - KlfファミリーメンバーがKlf4であり、又はMycファミリーメンバーがc-Mycである、請求項1又は2に記載の方法。
- 核初期化因子が(a)Oct3/4、(b)Oct3/4及びKlf4、或いは(c)Oct3/4、Klf4及びc-Mycである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1種のmiRNAもしくはその前駆体RNAをコードするDNAを含むベクターを体細胞中に導入することを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1種の核初期化因子をコードするDNA及び/又は少なくとも1種のmiRNAもしくはその前駆体RNAをコードするDNAを含むベクターを体細胞中に導入することを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- miRNAが、配列番号1〜5、10〜12及び14から選択されるRNA配列に含まれるmiRNAである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- miRNAが、18〜25塩基からなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 体細胞が、ヒトの体細胞である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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