ITRM20110685A1 - Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci - Google Patents

Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci Download PDF

Info

Publication number
ITRM20110685A1
ITRM20110685A1 IT000685A ITRM20110685A ITRM20110685A1 IT RM20110685 A1 ITRM20110685 A1 IT RM20110685A1 IT 000685 A IT000685 A IT 000685A IT RM20110685 A ITRM20110685 A IT RM20110685A IT RM20110685 A1 ITRM20110685 A1 IT RM20110685A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
seq
micrornas
microrna
cardiomyocytes
proliferation
Prior art date
Application number
IT000685A
Other languages
English (en)
Inventor
Eulalio Ana Sofia Bregieiro
Mano Miguel Luis Cunha
Mauro Giacca
Serena Zacchigna
Original Assignee
Internat Ct For Genetic En Gineering And
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Internat Ct For Genetic En Gineering And filed Critical Internat Ct For Genetic En Gineering And
Priority to IT000685A priority Critical patent/ITRM20110685A1/it
Priority to ES12823043.0T priority patent/ES2644574T3/es
Priority to DK12823043.0T priority patent/DK2794882T3/en
Priority to PL12823043T priority patent/PL2794882T3/pl
Priority to EP12823043.0A priority patent/EP2794882B1/en
Priority to US14/368,149 priority patent/US10337002B2/en
Priority to JP2014548318A priority patent/JP6153538B2/ja
Priority to PCT/IB2012/057590 priority patent/WO2013093870A1/en
Publication of ITRM20110685A1 publication Critical patent/ITRM20110685A1/it
Priority to JP2017081427A priority patent/JP6420865B2/ja
Priority to US16/400,333 priority patent/US11236332B2/en
Priority to US17/570,714 priority patent/US20220228143A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Description

Descrizione dell’invenzione: “microRNA per la rigenerazione cardiaca attraverso l’induzione della proliferazione dei miociti cardiaciâ€
La presente invenzione riguarda il settore farmaceutico e biotecnologico. In particolare, la presente invenzione descrive una serie di microRNA umani ed il loro utilizzo come agenti terapeutici, in particolare mediante approcci di terapia genica, per indurre la proliferazione dei cardiomiociti per prevenire e trattare patologie cardiache associate a perdita di cardiomiociti (infarto del miocardio, cardiomiopatia di origine ischemica e non-ischemica, miocardite e scompenso cardiaco).
Inoltre, l’invenzione si riferisce ad un metodo di screening di composti biologicamente e farmacologicamente attivi per la loro capacità di indurre proliferazione dei cardiomiociti.
Sfondo dell’invenzione
Nonostante gli enormi progressi compiuti negli ultimi anni in termini di prevenzione e diagnosi precoce, un’analisi epidemiologica indica che nei paesi occidentali le malattie cardiovascolari sono tra le principali cause di morbosità e mortalità tra le persone con più di 60 anni. Si annoverano circa 600.000 morti ogni anno in Europa per infarto del miocardio e, ancora più rilevante, lo scompenso cardiaco si stima colpisca oltre 12 milioni di persone in tutto il mondo, rappresentando una delle prime cause di morte; tali numeri sono con ogni probabilità destinati ad aumentare, in conseguenza dell’invecchiamento progressivo della popolazione generale e del progresso della tecnologia medica. Nonostante il trattamento farmacologico, la prognosi a lungo termine dei pazienti con scompenso cardiaco rimane scarsa: più del 60% di questi pazienti à ̈ destinato a morire entro 5 anni, a causa del peggioramento progressivo dello scompenso o dell’insorgenza improvvisa di un’aritmia ventricolare. Fino al 16% dei pazienti va incontro a un nuovo ricovero durante i 6 mesi successivi alla dimissione, rendendo questa patologia la prima causa di ospedalizzazione (circa il 20%) nella popolazione con più di 65 anni.
Alla luce di queste considerazioni, lo sviluppo di nuove terapie aventi un impatto diretto sulla proliferazione, vitalità e funzione dei cardiomiociti, e quindi volte nel complesso a migliorare la sopravvivenza e la rigenerazione del tessuto cardiaco, rappresenta una priorità.
Nei mammiferi, la crescita del cuore durante lo sviluppo embrionale dipende principalmente dall’aumento del numero dei cardiomiociti, ma subito dopo la nascita i cardiomiociti smettono di proliferare e la successiva crescita del miocardio avviene grazie all’incremento delle dimensioni (ipertrofia) dei cardiomiociti già esistenti (Ahuja et al. 2007; van Amerongen and Engel 2008). Tale cambiamento del potenziale proliferativo dei cardiomiociti avviene in epoche diverse dello sviluppo nelle varie specie animali: nel topo esso si verifica subito dopo la nascita, mentre nel ratto tra il terzo e il quarto giorno di vita post-natale; al contrario, i cardiomiociti umani vanno incontro ad una drastica riduzione della propria capacità proliferativa dopo il settimo mese di vita. Recenti evidenze sperimentali, ottenute tramite datazione del DNA del cardiomiocita nell’uomo, hanno indicato che il tasso di rinnovamento dei nostri cardiomiociti à ̈ di circa l’1% a 25 anni e dello 0,45% a 75 anni, e che meno del 50% dei cardiomiociti viene ricambiato nel corso di una vita media (Bergmann et al. 2009). Come conseguenza del ridotto potenziale di proliferazione dei cardiomiociti adulti, la capacità del cuore dei mammiferi adulti di rigenerarsi in seguito ad un danno, come ad esempio dopo un infarto acuto o in corso di scompenso cardiaco, à ̈ molto limitata.
La transizione dei cardiomiociti da uno stato proliferativo, caratteristico degli stadi embrionali, ad un fenotipo differenziato ed ipertrofico, tipico delle cellule adulte à ̈ un processo finemente regolato, cui partecipano diverse molecole che regolano il ciclo cellulare, fattori di trascrizione, fattori di crescita, citochine e trasduttori del segnale (Ahuja et al. 2007; van Amerongen and Engel 2008). Tuttavia, gli esatti meccanismi molecolari che controllano tale transizione, così come quelli che determinano la proliferazione ed il differenziamento terminale dei cardiomiociti rimangono in larga misura sconosciuti.
I microRNA sono piccoli RNA non codificanti, conservati nel corso dell’evoluzione, che regolano l’espressione genica a livello post-trascrizionale. Nelle cellule animali, la repressione dell’espressione genica ad opera dei microRNA richiede il loro appaiamento a sequenze parzialmente complementari presenti principalmente a livello delle regioni 3’ UTR degli RNA messaggeri (mRNA) bersaglio, con conseguente repressione della traduzione, degradazione dell’mRNA o entrambi (Eulalio et al. 2008). La sequenza seme (seed) del microRNA, essenziale per l’appaiamento dei microRNA agli mRNA, à ̈ una sequenza conservata che à ̈ generalmente situata a livello delle posizioni 2-8 dall’estremità 5’ del microRNA (Filipowicz et al.2008). Sebbene l’appaiamento tra il microRNA e il suo mRNA bersaglio non sia perfetto, la regione che corrisponde alla sequenza seme deve essere perfettamente complementare. Perciò la sequenza seme à ̈ il principale determinante di specificità nella selezione del bersaglio. Le piccole dimensioni della sequenza seme implicano che un singolo microRNA possa regolare molteplici geni, nell’ordine delle centinaia.
I microRNA sono sequenze codificate dal genoma generalmente trascritte dalla RNA polimerasi II in microRNA primari (pri-microRNA). I pri-microRNA sono quindi processati sequenzialmente da due endonucleasi della famiglia delle RNAasi III: nel nucleo, Drosha processa il pri-microRNA in un microRNA precursore (premicroRNA) di circa 60-80 nucleotidi, che viene poi ulteriormente processato nel citoplasma da Dicer generando una molecola a doppia elica (duplex) che contiene due filamenti di circa 19-23 nucleotidi. Il microRNA a doppia elica viene quindi svolto e il microRNA maturo à ̈ incorporato nel complesso di silenziamento indotto dal RNA (RNA-Induced Silencing Complex, RISC), che contiene, tra gli altri fattori, proteine delle famiglie Argonaute e GW182, mediatori essenziali del silenziamento indotto da microRNA (per una revisione della letteratura, cfr. Ghildiyal and Zamore 2009).
L’ultima versione di miRBase (www.mribase.org), il database di riferimento per le sequenze pubblicate di microRNA e le relative annotazioni, contiene 18226 voci, che rappresentano i microRNA precursori a forcina esprimenti 21643 microRNA maturi, presenti in 168 specie (versione di miRBase numero 18, Novembre 2011).
Considerando che un singolo microRNA può avere centinaia di bersagli, à ̈ possibile predire che circa un terzo del trascrittoma umano sia regolato dai microRNA. Un ulteriore livello di complessità regolatoria deriva dal fatto che ogni mRNA può essere bersaglio di molteplici microRNA (Bartel 2009).
E’ stato dimostrato che il controllo dell’espressione genica da parte dei microRNA svolge un ruolo essenziale in un’ampia serie di processi biologici, tra cui lo sviluppo, il differenziamento e la proliferazione cellulare, l’apoptosi, il metabolismo e la risposta immunitaria (Bueno et al.2008; Kedde and Agami 2008; O'Connell et al. 2010). In accordo con il concetto che i microRNA svolgono un ruolo cruciale nel controllare l’espressione genica, l’alterazione nella loro espressione à ̈ stata correlata con diverse patologie, tra cui il cancro (Croce 2009) e le infezioni virali (Umbach and Cullen 2009); la ricerca sta cominciando a svelare il ruolo essenziale dei microRNA anche nelle malattie cardiovascolari (van Rooij and Olson 2007; Latronico and Condorelli 2009; Williams et al. 2009; Small and Olson 2011).
Diversamente da molti fattori cellulari coinvolti nella malattia, che risultano difficili da modulare per finalità terapeutiche, i livelli di microRNA possono essere facilmente modulati in vivo, utilizzando mimetici (mimics) di microRNA (che mimano l’azione dei microRNA) e antimiR (sequenze complementari alla sequenza del microRNA maturo che ne bloccano l’attività). Di fatto, l’uso efficace degli antimiR à ̈ stato dimostrato in primati non umani (Elmen et al., 2008; Lanford et al., 2010), e questi studi sono stati proseguiti con le prove cliniche sull’uomo.
L’importanza dei microRNA nel regolare la funzionalità dei cardiomiociti à ̈ stata dimostrata da una serie di studi condotti nei topi, nei quali gli enzimi coinvolti nella biogenesi dei microRNA (Dicer e Dgcr8) sono stati bloccati specificamente nel cuore (Chen et al. 2007; Rao et al. 2009). Tali studi hanno rivelato che il blocco del sistema dell’interferenza ad RNA (RNAi) nel muscolo cardiaco in epoca postnatale determina la morte prematura degli animali con segni di scompenso cardiaco e cardiomiopatia (Chen et al.2007; Rao et al.2009).
La valutazione del profilo di espressione dei microRNA da varie patologie cardiache dimostra schemi di espressione dei microRNA alterati (Ikeda et al., 2007; Matkovich et al., 2009; Thum et al., 2007; van Rooij et al., 2006), suggerendo che i microRNA associati a patologie potrebbero rappresentare dei potenti strumenti diagnostici, nonché un promettente approccio terapeutico per la cura delle patologie cardiache. Specifici microRNA sono stati implicati in malattie del miocardio, tra cui la cardiomiopatia ipertrofica (Callis et al., 2009; Care et al., 2007; Lin et al., 2009), lo scompenso cardiaco (Callis et al., 2009; Care et al., 2007; van Rooij et al., 2007), aritmie cardiache (Callis et al., 2009; Yang et al., 2007), la fibrosi (Thum et al., 2008; van Rooij et al., 2008) e malattie metaboliche (Najafi-Shoushtari et al., 2010). Inoltre, esperimenti di guadagno e perdita di funzione hanno dimostrato che specifici microRNA sono necessari e sufficienti a causare patologie cardiache (per una revisione della letteratura, cfr. Huang et al., 2010; Small et al., 2010).
Ad oggi, solo un numero esiguo di microRNA, tra cui miR-1, miR-133 e, più di recente, i membri della famiglia miR-15, à ̈ stato chiaramente associato alla proliferazione dei cardiomiociti. La sovraespressione di miR-1 a livello del cuore embrionale si à ̈ rivelata in grado di inibire la proliferazione cardiomiocitaria, il che à ̈ stato correlato alla repressione di Hand2, un fattore trascrizionale necessario per lo sviluppo del cuore durante l’embriogenesi (Zhao et al. 2005). MiR-133 esercita un effetto inibitorio sulla proliferazione dei cardiomiociti attraverso la repressione di SRF e ciclina D2, due regolatori fondamentali del processo di differenziamento muscolare (Liu et al.2008). Infine, à ̈ stato dimostrato che la famiglia miR-15 regola l’arresto mitotico dei cardiomiociti di topo in epoca post-natale, attraverso la sottoregolazione dell’espressione di Chek1 (Porrello et al.2011).
WO2011111824 descrive miRNA che promuovono la proliferazione dei cardiomiociti, in particolare miR-148a, miR-148b, miR-152 e miR-373.
WO2006/107826 descrive microRNA che regolano il differenziamento, la proliferazione e la morte delle cellule muscolari cardiache e scheletriche. Possono essere utilizzati come agenti attivi per indurre il differenziamento di cellule progenitrici e la loro repressione consente il mantenimento e l’espansione di una popolazione di cellule progenitrici.
WO2008/063919 fornisce il microRNA della β-miosina e metodi per ridurre o inibire la sua espressione, al fine di selezionare composti attivi capaci di modularne l’espressione e metodi di diagnosi del rischio di malattie cardiovascolari.
WO2009/058818 identifica miR-21, che altera il metabolismo energetico del cardiomiocita, contribuendo al rimodellamento cardiaco. La sua inibizione à ̈ descritta come un metodo per il trattamento dell’ipertrofia cardiaca, dello scompenso cardiaco e/o dell’infarto del miocardio.
US2010/0010073 descrive 29 sequenze di miRNA per la diagnosi, la profilassi e/o il trattamento di malattie cardiache, quali l’infarto del miocardio, lo scompenso cardiaco, lo scompenso cardiaco cronico e/o l’ipertrofia cardiaca.
CN101643791 descrive il microRNA-328 e l’utilizzo di un antisenso dello stesso per la diagnosi e il controllo di patologie cardiache. Il nucleotide antisenso esibisce attività sia terapeutica sia preventiva.
WO2010/117860 descrive un profilo di microRNA per predire la prognosi nello scompenso cardiaco. I microRNA sono hsa-miR-367, hsa-miR-10a, hsa-miR-187, hsa-miR-452, hsa-miR-218, hsa-miR-10b, hsa-miR-214, hsa-miR-193a e hsa-miR-565.
WO2010/129950 descrive un metodo per trattare o prevenire l’ipertrofia cardiaca patologica, il rimodellamento cardiaco, l’infarto del miocardio o lo scompenso cardiaco attraverso l’inibizione dell’espressione o dell’attività di miR-451 nelle cellule cardiache.
Rimane la necessità di trovare degli approcci efficaci per trattare le malattie cardiovascolari, in particolare quelle associate a perdita di cardiomiociti (infarto del miocardio, cardiomiopatia di origine ischemica e non-ischemica, miocardite e scompenso cardiaco).
In particolare, Ã ̈ di fondamentale importanza la scoperta di agenti attivi capaci di stimolare la proliferazione dei cardiomiociti, in particolare nella porzione del tessuto cardiaco danneggiata o compromessa nella sua funzione fisiologica.
E’ stato ora scoperto che 208 microRNA umani sono capaci di incrementare significativamente la proliferazione di cardiomiociti di ratto in vitro. Di questi, 37 microRNA hanno anche incrementato la proliferazione di cardiomiociti isolati dal cuore di topi neonati e di cardiomiociti derivati da cellule staminali umane.
Inoltre, à ̈ stato anche scoperto che microRNA selezionati inducono proliferazione di cardiomiociti in modelli animali, in particolare in seguito all’iniezione intracardiaca di microRNA sintetici nel ratto o all’iniezione intraperitoneale di vettori adeno-associati (AAV) esprimenti i microRNA nel topo. Di particolare rilevanza, questi microRNA hanno migliorato la funzionalità cardiaca in un modello animale di infarto del miocardio, indotto attraverso la legatura dell’arteria coronaria.
Questi risultati, ottenuti in modelli animali valutati e accettati, supportano lo sviluppo di medicamenti per il trattamento di patologie cardiache in soggetti umani.
Riassunto dell’invenzione
Gli oggetti della presente invenzione sono specificati nelle rivendicazioni allegate, tuttavia, altri oggetti e propositi dell’invenzione saranno evidenti dalla seguente descrizione.
Sono oggetti della presente invenzione:
i) MicroRNA, in particolare un gruppo di 37 microRNA selezionati, preferibilmente di origine umana, capaci di stimolare la proliferazione dei cardiomiociti, rendendo quindi possibile un metodo e un medicamento per stimolare la rigenerazione cardiaca in vivo attraverso la stimolazione della proliferazione dei cardiomiociti, e quindi un metodo, un medicamento e composizioni, vettori e formulazioni per la sua somministrazione per il trattamento di patologie cardiache associate a perdita di cardiomiociti (in particolare infarto del miocardio, cardiomiopatia di origine ischemica o nonischemica e scompenso cardiaco).
ii) MicroRNA, preferibilmente di origine umana, in particolare gli stessi 37 microRNA dell’oggetto i), aventi la capacità di stimolare la proliferazione dei cardiomiociti in coltura cellulare, e quindi aventi la capacità di migliorare l’ottenimento e l’espansione di cardiomiociti a partire da cellule staminali embrionali (ottenute da colture embrionali, trasferimento nucleare e clonazione animale, attraverso la tecnologia iPS o qualsiasi altra tecnologia), con il fine ultimo di stimolare la generazione di cardiomiociti per utilizzo in laboratorio (diagnosi di malattia umana) o applicazione clinica in vivo (riparo cardiaco per le applicazioni elencate sopra).
I metodi correlati sono anche oggetti della presente invenzione.
iii) I metodi di somministrazione (delivery) dei microRNA descritti sopra per le applicazioni in vitro e in vivo. In particolare, i vettori, le composizioni e le formulazioni sono compresi nell’ambito della presente invenzione.
iv) Un metodo per lo screening ad alta processività (high-throughput) di composti biologicamente attivi per la loro capacità di incrementare la proliferazione di cardiomiociti, basato sulla microscopia ad alto contenuto (highcontent), tale metodo à ̈ qui utilizzato per la selezione dei microRNA che sono anche oggetto della presente invenzione.
Descrizione dell’invenzione
E’ un oggetto della presente invenzione un gruppo di microRNA umani, in particolare di 37 microRNA umani singoli, o la loro combinazione, capaci di indurre la proliferazione di cardiomiociti di varia origine (ratto, topo e uomo), come elencati nella Tabella 1.
SEQ Nome # collocazione Sequenza
ID miRBase
1 hsa-miR- MIMAT0002891 ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGG 18a*
2 hsa-miR- MIMAT0004751 UGCCCUAAAUGCCCCUUCUGGC 18b*
3 hsa-miR- MIMAT0004490 AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA 19a*
4 hsa-miR-19b- MIMAT0004492 AGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCA 2*
5 hsa-miR-23a MIMAT0000078 AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC
6 hsa-miR-23b MIMAT0000418 AUCACAUUGCCAGGGAUUACC
7 hsa-miR-26b MIMAT0000083 UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU
8 hsa-miR- MIMAT0000088 CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC 30a*
9 hsa-miR- MIMAT0000693 CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC 30e*
10 hsa-miR- MIMAT0004811 CAGUGCCUCGGCAGUGCAGCCC 33b*
11 hsa-miR- MIMAT0004593 UUCACAUUGUGCUACUGUCUGC hsa-miR- MIMAT0004599 GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU 143*
hsa-miR- MIMAT0000256 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 181a
hsa-miR- MIMAT0000232 ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA 199a-3p
hsa-miR-210 MIMAT0000267 CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA
hsa-miR-219- MIMAT0000276 UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU 5p
hsa-miR- MIMAT0000684 UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA 302a
hsa-miR- MIMAT0000715 UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG 302b
hsa-miR- MIMAT0000717 UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG 302c
hsa-miR- MIMAT0000716 UUUAACAUGGGGGUACCUGCUG 302c*
hsa-miR- MIMAT0000718 UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU 302d
hsa-miR- MIMAT0005931 UAAGUGCUUCCAUGCUU 302e
hsa-miR- MIMAT0004703 UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC 335*
hsa-miR-372 MIMAT0000724 AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGU
hsa-miR-455- MIMAT0003150 UAUGUGCCUUUGGACUACAUCG 5p
hsa-miR-511 MIMAT0002808 GUGUCUUUUGCUCUGCAGUCA 27 hsa-miR- MIMAT0002834 AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU 520a-3p
28 hsa-miR- MIMAT0002843 AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG 520b
29 hsa-miR- MIMAT0002846 AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU 520c-3p
30 hsa-miR-590- MIMAT0004801 UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU 3p
31 hsa-miR-875- MIMAT0004922 UAUACCUCAGUUUUAUCAGGUG 5p
32 hsa-miR-885- MIMAT0004947 UCCAUUACACUACCCUGCCUCU 5p
33 hsa-miR- MIMAT0005896 AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGG 1244 UU
34 hsa-miR- MIMAT0005900 ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCU 1248 AAA
35 hsa-miR- MIMAT0005939 UCGCCUCCUCCUCUCCC
1281
36 hsa-miR- MIMAT0006765 UCCAGUGCCCUCCUCUCC
1825
37 hsa-miR- MIMAT0009977 UGUUUUGAUAACAGUAAUGU 2052
Tabella 1. Elenco dei microRNA che inducono proliferazione cardiaca
Un altro oggetto della presente invenzione à ̈ uno dei microRNA elencati sopra, o una miscela degli stessi, per uso nella promozione della proliferazione di cardiomiociti in vivo, nella prevenzione o nel trattamento di patologie cardiache associate a perdita di miociti cardiaci (tra cui, ma non limitate a, infarto del miocardio, cardiomiopatia ischemica e non-ischemica e scompenso cardiaco) e nell’induzione di rigenerazione cardiaca.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ uno dei microRNA elencati sopra, o una miscela degli stessi, per uso in vitro o ex vivo per promuovere la proliferazione di cardiomiociti e per l’espansione di cellule analoghe a cardiomiociti ottenute da cellule staminali embrionali, cellule pluripotenti indotte (iPS) o cellule staminali ottenute mediante altre procedure.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per lo screening ad alta processività di composti con attività biologica e terapeutica per la loro capacità di aumentare la proliferazione dei cardiomiociti. Tale metodo à ̈ utilizzato per la selezione dei microRNA che sono anche un oggetto della presente invenzione.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ una sequenza (stretch) di RNA contenente uno o una combinazione dei microRNA elencati sopra. Tale sequenza di RNA à ̈ ottenuta in vitro attraverso metodi di trascrizione in assenza di elementi cellulari, viene prodotta per sintesi oppure viene espressa da cellule in seguito al trasferimento della relativa sequenza di DNA codificante, oppure à ̈ introdotta o espressa nelle cellule tramite somministrazione di un vettore virale.
La presente invenzione inoltre fornisce uno dei microRNA elencati sopra, o una loro combinazione, per uso come medicamento.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ una composizione farmaceutica, comprendente uno dei microRNA sopra elencati, o una loro combinazione, come principi attivi per la prevenzione o il trattamento di patologie cardiache associate a perdita di cellule muscolari cardiache (tra cui, ma non limitate a, infarto del miocardio, cardiomiopatia e scompenso cardiaco).
E’ ancora un altro oggetto della presente invenzione un agente progettato per aumentare i livelli di espressione di uno o più dei microRNA elencati sopra per il trattamento di patologie cardiache. Detto agente à ̈ un microRNA, un composto chimico, una composizione farmaceutica, una proteina ricombinante ottenuta in vitro, espressa nelle cellule dopo trasferimento della relativa sequenza di DNA, o espressa dalle cellule tramite somministrazione di un vettore.
Questi e altri oggetti dell’invenzione saranno descritti in dettaglio nella seguente descrizione anche per mezzo di esempi e Figure.
Nelle Figure:
La Figura 1 mostra i risultati dello screening per l’induzione della proliferazione dei cardiomiociti da parte dei microRNA. Ogni punto indica l’effetto esercitato dai singoli microRNA sulla proliferazione dei cardiomiociti in due esperimenti identici. I microRNA di controllo ricadono nel riquadro in basso (linee punteggiate); i 37 microRNA che sono oggetto di questa invenzione sono nel riquadro in alto (numero di cardiomiociti proliferanti, EdU+, Ki67+ >35% fino al 55%).
La Figura 2 mostra degli esempi di microRNA che aumentano la proliferazione dei cardiomiociti in vitro, misurata come positività per EdU e Ki67.
La Figura 3 mostra esempi di microRNA che aumentano la proliferazione e la citochinesi dei cardiomiociti in vitro, come misurato dalla fosforilazione dell’istone H3 (sinistra) e dalla positività per la localizzazione di Aurora B nei corpi intermedi (midbodies) (destra).
La Figura 4 mostra esempi di microRNA che aumentano la proliferazione dei cardiomiociti in vivo, misurata dalla positività per l’incorporazione di EdU, un analogo al nucleotide uridina.
La Figura 5 mostra gli effetti del microRNA hsa-miR-590-3p e del microRNA hsamiR-199a-3p, in seguito a somministrazione, mediante un vettore AAV, al cuore di topo con infarto. A. Area corrispondente all’infarto del miocardio (MI). B. Da sinistra a destra, gli istogrammi indicano: la frazione di eiezione del ventricolo sinistro (EF), l’accorciamento frazionale (fractional shortening) (FS) del ventricolo sinistro e l’ispessimento sistolico della parete anteriore del ventricolo sinistro al giorno 12 e 30 dopo il trattamento. I controlli sono animali con infarto trattati con un microRNA irrilevante.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
La presente invenzione fornisce i microRNA, preferibilmente di origine umana, che hanno la proprietà di indurre proliferazione dei cardiomiociti in vitro e in vivo e che sono stati selezionati da una libreria mediante metodi di screening ad alta processività, in particolare basati sull’analisi di immagine ad alto contenuto. Un metodo preferito à ̈ lo screening ad alta processività basato sulla microscopia a fluorescenza in cardiomiociti neonatali di ratto utilizzando sequenze di sintesi di microRNA maturi, corrispondenti a tutti i microRNA umani annotati (secondo la versione 13.0 di miRBase, 2009).
Come descritto più in dettaglio nell’Esempio 1, cardiomiociti primari di ratto sono stati trattati con ciascuno dei microRNA della libreria, colorati con un colorante nucleare convenzionale, come ad esempio l’Hoechst 33432, con anticorpi diretti contro il marcatore cardiomiocitario alfa-actinina sarcomerica e contro l’antigene di proliferazione Ki-67, e con EdU, un analogo dell’uridina che viene incorporato nel DNA di nuova sintesi.
Con tale metodo sono stati identificati 208 microRNA che possono aumentare in maniera significativa la proliferazione dei cardiomiociti.
Animali da laboratorio, ad esempio ratti, sono utilizzati per l’isolamento dei cardiomiociti. Preferibilmente, i miociti sono isolati da animali neonati secondo metodi noti. Sono preferibilmente usati miociti da ventricoli.
I singoli microRNA sono trasferiti dalla libreria in piastre di micropozzetti, ciascuno in un pozzetto singolo. Successivamente, ognuno di questi microRNA à ̈ trasfettato all’interno di cardiomiociti animali. L’ordine di grandezza preferito delle cellule seminate à ̈ di 1x104 cellule per pozzetto. Un protocollo standard di trasfezione inversa può essere utilizzato, con una concentrazione finale di microRNA adeguata, per esempio di 25 nM. Lo screening viene ripetuto un certo numero di volte per una sperimentazione accurata, per esempio in duplicato.
Successivamente alla trasfezione e alla semina delle cellule, per esempio 24 ore, il terreno di coltura può essere sostituito con terreno fresco. In seguito, come 28 ore dopo, ossia 52 ore dopo la semina, il terreno di coltura viene sostituito con un terreno adeguato per valutare la vitalità cellulare, vengono usati almeno due marcatori di proliferazione, ad esempio EdU e Ki-67, per un tempo adeguato (ad esempio 20 ore). Le cellule sono fissate, generalmente intorno alle 72 ore dopo la semina, e processate per l’immunofluorescenza come noto nell’arte. Le cellule sono poi colorate, preferibilmente per una notte alla temperatura solita (per esempio 4°C) con gli anticorpi primari diluiti in una soluzione di blocco. Esempi di anticorpi primari sono un anticorpo monoclonale di topo contro l’alfa-actinina del sarcomero e un anticorpo di coniglio contro Ki67. Altri anticorpi possono essere utilizzati. Le cellule sono quindi lavate con un mezzo, ad esempio tampone fosfato salino, e incubate per un tempo sufficiente (come 2 ore) con i rispettivi anticorpi secondari coniugati ad un marcatore rilevabile. Le cellule sono ulteriormente processate per rivelare l’incorporazione di EdU e colorate come noto nell’arte.
L’acquisizione delle immagini à ̈ quindi realizzata con una strumentazione commerciale, come un microscopio a fluorescenza per screening ad alto contenuto, ed à ̈ effettuata l’analisi delle immagini. Le cellule sono considerate proliferanti solo se risultano positive per entrambi gli almeno due marcatori di proliferazione; i cardiomiociti si distinguono dalle altre cellule presenti nella coltura primaria (ad esempio fibroblasti e cellule endoteliali) per la loro positività all’alfaactinina sarcomerica.
La selezione di microRNA à ̈ ripetuta in un animale da laboratorio diverso dall’animale usato nella prima selezione al fine di selezionare quei microRNA che agiscono riconoscendo un gruppo conservato di bersagli.
La selezione dei microRNA per aumentare la proliferazione dei cardiomiociti nell’uomo à ̈ quindi effettuata trasfettando i microRNA emersi dalla seconda selezione in cardiomiociti umani derivati da cellule staminali embrionali, che sono commercialmente disponibili (ad esempio, da Cytiva Cardiomyocytes, GE Healthcare). Queste cellule comprendono sottotipi ventricolari, atriali e nodali, la maggior parte sono miociti ventricolari, e sono caratterizzati dal punto di vista morfologico, elettrofisiologico e del profilo di espressione dei marcatori cardiaci, e pertanto costituiscono una alternativa biologica rilevante alle cellule primarie, impossibili da ottenere a partire da donatori umani per analisi di tipo predittivo.
Collettivamente, i risultati qui descritti identificano un sottogruppo di microRNA capaci di aumentare la proliferazione dei cardiomiociti di diverse specie, incluse le cellule umane. E’ rilevante che questi microRNA rappresentano il punto di partenza per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici contro le patologie cardiache nell’uomo.
E’ un altro oggetto della presente invenzione un metodo per lo screening di microRNA, preferibilmente di origine umana, e i microRNA ottenibili dallo screening di una libreria di microRNA, detto screening che comprende: a) trasfettare ogni microRNA in un cardiomiocita isolato da un primo soggetto animale, b) coltivare detto cardiomiocita trasfettato; c) valutare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trasfettato; d) selezionare i microRNA capaci di indurre la proliferazione in detto cardiomiocita trasfettato.
E’ un altro oggetto della presente invenzione un metodo per lo screening di microRNA, preferibilmente di origine umana, e i microRNA ottenibili dallo screening di una libreria di microRNA, detto screening che comprende: a) trasfettare ogni microRNA in un cardiomiocita isolato da un primo soggetto animale, b) coltivare detto cardiomiocita trasfettato; c) valutare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trasfettato; d) selezionare i microRNA capaci di indurre la proliferazione in detto cardiomiocita trasfettato; e) trasfettare ogni microRNA selezionato nel passaggio d) in un cardiomiocita isolato da un secondo soggetto animale diverso da detto primo animale; f) coltivare detto cardiomiocita trasfettato; g) valutare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trasfettato; h) selezionare i microRNA capaci di indurre la proliferazione in detto cardiomiocita trasfettato del passaggio g).
E’ un altro oggetto della presente invenzione un metodo per lo screening di microRNA, preferibilmente di origine umana, e i microRNA ottenibili dallo screening di una libreria di microRNA, detto screening che comprende: a) trasfettare ogni microRNA in un cardiomiocita isolato da un primo soggetto animale, b) coltivare detto cardiomiocita trasfettato; c) valutare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trasfettato; d) selezionare i microRNA capaci di indurre la proliferazione in detto cardiomiocita trasfettato; e) trasfettare ogni microRNA selezionato nel passaggio d) in un cardiomiocita isolato da un secondo soggetto animale diverso da detto primo animale; f) coltivare detto cardiomiocita trasfettato; g) valutare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trasfettato; h) selezionare i microRNA capaci di indurre la proliferazione in detto cardiomiocita trasfettato del passaggio g), i) trasfettare ogni microRNA selezionato nel passaggio h) in un cardiomiocita isolato derivante da una cellula staminale umana; j) coltivare detto cardiomiocita trasfettato; k) valutare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trasfettato; l) selezionare i microRNA capaci di indurre la proliferazione in detto cardiomiocita trasfettato del passaggio g).
I passaggi di valutazione e selezione nei metodi di cui sopra sono preferibilmente effettuati con metodi di screening ad alta processività, in particolare basati sull’analisi di immagine ad alto contenuto. Un metodo preferito à ̈ lo screening ad alta processività basato sulla microscopia a fluorescenza.
I microRNA ottenuti dal metodo sopra descritto sono capaci di indurre proliferazione in cardiomiociti, in vitro e in vivo; in particolare sono capaci di indurre proliferazione di cardiomiociti di un soggetto animale, più in particolare in diversi soggetti animali, ancora più in particolare nell’uomo.
Modificazioni dello scheletro dei microRNA sono anche contemplate nella presente invenzione. La modificazione può essere realizzata secondo tecniche note, a condizione che dette modificazioni non alterino la funzione dei microRNA della presente invenzione. Tali modifiche includono, ma non sono limitate a, sostituzione di atomi di ossigeno legati in maniera non covalente al gruppo fosfato, introduzione di un gruppo alchile nella molecola di zucchero dei nucleotidi, inclusione di atomi di carbonio che collegano legami aggiuntivi negli zuccheri dei nucleotidi e i simili. Queste modifiche sono note nel settore e non richiedono ulteriori specificazioni.
I microRNA della presente invenzione sono capaci di aumentare la mitosi, la divisione cellulare (citochinesi) e il numero di cellule dei cardiomiociti in vitro e in vivo, come dimostrato negli esempi sotto.
Nelle forme di realizzazione della presente invenzione che riguardano i microRNA come medicamenti, in particolare per la prevenzione ed il trattamento delle patologie cardiache associate alla perdita di cardiomiociti (infarto del miocardio, cardiomiopatia di origine ischemica e non ischemica, miocardite e scompenso cardiaco), questi possono essere somministrati ad un soggetto affetto da detta malattia mediante metodi convenzionali.
Convenientemente, detto medicamento à ̈ nella forma di una preparazione per somministrazione parenterale, intracoronarica o intracardiaca, ma altre forme sono altrettanto idonee per mettere in atto la presente invenzione. L’esperto del settore deciderà la tempistica efficace di somministrazione, a seconda delle condizioni del paziente, del livello di gravità della patologia, della risposta del paziente e di ogni altro parametro clinico compreso nella conoscenza generale di questo argomento.
Le composizioni farmaceutiche conterranno almeno uno dei seguenti elementi: un RNA sintetico corrispondente al microRNA della presente invenzione, DNA codificante per detto microRNA, DNA codificante per un precursore di detto RNA, come quando il microRNA à ̈ prodotto da una cellula che contiene tale DNA. La somministrazione di uno dei microRNA della presente invenzione, o del corrispondente DNA codificante, può avvenire insieme a molecole lipidiche, come ad esempio lipidi cationici che ne possono facilitare il trasporto, secondo lo stato dell’arte. Un ulteriore metodo per somministrare tali microRNA o i loro corrispondenti DNA à ̈ per mezzo di un vettore adatto, noto per la somministrazione di RNA o DNA. Un vettore più preferito à ̈ il vettore adenoassociato (AAV), un vettore virale ben noto per la somministrazione di DNA in vivo (Mingozzi et al. 2011). Tutti questi metodi e formulazioni per somministrare il suddetto RNA sintetico corrispondente al microRNA della presente invenzione, il DNA codificante per detto microRNA, il DNA codificante per un precursore di detto RNA, come quando il microRNA à ̈ prodotto dentro le cellule contenenti tale DNA, sono convenzionali e ben noti nel settore e non richiedono ulteriori spiegazioni.
L’iniezione à ̈ una via preferita di somministrazione. Tuttavia, la persona esperta nel settore può decidere di somministrare i microRNA per mezzo di qualsiasi composizione farmaceutica convenzionale. Si può fare riferimento al Remington’s Pharmaceutical Sciences, ultima edizione.
Il regime di somministrazione, il dosaggio e la posologia saranno decisi dal medico in base alla propria esperienza, alla malattia da trattare e alle condizioni del paziente.
A seconda della via di somministrazione prescelta, le composizioni saranno in forma solida o liquida, adatta alla somministrazione orale, parenterale o endovenosa. La terapia genica à ̈ anche un’altra forma di realizzazione. Le composizioni secondo la presente invenzione contengono, insieme all’ingrediente attivo, almeno un vettore o un eccipiente farmaceuticamente accettabile. Questi possono essere dei coadiuvanti della formulazione particolarmente utili, ad esempio agenti solubilizzanti, agenti disperdenti, agenti sospendenti e agenti emulsionanti.
Gli agenti attivi per uso nella presente invenzione possono essere somministrati come un medicamento, ovvero una composizione farmaceutica. Tale composizione contiene almeno un agente attivo della presente invenzione con un veicolo adeguato. Diverse vie e tecniche di somministrazione possono essere utilizzate, tra cui tecniche parenterali, come l’iniezione endovenosa, intracardiaca e intra-arteriosa, il cateterismo e simili. Le quantità medie di composto attivo possono variare e in particolare dovrebbero essere basate sulle raccomandazioni e la prescrizione di un medico qualificato.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per lo screening di composti biologicamente e terapeuticamente attivi per la loro capacità di incrementare la proliferazione dei cardiomiociti, detto metodo comprendente i passaggi: a) fornire un cardiomiocita trasfettato con uno qualsiasi dei microRNA descritti sopra; b) mettere in contatto un candidato per un composto terapeuticamente attivo con detto cardiomiocita, c) testare la capacità di proliferazione di detto cardiomiocita trasfettato, d) selezionare i composti in grado di indurre la proliferazione di detto cardiomiocita trasfettato.
I seguenti esempi illustrano ulteriormente l†̃invenzione:
ESEMPIO 1
Lo screening funzionale identifica microRNA che controllano la proliferazione di cardiomiociti neonatali di ratto in vitro
Considerato il coinvolgimento dei microRNA nella regolazione di molteplici processi biologici, tra cui la proliferazione cellulare, abbiamo voluto sondare se i microRNA potessero controllare la proliferazione dei cardiomiociti in vitro e identificare i microRNA più efficaci nell’aumentare la capacità proliferativa di queste cellule.
Per affrontare questo problema, abbiamo realizzato uno screening ad alta processività basato sulla microscopia a fluorescenza in cardiomiociti neonatali di ratto utilizzando una libreria commerciale di 988 mimetici di microRNA (miRIDIAN microRNA mimics, Dharmacon, Thermo Scientific), corrispondenti a tutti i microRNA umani annotati (secondo la versione 13.0 del miRBase, 2009). Le cellule sono state colorate con il colorante nucleare Hoechst 33432, con anticorpi contro il marcatore del cardiomiocita alfa-actinina sarcomerica e l’antigene di proliferazione Ki-67 e con EdU, un analogo dell’uridina che viene incorporato nel DNA di nuova sintesi. Abbiamo utilizzato due marcatori di proliferazione (Ki67 e incorporazione di EdU) per aumentare l’affidabilità nell’identificazione delle cellule proliferanti; l’analisi automatica delle immagini à ̈ stata realizzata su circa 3000 cellule per condizione sperimentale.
Utilizzando tale approccio abbiamo identificato 208 microRNA capaci di incrementare significativamente la proliferazione dei cardiomiociti di oltre 2 volte (da 12,5% di proliferazione di base a più di 40%).
La Figura 1 mostra i Risultati dello screening per l’induzione di proliferazione dei cardiomiociti da parte di microRNA. Ogni punto indica l’effetto esercitato dai singoli microRNA sulla proliferazione dei cardiomiociti in due esperimenti identici. I microRNA di controllo ricadono nel riquadro in basso (linee punteggiate); i 37 microRNA che sono soggetto di questa invenzione sono dentro il riquadro in alto (numero di cardiomiociti proliferanti, EdU+, Ki67+ >35% fino a 55%).
La Figura 2 mostra esempi di microRNA che aumentano la proliferazione dei cardiomiociti in vitro, come valutato dalla positività per EdU e Ki67.
METODI
La cura e i trattamenti degli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali, in accordo con le leggi e le norme nazionali ed internazionali (Direttiva del Consiglio della CEE 86/609, OJL 358, 12 Dicembre 1987).
Ratti Wistar sono stati acquistati dalla Charles River Laboratories Italia Srl. I cardiomiociti sono stati isolati da ratti neonati come descritto in precedenza (Collesi et al. 2008), con minori modifiche. In breve, i ventricoli di ratti neonati (giorno 0) sono stati separati dagli atri, ridotti in frammenti e quindi dissociati in tampone Hanks con HEPES privo di calcio e bicarbonato (CBFHH) contenente 1,75 mg/ml di tripsina (BD Difco) e 10 ï g/ml di DNasi II (Sigma) in costante agitazione. La digestione à ̈ avvenuta a temperatura ambiente, in da otto a dieci passaggi di 10 minuti, raccogliendo il sopranatante a siero fetale bovino (FBS, Invitrogen) dopo ogni passaggio. Il sopranatante à ̈ stato centrifugato per isolare le cellule che sono state risospese in terreno Eagle modificato secondo Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (DMEM) contenente 4,5 g/l di glucosio (Invitrogen) integrato con 5% di FBS e 20 µg/ml di vitamina B12 (Sigma). Le cellule raccolte sono state fatte passare attraverso un filtro per cellule (40ï m, BD Falcon) e quindi seminate su piastre di plastica di 100 mm non rivestite per 2 ore a 37°C in atmosfera umidificata e al 5% di CO2. Il sopranatante, contenente essenzialmente cardiomiociti, à ̈ stato infine raccolto, le cellule sono state contate e piastrate; le colture di cardiomiociti ventricolari di ratto neonato allestite secondo questa procedura presentano una purezza superiore al 90%.
La libreria di microRNA corrispondente a tutti i microRNA umani maturi (miRIDIAN microRNA mimics) à ̈ stata acquistata da Dharmacon, Thermo Scientific. I singoli microRNA sono stati trasferiti mediante sistema robotizzato in piastre da 96 pozzetti Primaria (BD-Falcon), lasciando le colonne 1 e 12 vuote per l’aggiunta dei microRNA di controllo (cel-miR-67, hsa-miR-1). I microRNA sono stati trasfettati nei cardiomiociti neonatali di ratto (sono state seminate 1,0 x 104 cellule per pozzetto) ad una concentrazione finale di 25 nM, attraverso un protocollo di trasfezione inversa standard usando il reagente di trasfezione Lipofectamine RNAimax (Invitrogen); lo screening à ̈ stato condotto in duplicato.
Ventiquattro ore dopo la trasfezione e la semina delle cellule, il terreno di coltura à ̈ stato sostituito con terreno fresco; dopo ulteriori 28 ore, ovvero 52 ore dopo la semina, il terreno di coltura à ̈ stato sostituito con terreno contenente 5ï M di EdU per 20 ore. Le cellule sono state fissate a 72 ore dopo la semina e processate per l’immunofluorescenza. In breve, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti, permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,5% in soluzione tampone fosfato salino (PBS) per 10 minuti e quindi poste in una soluzione di blocco contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA) per 30 minuti. Le cellule sono quindi state colorate per una notte a 4°C con i seguenti anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco: anticorpo monoclonale di topo diretto contro la alfa-actinina del sarcomero (Abcam) e anticorpo di coniglio contro Ki67 (Monosan). Le cellule sono state lavate con PBS e incubate per 2 ore con i rispettivi anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor 488 o 647 (Invitrogen). Le cellule sono state ulteriormente trattate usando il Click-IT EdU555 Imaging Kit (Invitrogen) per rivelare l’incorporazione di EdU, secondo le istruzioni del produttore, e colorate con Hoechst 33432 (Invitrogen).
L’acquisizione delle immagini à ̈ stata realizzata utilizzando un microscopio a fluorescenza a screening ad alto contenuto, automatizzato, ImageXpress Micro (Molecular Devices) ad un ingrandimento 10x; in totale sono state acquisite 16 immagini per lunghezza d’onda, pozzetto e replica, corrispondenti a circa 3000 cellule analizzate per condizione sperimentale. L’elaborazione delle immagini à ̈ stata realizzata utilizzando il modulo di applicazione “Multi-Wavelenght Cell Scoring†implementato all’interno del software MetaXpress (Molecular Devices). Le cellule sono state conteggiate come proliferanti solo se positive per entrambi i marcatori di proliferazione (Ki-67 e EdU); i cardiomiociti sono stati distinti dalle altre cellule presenti nelle colture primarie (ad esempio fibroblasti e cellule endoteliali) per la loro positività all’alfa-actinina del sarcomero.
ESEMPIO 2
Un sottogruppo di microRNA controllano la proliferazione dei cardiomiociti di diversi organismi (ratto, topo e uomo) in vitro
Durante lo sviluppo, i cardiomiociti nel cuore di topo smettono di dividersi prima rispetto alle loro controparti nel cuore del ratto (rispettivamente poco dopo la nascita e 3-4 giorni dopo la nascita). Di conseguenza, i cardiomiociti isolati dal topo appena nato hanno una capacità proliferativa significativamente ridotta rispetto a quelli isolati dai ratti della stessa età; mentre la proliferazione dei cardiomiociti isolati dai ratti neonati (giorno 0 dopo la nascita) à ̈ circa del 12,5%, quella dei cardiomiociti murini à ̈ circa del 5%.
Pertanto, abbiamo ripetuto gli esperimenti ad alta processività basati sulla microscopia a fluorescenza descritti nell’esempio 1 in cardiomiociti neonatali di topo, usando i 208 microRNA selezionati, che si erano dimostrati capaci di incrementare la proliferazione dei cardiomiociti di ratto. I risultati di questi esperimenti hanno rivelato che dei 208 microRNA testati, 37 microRNA aumentavano anche la proliferazione dei cardiomiociti di topo, il che suggerisce che questi potrebbero agire colpendo un gruppo conservato di bersagli.
Al fine di valutare il potenziale utilizzo di tali microRNA per aumentare la proliferazione dei cardiomiociti umani, abbiamo trasfettato i 37 microRNA selezionati negli esperimenti condotti su cardiomiociti primari di ratto e di topo su cardiomiociti umani, derivati da cellule staminali embrionali, che sono commercialmente disponibili (Cytiva Cardiomyocytes, GE Healthcare). Queste cellule includono sottotipi ventricolari, atriali e nodali, la maggioranza essendo miociti ventricolari, e sono state estesamente caratterizzate in termini di morfologia, elettrofisiologia ed espressione di marcatori cardiaci, rappresentando pertanto un’alternativa biologicamente rilevante alle cellule primarie, impossibili da ottenere da donatori umani per test di tipo predittivo. I risultati di questi esperimenti hanno dimostrato che molti di questi microRNA incrementavano anche la proliferazione dei cardiomiociti umani.
Collettivamente, i risultati qui riportati identificano un sottogruppo di 37 microRNA in grado di aumentare la proliferazione di miociti cardiaci di diverse specie, compresa quella umana. Di particolare rilevanza, questi microRNA possono rappresentare il punto di partenza per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici contro le patologie cardiache nell’uomo.
METODI
Topi del ceppo CD1 sono stati acquistati dalla Charles River Laboratories Italia Srl. I cardiomiociti di topo sono stati isolati da topi neonati (giorno 0 dopo la nascita), come descritto nell’esempio 1 per i cardiomiociti di ratto.
I cardiomiociti derivati da cellule staminali embrionali umane (hESC) (Cytiva Cardiomyocytes) sono stati acquistati da GE Healthcare. Queste cellule sono state estesamente caratterizzate e rappresentano pertanto una valida alternativa alle cellule primarie. Le cellule sono state scongelate seguendo le istruzioni allegate dalla ditta venditrice.
I singoli microRNA selezionati sono stati trasferiti mediante un sistema robotizzato dalle piastre di stock della libreria di microRNA e riposizionati in piastre nere da 96 pozzetti con il fondo trasparente rivestito di collagene (Perkin-Elmer). La trasfezione dei microRNA selezionati nelle cellule murine e umane à ̈ stata condotta come descritto nei metodi dell’Esempio 1, eccetto che il numero di cellule seminate per pozzetto à ̈ stato 1,5 x 104 e 1 x 104 per le cellule murine e umane, rispettivamente, e la concentrazione finale di microRNA à ̈ stata 50 nM e 25 nM per le cellule murine e umane, rispettivamente.
Altri reagenti e procedure, inclusa l’acquisizione automatizzata delle immagini e la loro elaborazione, sono identici a quelli descritti nei Metodi dell’Esempio 1.
ESEMPIO 3
microRNA aumentano le mitosi, la divisione cellulare (citochinesi) e il numero di cellule dei cardiomiociti in vitro
Al fine di dimostrare che l’aumento della proliferazione dei cardiomiociti, rivelato colorando con il marcatore di proliferazione Ki67 e con l’incorporazione di EdU durante la sintesi di DNA, correla con un incremento degli eventi di divisione cellulare (citochinesi) dei cardiomiociti, i cardiomiociti sono stati trattati con i singoli microRNA e sono stati valutati ulteriori marcatori, quali: i) la colorazione per l’istone H3 fosforilato sulla serina in posizione 10 (P-S10-H3), che rivela le cellule nello stadio tardivo G2/mitosi; ii) la colorazione per la chinasi AuroraB, un componente dei corpi intermedi, una struttura transiente che compare verso la fine della citochinesi, immediatamente prima della separazione completa delle due cellule figlie, ed à ̈ preservata per un breve periodo successivo; e iii) numero di cardiomiociti al giorno 6 dopo la trasfezione del microRNA.
Il trattamento dei cardiomiociti con i microRNA selezionati ha portato ad un significativo aumento sia nel numero di cellule positive per P-S10-H3 (da 1,7% nel caso di un microRNA di controllo fino all’8%), sia nel numero di cellule che presentano corpi intermedi (dallo 0,5% al 4%). Come atteso, la percentuale di cellule positive per P-S10-H3 e di corpi intermedi à ̈ stata significativamente inferiore a quella delle cellule positive per Ki67 ed EdU, in quanto i primi sono dei marcatori di eventi che hanno una durata relativamente più breve.
In accordo con una progressione efficace attraverso il ciclo cellulare e l’effettiva realizzazione della citochinesi, l’analisi dei cardiomiociti trattati con i microRNA selezionati per 6 giorni ha rivelato che i microRNA selezionati hanno anche significativamente aumentato il numero di cardiomiociti rispetto ai controlli.
METODI
I singoli microRNA selezionati sono stati trasferiti mediante un sistema automatizzato in piastre da 96 pozzetti Primaria (BD Falcon). La trasfezione dei microRNA selezionati nei cardiomiociti neonatali di ratto e l’immunofluorescenza sono state condotte come descritto nei Metodi dell’Esempio 1. Le cellule sono state colorate con i seguenti anticorpi primari: anticorpo monoclonale di topo diretto contro l’alfa-actinina del sarcomero (Abcam), anticorpo di coniglio diretto contro l’istone H3 fosforilato sulla Serina 10 (Millipore) e anticorpo di coniglio diretto contro la chinasi Aurora B (Sigma).
Altri reagenti e procedure, inclusa l’acquisizione automatizzata delle immagini e la loro elaborazione, sono gli stessi di quelli descritti nei Metodi dell’Esempio 1. La quantificazione dei corpi intermedi colorati con l’anticorpo AuroraB à ̈ stata realizzata mediante osservazione e conta manuale delle 16 immagini acquisite per pozzetto.
ESEMPIO 4
microRNA aumentano la proliferazione dei cardiomiociti in vivo.
Considerato l’incremento della proliferazione dei cardiomiociti osservato dopo trattamento degli stessi con i microRNA selezionati in vitro, abbiamo voluto determinare se gli stessi microRNA fossero altrettanto capaci di aumentare la proliferazione in vivo. Come esempio, qui sotto riportiamo l’effetto di due dei microRNA selezionati: hsa-miR-199a-3p e hsa-miR-590-3p (corrispondenti ai microRNA più efficaci nell’indurre la proliferazione in vitro dei cardiomiociti di topo e ratto, rispettivamente).
I microRNA sintetici, complessati con un reagente di trasfezione, sono stati iniettati direttamente nel cuore di ratti neonati, e il loro effetto à ̈ stato valutato 4 giorni dopo, comparando il numero di cellule che hanno incorporato EdU negli animali iniettati con ciascuno dei due microRNA selezionati con quello degli animali iniettati con un microRNA di controllo (cel-miR-67). Abbiamo potuto osservare un significativo aumento del numero delle cellule proliferanti nel cuore degli animali iniettati con i microRNA selezionati (dal 3% negli animali iniettati con cel-miR-67 a circa il 10% negli animali iniettati con hsa-miR-199a-3p e hsa-miR-590-3p). Di particolare interesse, abbiamo confermato che una frazione significativa delle cellule proliferanti erano effettivamente cardiomiociti mediante analisi al microscopio confocale a fluorescenza. I risultati significativi sono mostrati in Figura 4, che comprende esempi di microRNA che aumentano la proliferazione dei cardiomiociti in vivo, valutata come positività per EdU.
In alternativa all’utilizzo di microRNA sintetici, ulteriori esperimenti sono stati condotti mediante iniezione intraperitoneale (IP) di vettori basati sul virus adenoassociato (AAV) codificanti per hsa-miR-199a e hsa-miR-590 in topi neonati. Tali vettori AAV sono capaci di trasdurre efficacemente il cuore (Inagaki et al, 2006); l’espressione dei microRNA da questi vettori à ̈ posta sotto il controllo del promotore costitutivo di CMV. La proliferazione cellulare nel cuore à ̈ stata valutata 12 giorni dopo l’iniezione, colorando con anticorpi contro l’alfa-actinina e P-S10-H3 per identificare le cellule in fase tardiva G2/mitosi. Abbiamo osservato un aumento significativo nel numero di cardiomiociti proliferanti nel cuore di animali iniettati con i microRNA selezionati rispetto agli animali iniettati con AAV di controllo.
Utilizzando tali approcci abbiamo determinato che i microRNA selezionati sulla base degli studi in vitro descritti negli Esempi 1, 2 e 3 sono capaci di aumentare significativamente la proliferazione dei cardiomiociti in vivo, sia nel ratto sia nel topo neonati. Inoltre, abbiamo dimostrato che questi microRNA sono attivi a prescindere dal fatto che siano introdotti come sequenze mature di sintesi, o espressi da un vettore virale.
METODI
Ratti neonati Wistar (al giorno 1 di vita) sono stati anestetizzati mediante raffreddamento su un letto di ghiaccio per 5 minuti. Una toracotomia laterale in corrispondenza del quarto spazio intercostale à ̈ stata realizzata mediante incisione cutanea e successiva dissezione dei muscoli intercostali. Successivamente all’iniezione intracardiaca dei complessi di microRNA mediante una siringa da insulina dotata di ago da 30 gauge (Roche), gli animali neonati sono stati prelevati dal letto di ghiaccio e sottoposti a sutura della parete toracica e del piano cutaneo soprastante. Infine, i neonati sono stati posti sotto una lampada rossa e riscaldati per alcuni minuti fino al loro risveglio spontaneo.
I complessi di microRNA sono stati preparati mescolando il microRNA (circa 2,8 ï g di cel-miR-67, hsa-miR-199a-3p o hsa-miR-590-3p, Dharmacon Thermo Scientific) con il reagente di trasfezione Lipofectamine RNAimax (Invitrogen) per 30 minuti a temperatura ambiente. Il volume totale della miscela iniettato in ogni cuore di ratto à ̈ stato di 30ï l.
Per la produzione dei vettori AAV, i pre-hsa-miR-199a e pre-hsa-miR-590, insieme alla sequenze fiancheggianti a monte e a valle (per un totale approssimativamente di 300 paia di basi) sono stati amplificati dal DNA genomico umano isolato da cellule HeLa usando il kit QIAamp DNA mini (Qiagen) seguendo le istruzioni allegate al prodotto. Le sequenze amplificate sono state clonate nel vettore pZac.
I vettori AAV ricombinanti sono stati ottenuti come descritto in precedenza (Zentilin et al., 2001). In breve, i vettori AAV sono stati generati in cellule HEK293T, usando una co-trasfezione plasmidica tripla per l’imballaggio (packaging) (Gao et al., 2004). Le preparazioni virali sono state ottenute mediante centrifugazione su gradiente di CsCl2. La titolazione delle particelle virali AAV à ̈ stata condotta quantificando il numero di genomi virali mediante PCR real-time come descritto in precedenza (Zentilin et al., 2001); le preparazioni virali usate per questo lavoro presentavano un titolo compreso tra 1x1012 e 1x1013 genomi virali (gv) per ml.
Negli esperimenti che hanno contemplato l’utilizzo di vettori AAV, topi CD1 neonati (al giorno 1 di vita) sono stati iniettati per via intraperitoneale usando una siringa da insulina dotata di ago da 30 gauge (Roche) con AAV-LacZ, AAV-hsa-miR-199a o AAV-hsa-miR-590 alla dose di 1x1011 gv per animale.
I cuori dei ratti e topi iniettati sono stati prelevati rispettivamente 4 e 12 giorni dopo l’iniezione e velocemente lavati in PBS per rimuovere eventuali residui ematici all’interno dei ventricoli. I cuori sono stati fissati in formalina al10% a temperatura ambiente e processati in modo abituale per l’inclusione in paraffina. Le colorazioni con ematossilina/eosina e tricromica di Masson sono state eseguite secondo protocolli standard e analizzate per la morfologia regolare e l’estensione della fibrosi. Per la colorazione con immunofluorescenza, le sezioni di campione sono state deparaffinate, reidratate e quindi processate come descritto nell’Esempio 1. Sono stati usati i seguenti anticorpi primari: anticorpo monoclonale di topo contro l’alfa-actinina del sarcomero (Abcam) e anticorpo di coniglio contro l’istone H3 fosforilato in Serina 10 (Millipore), seguiti dalla colorazione con anticorpi secondari anti-topo e anti-coniglio coniugati con Alexa Fluor 488 o 555 (Invitrogen). I nuclei sono stati identificati grazie alla colorazione con TOTO-3 (Invitrogen). I vetrini sono stati montati con Vectashield contenente DAPI (Vector Labs) e analizzati usando un microscopio automatizzato a fluorescenza ad alto contenuto ImageXpress Micro (Molecular Devices) oppure con il microscopio confocale 510 META (Carl Zeiss MicroImaging).
La quantificazione delle cellule positive per EdU o P-S10-H3 nelle diverse sezioni di cuore à ̈ stata realizzata mediante analisi automatizzata delle immagini, come descritto negli esempi 1 e 3.
ESEMPIO 5
microRNA preservano la funzionalità cardiaca dopo infarto del miocardio
Considerando l’aumento della proliferazione dei cardiomiociti osservato in conseguenza al trattamento con i microRNA selezionati in vitro e in vivo, abbiamo valutato l’effetto dei microRNA sulla funzione cardiaca dopo infarto del miocardio nel topo.
A tal fine i topi sono stati sottoposti a legatura permanente dell’arteria coronaria discendente anteriore sinistra, seguita immediatamente dall’iniezione nella zona di bordo dell’area infartuata del ventricolo sinistro dei vettori AAV esprimenti i microRNA selezionati o un vettore di controllo. La valutazione ecocardiografica a 12 giorni e a 1 mese dopo l’infarto ha rivelato che la frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) e l’accorciamento frazionale (LVFS) erano significativamente preservati nei topi infartuati trattati con AAV-hsa-miR-199a o AAV-hsa-miR-590 rispetto agli animali trattati con l’AAV di controllo (a 1 mese: LVEF 42%, 53%, 54%; LVFS 20%, 27%, 26% negli animali iniettati con controllo, hsa-miR-199a e hsa-miR-590, rispettivamente; P<0,05). L’ispessimento telesistolico della parete del LV dei cuori infartuati iniettati con i vettori AAV esprimenti i microRNA selezionati à ̈ risultato anche notevolmente migliorato rispetto al gruppo di controllo (da 0,77 mm negli animali iniettati con AAV di controllo a 0,98 e 0,97 mm negli animali iniettati con AAV-hsa-miR-199a e AAV-hsa-miR-590, rispettivamente).
Per determinare se il miglioramento della funzionalità cardiaca indotto dai microRNA selezionati fosse correlato ad una riduzione dell’estensione dell’infarto, un sottogruppo di animali (n=6) à ̈ stato sacrificato a 12 giorni dall’infarto e i cuori sono stati analizzati per quantificare l’area fibrotica post-infarto. L’analisi delle sezioni cardiache coronali sottoposte a colorazione tricromica ha rivelato che i topi trattati con AAV-hsa-miR-199a e AAV-hsa-miR-590 presentavano una significativa riduzione delle dimensioni dell’area infartuale rispetto agli animali di controllo con infarto (dal 28% dell’area del ventricolo sinistro negli animali trattati con l’AAV di controllo al 14% e 13% negli animali iniettati con AAV-hsa-miR-199a e AAV-hsamiR-590, rispettivamente).
Nel loro insieme, questi risultati indicano che l’espressione di hsa-miR-199a e hsamiR-590 in un modello animale di infarto del miocardio può ridurre le dimensioni dell’infarto e migliorare in maniera significativa la funzione cardiaca.
La Figura 5 mostra gli effetti dei microRNA hsa-miR-199a-3p e hsa-miR-590-3p in seguito alla somministrazione al cuore di topi infartuati mediante un vettore AAV.
METODI
L’infarto del miocardio à ̈ stato indotto in topi CD1 femmine (di 8-12 settimane) mediante legatura permanente dell’arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD). In breve, i topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di chetamina e xilazina, intubati per via endotracheale e collegati ad un ventilatore per piccoli animali. La temperatura corporea à ̈ stata mantenuta a 37°C grazie ad un piano riscaldato. Per accedere al cuore à ̈ stata eseguita una toracotomia sinistra. Dopo aver rimosso il pericardio, una branca discendente dell’arteria coronaria LAD à ̈ stata visualizzata allo stereomicroscopio (Leica) e chiusa con una sutura di nylon. La legatura à ̈ stata confermata dall’osservazione della comparsa di una zona biancastra nella regione del ventricolo sinistro immediatamente dopo la legatura. I vettori AAV ricombinanti alla dose di 1x1011 gv per animale, prodotti come descritto nell’esempio 4, sono stati iniettati immediatamente dopo la legatura LAD nel miocardio che circonda la zona dell’infarto (mediante un’iniezione singola), utilizzando una siringa da insulina dotata di ago da 30 gauge (Roche). Sono stati studiati tre gruppi di animali (n=12 per gruppo), che hanno ricevuto AAV-LacZ, AAV-hsa-miR-199a o AAV-hsa-miR-590. Il torace à ̈ stato chiuso e gli animali posizionati in decubito prono fino alla ripresa spontanea dell’attività respiratoria.
Al fine di valutare la funzione e le dimensioni del ventricolo sinistro, una ecocardiografia bidimensionale transtoracica à ̈ stata realizzata a 12 giorni e a 1 mese dopo l’induzione dell’infarto del miocardio sedando gli animali con isoflurano al 5% e utilizzando un Ultrasuono Visual Sonics Vevo 770 (Visual Sonics) dotato di una sonda lineare da 30 MHz. I tracciati in M-mode sono stati utilizzati per misurare lo spessore della parete anteriore e posteriore del ventricolo sinistro, e il diametro interno alla fine della sistole e alla fine della diastole, l’accorciamento frazionale e la frazione di eiezione.
Alla fine dello studio ecocardiografico (12 giorni o 1 mese dopo l’infarto), i cuori sono stati prelevati e processati per l’analisi istologica e per l’immunofluorescenza, come descritto nell’Esempio 4. Le dimensioni dell’infarto sono state calcolate come l’area fibrotica come percentuale dell’area totale del ventricolo sinistro.
Referenze citate
Ahuja, P., Sdek, P., and MacLellan, W.R. (2007). Cardiac myocyte cell cycle control in development, disease, and regeneration. Physiological reviews 87, 521-544.
Bartel, D.P. (2009). MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-233.
Bergmann, O., Bhardwaj, R.D., Bernard, S., Zdunek, S., Barnabe-Heider, F., Walsh, S., Zupicich, J., Alkass, K., Buchholz, B.A., Druid, H., et al. (2009). Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, NY 324, 98-102.
Bueno, M.J., Perez de Castro, I., and Malumbres, M. (2008). Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell cycle (Georgetown, Tex 7, 3143-3148.
Callis, T.E., Pandya, K., Seok, H.Y., Tang, R.H., Tatsuguchi, M., Huang, Z.P., Chen, J.F., Deng, Z., Gunn, B., Shumate, J., et al. (2009). MicroRNA-208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice. The Journal of clinicalinvestigation 119, 2772-2786.
Care, A., Catalucci, D., Felicetti, F., Bonci, D., Addario, A., Gallo, P., Bang, M.L., Segnalini, P., Gu, Y., Dalton, N.D., et al. (2007). MicroRNA-133 controlscardiachypertrophy. Nature medicine 13, 613-618.
Chen, J.F., Murchison, E.P., Tang, R., Callis, T.E., Tatsuguchi, M., Deng, Z., Rojas, M., Hammond, S.M., Schneider, M.D., Selzman, C.H., et al.(2008). Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 2111-2116.
Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., and Giacca, M. (2008). Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. The Journal of cell biology 183, 117-128.
Croce, C.M. (2009). Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nature reviews 10, 704-714.
Elmen, J., Lindow, M., Schutz, S., Lawrence, M., Petri, A., Obad, S., Lindholm, M., Hedtjarn, M., Hansen, H.F., Berger, U., et al. (2008). LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature 452, 896-899.
Eulalio, A., Huntzinger, E., and Izaurralde, E. (2008). Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing. Cell 132, 9-14.
Filipowicz, W., Bhattacharyya, S.N., and Sonenberg, N. (2008). Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nature reviews 9, 102-114.
Gao, G., Vandenberghe, L.H., Alvira, M.R., Lu, Y., Calcedo, R., Zhou, X., and Wilson, J.M. (2004). Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of virology 78, 6381-6388.
Ghildiyal, M., and Zamore, P.D. (2009). Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature reviews 10, 94-108.
Huang, Z.P., Neppl, R.L., and Wang, D.Z. (2010). MicroRNAs in cardiac remodeling and disease. Journal of cardiovascular translational research 3, 212-218.
Ikeda, S., Kong, S.W., Lu, J., Bisping, E., Zhang, H., Allen, P.D., Golub, T.R., Pieske, B., and Pu, W.T. (2007). Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics 31, 367-373.
Inagaki, K., Fuess, S., Storm, T.A., Gibson, G.A., McTiernan, C.F., Kay, M.A., and Nakai, H. (2006). Robust systemic transduction with AAV9 vectors in mice: efficient global cardiac gene transfer superior to that of AAV8. Mol Ther 14, 45-53.
Kedde, M., and Agami, R. (2008). Interplay between microRNAs and RNA-binding proteins determines developmental processes. Cell cycle (Georgetown, Tex 7, 899-903.
Lanford, R.E., Hildebrandt-Eriksen, E.S., Petri, A., Persson, R., Lindow, M., Munk, M.E., Kauppinen, S., and Orum, H. (2010). Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science (New York, NY 327, 198-201.
Latronico, M.V., and Condorelli, G. (2009). MicroRNAs and cardiac pathology. Nat Rev Cardiol 6, 419-429.
Lin, Z., Murtaza, I., Wang, K., Jiao, J., Gao, J., and Li, P.F. (2009). miR-23a functions downstream of NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 12103-12108.
Liu, N., Williams, A.H., Kim, Y., McAnally, J., Bezprozvannaya, S., Sutherland, L.B., Richardson, J.A., Bassel-Duby, R., and Olson, E.N. (2007). An intragenic MEF2-dependent enhancer directs muscle-specific expression of microRNAs 1 and 133. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 20844-20849.
Matkovich, S.J., Van Booven, D.J., Youker, K.A., Torre-Amione, G., Diwan, A., Eschenbacher, W.H., Dorn, L.E., Watson, M.A., Margulies, K.B., and Dorn, G.W., 2nd (2009). Reciprocal regulation of myocardial microRNAs and messenger RNA in human cardiomyopathy and reversal of the microRNA signature by biomechanical support. Circulation 119, 1263-1271.
Mingozzi F, High KA. Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress and challenges. Nat Rev Genet 2011; 12: 341-355.
Najafi-Shoushtari, S.H., Kristo, F., Li, Y., Shioda, T., Cohen, D.E., Gerszten, R.E., and Naar, A.M. (2010). MicroRNA-33 and the SREBP host genes cooperate to control cholesterol homeostasis. Science (New York, NY 328, 1566-1569.
O'Connell, R.M., Rao, D.S., Chaudhuri, A.A., and Baltimore, D. (2010). Physiological and pathological roles for microRNAs in the immune system. Nat Rev Immunol 10, 111-122.
Porrello, E.R., Johnson, B.A., Aurora, A.B., Simpson, E., Nam, Y.J., Matkovich, S.J., Dorn, G.W., 2nd, van Rooij, E., and Olson, E.N. (2011). MiR-15 family regulates postnatal mitotic arrest of cardiomyocytes. Circulation research 109, 670-679.
Rao, P.K., Toyama, Y., Chiang, H.R., Gupta, S., Bauer, M., Medvid, R., Reinhardt, F., Liao, R., Krieger, M., Jaenisch, R., et al. (2009). Loss of cardiac microRNA-mediated regulation leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Circulation research 105, 585-594.
Small, E.M., Frost, R.J., and Olson, E.N. (2010). MicroRNAs add a new dimension to cardiovascular disease. Circulation 121, 1022-1032.
Small, E.M., and Olson, E.N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature 469, 336-342.
Thum, T., Galuppo, P., Wolf, C., Fiedler, J., Kneitz, S., van Laake, L.W., Doevendans, P.A., Mummery, C.L., Borlak, J., Haverich, A., et al. (2007). MicroRNAs in the human heart: a clue to fetal gene reprogramming in heart failure. Circulation 116, 258-267.
Thum, T., Gross, C., Fiedler, J., Fischer, T., Kissler, S., Bussen, M., Galuppo, P., Just, S., Rottbauer, W., Frantz, S., et al. (2008). MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts. Nature 456, 980-984.
Umbach, J.L., and Cullen, B.R. (2009). The role of RNAi and microRNAs in animal virus replication and antiviral immunity. Genes & development 23, 1151-1164.
van Amerongen, M.J., and Engel, F.B. (2008). Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of cellular and molecular medicine 12, 2233-2244.
van Rooij, E., and Olson, E.N. (2007). MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of clinical investigation 117, 2369-2376.
van Rooij, E., Sutherland, L.B., Liu, N., Williams, A.H., McAnally, J., Gerard, R.D., Richardson, J.A., and Olson, E.N. (2006). A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 18255-18260.
van Rooij, E., Sutherland, L.B., Qi, X., Richardson, J.A., Hill, J., and Olson, E.N. (2007). Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA. Science (New York, NY 316, 575-579.
van Rooij, E., Sutherland, L.B., Thatcher, J.E., DiMaio, J.M., Naseem, R.H., Marshall, W.S., Hill, J.A., and Olson, E.N. (2008). Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 13027-13032.
Williams, A.H., Liu, N., van Rooij, E., and Olson, E.N. (2009). MicroRNA control of muscle development and disease. Current opinion in cell biology 21, 461-469.
Yang, B., Lin, H., Xiao, J., Lu, Y., Luo, X., Li, B., Zhang, Y., Xu, C., Bai, Y., Wang, H., et al. (2007). The muscle-specific microRNA miR-1 regulates cardiac arrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2. Nature medicine 13, 486-491.
Zentilin, L., Marcello, A., and Giacca, M. (2001). Involvement of cellular doublestranded DNA break binding proteins in processing of the recombinant adenoassociated virus genome. Journal of virology 75, 12279-12287.
Zhao, Y., Samal, E., and Srivastava, D. (2005). Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis. Nature 436, 214-220.

Claims (22)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un microRNA scelto dal gruppo che consiste di: UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU (SEQ ID NO: 30), ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA (SEQ ID NO: 14), ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGG (SEQ ID NO: 1), UGCCCUAAAUGCCCCUUCUGGC (SEQ ID NO: 2), AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA (SEQ ID NO: 3), AGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCA (SEQ ID NO: 4), AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC (SEQ ID NO: 5), AUCACAUUGCCAGGGAUUACC (SEQ ID NO: 6), UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU (SEQ ID NO: 7), CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC (SEQ ID NO: 8), CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC (SEQ ID NO: 9), CAGUGCCUCGGCAGUGCAGCCC (SEQ ID NO: 10), UUCACAUUGUGCUACUGUCUGC (SEQ ID NO: 11), GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU (SEQ ID NO: 12), AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU (SEQ ID NO: 13), CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA (SEQ ID NO: 15), UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU (SEQ ID NO: 16), UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA (SEQ ID NO: 17), UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG (SEQ ID NO: 18), UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG (SEQ ID NO: 19), UUUAACAUGGGGGUACCUGCUG (SEQ ID NO: 20), UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU (SEQ ID NO: 21), UAAGUGCUUCCAUGCUU (SEQ ID NO: 22), UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC (SEQ ID NO: 23), AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGU (SEQ ID NO: 24), UAUGUGCCUUUGGACUACAUCG (SEQ ID NO: 25), GUGUCUUUUGCUCUGCAGUCA (SEQ ID NO: 26), AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU (SEQ ID NO: 27), AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG (SEQ ID NO: 28), AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU (SEQ ID NO: 29), UAUACCUCAGUUUUAUCAGGUG (SEQ ID NO: 31), UCCAUUACACUACCCUGCCUCU (SEQ ID NO: 32), AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU (SEQ ID NO: 33), ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA (SEQ ID NO: 34), UCGCCUCCUCCUCUCCC (SEQ ID NO: 35), UCCAGUGCCCUCCUCUCC (SEQ ID NO: 36) e UGUUUUGAUAACAGUAAUGU (SEQ ID NO: 37), o una combinazione degli stessi per uso come medicamento per stimolare la rigenerazione cardiaca attraverso la proliferazione dei cardiomiociti.
  2. 2. Il microRNA come descritto nella rivendicazione 1 per uso come medicamento per il trattamento e/o la prevenzione di una patologia cardiaca associata alla perdita di cardiomiociti.
  3. 3. Il microRNA secondo la rivendicazione 2, in cui detta patologia à ̈ scelta dal gruppo che consiste di infarto del miocardio, cardiomiopatia ischemica e non-ischemica, miocardite e scompenso cardiaco.
  4. 4. Il microRNA secondo la rivendicazione 1 per uso in terapia genica.
  5. 5. Il microRNA secondo la rivendicazione 1 in cui il microRNA Ã ̈ scelto dal gruppo che consiste di ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA (SEQ ID NO: 14) e UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU (SEQ ID NO: 30).
  6. 6. Un vettore che comprende almeno un microRNA secondo la rivendicazione 1 e/o un DNA che codifica per almeno detto microRNA e/o un DNA che codifica per almeno un precursore per detto microRNA, o una miscela degli stessi.
  7. 7. Il vettore secondo la rivendicazione 6, che à ̈ un vettore adeno-associato (AAV).
  8. 8. Una composizione farmaceutica che comprende almeno un microRNA secondo la rivendicazione 1 e/o un DNA che codifica per almeno detto microRNA e/o un DNA che codifica per almeno un precursore per detto microRNA e/o un RNA che comprende almeno detto microRNA, o una miscela degli stessi, e almeno un vettore o eccipiente farmaceuticamente accettabile.
  9. 9. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8 in cui la somministrazione à ̈ parenterale, intracoronarica o intracardiaca.
  10. 10. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8 comprendente ulteriormente molecole lipidiche, preferibilmente lipidi cationici.
  11. 11. Metodo per la generazione e l’espansione di cardiomiociti da cellule staminali in vitro o ex vivo che comprende aggiungere a dette cellule almeno uno dei microRNA della rivendicazione 1, a condizione che detta cellula staminale non à ̈ una cellula staminale embrionale umana.
  12. 12. Metodo per stimolare la proliferazione di cardiomiociti in colture cellulari che comprende aggiungere a detta coltura cellulare almeno uno dei microRNA della rivendicazione 1.
  13. 13. Un cardiomiocita ottenuto con il metodo della rivendicazione 11.
  14. 14. Il cardiomiocita della rivendicazione 13 per uso per la diagnosi di malattie umane.
  15. 15. Il cardiomiocita della rivendicazione 13 per uso per la riparazione del cuore.
  16. 16. Metodo per lo screening ad alta processività di composti biologicamente e terapeuticamente attivi per la loro capacità di aumentare la proliferazione di cardiomiociti basato sulla microscopia ad alto contenuto e comprendente i passaggi: a) fornire un cardiomiocita trattato con almeno uno dei microRNA della rivendicazione 1, b) porre un candidato per un composto terapeuticamente attivo a contatto con detto cardiomiocita, c) testare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trattato, d) selezionare i composti capaci di indurre la proliferazione di detto cardiomiocita trattato.
  17. 17. Metodo per lo screening di microRNA, preferibilmente di origine umana, capaci di indurre la proliferazione dei cardiomiociti, comprendente i passaggi di: a) trattare ogni microRNA in un cardiomiocita isolato da un soggetto animale; b) coltivare detto cardiomiocita trattato; c) testare la capacità proliferativa di detto cardiomiocita trattato; d) selezionare i microRNA capaci di indurre la proliferazione in detto cardiomiocita trattato.
  18. 18. Metodo secondo la rivendicazione 17, in cui i passaggi di analisi e selezione sono realizzati mediante metodi di screening ad alta processività basati su analisi delle immagini ad alto contenuto.
  19. 19. Metodo secondo le rivendicazioni 17-18 che à ̈ uno screening ad alta processività basato sulla microscopia a fluorescenza.
  20. 20. MicroRNA ottenibile con i metodi delle rivendicazioni 17-19, a condizione che detto microRNA non à ̈ un microRNA della rivendicazione 1.
  21. 21. Un agente progettato per aumentare i livelli di espressione di uno o più dei microRNA della rivendicazione 1 per uso come medicamento per il trattamento di malattie cardiache.
  22. 22. Una sequenza di RNA comprendente almeno uno o una combinazione dei microRNA della rivendicazione 1 che à ̈ ottenuto in vitro mediante metodi di trascrizione privi di elementi cellulari, prodotto sinteticamente, espresso in cellule dopo trasferimento della relativa sequenza di DNA codificante, oppure à ̈ introdotto o espresso nelle cellule tramite somministrazione di un vettore virale, a condizione che non à ̈ un RNA esistente in natura.
IT000685A 2011-12-23 2011-12-23 Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci ITRM20110685A1 (it)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000685A ITRM20110685A1 (it) 2011-12-23 2011-12-23 Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci
US14/368,149 US10337002B2 (en) 2011-12-23 2012-12-21 MicroRNAs for cardiac regeneration through induction of cardiac myocyte proliferation
DK12823043.0T DK2794882T3 (en) 2011-12-23 2012-12-21 Micro-RNAs for cardiac regeneration by induction of cardiac myocyte proliferation
PL12823043T PL2794882T3 (pl) 2011-12-23 2012-12-21 MikroRNA do regeneracji serca poprzez indukowanie proliferacji miocytów serca
EP12823043.0A EP2794882B1 (en) 2011-12-23 2012-12-21 Micrornas for cardiac regeneration through induction of cardiac myocyte proliferation
ES12823043.0T ES2644574T3 (es) 2011-12-23 2012-12-21 MicroARN para la regeneración cardíaca mediante la inducción de proliferación de miocitos cardíacos
JP2014548318A JP6153538B2 (ja) 2011-12-23 2012-12-21 心臓筋細胞増殖の誘導による心臓再生のためのマイクロｒｎａ
PCT/IB2012/057590 WO2013093870A1 (en) 2011-12-23 2012-12-21 microRNAs FOR CARDIAC REGENERATION THROUGH INDUCTION OF CARDIAC MYOCYTE PROLIFERATION
JP2017081427A JP6420865B2 (ja) 2011-12-23 2017-04-17 心臓筋細胞増殖の誘導による心臓再生のためのマイクロｒｎａ
US16/400,333 US11236332B2 (en) 2011-12-23 2019-05-01 MicroRNAs for cardiac regeneration through induction of cardiac myocyte proliferation
US17/570,714 US20220228143A1 (en) 2011-12-23 2022-01-07 Micrornas for cardiac regeneration through induction of cardiac myocyte proliferation

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000685A ITRM20110685A1 (it) 2011-12-23 2011-12-23 Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ITRM20110685A1 true ITRM20110685A1 (it) 2013-06-24

Family

ID=45614969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
IT000685A ITRM20110685A1 (it) 2011-12-23 2011-12-23 Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci

Country Status (8)

Country Link
US (3) US10337002B2 (it)
EP (1) EP2794882B1 (it)
JP (2) JP6153538B2 (it)
DK (1) DK2794882T3 (it)
ES (1) ES2644574T3 (it)
IT (1) ITRM20110685A1 (it)
PL (1) PL2794882T3 (it)
WO (1) WO2013093870A1 (it)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITRM20110685A1 (it) 2011-12-23 2013-06-24 Internat Ct For Genetic En Gineering And Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci
MY190726A (en) * 2014-03-21 2022-05-12 Genzyme Corp Gene therapy for retinitis pigmentosa
PT3143123T (pt) * 2014-05-16 2020-02-04 Univ Pennsylvania Indução da regeneração cardíaca por micro-rna
DE102015216782B3 (de) * 2015-09-02 2017-01-26 Ikdt Institut Kardiale Diagnostik Und Therapie Gmbh Verwendung von im Blutserum oder Blutplasma zirkulierenden microRNAs zur Identifikation biopsiepflichtiger Patienten und als Marker zur Differentialdiagnose einzelner nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens
TWI685500B (zh) * 2015-10-13 2020-02-21 長庚大學 以微核酸-５２０ｂ（ｍｉＲ-５２０ｂ）序列作爲抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移及其醫藥組成物之用途
WO2017219002A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Massachusetts Institue Of Technology Chemiresistor with ionic liquid carbon nanotube composite for wireless chemical sensing
EP3375458A1 (en) * 2017-03-14 2018-09-19 I.C.G.E.B. International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology Microrna hsa-mir-665 in cardiac hypertrophy
GB201906052D0 (en) 2019-04-30 2019-06-12 Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Proteins with cardioprotective activity
EP3936616A1 (en) 2020-07-10 2022-01-12 Charité - Universitätsmedizin Berlin Microrna-targeted therapy for cardiac repair
CN112680509A (zh) * 2021-01-20 2021-04-20 河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院） 一种评估冠心病预后分子标志物miR-302e及其逆转录引物、扩增引物和应用
CN114958849B (zh) * 2022-05-26 2023-10-27 华南农业大学 lncRNACACF吸附miR-520b-3p在调控人脐静脉内皮细胞周期中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010138263A2 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
WO2011111824A1 (ja) * 2010-03-12 2011-09-15 第一三共株式会社 マイクロrnaを用いた心筋細胞の増殖方法

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7380126B2 (en) 2001-06-01 2008-05-27 Logan James D Methods and apparatus for controlling the transmission and receipt of email messages
EP2428571B1 (en) * 2001-09-28 2018-07-18 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. MicroRNA molecules
US20050256072A1 (en) 2004-02-09 2005-11-17 University Of Massachusetts Dual functional oligonucleotides for use in repressing mutant gene expression
EP1784501B1 (en) 2004-05-14 2015-11-18 Rosetta Genomics Ltd VIRAL AND VIRUS ASSOCIATED MicroRNAS AND USES THEREOF
EP2290071B1 (en) 2004-05-28 2014-12-31 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
WO2007148235A2 (en) * 2006-05-04 2007-12-27 Rosetta Genomics Ltd Cancer-related nucleic acids
DK2302055T3 (da) * 2004-11-12 2014-10-13 Asuragen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger involverende miRNA og miRNA-inhibitormolekyler
WO2006063356A1 (en) 2004-12-10 2006-06-15 Isis Phamaceuticals, Inc. Regulation of epigenetic control of gene expression
US20060185027A1 (en) 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
EP1877557A2 (en) 2005-04-04 2008-01-16 The Board of Regents of The University of Texas System Micro-rna's that regulate muscle cells
EP2377559A1 (en) 2005-06-03 2011-10-19 Southern Adelaide Health Service - Flinders Medical Centre Targeting cells with altered microRNA expression
CN103882124B (zh) 2005-08-01 2015-11-18 俄亥俄州立大学研究基金会 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物
WO2007081720A2 (en) * 2006-01-05 2007-07-19 The Ohio State University Research Foundation Microrna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of lung cancer
AU2007284036A1 (en) * 2006-08-16 2008-02-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Nucleic acid modulation of Toll-like receptor-mediated immune stimulation
WO2008042231A2 (en) 2006-09-29 2008-04-10 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for evaluating and treating heart failure
WO2008043521A2 (de) 2006-10-09 2008-04-17 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Microrna (mirna) zur diagnose und therapie von herzerkrankungen
WO2008063919A2 (en) 2006-11-10 2008-05-29 The Uab Research Foundation A microrna mediator of cardiomyopathy and heart failure
WO2008107901A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Agents, compositions and methods for treating pathologies in which regulating an ache-associated biological pathway is beneficial
BRPI0813527A2 (pt) 2007-07-18 2014-12-30 Univ Colorado Expressão diferencial de micro-rnas em corações humanos que não falham versus que falham
WO2009012263A2 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
WO2009099465A2 (en) * 2007-08-14 2009-08-13 Yale University Methods of using mir-199a as a marker and sequences of mir-199a as a therapeutic for cancer
DK2195450T4 (en) 2007-08-22 2016-10-24 Trovagene Inc Methods of using miRNA FOR DETECTION IN VIVO cell death
WO2009058818A2 (en) 2007-10-29 2009-05-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions comprising a micro-rna and methods of their use in regulating cardiac remodeling
JP5626619B2 (ja) 2008-12-08 2014-11-19 国立大学法人京都大学 効率的な核初期化方法
WO2009082817A1 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
AU2009207291B2 (en) 2008-01-27 2014-11-06 Mor Research Applications Methods and compositions for diagnosing complications of pregnancy
ES2936256T3 (es) 2008-02-01 2023-03-15 Massachusetts Gen Hospital Uso de microvesículas en el diagnóstico, y pronóstico de enfermedades y afecciones médicas
WO2009100342A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Medimmune, Llc Disease markers and uses thereof
WO2009105759A2 (en) 2008-02-21 2009-08-27 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Micro-rnas that modulate smooth muscle proliferation and differentiation and uses thereof
EP2254586B1 (en) * 2008-02-22 2015-04-08 Agency For Science, Technology And Research (A*star) Mesenchymal stem cell particles
US20110160285A1 (en) 2008-03-13 2011-06-30 The Regents Of The University Of Colorado Identification of mirna profiles that are diagnostic of hypertrophic cardiomyopathy
WO2009137807A2 (en) * 2008-05-08 2009-11-12 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
US20110160290A1 (en) 2008-05-21 2011-06-30 Muneesh Tewari Use of extracellular rna to measure disease
US20110152352A1 (en) 2008-06-10 2011-06-23 Tufts University Smad proteins control drosha-mediated mirna maturation
WO2010005295A1 (en) 2008-06-16 2010-01-14 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Means and methods for counteracting, delaying and/or preventing heart disease
US20100003674A1 (en) 2008-07-03 2010-01-07 Cope Frederick O Adult stem cells, molecular signatures, and applications in the evaluation, diagnosis, and therapy of mammalian conditions
WO2010033871A2 (en) 2008-09-18 2010-03-25 The Johns Hopkins University Compositions and methods targeting glutaminase
RU2562154C2 (ru) * 2008-11-19 2015-09-10 Антродженезис Корпорейшн Амниотические адгезивные клетки
EP2208785A1 (en) * 2009-01-15 2010-07-21 Newbiotechnic, S.A. Methods and kits to generate miRNA- and smallRNA-expressing vectors, and its application to develop lentiviral expression libraries
CN102388149A (zh) 2009-02-02 2012-03-21 西菲伊德公司 检测败血症的方法
US20110086348A1 (en) 2009-02-19 2011-04-14 The Cleveland Clinic Foundation Method for assessing heart disease
SG174150A1 (en) 2009-02-24 2011-10-28 Scripps Research Inst Reengineering mrna primary structure for enhanced protein production
EP2228444A1 (en) 2009-03-09 2010-09-15 Julius-Maximilians-Universität Würzburg microRNA for diagnostic and therapeutic purposes in cardiovascular diseases
WO2010108126A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Fate Therapeutics, Inc. Reprogramming compositions and methods of using the same
WO2010117860A2 (en) 2009-04-06 2010-10-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Microrna signature to predict prognosis in heart failure
AU2010237191A1 (en) * 2009-04-07 2011-11-03 Velin-Pharma A/S Method and device for treatment of conditions associated with inflammation or undesirable activation of the immune system
WO2010120969A1 (en) * 2009-04-15 2010-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting of the mir-30 family and let-7 family as a treatment for heart disease
WO2010126355A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for counteracting, preventing and/or determining heart failure, or a risk of heart failure
DK2425016T3 (en) 2009-04-29 2015-06-29 Amc Amsterdam MEANS AND METHODS TO REMEDY THE, PREVENT AND / OR diagnose heart failure or EN risk of cardiac failure
WO2010129672A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Miragen Therapeutics Lipophilic polynucleotide conjugates
WO2010129950A1 (en) 2009-05-08 2010-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Micro-rna that regulates cardiac remodeling
JP2012527478A (ja) 2009-05-20 2012-11-08 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 心筋梗塞後のリモデリングおよび心不全に関与するマイクロｒｎａの同定
WO2010151640A2 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory disorders and fibrotic disease
US8815822B2 (en) 2009-08-06 2014-08-26 Universiteit Maastricht Means and methods for counteracting, delaying and/or preventing adverse energy metabolism switches in heart disease
CN101643791A (zh) 2009-09-04 2010-02-10 哈尔滨医科大学 microRNA-328及其反义核苷酸在诊断、防治心脏疾病中的用途
CN102573856B (zh) 2009-09-10 2016-10-26 弗莱明·韦林 用于制备微小rna 的方法及其治疗性应用
EP2305810A1 (en) 2009-10-02 2011-04-06 Technische Universität München miRNAs in the treatment of fibrosis
WO2011044541A2 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Baylor Research Institute Identification of micrornas (mirnas) in fecal samples as biomarkers for gastroenterological cancers
CN102858997B (zh) 2009-11-02 2014-06-18 新加坡科技研究局 用于监测细胞状态和用于永生间充质干细胞的方法
WO2011072177A2 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Aviir, Inc. Biomarker assay for diagnosis and classification of cardiovascular disease
EP2341145A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-06 febit holding GmbH miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases
DE102010004722B4 (de) * 2010-01-15 2013-05-08 Maschinenfabrik Köppern Gmbh & Co. Kg Verschleißbeständiger, warmfester Werkstoff, sowie dessen Verwendung
EP3210611B1 (en) 2010-03-12 2019-08-21 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods of treating vascular inflammatory disorders
BR112012025593A2 (pt) 2010-04-06 2019-06-25 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings biomarcadores em circulação para doença
US9115345B2 (en) 2010-04-19 2015-08-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania MicroRNA induction of pluripotential stem cells and uses thereof
WO2011133036A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for determining risk of cardiovascular disease
WO2011154553A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Cellartis Ab Novel micrornas for the detection and isolaton of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types
WO2011157294A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Universita' Degli Studi Di Padova Compositions for use in treating or preventing cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, metastasis, heart failure, cardiac remodelling, dilated cardiomyopathy, autoimmune diseases, or diseases or disorders related thereto
GB201012272D0 (en) 2010-07-21 2010-09-08 Univ Coventry Assays for screening drug safety
WO2012012870A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Institut De Cardiologie De Montreal Pharmaceutical compositions for the treatment of left ventricular diastolic dysfunction comprising an apolipoprotein peptide/phospholipid complex
EP2603592A2 (en) 2010-08-13 2013-06-19 The University Court of the University of Glasgow Therapeutic uses of microvesicles and related micrornas
WO2012027704A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 New York University Mir-33 inhibitors and uses thereof
TW201303026A (zh) 2010-10-08 2013-01-16 Baylor Res Inst 作為鑑別家族性及非家族性結腸直腸癌生物標記之微型核糖核酸（ｍｉＲＮＡ）
US20120093885A1 (en) 2010-10-18 2012-04-19 Northwestern University Therapeutic vesicles
WO2012052953A1 (en) 2010-10-20 2012-04-26 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor MiRNA
EP2446929A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-02 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Microvesicles derived from atheroprotective endothelial cells for the treatment and prevention of atherosclerotic diseases
EP2635681B8 (en) 2010-11-05 2017-10-04 Miragen Therapeutics, Inc. Base modified oligonucleotides
WO2012072685A1 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Katholieke Universiteit Leuven, K.U.Leuven R&D Irak-related interventions and diagnosis
US20140024700A1 (en) 2010-12-15 2014-01-23 MiRagen Therapeutics, Inc. Blood-borne mirnas as surrogate markers of drug efficacy for cardiac conditions
WO2012094366A1 (en) 2011-01-06 2012-07-12 Cardiodx, Inc. Circulating mirnas as biomarkers for coronary artery disease
AU2012220872A1 (en) 2011-02-22 2013-09-12 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Circulating biomarkers
EP2681336A4 (en) 2011-03-02 2014-11-19 Groove Biopharma Corp ENHANCED BIODISTRIBUTION OF OLIGOMERS
US9322015B2 (en) 2011-03-09 2016-04-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods of using microRNA-26a to promote angiogenesis
WO2012149557A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 New York University miR-33 INHIBITORS AND USES THEREOF TO DECREASE INFLAMMATION
WO2012160551A2 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Rosetta Genomics Ltd Methods and compositions for determining heart failure or a risk of heart failure
ITRM20110685A1 (it) 2011-12-23 2013-06-24 Internat Ct For Genetic En Gineering And Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010138263A2 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
WO2011111824A1 (ja) * 2010-03-12 2011-09-15 第一三共株式会社 マイクロrnaを用いた心筋細胞の増殖方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S. HU ET AL: "MicroRNA-210 as a Novel Therapy for Treatment of Ischemic Heart Disease", CIRCULATION, vol. 122, no. 11_suppl_1, 14 September 2010 (2010-09-14), pages S124 - S131, XP055029627, ISSN: 0009-7322, DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.109.928424 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017186339A (ja) 2017-10-12
PL2794882T3 (pl) 2018-03-30
ES2644574T3 (es) 2017-11-29
WO2013093870A1 (en) 2013-06-27
JP6420865B2 (ja) 2018-11-07
US20190256850A1 (en) 2019-08-22
US20150011609A1 (en) 2015-01-08
JP2015502976A (ja) 2015-01-29
DK2794882T3 (en) 2017-10-30
US20220228143A1 (en) 2022-07-21
US11236332B2 (en) 2022-02-01
EP2794882A1 (en) 2014-10-29
US10337002B2 (en) 2019-07-02
EP2794882B1 (en) 2017-07-26
JP6153538B2 (ja) 2017-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220228143A1 (en) Micrornas for cardiac regeneration through induction of cardiac myocyte proliferation
Pan et al. MicroRNA-101 inhibited postinfarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via the FBJ osteosarcoma oncogene/transforming growth factor-β1 pathway
Topkara et al. Role of microRNAs in cardiac remodeling and heart failure
Harada et al. MicroRNA regulation and cardiac calcium signaling: role in cardiac disease and therapeutic potential
Thum et al. MicroRNAs: novel regulators in cardiac development and disease
Eulalio et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration
Shilo et al. MicroRNA in cutaneous wound healing: a new paradigm
Gong et al. Loss of m6A methyltransferase METTL3 promotes heart regeneration and repair after myocardial injury
Alam et al. Inhibition of senescence‐associated genes Rb1 and Meis2 in adult cardiomyocytes results in cell cycle reentry and cardiac repair post–myocardial infarction
CA3134991A1 (en) Pharmaceutical composition for treating cancer comprising microrna as active ingredient
Piccoli et al. Non-coding RNAs as modulators of the cardiac fibroblast phenotype
US9243247B2 (en) Composition for promoting apoptosis or inhibiting cell growth, comprising epstein-barr virus microrna
Luo et al. microRNA133a targets Foxl2 and promotes differentiation of C2C12 into myogenic progenitor cells
Liu et al. miR-371-5p down-regulates pre mRNA processing factor 4 homolog B (PRPF4B) and facilitates the G1/S transition in human hepatocellular carcinoma cells
Valkov et al. MicroRNA-1-mediated inhibition of cardiac fibroblast proliferation through targeting cyclin D2 and CDK6
US20140213634A1 (en) Method for proliferation cardiomyocytes using micro-rna
Mao et al. MiR-183-5p overexpression in bone mesenchymal stem cell-derived exosomes protects against myocardial ischemia/reperfusion injury by targeting FOXO1
Notari et al. Update on the pathogenic implications and clinical potential of microRNAs in cardiac disease
Fiedler et al. MicroRNA‐based therapeutic approaches in the cardiovascular system
Liu et al. MicroRNA-29c overexpression inhibits proliferation and promotes apoptosis and differentiation in P19 embryonal carcinoma cells
Haider et al. Micrornas with Mega Functions in Cardiac Remodeling and Repair: The Micromanagement of Matters of the Heart
KR102177130B1 (ko) 근육 질환 및 신경근육 질환 예방, 치료 또는 진단을 위한 miR-18b의 용도
Ono MicroRNA-Linked Heart Disease and Therapeutic Potential
ES2774486T3 (es) MicroARN para el tratamiento de enfermedades cardíacas
Momeni-Moghaddam et al. MicroRNAs: Small Regulators of Tissue Regeneration