TWI685500B - 以微核酸-５２０ｂ（ｍｉＲ-５２０ｂ）序列作爲抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移及其醫藥組成物之用途 - Google Patents

以微核酸-５２０ｂ（ｍｉＲ-５２０ｂ）序列作爲抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移及其醫藥組成物之用途 Download PDF

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Abstract

一種以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移之用途及其醫藥組成物，其中該序列係為5’-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3’(SEQ ID NO：2)，微核酸-520b序列具有抑制頭頸癌惡性表徵之功能，可增加放射與化療藥物之過敏性、抑制頭頸腫瘤之生成、並降低頭頸癌轉移的發生。

Description

以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移及其醫藥組成物之用途
本發明係一種以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移及其醫藥組成物之用途，不但具有抑制頭頸癌惡性表徵之功能，還可增加放射與化療藥物之敏感性、抑制頭頸腫瘤之生成、並降低頭頸癌轉移的發生。
頭頸癌是十大癌症之一，每年約五十萬人的新病例增加，對於頭頸癌的治療，除手術切除外，化療與放射線合併治療均為常用的方式。頭頸部位含呼吸、說話、吞嚥等重要功能器官的位置，此部位的手術切除，常會劇烈影響病人外觀與生活品質。目前對於癌症之治療，已逐漸趨向器官保存之治療概念，即依病患個別癌症病況，採用少手術或小範圍手術切除腫瘤，而合併使用化療藥物和放射線區域加強治療，這樣的治療方針，對大部分頭頸癌病患可達顯著之療效。然而，部分病患的治療效果不佳，乃因為腫瘤細胞對放射或化療藥物具有抗性，引發腫瘤再度復發，甚至發生轉移，這些現象也為惡性癌幹細胞之特徵，而對這類惡性癌目前也無有效藥物可供使用。
近年來統計發現，頭頸癌病患之存活率並未隨著醫療研究進步而有顯著增加，反映出頭頸癌的治療，需要有更積極療效之藥物。因 此，本發明之目的係希望能找到一個可以抑制癌幹細胞特性之標的，增加頭頸癌細胞對於化療藥物和放射治療的敏感性，並降低其腫瘤生成和轉移的發生，以做為治療惡性頭頸癌之另一選擇。
本發明為一種以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移之用途，其中該序列係為5’-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3’(SEQ ID NO：2)。
其中，該序列能增加頭頸癌細胞對化療藥物和放射治療的敏感性，並降低其腫瘤生成和轉移。
其中，將頭頸癌細胞以質體轉染miR-520b序列能增加細胞內miR-520b之表現量。
本發明另一應用為一種以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，該組成物係由作微核酸-520b(miR-520b)序列所製成之藥劑，以該微核酸-520b(miR-520b)序列直接注射至癌症個體內。
其中，該微核酸-520b(miR-520b)序列係為5’-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3’(SEQ ID NO：2)。
其中，將該miR-520b序列分子溶於生理食鹽水中，且每次係以1ug/kg的體積注射癌症個體內。
其中，該miR-520b序列係能抑制頭頸癌腫瘤生長。
其中，該miR-520b序列係能抑制頭頸癌轉移及移行。
其中，該miR-520b序列係具有治療惡性頭頸癌之潛力。
其中，該miR-520b序列係能增進放射線治療之效益。
其中，該miR-520b序列係能增進化療藥物治療之效益。
接下來列舉一較佳實施例，並配合圖式及圖號，對本發明做進一步的說明，期能使 貴審查委員對本發明有更詳細的了解，並使熟悉該項技術領域者能據以實施。以下僅在於解釋較佳實施例，而非在於限制本發明之實施範圍，故凡有以本發明精神為基礎，而為本發明之任何形式的變更或修飾，皆屬於本發明意圖保護之範疇。
第1圖係為本發明之頭頸癌細胞中，轉染miR-520b序列可以顯著增加miR-520b表現量。
第2A圖係為本發明之以OECM1細胞移行實驗，以證明轉染miR-520b序列對頭頸癌細胞，可有效抑制頭頸癌細胞移行能力。
第2B圖係為本發明之以SAS細胞移行實驗，以證明轉染miR-520b序列對頭頸癌細胞，可有效抑制頭頸癌細胞移行能力。
第3A圖係為本發明之以基底膜侵襲試驗OECM1細胞，以證明轉染miR-520b序列對頭頸癌細胞，可有效抑制癌細胞對周邊組織侵襲能力。
第3B圖係為本發明之以基底膜侵襲試驗SAS細胞，以證明轉染miR-520b序列對頭頸癌細胞，可有效抑制癌細胞對周邊組織侵襲能力。
第4圖係為本發明之轉染miR-520b序列的頭頸癌細胞，可增加化療藥物cisplatin的敏感性，降低細胞存活率。
第5A圖係為本發明之轉染miR-520b序列的頭頸癌OECM1細胞，可增加 放射處理的敏感性，減低細胞存活的聚落數。
第5B圖係為本發明之轉染miR-520b序列的頭頸癌SAS細胞，可增加放射處理的敏感性，減低細胞存活的聚落數。
第6A圖係為本發明之轉染miR-520b序列的頭頸癌OECM1細胞，可有效抑制癌細胞球型體生長的能力。
第6B圖係為本發明之轉染miR-520b序列的頭頸癌SAS細胞，可有效抑制癌細胞球型體生長的能力。
第7A圖係為本發明之以小鼠動物實驗，證實miR-520b序列，可有效抑制頭頸癌腫瘤生長與癌轉移。(A)高表現或抑制miR-520b的頭頸癌細胞(Fadu)以皮下注射的方式轉殖1x105與1x106的細胞量於下背處兩側。代表的腫瘤照片與平均的腫瘤大小顯示於圖中。miR-520b mimic抑制腫瘤新生。
第7B圖係為本發明之以小鼠動物實驗，證實miR-520b序列，可有效抑制頭頸癌腫瘤生長與癌轉移。(B)高表現或抑制miR-520b的頭頸癌細胞(Fadu)以尾靜脈注射的方式將5x105細胞送入老鼠循環中。老鼠犧牲後肝臟的代表照片和每隻老鼠肝臟中的轉移節結數目顯示於圖中。miR-520b序列減少頭頸癌細胞的轉移。
本發明為一種以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移之用途，用以抑制頭頸癌細胞之生長、侵犯與轉移，其中該序列係為5’-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3’(SEQ ID NO：2)。
其中，該微核酸序列之反轉序列為5’-CCCUCUAAAA GGAAGCACUUU-3’(SEQ ID NO：1)。
參閱第1~7B圖，將頭頸癌細胞以質體轉染miR-520b序列，藉以增加細胞內miR-520b之表現量，來觀察對癌細胞之影響，結果如第1圖所示，miR-520b質體可有效提升使miR-520b之表現，在OECM1細胞中表現量比控制組(pcDNA)增加為12.4倍，而在SAS細胞則增加了30.3倍。
而後，利用細胞移行實驗，來評估miR-520b對頭頸癌細胞移行能力之影響。結果如第2A、2B圖所示，當OECM1與SAS細胞轉染miR-520b序列後，發現細胞爬行到空隙的速度被抑制；於OECM1細胞中，控制組在12hr時間點已經填滿爬行空隙，而miR-520b轉染組只覆蓋了空隙的51%；同樣於SAS細胞中，控制組在24hr時間點可以爬滿空隙的98%，而miR-520b轉染組只有覆蓋64%。
再來，運用基底膜侵犯試驗，來評估細胞侵襲周邊組織的能力。結果如第3A、3B圖所示，於OECM1細胞中，轉染miR-520b序列後，穿透基底膜到下層的細胞數減少了57%；同樣於SAS細胞中則抑制了80%；這些結果顯示，細胞轉染miR-520b序列，可降低細胞侵入穿過基底膜的能力。
同時，我們也評估miR-520b序列，是否影響細胞對化療藥物和放射處理之敏感度。細胞轉染miR-520b序列後，將細胞處理0~4ug/ml的化療藥物cisplatin、或0~6Gy劑量的放射線，而後觀察細胞存活數或存活聚落之改變。結果如第4圖所示，轉染miR-520b序列後，細胞對藥物毒殺的效果大幅提升，使細胞存活數目顯著減少，如在4ug/ml的劑量下，於OECM1細胞中，其細胞死亡比例提高1.26倍，於SAS細胞中提高1.44倍。同 樣地，細胞對放射處理的影響如第5A、5B圖所示，轉染miR-520b序列後，促使細胞對放射敏感性大幅提升，使細胞存聚落明顯降低，在6Gy的劑量下，於OECM1細胞中，其細胞死亡增加1.82倍，於SAS細胞中死亡增加1.7倍；換言之，該序列能增加頭頸癌細胞對化療藥物和放射治療的敏感性，並降低其腫瘤生成。
而細胞球型體生長試驗(cell sphere formation)，是以細胞研究模式，來評估腫瘤新生成的能力(in vitro tumorigenesis)。實驗結果如第6A、6B圖所示，轉染miR-520b序列後，可有效抑制細胞球體生長數目，在OECM1和SAS細胞中，其球體生長數目均減少約50%。
進一步，我們利用小鼠動物實驗，來探討miR-520b序列，對活體內之腫瘤生成和癌轉移之影響，以評估是否具有治療的應用之潛力。在腫瘤生長研究方面，首先將頭頸癌細胞轉染了miR-520b序列(SEQ ID NO：2)、miR-520b反序列(SEQ ID NO：1)、或控制組之寡核酸序列(SEQ ID NO：3、4)後，將細胞轉殖注入小鼠皮下，靜養6天使腫瘤初步穩定生成，而後將小鼠分為三組，以一周兩次的頻率，從尾靜脈持續補充注射miR-520b序列(SEQ ID NO：2)、miR-520b反序列(Anti-520b)(SEQ ID NO：1)、或控制組之寡核酸序列(Control oligonucleotide)(SEQ ID NO：3、4)，再持續靜養觀察腫瘤生長情形至21天。結果如第7A圖所示，與控制組相比，在施予miR-520b序列的實驗組中，完全抑制小鼠皮下腫瘤的形成，反之，若給予miR-520b反序列，則促進腫瘤生長，到21天時，平均腫瘤大小為控制組的1.6倍。而在癌轉移之研究方面，首先將轉染後的頭頸癌細胞從尾靜脈注入血流，再靜養6天以模擬癌細胞進入循環之轉移條件，而後將小鼠分為 三組，同樣以一周兩次的頻率，從尾靜脈分別注射miR-520b序列(SEQ ID NO：2)、miR-520b反序列(SEQ ID NO：1)、或控制組之寡核酸序列(SEQ ID NO：3、4)，再持續靜養至21天後，觀察腫瘤細胞在肝臟轉移植生(liver colonization)的情形。結果如第7B圖所示，給予miR-520b反序列與控制組相較，二者產生相當程度的肝臟植生，而施予miR-520b序列的實驗組，則能顯著減緩癌細胞在肝臟植生的情形。這些結果顯示，miR-520b序列能有效抑制頭頸癌之生成和轉移。
上述中，miR-520b序列分子係以濃度50uM溶於生理食鹽水Normal saline中，在進行小鼠實驗時，每次注射體積為50ul，相當於每次注射20ng於每隻小鼠體內(1ug/Kg)。
本發明之另一種應用為一種以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，該組成物係由作微核酸-520b(miR-520b)序列所製成之藥劑，以該微核酸-520b(miR-520b)序列直接注射至癌症個體內，該微核酸-520b(miR-520b)序列係為5’-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3’(SEQ ID NO：2)，該miR-520b序列係能抑制頭頸癌轉移、移行及生長，還能增進放射線治療及化療藥物治療之效益。
因此，本發明施予miR-520b序列，可以增加癌細胞對化療藥物與放射處理之敏感性而導向癌細胞之死亡，同時抑制細胞移行和侵襲能力並減少無附著的癌細胞生長，顯示miR-520b序列對頭頸癌細胞具抑癌之多方面功效；進一步在動物實驗中發現，在老鼠體內注射miR-520b序列可顯著抑制皮下腫瘤之發生，且降低腫瘤細胞之肝轉移，更顯示miR-520b 序列具有治療惡性頭頸癌之潛力。
歸納上述說明，藉由本發明上述結構設計，可有效克服習知發明所面臨的缺失，進一步具有上述眾多的優點及實用價值，因此本發明為一創意極佳之發明創作，且在相同的技術領域中未見相同或近似的產品創作或公開使用，故本發明已符合發明專利有關「新穎性」與「進步性」之要件，乃依法提出申請；惟，熟悉此技術之人士當可在不脫離本發明之精神與原則下對本發明進行變更與修改，而該等變更與修改，應皆涵蓋於如下申請專利範圍所界定之範疇中。
<110> 長庚大學
<120> 微核酸-520b(miR-520b)序列運用於抑制頭頸癌腫瘤生長與轉移之方法
<130> P06113
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> single strand RNA,complement to Hsa-miR-520b
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 1
Figure 104133462-A0101-12-0009-1
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> double strand RNA,same sequence to hsa-miR-520b
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 2
Figure 104133462-A0101-12-0010-2
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> single strand RNA,Negative control for SEQUENCE NO 1
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 3
Figure 104133462-A0101-12-0010-3
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> double strand RNA,Negative control for SEQUENCE NO 2
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 4
Figure 104133462-A0101-12-0010-4

Claims (9)

  1. 一種以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移之用途，透過將該miR-520b序列轉染至頭頸癌細胞以達到抑制頭頸癌細胞的生長、侵犯及轉移，其中該miR-520b序列實質上由SEQ ID NO：2所組成。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移之用途，其中，該序列能增加頭頸癌細胞對化療藥物和放射治療的敏感性，並降低其腫瘤生成和轉移。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之以微核酸-520b(miR-520b)序列作為抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移之用途，其中，將頭頸癌細胞以質體轉染miR-520b序列能增加細胞內miR-520b之表現量。
  4. 一種以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，其中該微核酸-520b(miR-520b)序列實質上由SEQ ID NO：2所組成，製備時將該miR-520b序列分子溶於生理食鹽水中，且每次係以1ug/kg比例體積注射癌症個體內。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，其中，該miR-520b序列係能抑制頭頸癌腫瘤生長。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，其中，該miR-520b序列係能抑制頭頸癌轉移及移行。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭 頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，其中，該miR-520b序列係具有治療惡性頭頸癌之潛力。
  8. 如申請專利範圍第4項所述之以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，其中，該miR-520b序列係能增進放射線治療之效益。
  9. 如申請專利範圍第4項所述之以微核酸-520b(miR-520b)序列製備抑制頭頸癌腫瘤表現之醫藥組成物的用途，其中，該miR-520b序列係能增進化療藥物治療之效益。
TW104133462A 2015-10-13 2015-10-13 以微核酸-５２０ｂ（ｍｉＲ-５２０ｂ）序列作爲抑制頭頸癌腫瘤生長、侵犯與轉移及其醫藥組成物之用途 TWI685500B (zh)

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