CN105983097B

CN105983097B - 一种抗肿瘤制剂及其制备方法

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Publication number: CN105983097B
Application number: CN201510043930.XA
Authority: CN
Inventors: 王琳; 李永奎; 方敏; 王征; 张剑; 宋煜; 石洁; 徐妞妞; 王健
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2035-01-28
Also published as: WO2016119308A1; CN105983097A

Abstract

本发明提供一种抗肿瘤制剂及其制备方法。所述抗肿瘤制剂为由分散有有效成分PD‑1阻断抗体和塞来昔布的海藻酸盐水溶液形成的水凝胶形式的抗肿瘤制剂，所述抗肿瘤制剂为注射制剂。本发明提供的抗肿瘤制剂具有良好的体内稳定性和延长的缓释效果，同时还具有显著提高的对肿瘤细胞生长、转移的抑制作用、以及扩大的抗瘤谱。

Description

一种抗肿瘤制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物制剂及其制备方法，尤其涉及一种抗肿瘤制剂及其制备方法。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康和生命最大的敌人之一，世界卫生组织报告表明，2012年全球有1410万人患癌，死亡人数达820万，超过艾滋病、疟疾和结核病死亡人数总和。我国新增癌症病例居世界第一位，癌症也已成我国居民的第一死因，每年有207万人因癌症去世。目前在临床上，肿瘤的治疗手段主要以手术切除、化疗和放疗为主。而治疗恶性肿瘤时，手术的方法几乎不可能将扩散的肿瘤细胞完全切除，从而造成肿瘤反复发作；化疗和放疗虽然一定程度上可以辅助恶性肿瘤的治疗，但强烈的毒副作用对机体造成额外的巨大伤害，且治愈率很低。绝大部分化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时都会对机体正常组织和器官造成不可逆的损伤。因此，传统的治疗技术无法解决肿瘤尤其是恶性肿瘤对人类健康的重大威胁。

肿瘤的免疫治疗技术，是基于肿瘤免疫基本原理而开发和发展出来的、以免疫学手段达到对肿瘤细胞有效杀伤的一类肿瘤治疗技术。免疫系统对肿瘤细胞的杀伤具有很强的针对性和专一性，因此此类疾病的免疫学治疗技术具有传统治疗技术无法比拟的天然的高效性和靶向性。针对某一类型的肿瘤，成功的免疫学治疗方案可以激活机体产生足够的肿瘤细胞特性细胞毒性T淋巴细胞，可选择性杀死所有肿瘤细胞，和肿瘤的其他的疗法相比，免疫治疗是目前已知的惟一有望完全消灭肿瘤细胞的手段而对对机体正常细胞没有不良影响。近些年随着肿瘤免疫逃逸相关研究逐渐深入，使用单克隆抗体阻断共刺激分子通路已作为一种新的肿瘤免疫治疗手段逐渐被重视，也为肿瘤免疫治疗翻开了新的篇章。首个投入临床应用的针对负性共刺激信号通路阻断的药物是易普利姆玛(ipilimumab)作为B7/CTLA-4共刺激通路阻断剂，ipilimumab被证实能有效提高晚期恶性黑素瘤患者的生存率，并在2011年被FDA批准用于治疗转移性恶性黑素瘤，但易普利姆玛能导致严重和致死性自身免疫相关疾病。紧随其后，程序性死亡分子-1(PD-1)通路阻断剂抗PD-1和PD-L1单克隆抗体也有了突破性的进展，可以阻断PD-1对T细胞的抑制作用，从而激活肿瘤患者体内的免疫效应细胞杀瘤效应，减少抑制性调节T细胞效应，以增强CTL杀伤癌细胞的功能已成为近年免疫治疗的热点。多项荷瘤动物实验表明，阻断PD-L1/PD-1通路可以增强抗肿瘤效应、延长生存期、改善预后。目前，多种针对PD-L1/PD-1通路阻断的单克隆抗体用于进展期恶性肿瘤的三期临床试验都在进行，PD-1抗体由于其广谱抗癌作用，对肾癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病、头颈癌、肠癌和脑瘤等癌症的临床疗效也正在二期或三期临床试验之中。然而由于体内稳定性差以及作用的多效性，要求连续灌输或频繁给药才能获得理想的治疗效果，动物实验中每次PD-1抗体的给药量通常为250ug/只小鼠，并需要每隔两天给药一次以维持药效，如此高剂量致使全身治疗时副作用较大，如引起免疫性小肠炎及严重的自身免疫疾病等副作用，限制了其的应用。

因此，如何提供一种抗药物制剂，利用PD-1抗体，但具有良好的体内稳定性，具有提高的药效发挥并且副作用小，成为有待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种抗肿瘤制剂，为由分散有有效成分PD-1阻断抗体和塞来昔布的海藻酸盐水溶液形成的水凝胶形式的抗肿瘤制剂。该制剂具有良好的体内稳定性、显著提高的抑制肿瘤细胞生长和转移的作用、扩大的抗瘤谱，以及降低的对机体的毒副作用。

本发明还提供了一种抗肿瘤制剂的制备方法，通过将有效成分PD-1阻断抗体及塞来昔布分散在海藻酸盐溶液中，并形成水凝胶形式的可注射的抗肿瘤制剂。对个体施用该方法制成的抗肿瘤制剂，PD-1阻断抗体及塞来昔布表现出良好的体内稳定性和延长的缓释效果，更加利于所述有效成分药效的发挥，以及降低其使用剂量。

非甾体类抗炎药，例如塞来昔布等已被证明可通过抑制多种肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制治肿瘤新生血管形成从而预防肿瘤发生及发展，在预防肿瘤的发生、抑制肿瘤的生长、转移及在动物实验中取得了较好的肯定效果。但至今其临床应用仍然受限，主要是由于许多问题尚待解决，如用药时间较长，用药剂量偏大，小鼠实验显示通常需要每天口饲25mg/kg体重的剂量的塞来昔布才能具有抗肿瘤效果，致使胃肠道及心血管方面的副作用大，并且抗瘤谱较窄(主要用于结直肠癌的预防和早期治疗)。目前还没有报道显示将非甾体类抗炎药，例如塞来昔布与PD-1阻断抗体联合使用可以降低其用药量，扩大抗瘤谱，以及降低机体毒副作用的报道。

本发明提供的一种抗肿瘤制剂，为由分散有有效成分PD-1阻断抗体和塞来昔布的海藻酸盐水溶液形成的水凝胶形式的抗肿瘤制剂，所述抗肿瘤制剂为注射制剂。

在本发明的方案中，所述海藻酸盐的分子量为75,000–300,000g。

进一步的，进一步的，所述海藻酸盐溶液混合物在交联剂存在下发生交联。所述交联剂为二价金属阳离子。更进一步的，所述二价金属阳离子由二价金属的硫酸盐或盐酸盐提供，所述二价金属为钙或镁。更进一步的，所述二价金属阳离子由CaSO₄,MgCl₂或CaCl₂提供。

更进一步的，所述抗肿瘤制剂为用于黑素瘤、乳腺癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、白血病、头颈癌、肠癌或脑瘤的抗肿瘤制剂。

本发明提供的一种抗肿瘤制剂的制备方法，包括：

将海藻酸盐溶解在生理盐水中制成海藻酸盐溶液；

在该海藻酸盐溶液中添加有效成分PD-1阻断抗体和塞来昔布，并使之分散在所述海藻酸盐溶液中，得到海藻酸盐溶液混合物；

使所述海藻酸盐溶液混合物发生交联，形成水凝胶形式的抗肿瘤制剂，所述抗肿瘤制剂为注射制剂。

进一步的，所述海藻酸盐的分子量为75,000–300,000g。对于本申请方案中使用的海藻酸盐，本领域技术人员可以在上述分子量范围内根据需要进行选择。本领域技术人员也可以直接使用商购的在上述分子量范围的一种或多种海藻酸盐。

进一步的，所述海藻酸盐溶液混合物在交联剂存在下发生交联。所述交联剂为二价金属阳离子。更进一步的，所述二价金属阳离子由二价金属的硫酸盐或盐酸盐提供，所述二价金属为钙或镁。更进一步的，所述二价金属阳离子由CaSO₄,MgCl₂或CaCl₂提供。

进一步的，在本申请的方案中，由于塞来昔布为粉末状不易溶于水，在将其分散在海藻酸盐溶液的过程中可采用超声法进行。

更进一步的，制备本发明的抗肿瘤制剂的过程应在无菌条件下进行。

本发明提供的一种抗肿瘤制剂可以通过皮下注射进行给药，来抑制肿瘤发生或杀伤肿瘤细胞。

本发明的所述抗肿瘤制剂可以为单位制剂。所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，如一单位(针)针剂等。患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。例如，在制备药物的过程中，一般认为成人体重为50-70kg，可以最初可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如，可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见，也可参考(黄继汉等，“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，《中国临床药理学与治疗学》,2004Sep；9(9):1069-1072)来确定。在本发明的实施方式中，可以使用按照人和小鼠的体表面积折算系数0.0026来换算人和小鼠的剂量。

在本发明的一个实施方案中，对体重为25g的小鼠皮下注射0.2ml的本发明抗肿瘤制剂，其中PD-1阻断抗体的含量为100ug,塞来昔布的含量625ug，即：4mg/kg小鼠体重的PD-1阻断抗体，25mg/kg小鼠体重的塞来昔布，两周施用一次即可维持药效。

制药商可以根据上述换算方法得到满足成年人一次给药的单位制剂中的有效成分含量，用以应用于其制药过程中。在本发明的技术方案中，根据等效剂量换算关系以及人的常规体重，并且综合用药安全、成本和药效，优选的，所述单位制剂中含有20-30mg的PD-1阻断抗体和130-200mg的塞来昔布。

在本申请的抗肿瘤制剂的制备方法中，海藻酸盐溶液的溶液浓度可以在10-40mg/mL范围，所述PD-1阻断抗体可以500～1000μg/mL的量分散在上述海藻酸盐溶液中，所述塞来昔布可以3.75～7.5mg/mL的量分散在上述海藻酸盐溶液中。申请人可以根据所要制备的抗肿瘤制剂的规格，例如单位制剂中需要含有的PD-1阻断抗体和塞来昔布的量适当选择海藻酸盐溶液的溶液浓度，PD-1阻断抗体、塞来昔布分散在海藻酸盐中的量，这对本领域技术人员来说是可以实现的。

本发明提供的方案具有以下优点：

(1)采用本发明方法制成的抗肿瘤制剂，能使PD-1阻断抗体及塞来昔布具有良好的体内稳定性，具有延长的缓释效果，从而能更有利于药效的发挥，降低用药剂量。

(2)申请人研究发现，通过注射方式对个体施用本发明的抗肿瘤制剂，即同时将PD-1阻断抗体和塞来昔布包裹进海藻酸盐水凝胶提供给个体，相比于施用仅含PD-1阻断抗体的海藻酸盐水凝胶和/或仅含塞来昔布的海藻酸盐水凝胶，在增加荷瘤小鼠存活百分比、促进有活性的CD8T细胞的产生方面具有出乎意料的协同作用。

(3)本发明所提供的抗肿瘤制剂是通过增强机体针对肿瘤细胞的获得性免疫反应，阻断免疫抑制通路，激活效应细胞特异性地杀死肿瘤细胞，对机体正常组织和细胞几乎没有伤害，与手术、化疗、放疗对身体带来的伤害相比，优势明显。

(4)本发明方案使用的材料海藻酸盐来源广泛，可从海藻中可大量提取，使用显著降低的PD-1阻断抗体和塞来昔布的剂量即可获得良好的抑制肿瘤效果，显著降低了病人的用药成本。

(5)本发明提供的抗肿瘤制剂既可以用于治疗实体肿瘤，抑制肿瘤的生长；可以用于治疗发生了恶性转移的肿瘤；以及用于恶性肿瘤手术后放、化疗的辅助治疗；尤其适合于无法进行手术切除的肿瘤的治疗，具有广泛的应用领域。

附图说明

图1为本发明的抗肿瘤制剂的制备流程图。

图2A显示了各组小鼠血清中的塞来昔布浓度,图2B显示了各组小鼠肿瘤组织中塞来昔布含量。图2C显示了各组小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(CD8和IFN-γ双阳性)和调节性T淋巴细胞(CD4和FoxP3双阳性)的比值。图2D显示了各组小鼠的存活百分比。

图3A-图3B显示了肿瘤微环境中对能有效杀伤肿瘤细胞的CD8T细胞的检测结果。

图4A显示了COX-2基因的相对信使RNA的表达水平。图4B显示了IL-1β基因的相对信使RNA的表达水平。图4C显示了IL-6基因的相对信使RNA的表达水平。其中*表示p值<0.05，**表示p值<0.01。

图5A显示了第0，10,13,17,20,22天各组小鼠的肿瘤外观的图片。图5B显示了第0，10,13,17,20,22天各组小鼠的肿瘤尺寸变化。其中*表示p值<0.05。

图6A显示了各组小鼠的肺部转移瘤的图片。图6B显示了各组小鼠的肺部转移瘤数量。其中$表示该组与a组对比；#表示该组与b组对比。*，$，#表示p值<0.05；$$，##表示p值<0.01。

具体实施方式

实施例1.制备本发明的抗肿瘤制剂。

可以按照如图1所示的流程制备本发明的抗肿瘤制剂。

步骤(1)，用生理盐水分别配制10-40mg/mL的高分子量(SLG100，Mw＝200,000–300,000g/mol)和低分子量(SLG20，Mw＝75,000–220,000g/mol,FMC Biopolymer公司，美国费城)的海藻酸盐溶液，磁力搅拌器4℃搅拌过夜，用孔径为0.22微米的滤器过滤除菌。取高、低分子量的海藻酸盐溶液按1：3的比例混合并充分混匀；

步骤(2)-a，按每毫升的海藻酸盐溶液称取3.75～7.5mg塞来昔布粉末(LC实验室，LC Laboratories,美国马萨诸塞州)，混合；

步骤(2)-b，采用探头式超声仪(QSONICA公司，美国)以60W功率超声60秒，使塞来昔布粉末均匀分散于海藻酸盐溶液中,获得混合体系；

步骤(3)，按每毫升海藻酸盐溶液量取500～1000μg PD-1阻断抗体(BioXCell公司，美国)加入步骤(2)-b所得混合体系中，震荡器振荡充分混匀；

步骤(4)-a，称取硫酸钙固体粉末(CaSO₄,国药集团化学试剂有限公司),按质量体积比为0.21g/ml与纯净水混合，高压灭菌，得到硫酸钙悬浊液(使用时若发生聚集，产生粗大颗粒，可用超声仪超声，使其形成均一的悬浊液)；

步骤(4)-b，用带螺口的注射器吸取步骤(3)所得的混合物；

步骤(4)-c，另一带螺口的注射器中加入CaSO₄悬浊液，按每mL海藻酸盐盐溶液加入40μL的CaSO₄悬浊液；

步骤(5)，通过接头和螺口使两注射器完成紧密连接，尽量排除多余的空气；

步骤(6)，迅速互推注射器20次；

步骤(7)，静置1分钟，水凝胶形式的本发明的抗肿瘤制剂即制作完成。旋开装有水凝胶的注射器，接上注射针头，即可进行注射。或者可以将制成的抗肿瘤制剂在4℃保存。

实施例2：本发明提供的抗肿瘤制剂的在体内的缓释效果和药效延长效果

1.按照实施例1相同方法制备出所述抗肿瘤制剂，使得每毫升所述抗肿瘤制剂中含有PD-1阻断抗体500ug,塞来昔布3125ug。

C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，每只体重约25克左右。B16-F10黑素瘤细胞购自美国模式培养物保藏所。

2.构建小鼠B16黑素瘤模型。

B16-F10黑素瘤细胞是公认的具有最强侵袭能力的肿瘤细胞，每只C57BL/6小鼠皮下注射2.5×10⁴个B16-F10黑素瘤细胞后，1周后可产生成形的原位黑色素瘤，之后迅速生长并导致小鼠死亡。C57BL/6小鼠黑素瘤模型是评估药物抗肿瘤效果广泛采用的成熟的动物模型。发明人将从ATCC(美国模式培养物保藏所)购买到的B16-F10黑素瘤细胞，皮下注射6-8周龄体重约25克的C57BL/6雄性小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，约7-10天后在注射细胞的部位可见黑色素瘤成形。

3.本发明提供的抗肿瘤制剂在体内的缓释效果和药效延长效果实验。

3.1在C57BL/6小鼠接种黑色素瘤细胞一周后，设置以下3组小鼠：

除口饲塞来昔布组是在给药后24小时取小鼠血清和肿瘤组织，其他两组小鼠分别在给药后第1天，第3天，第7天和第14天取小鼠血清和肿瘤组织，然用液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)检测小鼠血清和肿瘤组织的匀浆液中的塞来昔布的浓度，每组每个时间点实验动物数量为3只。

图2A显示了各组小鼠血清中的塞来昔布浓度。图2B显示了各组小鼠肿瘤组织中塞来昔布含量。可以看出，注射本发明的抗肿瘤制剂的实验组小鼠的塞来昔布血清浓度水平至少在一周内显著高于对照组；肿瘤组织中的塞来昔布含量至少在两周内显著高于对照组。

3.2在C57BL/6小鼠接种黑色素瘤细胞一周后，设置以下4组小鼠：

在如上表处理各组小鼠后，分别在处理后第1天，第3天，第7天和第14天对各组小鼠进行腹股沟淋巴结取样，使用流式细胞术检测其中细胞毒性T淋巴细胞(CD8和IFN-γ双阳性)和调节性T淋巴细胞(CD4和FoxP3双阳性)的数量并计算比值,每组每个时间点实验动物数量为3只。通过流式细胞术检测细胞毒性T细胞(CTL)的激活和调节性T细胞(Treg)的抑制的动态变化，来反映PD-1阻断抗体的缓释效果。

图2C显示了各组小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(CD8和IFN-γ双阳性)和调节性T淋巴细胞(CD4和FoxP3双阳性)的比值。结果显示，注射本发明的抗肿瘤制剂组的实验组至少在两周内，药效延长效果显著性地高于各对照组。

通过本实施例数据说明本发明提供的抗肿瘤制剂，在降低了用药剂量的基础上，仍然维持了长时间的有效药物浓度和效果。

3.3在C57BL/6小鼠接种黑色素瘤细胞一周后，设置以下4组小鼠：

图2D显示了各组小鼠的存活百分比。表明施用本发明抗肿瘤制剂组(通过将PD-1抗体以及塞来昔布同时包裹进海藻酸盐水凝胶形成)，获得了比分步施用包裹进海藻酸盐水凝胶的有效成分组(即施用仅含PD-1抗体的海藻酸盐水凝胶，以及同时施用仅含塞来昔布的海藻酸盐水凝胶)，获得了显著提高的小鼠存活百分比。这说明本发明的抗肿瘤制剂，并非简单的组合使用塞来昔布、PD-1抗体以及海藻酸盐水凝胶三种成分，塞来昔布和PD-1抗体必须同时包埋进海藻酸盐水凝胶中(即本发明抗肿瘤制剂)，才能产生优越的抗肿瘤效果。

实施例3本发明的抗肿瘤制剂能促进有活性的CD8T细胞的产生

2.构建与实施例2相同的小鼠黑素瘤模型。

在C57BL/6小鼠接种黑色素瘤细胞一周后，设置以下4组小鼠：

在如上表处理各组小鼠后，分别在一周后检测用流式细胞术术检测肿瘤微环境中有活性的CD8细胞百分比。

图3A和图3B显示了肿瘤微环境中对能有效杀伤肿瘤细胞的CD8T细胞的检测结果。表明施用本发明的抗肿瘤制剂组(通过将PD-1抗体以及塞来昔布同时包裹进海藻酸盐水凝胶形成)才能极大的促进有活性的CD8T细胞的产生。这说明本发明的抗肿瘤制剂在治疗肿瘤时，不仅作为药物缓释载体，而且其在体内占据的体积和空间是促进抗肿瘤免疫细胞产生的场所。塞来昔布和PD-1抗体两种成分同时存在于该“场所”中，它们激活免疫细胞的协同作用才能产生。

实施例4本发明提供的抗肿瘤制剂具有降低的机体毒副作用。

2.构建与实施例2相同的小鼠黑素瘤模型。

3.检测本发明提供的抗肿瘤制剂对机体的毒副作用。

在C57BL/6小鼠接种黑色素瘤细胞一周后，设置以下各组小鼠：

在如上表处理各组小鼠后，继续培养小鼠一周，处死小鼠，剥取皮下肿瘤，按照RNA提取试剂说明提取总RNA,荧光定量PCR分析COX-2、IL-1β和IL-6四个基因的相对信使RNA的表达水平。结果如图4A-图4C所示，图4A为COX-2基因的相对信使RNA的表达水平。图4B为IL-1β基因的相对信使RNA的表达水平。图4C为IL-6基因的相对信使RNA的表达水平。可以看出，注射本发明的抗肿瘤制剂组的实验组，相比于注射PD-1抗体的海藻酸盐水凝胶组，具有显著降低的炎症因子的表达。表明本发明提供的抗肿瘤制剂具有显著降低的对机体的毒副作用。

实施例5：本发明提供的抗肿瘤制剂用于抑制B16黑素瘤肿瘤生长

2.构建与实施例2相同的小鼠黑素瘤模型。

3.本发明提供的抗肿瘤制剂用于抗B16黑素瘤肿瘤生长效果。

在C57BL/6小鼠接种黑色素瘤细胞一周后，设置以下各组小鼠：

分别在在如上表处理各组小鼠后的第0，10,13,17,20,22天，用游标卡尺测量黑色素瘤的长径(长)和短径(宽)，对肿瘤外观进行拍照。

图5A显示了第0，10,13,17,20,22天各组小鼠的肿瘤外观的图片。图5B显示了第0，10,13,17,20,22天各组小鼠的肿瘤的尺寸变化。

由图5A-图5B可以看出，与对照组相比，皮下注射本发明抗肿瘤制剂的实验组能很好的抑制恶性黑素瘤原位瘤的生长。本发明抗肿瘤制剂的抗肿瘤效果优于海藻酸盐水凝胶单独包埋塞来昔布或PD-1阻断抗体的疗效，也优于生理盐水混合塞来昔布和PD-1阻断抗体组，即说明本发明抗肿瘤制剂中的所有组分对于获得本申请的抗肿瘤效果是必须的，并且获得了单独施用PD-1阻断抗体、塞来昔布所实现不了的效果。

实施例6：本发明提供的抗肿瘤制剂用于控制4T1恶性乳腺癌的转移

Balb/c小鼠购自武汉大学医学实验动物中心，每只体重约25克左右。小鼠乳腺癌细胞购自美国模式培养物保藏所。

2.构建4T1恶性乳腺癌转移模型。

4T1乳腺癌转移模型是最常用的用于研究恶性肿瘤转移的实验模型。发明人将体外培养的4T1小鼠乳腺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)注射进6-8周龄雌性体重为25克左右的Balb/c小鼠右侧第二个乳腺部位，每只小鼠注射的细胞量为1×10⁶个。一周后可见被注射的乳腺部位产生了明显的乳腺肿瘤，4-5周后解剖可观察到明显的肺部转移瘤。通过观察小鼠肺部被癌细胞侵袭后的外观，和统计肺转移瘤的数量，可以对癌细胞的转移情况进行定性和定量分析。

3.本发明提供的抗肿瘤制剂抑制肿瘤转移的效果。

在以上Balb/c小鼠接种4T1乳腺癌细胞一周后，设置以下各组小鼠：

分别在在如上表处理各组小鼠后的25天后(接种癌细胞后的第32天)，颈椎脱臼处死各组小鼠，取小鼠全肺，统计肺表面转移肿瘤灶的数目，从肺组织中手术剥离转移瘤，同时对小鼠全肺和剥离的转移瘤进行拍照。

图6A显示了各组小鼠的肺部转移瘤的图片。图6B显示了各组小鼠的肺部转移瘤数量。

由图6A-图6B可以看出，注射本发明抗肿瘤制剂组与对照组相比，表现了极好的抑制肿瘤转移的效果，肺部转移瘤的数量被抑制了70％。与注射本发明制剂组相比，缺少任何一种成分的对照组，转移瘤的数量都显著性地大大增加，抑制肿瘤转移的效果远不如本发明，说明本发明抗肿瘤制剂中的所有组分对于获得本申请希望的抗肿瘤效果是必须的。

实施例7本发明的抗肿瘤制剂对黑素瘤、乳腺癌外的其它肿瘤类型同样有效

1、实验材料和试剂

不同荷瘤小鼠包括：肾癌小鼠、胃癌细小鼠、膀胱癌小鼠、白血病小鼠、头颈癌小鼠、肠癌小鼠、脑瘤小鼠，分别购自武汉大学医学实验动物中心，体重约25克左右。

2、实验步骤

2.1.按照实施例1相同方法制备出所述抗肿瘤制剂，使得每毫升所述抗肿瘤制剂中含有PD-1阻断抗体500ug,塞来昔布3125ug。

构建荷瘤小鼠：本实施例中的构建荷瘤小鼠模型的方法为本领域常规方法，这些荷瘤小鼠模型是评估药物抗肿瘤效果广泛采用的成熟的动物模型。

2.2.按以下方式针对各种荷瘤小鼠进行实验

实验结果显示，施用本发明抗肿瘤制剂的肾癌小鼠、胃癌细小鼠、膀胱癌小鼠、白血病小鼠、头颈癌小鼠、肠癌小鼠、脑瘤小鼠，相比于各对照组小鼠，表现了极好的抑制肿瘤生长的效果，以及降低的毒副作用。

Claims

1.一种抗肿瘤制剂，其特征在于，为由分散有有效成分PD-1阻断抗体和塞来昔布的海藻酸盐水溶液形成的水凝胶形式的抗肿瘤制剂，所述抗肿瘤制剂为注射制剂，所述抗肿瘤制剂为用于黑素瘤、乳腺癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、白血病、头颈癌、或脑瘤的抗肿瘤制剂。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤制剂，其特征在于，所述抗肿瘤制剂还包括用于使所述海藻酸盐水溶液发生交联的交联剂。

3.根据权利要求2所述的抗肿瘤制剂，其特征在于，所述海藻酸盐的分子量为75,000–300,000g，所述交联剂为二价金属阳离子。

4.根据权利要求1所述的抗肿瘤制剂，其特征在于，所述抗肿瘤制剂为单位制剂。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤制剂，其特征在于，所述单位制剂含有治疗有效量为20-30mg的PD-1阻断抗体和130-200mg的塞来昔布。

6.一种抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，包括：

将海藻酸盐溶解在生理盐水中制成海藻酸盐溶液；

在该海藻酸盐溶液中添加有效成分PD-1阻断抗体及塞来昔布，并使之分散在所述海藻酸盐溶液中，得到海藻酸盐溶液混合物；

使所述海藻酸盐溶液混合物发生交联，形成水凝胶形式的抗肿瘤制剂，所述抗肿瘤制剂为注射制剂；

所述抗肿瘤制剂为用于黑素瘤、乳腺癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、白血病、头颈癌或脑瘤的抗肿瘤制剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述海藻酸盐溶液混合物在交联剂存在下发生交联。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述海藻酸盐的分子量为75,000–300,000g，所述交联剂为二价金属阳离子。