CN111714500A - 一种含柚皮素的药物组合物及其在治疗大肠癌上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含柚皮素的药物组合物及其在治疗大肠癌上的应用，所述的药物组合物包含柚皮素和5‑氟尿嘧啶，且所述柚皮素和氟尿嘧啶的摩尔比为4:1，本发明提供的药物组合物在治疗结肠癌中的应用，特别是用于抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进结肠癌凋亡。相较于单独柚皮素或5‑氟尿嘧啶给药对大肠癌LoVo细胞增殖的影响，柚皮素和5‑氟尿嘧啶联合用药具有更加显著的抑制大肠癌LoVo细胞增殖能力，且具有协同效应。柚皮素联合5‑氟尿嘧啶用药激活AMPK，抑制mTOR及下游p70S6k的磷酸化，显著抑制癌细胞的迁移与侵袭；柚皮素联合5‑FU对LoVo细胞用药，通过增加促凋亡因子Bax和Cleaved‑Caspase‑3的蛋白表达，减少抑制凋亡因子Bcl‑2的蛋白表达，起到促进LoVo细胞凋亡的作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是一种含柚皮素的药物组合物及其在治疗大肠癌上的应用。
背景技术
目前大肠癌(CRC)的发病率和死亡率不断升高，化疗作为CRC患者的主要治疗方式之一，其经典化疗药物氟尿嘧啶，又称5-氟尿嘧啶（5-FU），具有易耐药性，毒副作用大，晚期CRC中5-FU单药治疗效率低只有10-15%等缺点，在临床治疗效果受限。因此，迫切需要寻找高效低毒的抗肿瘤药物来改善以5-FU为化疗基础的治疗方案。柚皮素（naringenin，NAR）是具有多种生物活性的柑橘黄酮类化合物，它具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤等特性，能有效抑制神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌等多种癌症，是一种潜在的癌症辅助治疗药物，以及具有来源广泛、价格低廉、毒副作用小的优势。然而本领域尚不了解将这两类独特的药物，因此迫切需要了解柚皮素与5-FU联用的效果及其作用机理。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含柚皮素的药物组合物及其在治疗大肠癌上的应用，以解决上述技术背景中提出的问题。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
一方面，本发明提供一种含柚皮素的药物组合物，用于制备治疗大肠癌的药物，所述的药物组合物包含柚皮素和5-氟尿嘧啶。
进一步的，所述柚皮素和5-氟尿嘧啶的摩尔比为4:1。
进一步的，所述药物组合物的剂型为药学接受剂型。
进一步的，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体，所述的药物组合物是将柚皮素与5-氟尿嘧啶，以及药学上可接受的载体，制备成药学接受剂型。
另一方面，本发明提供上述的含柚皮素的药物组合物在治疗大肠癌上的应用。
进一步的，所述的药物组合物在治疗结肠癌中的应用。
进一步的，所述的药物组合物用于抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进结肠癌细胞凋亡。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、相较于单独柚皮素或5-氟尿嘧啶给药对大肠癌LoVo细胞增殖的影响，柚皮素和5-氟尿嘧啶联合用药具有更加显著的抑制大肠癌LoVo细胞增殖能力，且具有协同效应。
2、相较于柚皮素或5-氟尿嘧啶单独用药，柚皮素联合5-氟尿嘧啶用药激活AMPK，抑制mTOR及下游p70S6k的磷酸化，显著抑制癌细胞的迁移与侵袭。
3、相较于柚皮素或5-氟尿嘧啶单独用药，柚皮素联合5-氟尿嘧啶用药使得Bax和Cleaved-caspase-3上调，Bcl-2下调相关，显著促进细胞凋亡。
附图说明
图1为实施例1中，柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞存活率影响的条形图；其中横坐标为柚皮素（NAR）、5-FU、NAR+5-FU组的加药浓度，NAR、5-FU、NAR+5-FU分别对应一栏为该组对应的加药浓度，且每组所对应浓度值一栏中“-”分别表示所对应加药量为0umol/l，即为正常对照组，纵坐标为细胞存活率；
图2为不同浓度的联合用药的药物效应-联合指数曲线图，其中联合指数CI的数值分别代表指不同柚皮素+5-氟尿嘧啶药物浓度组合所对应的联合指数；
图3为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞迁移影响的图片（×200）；
图4为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞迁移数影响的条形图，图中，横坐标为分组，纵坐标为各组对应的LoVo细胞迁移个数；
图5为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞侵袭影响的图片（×200）；
图6为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞侵袭数影响的条形图，图中，横坐标为分组，纵坐标为各组对应的LoVo细胞侵袭个数；
图7为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞生长形态影响的图片（×200）；
图8为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞生长数影响的条形图，图中，横坐标为分组，纵坐标为各组对应的LoVo细胞生长个数；
图9为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞凋亡影响的图片（×200）；
图10为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞凋亡率影响的条形图，图中，横坐标为分组，纵坐标为各组对应的LoVo细胞凋亡率；
图11为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平影响的western blot 检测图谱；
图12为对LoVo细胞Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平影响的western blot 检测灰度值条形图，图中，横坐标为分组，纵坐标为各组对应的表示Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平的灰度值；
图13为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞AMPK/mTOR通路蛋白表达的影响的westernblot 检测图谱；
图14为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞AMPK、p-AMPK蛋白水平影响的western blot检测灰度值条形图；
图15为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞mTOR、p-mTOR蛋白水平影响的western blot检测灰度值条形图；
图16为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞p70S6k、p-p70S6k蛋白水平影响的westernblot 检测灰度值条形图；
图17为柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞AMPK/mTOR通路蛋白表达的影响westernblot 检测灰度值条形图；
图14至图17中，横坐标为分组，纵坐标为各组对应的蛋白水平的灰度值；
图1中，“#”代表联合组与柚皮素组相比，且#P<0.05，##P<0.01；“*”代表联合组与5-FU组相比，且*P<0.05，**P<0.01；
图3至图17中，A为对照组；B为柚皮素组；C为5-FU、D为柚皮素+5-FU联合组；E为Compound C组；
图3至图17中，“*”代表与对照组的比较，包含NAR组、5-FU组、联合组、CompoundC分别与对照组的比较；且*P<0.05，**P<0.01；
“#”代表与柚皮素组的比较，包含5-FU组、联合组、CompoundC分别与柚皮素组的比较；且#P＜0.05，##P＜0.01；
“x”表示与5-FU组的比较，包含联合组、CompoundC分别与5-FU组的比较；且xxP＜0.05，xxP＜0.01；
“Δ”表示与柚皮素+5-FU组比较，包含CompoundC分别与联合组的比较；且ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，柚皮素和5-氟尿嘧啶联用治疗大肠癌可以产生明显的协同效应，二者联用既可以增强抗肿瘤药效，也能降低对细胞的毒性。具体的，本发明提供了一种含柚皮素的药物组合物，用于制备治疗大肠癌的药物，所述的药物组合物包含有效量的柚皮素和有效量的5-氟尿嘧啶。其中，所述柚皮素和5-氟尿嘧啶的摩尔比为4:1。所述药物组合物的剂型为药学接受剂型。具体的，柚皮素和5-氟尿嘧啶联合用药的比值采用两者48h的IC50比值做固定比。两者（柚皮素和5-氟尿嘧啶）48h的IC50比值接近4:1，其中，柚皮素的IC50为329.30μmol/l，5-FU的IC50为87.61μmol/l。
进一步的，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体，所述的药物组合物是将柚皮素与氟尿嘧啶，以及药学上可接受的载体，制备成药学接受剂型。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物和/或细胞产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、口服液以及缓释、控释制剂。
本发明还提供了上述的含柚皮素的药物组合物在治疗大肠癌上的应用。进一步的，所述的药物组合物在治疗结肠癌中的应用。
进一步的，本发明结合下述具体实施例，进一步阐述本发明中柚皮素和5-氟尿嘧啶联用能抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进结肠癌细胞凋亡，从而为柚皮素和氟尿嘧啶联用在治疗大肠癌的应用上提供理论基础。
实施例1 柚皮素与5-FU之间的药物相互作用
1、实验：将人结肠癌细胞（即LoVo细胞）分成4组，分别根据正常对照组、柚皮素组（NAR）、5-氟尿嘧啶组（5-FU）、柚皮素+5-氟尿嘧啶（NAR+5-FU）组用药，体外增殖48ｈ后，采用CCK-8试剂盒检测各组用药对LoVo细胞增殖的影响，
其中，正常对照组采用溶剂对照，设置3个子组；柚皮素组设置10、20、40、80、160、320umol/l的加药浓度子组；5-FU组设置2.5、5、10、20、40、80umol/l的加药浓度子组；NAR+5-FU组中将5-FU：NAR以1:4的固定浓度比组合给药，NAR+5-FU组设置10+2.5、20+5、40+10、80+20、160+40、320+80（NAR浓度，umol/l+5-FU浓度，umol/l）的加药浓度子组；
2、计算统计结果：
1）柚皮素组（NAR）、5-氟尿嘧啶组（5-FU）、柚皮素+5-氟尿嘧啶（NAR+5-FU）组用药分别对LoVo细胞存活率影响如图1所示，图1以加药浓度为横坐标，当前浓度的细胞存活率为纵坐标的条形图；
2）采用Compusyn软件计算联合指数CI，并筛选出柚皮素与5-氟尿嘧啶联合用药的最佳浓度组合；如表1为5-氟尿嘧啶(5-FU)联合柚皮素（NAR）对LoVo细胞体外增殖48h的联合用药指数CI。联合用药指数CI具体计算方法：采用Chou-Talalay方法，研究了柚皮素与5-FU之间的药物相互作用，并利用CompuSyn软件计算了其联合指数(CI)的结果，联合指数CI（Combinationindex）值评价两药的相互作用关系，CI=Dl/Dxl+D2/Dx2，其中，Dxl为药1单独用药后细胞受到一半抑制的给药浓度；Dx2为药2单独用药后细胞受到一半抑制的给药浓度；D2代表了联合用药后细胞受到一半抑制时，所对应的药物2的给药浓度；D1代表了联合用药后细胞受到一半抑制时，所对应的药物1的给药浓度；D2和D1的数值都是计算机根据药物采用固定比时，各自药物单独用药和联合用药的抑制率模拟算出的；其中CI<1为协同作用，CI=1为添加作用，CI>1为拮抗作用。
使用Compusyn1.0软件生成效应-联合指数曲线，即Fa-CI图，见图2，横坐标Fa为药物作用效应，纵坐标CI为联合指数。
将不同浓度的5-FU与柚皮素按1：4固定比分别联合用药，柚皮素浓度为（2.5、5、10、20、40、80μmol/l），5-FU浓度为（10、20、40、80、160、320μmol/l），CCK-8试剂盒测定各组（柚皮素、5-FU、柚皮素与5-FU组）增殖抑制率。最后，把柚皮素、5-FU、柚皮素与5-FU组的增殖抑制率以及柚皮素与5-FU组固定比值带入CompuSyn软件计算出其联合指数(CI)，并根据联合指数CI选择柚皮素与5-FU的药物浓度组合。
表1 5-氟尿嘧啶(5-FU)联合柚皮素（NAR）对LoVo细胞体外增殖48ｈ的联合用药指数CI
结论：如图1所示，同一浓度下，柚皮素+5-氟尿嘧啶组的细胞存活率低于柚皮素组和5-氟尿嘧啶组，说明5-氟尿嘧啶联合柚皮素用药，对LoVo细胞增殖抑制大于柚皮素单独用药和5-氟尿嘧啶单独用药；
由表1和图2可知，利用CompuSyn软件计算柚皮素和5-氟尿嘧啶对LoVo细胞体外增殖48ｈ的联合用药指数(CI)的结果，在不同柚皮素和5-氟尿嘧啶药物浓度组合下，其CI均小于1，表明柚皮素和5-氟尿嘧啶联用在抑制LoVo细胞增殖上具有明显的协同效应。同时CI是一个重要参考指标，CI越小联合效果越好，但是选CI太小的组细胞会死太多，无法做其他实验。所以选择5-FU浓度为20μmol/l和柚皮素浓度为80μmol/l的药物浓度组合，其联合抑制率为49%接近50%，同时CI值较小有较高协同效应。
实施例2 联合用药对LoVo细胞迁移和侵袭的影响
1、柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞迁移的影响
采用Transwell实验检测LoVo细胞迁移率。设置5组实验，分别为对照组（A）、柚皮素组（B）、5-FU组（C）、柚皮素+5-FU组（D）、抑制剂Compound C组（E），5组实验分别作用细胞后结果如图3和图4所示：对照组、柚皮素组、5-FU组、柚皮素+5-FU组、抑制剂Compound C组作用细胞后，穿膜细胞个数分别为323.20±17.97、167.60±22.80、131.20±8.77、82.20±7.14和83.2±9.99。与正常对照组相比，单独使用5-FU或柚皮素处理细胞迁移能力均下降（P<0.01)，而柚皮素+5-FU组较单独用药组能显著地抑制细胞的迁移能力（P<0.01)，CompoundC组与柚皮素+5-FU组比较，没有统计学意义。
2、柚皮素和5-FU联合用药对LoVo细胞侵袭的影响
通过Transwell侵袭实验，设置5组实验，分别为对照组（A）、柚皮素组（B）、5-FU组（C）、柚皮素+5-FU组（D）、抑制剂Compound C组（E），用于评价5-FU与柚皮素联合治疗对LoVo细胞侵袭能力的影响。结果如图5和图6表明：相较于对照组，柚皮素组，5-FU组，柚皮素和5-FU组干预可以显著减少穿透细胞的数量，有统计学差异（P<0.01）。与单纯使用5-FU或柚皮素治疗LoVo细胞相比，柚皮素和5-FU联合抑制细胞穿透基底膜数量更加明显，有显著的统计学差异（P<0.01）。Compound C组与柚皮素+5-FU组比较，没有统计学意义。
实施例3 柚皮素联合5-FU对大肠癌LoVo细胞形态的影响
观察加药对大肠癌LoVo细胞细胞形态的影响；设置5组实验，分别为对照组（A）、柚皮素组（B）、5-FU组（C）、柚皮素+5-FU组（D）、抑制剂Compound C组（E），5组实验分别加药后，观察细胞形态并统计细胞个数，如图7和图8所示，从形态学可观察到，相对于对照组，柚皮素组、5-FU组和抑制剂Compound C组均对LoVo细胞毒性小，少数细胞生长受到抑制、数量减少；而5-FU联合柚皮素组中细胞密度更小，且细胞间隙更大，部分脱落悬浮于培养上清中。说明柚皮素联合5-FU对抑制大肠癌LoVo细胞生长有协同作用。
实施例4 柚皮素联合5-FU对LoVo细胞凋亡的影响
为了研究柚皮素和5-FU协同抑制大肠癌LoVo细胞生长是否与细胞凋亡途径的活化增强有关，本实施例通过流式细胞仪分析了柚皮素和5-FU单独使用或者联合使用对LoVo细胞凋亡的影响。结果如图9和图10所示，处理48小时后发现，单独用柚皮素处理诱导17.81%细胞凋亡，单独用5-FU诱导了23.62% LoVo细胞凋亡，而CompoundC组诱导38.96%细胞凋亡；添加柚皮素显着增强了5-FU诱导的细胞凋亡能力，导致LoVo细胞中35.50％的细胞凋亡。Compound C组与柚皮素+5-FU组比较，没有统计学意义。
实施例5 柚皮素和5-FU联合对LoVo细胞Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3 蛋白水平的影响。
为了进一步了解柚皮素、5-FU及其联合使用诱导凋亡作用的可能机制，本实施例通过Western印迹检测了柚皮素、5-FU分别单独用药以及联合用药处理48h后，对三个关键凋亡蛋白（Cleaved caspase-3，Bax，Bcl-2）表达的影响（β-Actin为内参）。结果如图11和图12所示，可知：与对照组或单独药物组相比，LoVo细胞通过柚皮素和5-FU联合用药组处理后，Bax和Cleaved caspase-3的表达明显上调，Bcl-2的表达明显下调，P＜0.05。由此表明柚皮素和5-FU协同抑制大肠癌LoVo细胞生长，与细胞凋亡途径的活化增强有关。
实施例6 柚皮素和5-FU联合对LoVo细胞激活AMPK，抑制mTOR信号通路的影响
本实施例通过Western印迹检测了柚皮素、5-FU分别单独用药以及联合用药处理48h后，对AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、p70S6k和p-p70S6k蛋白表达的影响（β-Actin为内参），Western印迹结果如图13至图17所示，可知：用NAR和5-FU分别单独处理LoVo细胞后，p-AMPK蛋白表达增加，而p-mTOR和p-p70S6k的蛋白水平下降，但AMPK，mTOR和p70S6k蛋白无明显差异。柚皮素组和5-FU联合组较单药组显著增加了p-AMPK，减少p-mTOR、p-P70S6K水平。Compound C组与柚皮素和5-FU联合组比较，p-AMPK减少，p-mTOR、p-P70S6K蛋白增加。综上结果表明，柚皮素和5-FU联用在LoVo细胞中引起AMPK激活，抑制mTOR和p70S6k通路。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种含柚皮素的药物组合物，其特征在于，用于制备治疗大肠癌的药物，所述的药物组合物包含柚皮素和5-氟尿嘧啶。
2.根据权利要求1所述一种含柚皮素的药物组合物，其特征在于，所述柚皮素和5-氟尿嘧啶的摩尔比为4:1。
3.根据权利要求1所述的一种含柚皮素的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为药学接受剂型。
4.根据权利要求2所述的一种含柚皮素的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体，所述的药物组合物是将柚皮素与5-氟尿嘧啶，以及药学上可接受的载体，制备成药学接受剂型。
5.如权利要求1-4中任一项所述的含柚皮素的药物组合物在治疗大肠癌上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物在治疗结肠癌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物用于抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进结肠癌凋亡。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113045527A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-29 | 广东省科学院动物研究所 | 二氢色原酮衍生物及其合成方法和用途 |
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- 2020-07-09 CN CN202010657561.4A patent/CN111714500A/zh active Pending
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