CN109568313B - 一种抗肿瘤联合用药物及其在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种抗肿瘤联合用药物及其在制备抗癌药物中的应用，包括UMI‑77或其药学上可接收的载体形成的第一制剂，及替莫唑胺或其药学上可接收的载体形成的第二制剂。两者联用既能改善替莫唑胺的药物敏感性，又能发挥UMI‑77小分子抑制剂在抗PTEN突变的脑胶质瘤方面的作用，协同增强了替莫唑胺的治疗效果;两药联合使用也可以降低药物浓度，减轻药物毒性，减缓耐药性的产生。经实验证明，在PTEN突变的脑胶质瘤细胞中，UMI‑77和替莫唑胺两者联用有显著的协同抑制作用。本发明联合用药能应用于制备治疗PTEN突变的脑胶质瘤药物中，具有广阔的应用前景。

Description

一种抗肿瘤联合用药物及其在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤联合用药物及其在制备抗癌药物中的应用，尤其涉及一种联合用药在抑制PTEN突变脑胶质瘤细胞生长中的应用，特别是在制备抑制PTEN突变脑胶质瘤细胞生长药物中的应用。

背景技术

脑胶质瘤是一种最普遍的原发性颅内肿瘤，根据美国脑肿瘤注册中心(Centralbrain tμMor registry of the United States,CBTRUS)数据，恶性中枢神经系统肿瘤中有47％是脑胶质母细胞瘤(GBM)，是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一，具有侵袭性强，进展快的特点。目前针对脑胶质母细胞瘤的标准治疗是最大程度的手术切除再联合放疗和化疗。而唯一被临床证明能穿透血脑屏障并对脑胶质母细胞瘤有效的化疗药物替莫唑胺(TMZ)也仅能将患者中位生存期从12个月延长至14.1个月。

观察TCGA(The Cancer Genome Atlas)绘制的脑胶质母细胞瘤基因组图谱，发现88％的脑胶质母细胞瘤中RTK/RAS/PI3K信号通路发生基因突变，其中抑癌基因磷酸酯酶与张力蛋白同源物(Phosphatase and tensinhomolog,PTEN)突变率更是达到36％。在生存期的研究中发现，携带PTEN突变的胶质母细胞瘤病人的总体生存期要显著低于PTEN正常的对应病人群组(310天vs 620天；p＝5.16×10^-6)。由于携带PTEN突变或缺失的脑胶质瘤较为普遍，恶性程度高且预后差，在目前一线化疗药物替莫唑胺不能带来良好疗效的情况下，急需研发一种新的药物，用于特异性针对PTEN突变或缺失的脑胶质瘤，或者与替莫唑胺联合用药以改善替莫替莫唑胺疗效的药物。

髓样细胞白血病1(Mcl-1)基因是B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族的抗凋亡因子，在在筛选TPA(佛波酯)诱导人髓系白血病细胞系ML-1向单核/巨噬细胞分化过程中作为早期诱导基因首次被发现。它与BCL-2家族中促凋亡蛋白(BIM与BAK)形成异源二聚体，抑制线粒体中细胞色素C的释放，从而抑制细胞凋亡。本发明在PTEN突变和PTEN野生型的同源脑胶质母细胞瘤细胞系中，利用靶向178个靶点的606种小分子抑制剂进行筛选，找到Mcl-1的抑制剂UMI-77，将其与脑胶质瘤临床一线治疗药物替莫唑胺联用，发现在PTEN突变的脑胶质瘤细胞中UMI-77与替莫唑胺的协同抑制效应显著高于UMI-77与替莫唑胺单药在PTEN突变型脑胶质瘤细胞中的抑制效应。两药联用不仅发挥了UMI-77小分子抑制剂在抗PTEN突变脑胶质瘤中的作用，也增加了替莫唑胺的治疗效果；两药联合使用也可以降低药物浓度，减轻药物毒性，减缓耐药性的产生。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种抗肿瘤联合用药物及其在制备抗癌药物中的应用。本发明所述方案可以特异性抑制PTEN突变型脑胶质瘤细胞生长，能提高替莫唑胺在PTEN突变型脑胶质瘤细胞中的疗效。

技术方案：一种抗肿瘤联合用药物，包括UMI-77或其药学上可接收的载体形成的第一制剂，和替莫唑胺或其药学上可接收的载体形成的第二制剂。

上述第一制剂浓度不超过10μM，所述第二制剂浓度不超过500μM。

一种抗肿瘤联合用药物，包括上述的制剂组合物和其药学上可接受的辅料。

上述药物制剂的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂。

UMI-77或其药学上可接收的载体形成的第一制剂，和替莫唑胺或其药学上可接收的载体形成的第二制剂的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

上述肿瘤为PTEN突变的脑胶质瘤。

有益效果：本发明提供了一种联合用药；所述联合用药包含浓度0μM至500μM的替莫唑胺和浓度0μM至10μM的UMI-77，两者联用既能改善替莫唑胺的药物敏感性，又能发挥UMI-77小分子抑制剂在抗PTEN突变的脑胶质瘤方面的作用，协同增强了替莫唑胺的治疗效果；两药联合使用也可以降低药物浓度，减轻药物毒性，减缓耐药性的产生。经实验证明，在PTEN突变的脑胶质瘤细胞中，UMI-77和替莫唑胺两者联用有显著的协同抑制作用。本发明联合用药能应用于制备治疗PTEN突变的脑胶质瘤药物中，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中UMI-77和替莫唑胺分别单药和联合用药在LN18PTEN敲除脑胶质瘤细胞中的增殖抑制作用。

图2为实施例1中UMI-77和替莫唑胺分别单药和联合用药在LN229PTEN敲除脑胶质瘤细胞中的增殖抑制作用。

图3为实施例2中300μM替莫唑胺与不同浓度UMI-77联用对LN18PTEN野生型和PTEN突变型细胞生长的影响；图中每组数据自左至右依次为：LN18、LN18+TMZ300μM、LN18PTENKO、LN18PTEN KO+TMZ300μM；

图4为实施例3中不同浓度小分子抑制剂UMI-77和不同浓度替莫唑胺在LN18PTEN野生型和PTEN突变型细胞中两药联合的协同效应；Loewe在线软件计算得到两药协同分数显示UMI-77和替莫唑胺在LN18PTEN突变型细胞系中有协同效应。

具体实施方式

本发明的目的在于寻找针对PTEN突变型脑胶质瘤细胞的药物，改善替莫唑胺在治疗脑胶质瘤中的疗效，提高PTEN突变型脑胶质瘤患者的生存期。研究表明不同的药物联合使用时可以达到多靶点多抑制的效果，在恶性肿瘤的治疗中，联合用药已经成为一种趋势。不同的药物联合使用可能会产生一定的协同作用，从而降低单独用药的剂量，减少药物毒性在体内的积累，避免不良反应的叠加，增加药物的疗效。

本发明选择PTEN突变的脑胶质瘤是因为PTEN在脑胶质瘤中的突变率达到36％，并且携带PTEN突变的胶质母细胞瘤病人的总体生存期要显著低于PTEN正常的对应病人群组(310天vs 620天；p＝5.16×10^-6)。而替莫唑胺目前是临床脑胶质瘤治疗的一线药物，尽管其仅能将患者中位生存期从12个月延长至14.1个月，但是在脑胶质瘤的治疗史上已经是跨越式的进步。我们希望找到一种有效的小分子抑制剂，将其与替莫唑胺联用，减少替莫唑胺的药剂量和毒性，提高替莫唑胺疗效，延迟耐药性的产生。基于此思路，我们利用靶向178个靶点的606种小分子抑制剂在PTEN野生型和PTEN突变型的同源脑胶质瘤细胞上进行筛选，找到对PTEN野生型抑制率小于20％，对PTEN突变型抑制率大于50％的Mcl-1小分子抑制剂UMI-77；接着又通过MTS和克隆形成实验证明了10μM是UMI-77抑制PTEN突变脑胶质瘤细胞短期和长期生长最有效的浓度。在验证Mcl-1靶点的过程中发现Mcl-1敲降后确实PTEN突变型的脑胶质瘤细胞生长比PTEN野生型的脑胶质瘤细胞缓慢；并且发现UMI-77是通过抑制Mcl-1诱导细胞凋亡实现抑制PTEN突变型脑胶质瘤细胞生长的。最后用0μM至500μM的替莫唑胺和浓度0μM至10μM的UMI-77进行组合，发现在UMI-77和替莫唑胺在LN18PTEN突变的脑胶质瘤上呈现较好的协同抑制效应。

下面将结合本发明说明书附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。

实施例1

通过Alamar Blue检测替莫唑胺和UMI-77分别单药，以及两药联用处理LN18、LN229PTEN突变型细胞系后细胞增殖情况。具体实施方案如下:

(1)、LN18、LN229PTEN突变型细胞系分别每孔2000个细胞每孔种于96孔板中；

(2)、配制作用于LN18细胞系的UMI-77单药2、4、8、10μM；替莫唑胺单药200、300、400、500μM；双药浓度为UMI-77 2μM+TMZ 200μM、UMI-77 4μM+TMZ 300μM、UMI-77 8μM+TMZ400μM、UMI-77 10μM+TMZ 500μM；

(3)、配制作用于LN229细胞系的UMI-77单药2、4、8、10μM；替莫唑胺单药100、300、500、1000μM；双药浓度为UMI-77 2μM+TMZ 100μM、UMI-77 4μM+TMZ 300μM、UMI-77 8μM+TMZ500μM、UMI-77 10μM+TMZ 1000μM；

(4)、细胞铺板24h后弃掉旧培养基，更换(2)、(3)中不同浓度的新鲜含药培养基；

(5)、加药72h后弃掉含药的旧培养基，每孔加含有100μL完全培养基和10μLAlamarBlue的混合液，并设置阴性对照，在37℃5％二氧化碳的细胞培养箱中孵育4h后，采用化学发光仪在激发光波长534nm和发射光波长584nm的条件下检测吸光度并记录每孔数据。

(6)、对试验数据进行分析统计。如图1、2所示，无论UMI-77和替莫唑胺单药作用还是联合作用，其对LN18和LN229PTEN敲除的细胞生长的影响呈剂量依赖性。对于LN18PTEN敲除细胞，当UMI-77浓度为4μM，TMZ浓度为300μM开始时，联合用药对细胞生长的影响比单独用药效果明显；对于LN229PTEN敲除细胞，当UMI-77浓度为2μM，TMZ浓度为100μM开始时，联合用药对细胞生长的影响比单独用药效果明显。而且，在LN229PTEN敲除细胞中4μM UMI-77和300μM TMZ联合作用时，与单药作用浓度8μM的UMI-77和单药作用浓度为1000μM的TMZ对细胞的生长抑制率相近，说明本发明联合用药可以降低两药给药剂量，减少高剂量给药可能带来的毒副作用。

实施例2

采用300μM替莫唑胺与不同药物浓度UMI-77在LN18野生型和PTEN突变型细胞系联合使用观察是否有协同抑制作用。具体实施方案如下：

(1)、LN18野生型和PTEN突变型细胞系分别每孔2000个细胞每孔种于96孔板中；

(2)、配制300μM替莫唑胺单药，以及替莫唑胺与UMI-77的联合用药，其中联合药物中替莫唑胺浓度为300μM，UMI-77浓度分别为0、1、5、10μM。

(3)、细胞铺板24h后弃掉旧培养基，更换(2)中不同浓度的新鲜含药培养基；

(4)、加药72h后弃掉含药的旧培养基，每孔加含有100μL完全培养基和10μLAlamarBlue的混合液，并设置阴性对照，在37℃5％二氧化碳的细胞培养箱中孵育4h后，采用化学发光仪在激发光波长534nm和发射光波长584nm的条件下检测吸光度并记录每孔数据。

(5)、对试验数据进行分析统计。

如图3所示，当UMI-77浓度为10μM时，与野生型LN18相比在PTEN突变型LN18细胞系中具有更强的抑制效应；且与野生型LN18相比在LN18PTEN突变型细胞系中10μMUMI-77能显著增强300μM替莫唑胺对脑胶质瘤细胞的抑制率。

实施例3

将多个浓度替莫唑胺与多个浓度UMI-77联合用药，观察它们在LN18PTEN突变型细胞系中是否有协同抑制作用。具体实施方案如下：

(1)、LN18野生型和PTEN突变型细胞系分别每孔2000个细胞每孔种于96孔板中；

(2)、设置浓度梯度，每种药物五个浓度梯度，两两组合配成25组终浓度的含药完全培养基；

替莫唑胺(0μM、200μM、300μM、400μM、500μM)

UMI-77(0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM)

(3)、细胞铺板24h后弃掉旧培养基，更换(2)中不同浓度的新鲜含药培养基；

(4)、加药72h后弃掉含药的旧培养基，每孔加含有100μL完全培养基和10μLAlamarBlue的混合液，并设置阴性对照，在37℃5％二氧化碳的细胞培养箱中孵育4h后，采用化学发光仪在激发光波长534nm和发射光波长584nm的条件下检测吸光度并记录每孔数据。

使用Compusyn软件计算两药协同指数和Loewe在线软件计算两药协同分数，然后分析作图。

如图4所示使用使用Compusyn软件计算两药协同指数，图中横线表示CI＝1，当CI>1时两药有拮抗作用；CI＝1时两药有加和作用；CI<1时两药有协同作用；Loewe在线软件计算两药协同分数，当协同分数大于零时两药有协同作用，并且值越大协同作用越强。UMI-77和替莫唑胺在LN18PTEN突变型细胞系中具有较强的协同作用；Loewe在线软件计算得到两药协同分数显示，LN18PTEN突变型细胞系的协同分数大于PTEN野生型LN18细胞系的协同分数。以上结果说明，UMI-77和替莫唑胺在LN18PTEN突变型细胞系中具有协同抑制作用。

Claims (1)

1.浓度不超过10μM的UMI-77和浓度不超过500μM的替莫唑胺的组合物在制备抗PTEN突变的脑胶质母细胞瘤中的应用。

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