CN115920062A - 联合用药物及其在预防或治疗肝癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了联合用药物及其在预防或治疗肝癌中的应用，所述联合用药物包括：第一活性成分和第二活性成分，所述第一活性成分选自FGFR4抑制剂，所述第二活性成分选自格尔德霉素、伊马替尼、LY294002、小白菊内酯、坦螺旋霉素、曲古抑菌素A和伏立诺他的至少之一。利用本发明的联合用药物可以有效地预防或治疗肝癌，对于肝癌的科学研究和临床应用具有重要意义。

Description

联合用药物及其在预防或治疗肝癌中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及联合用药物及其在预防或治疗肝癌中的应用。

背景技术

原发性肝癌是全球范围内癌症相关死亡的第三大原因，是最致命的人类恶性肿瘤之一。据统计，肝细胞癌(HCC)占所有原发性肝癌的80％-90％。HCC起病隐秘，恶性程度高，被确诊时多已经处以疾病的晚期阶段，五年总体生存率小于20％。尽管手术技巧与局部治疗的方法不断进步，但估计表明，HCC患者中约有60％最终将通过系统疗法进行治疗。

FGFR4作为成纤维生长因子的重要受体之一，当其功能发生紊乱时，便会导致疾病包括肿瘤的发生。值得注意的是，FGFR4的异常表达与HCC的发生发展密切相关。靶向FGFR4的抑制剂有很多，部分已进入到phase 1或2期临床试验，目前研究进展最快的两个特异性抑制剂分别是罗布利替尼(简称为FGF401，英文为Roblitinib)与非索格替尼(简称为BLU-554，英文为Fisogatinib)，均已部分地进入到临床试验2期。在对53例FGFR4阳性HCC患者进行分析后，罗布利替尼的I/II期试验表明有效率为仅为8％。基于66名可评估的FGFR4/FGF19阳性患者，非索格替尼的I/Ib期试验显示有效率为仅为17％。实际上，BLU-554在晚期HCC患者中显示出与FGF401相似的临床活性。总体来说，FGFR4特异性抑制剂单药对HCC，特别是晚期HCC有一定效果，但是仍达不到理想的预期。

因此，目前用于治疗肝癌的药物仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了联合用药物、联合用药物在制备药物中的应用和体外抑制肝细胞癌细胞系的方法，利用本发明的联合用药物可以有效地预防或治疗肝癌，对于肝癌的科学研究和临床应用具有重要意义。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

本发明的发明人使用药物基因相关数据库，如连接图谱(cMap)、治疗靶点数据库(TTD)和药物库(Drugbank)，筛选出了7种可与FGF401或BLU-554联用以抑制肝细胞癌细胞系的小分子化合物，分别为格尔德霉素、伊马替尼、LY294002、小白菊内酯、坦螺旋霉素、曲古抑菌素A和伏立诺他。进一步地，通过生物学表型实验证实了这7种联合用药物具有抑制肝细胞癌细胞系生长的作用，其中小白菊内酯效果较佳。由此，对于肝癌的科学研究和临床应用具有重要意义。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种联合用药物。根据本发明的实施例，所述联合用药物包括：第一活性成分，所述第一活性成分选自FGFR4抑制剂；第二活性成分，所述第二活性成分选自格尔德霉素、伊马替尼、LY294002、小白菊内酯、坦螺旋霉素、曲古抑菌素A和伏立诺他的至少之一。本发明的发明人发现，FGFR4抑制剂与上述7种小分子化合物中的一种或多种联合用药，可以更好地发挥预防或治疗肝癌的作用，对于肝癌的科学研究和临床应用具有重要意义。

在本发明的另一方面，本发明提出了前面所述联合用药物在制备药物中的应用。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗肝癌。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种体外抑制肝细胞癌细胞系的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述联合用药物处理肝细胞癌细胞系。根据本发明实施例的方法中，采用联合用药物处理肝细胞癌细胞系，可以有效地抑制肝细胞癌细胞系生长，有助于肝癌的发病、发展和防治等研究提供帮助。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了cMap数据库筛选40种基于FGFR4共表达基因和富集途径的潜在组合药物分析图；

图2显示了TTD数据库分析候选药物的通路图；

图3显示了Drugbank数据库分析候选药物靶点图；

图4显示了CCK-8试剂盒检测FGFR4抑制剂(FGF401和BLU-554)和7种候选组合药物的细胞存活曲线；

图5显示了基于细胞存活曲线，计算9种药物处理Huh-7细胞的细胞存活分析图进而计算药物联合指数；其中，A：FGFR4抑制剂和药物处理Huh-7和Hep3B细胞，细胞活性分析图；B：热图中显示根据细胞活性和药物浓度计算的药物组合指数；“×”表示无法计算CI，“□”表示所选的联合用药方案；

图6显示了在Huh-7和Hep3B细胞系中，5种联合药物方案和对照组中流式细胞分析和统计结果；

图7显示了在显微镜下的明场中记录了联合用药物的Huh-7和Hep3B 3D细胞球体的状态；

图8显示了通过刃天青测定法检测使用组合药物的Huh-7和Hep3B 3D细胞球体的活性；

图9显示了3D细胞球状体，以评估FGFR4抑制剂和小叶内酯联合应用的效果，其中，A：探针染色用于检测3D细胞球体存活状态；B：探针染色用于检测3D细胞球体的活细胞和死细胞比例。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了联合用药物及其在制备药物中的应用和体外抑制肝细胞癌细胞系的方法，下面将分别对其进行详细描述。

联合用药物

在本发明的一个方面，本发明提出了一种联合用药物。根据本发明的实施例，该联合用药物包括：第一活性成分，所述第一活性成分选自FGFR4抑制剂；第二活性成分，所述第二活性成分选自格尔德霉素、伊马替尼、LY294002、小白菊内酯、坦螺旋霉素、曲古抑菌素A和伏立诺他的至少之一。

FGFR4抑制剂可以特异性抑制FGFR家族的FGFR4受体，具有较好的选择，从而避免对FGFR1-R3作用及因此导致的不良反应。根据本发明的实施例，所述FGFR4抑制剂选自FGF401和BLU-554的至少之一。FGF401是一种与ATP激酶竞争性可逆共价结合的FGFR4抑制剂；BLU-554是一种高选择性、不可逆的FGFR4抑制剂，可以以极高的特异性抑制FGFR4。FGF401和BLU-554均被证实对于肝癌具有治疗作用。

格尔德霉素(Geldanamycin)是一种Hsp90抑制剂，具有抗多种革兰氏阳性和阴性细菌的活性，还具有抗流感病毒H5N1的活性。

伊马替尼(Imatinib)是一种小分子蛋白激酶抑制剂，它具有阻断一种或多种蛋白激酶的作用，临床可用于治疗慢性髓性白血病和恶性胃肠道间质肿瘤。

LY294002是一种能够阻断三磷酸酰肌醇蛋白激酶(Phosphotidylinsitol-3-Kinase)细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂，它被广泛用于三磷酸酰肌醇蛋白激酶细胞信号传导通路的特性研究中。

坦螺旋霉素(Tanespimycin)是一种有效的HSP90抑制剂，对肿瘤细胞HSP90的亲和性比正常细胞高近百倍，其可消耗细胞内STK38/NDR1，并降低STK38激酶活性，还下调STK38基因表达。

曲古抑菌素A(Trichostatin A)是一种有效的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，也是一种抗真菌类抗生素，具有抑制细胞生长和诱导细胞分化的特性，在培养的哺乳动物细胞以及分离的细胞核提取物中，曲古抑菌素A在低浓度时可以非竞争性并可逆地抑制HDAC，能够使细胞停滞在G1和G2期，诱导细胞分化，恢复培养细胞的转化形态。

伏立诺他(Vorinostat)是一组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，能通过诱导细胞分化、阻断细胞周期、诱导细胞调控而发挥作用，主要治疗加重、持续和复发或用两种全身性药物治疗后无效的皮肤T细胞淋巴瘤。

小白菊内酯(Parthenolide)是一种天然存在的生物氨基苯甲酸，为κB抑制剂，抑制组蛋白脱乙酰酶1325(HDAC-1)和DNA甲基转移酶1(DMT-1)，其在多种肿瘤中具有抗癌活性，例如乳腺肿瘤、结直肠癌、肾细胞癌等。

本发明的发明人发现，格尔德霉素、伊马替尼、LY294002、小白菊内酯、坦螺旋霉素、曲古抑菌素A和伏立诺他的至少之一与FGFR4抑制剂联合用药，可以有效地抑制Huh7细胞或Hep3B细胞生长，有助于预防或治疗肝癌。

根据本发明的实施例，所述第一活性成分选自FGF401，所述第二活性成分选自小白菊内酯和伊马替尼的至少之一。发明人发现，上述7种小分子化合物中，小白菊内酯和伊马替尼中的一种或两种与FGF401联合用药，抑制肝细胞癌细胞系生长的效果更佳，可以更好地发挥预防或治疗肝癌的作用。

根据本发明的实施例，所述第一活性成分选自BLU-554，所述第二活性成分选自小白菊内酯、LY294002、曲古抑菌素A和伏立诺他的至少之一。发明人发现，上述7种小分子化合物中，小白菊内酯、LY294002、曲古抑菌素A和伏立诺他中的一种或多种与BLU-554联合用药，抑制肝细胞癌细胞系生长的效果更佳，可以更好地发挥预防或治疗肝癌的作用。

根据本发明的实施例，所述联合用药物包括：第一活性成分，所述第一活性成分选自FGF401和BLU-554的至少之一；第二活性成分，所述第二活性成分选自小白菊内酯。发明人发现，上述7种小分子化合物中，FGF401和BLU-554的至少之一与小白菊内酯联合用药，抑制肝细胞癌细胞系生长的效果更佳，可以更好地发挥预防或治疗肝癌的作用。

根据本发明的实施例，联合用药物可以进一步包括药学上可接受的辅料。本发明对于辅料的种类不做严格限定，可以根据情况灵活选择。对于注射制剂，药物上可接受的辅料可以包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗压剂和稳定剂等。对于局部给药的制剂，药物上可接受的辅料可以包括碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂、填充剂、抗凝血剂、润滑剂、保湿剂和芳香剂等。本发明的联合用药物可以被制备成各种剂型。对于注射制剂，联合用药物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。联合用药物还可以被制备成溶液、悬浮液、药片、药丸、胶囊和长效制剂等。

应用

在本发明的另一方面，本发明提出了前面所述联合用药物在制备药物中的应用。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗肝癌。

根据本发明的实施例，本发明的联合用药物能够可以有效地抑制肝细胞癌细胞系生长，有助于预防或治疗肝癌。因而，本发明的联合用药物可以在预防或治疗肝癌时被给药。

根据本发明的实施例，所述肝癌选自原发性肝癌。具体地，原发性肝癌进一步分为HCC(肝细胞癌)与ICC(肝内胆管细胞癌)。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的联合用药物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉、肌肉、皮下、皮层、口服、局部、鼻腔、肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，肽被消化，肽键断裂，因此口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解或破坏。优选地，本发明的联合用药物可以注射制剂被给药。此外，本发明的联合用药物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的联合用药物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型、给药途径、病人年龄、性别、体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在癌症治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果，例如抑制癌细胞生长、导致癌细胞死亡或改善疾病或病症。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指癌症)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防癌症)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物组合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述联合用药物的药物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的联合用药物或药物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的联合用药物或药物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。

需要说明的是，前面针对联合用药物所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。

体外抑制肝细胞癌细胞系的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种体外抑制肝细胞癌细胞系的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述联合用药物处理肝细胞癌细胞系。根据本发明实施例的方法中，采用联合用药物处理肝细胞癌细胞系，可以有效地抑制肝细胞癌细胞系生长，有助于肝癌的发病、发展和防治等研究提供帮助。具体地，采用联合用药物处理肝细胞癌细胞系是通过将联合用药物与肝细胞癌细胞系混合共培养实现的。

根据本发明的实施例，所述肝细胞癌细胞系选自Huh7细胞或Hep3B细胞。

根据本发明的实施例，所述肝细胞癌细胞系选自Huh7细胞；所述第一活性成分选自FGF401，所述第二活性成分选自伊马替尼和小白菊内酯的至少之一；或者所述第一活性成分选自BLU-554，所述第二活性成分选自伊马替尼、LY294002和小白菊内酯的至少之一。

发明人发现，伊马替尼和小白菊内酯的至少之一与FGF401联合用药，可以有效地抑制Huh7细胞生长。伊马替尼、LY294002和小白菊内酯的至少之一与BLU-554联合用药，也可以有效地抑制Huh7细胞生长。

根据本发明的实施例，所述肝细胞癌细胞系选自Hep3B细胞；所述第一活性成分选自FGF401，所述第二活性成分选自小白菊内酯；或者所述第一活性成分选自BLU-554，所述第二活性成分选自LY294002、曲古抑菌素A、伏立诺他和小白菊内酯的至少之一。

发明人发现，小白菊内酯与FGF401联合用药，可以有效地抑制Hep3B细胞生长。LY294002、曲古抑菌素A、伏立诺他和小白菊内酯的至少之一与BLU-554联合用药，也可以有效地抑制Hep3B细胞生长。

需要说明的是，前面针对联合用药物所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、筛选潜在的FGFR4抑制剂组合

通过cMap数据库预测可能的药物，为了找到可能治愈HCC的小化合物列表，使用上述分析中的交叉基因进行了查询，包括共表达基因和富集途径。根据p值，分别选择了前20种药物进行进一步研究(图1、表1和表2)。TTD数据库用于测试这40种药物的通路，Drugbank数据库用于筛选靶点(图2和图3)。综合使用三个数据库中的数据确定了以下药物用于联合使用：格尔德霉素、伊马替尼、LY294002、小白菊内酯、坦螺旋霉素、曲古抑菌素A和伏立诺他。

表1根据共表达基因匹配潜在的组合药物

表2基于代谢通路匹配潜在的组合药物

No.	cMap name	Mean	N	Enrichment	p-value
						1	Felbinac	-0.823	4	-0.884	0.0004
2	Cicloheximide	-0.679	4	-0.85	0.00095
						3	Mercaptopurine	0.782	2	0.965	0.00207
4	Aciclovir	-0.525	6	-0.688	0.00222
						5	Eldeline	0.381	6	0.688	0.00238
6	Monensin	-0.416	6	-0.679	0.003
						7	Pirinixic acid	0.605	5	0.732	0.00312
8	N-acetyl-L-leucine	0.476	4	0.797	0.00328
						9	3-nitropropionic acid	0.31	4	0.793	0.00362
10	Phenoxybenzamine	0.587	4	0.79	0.0039
						11	Lovastatin	-0.578	4	-0.79	0.00398
12	Napelline	0.344	4	0.787	0.004
						13	Luteolin	0.391	4	0.784	0.00412
14	Nadolol	-0.312	4	-0.776	0.00519
						15	Furazolidone	-0.651	4	-0.771	0.00561
16	Harmol	0.443	4	0.765	0.00579
						17	Josamycin	-0.505	5	-0.695	0.00581
18	Azlocillin	0.461	4	0.764	0.00591
						19	Eticlopride	-0.502	4	-0.763	0.00649
20	Lycorine	-0.471	5	-0.685	0.00717

2、HCC细胞中FGFR4抑制剂组合的评估

用两种FGFR4抑制剂(FGF401和BLU-554)以及七种候选单药处理Huh-7和Hep3B细胞，使用CCK-8试剂盒分析绘制这九种单药中每一种的细胞存活曲线(图4)。图5的A中的热图显示了药物联合使用的效果。之后，计算了联合药物指数(CI)，并将结果显示在图5的B中。如果CI小于1，则两种药物是协同的，如果CI大于1，则是拮抗的。为了进一步评估HCC细胞的细胞凋亡和坏死，我们将表型实验方案标准确定为细胞存活率(CV)<0.1或CI<0.6。

由图6看出，FGF401分别与Imatinib或Parthenolide可以有效地抑制Huh-7细胞，BLU-554分别与Imatinib、LY294002或Parthenolide可以有效地抑制Huh-7细胞。FGF401与Parthenolide可以有效地抑制Hep3B细胞，BLU-554分别与LY294002、Parthenolide、Trichostatin A或Vorinostat可以有效地抑制Hep3B细胞。整体而言，Parthenolide与FGF401或BLU-554联合用药，均对Huh-7细胞和Hep3B细胞具有较好的抑制作用。

3、评估FGFR4抑制剂和潜在联合药物对3D培养的HCC细胞球体的作用

为了更好地模拟实体瘤在体内的微环境，更真实地反映药物的效果，采用3D细胞球体对上述组合方案进行了验证。我们培养了3D细胞球，3天后，用上述药物组合处理这些HCC细胞球状体以进行进一步评估。用显微镜连续拍摄了3D细胞球体在药物暴露过程中细胞死亡和脱落图像。用药物组合处理的细胞球中的细胞脱落在图7中很明显，但是与仅接受一种治疗的组相比，细胞球状体的体积没有太大变化，这可能是松散的细胞间连接的结果。刃天青测定用于评估肿瘤球状体的细胞活性，如图8所示，从结果看出，FGFR抑制剂和小白菊内酯联合使用对Huh-7和Hep3B球状体的影响均明显。由此表明，小白菊内酯可用作潜在的组合策略。

为了进一步评估可能的潜在组合，进行了高内涵成像和分析，以研究药物治疗球状体中活细胞和死细胞的百分比。染色后，用一种或另一种组合药物治疗的微球用于使用Z步进模型通过转盘共聚焦生成高分辨率图像。结果如图9中A所示。采用探针在孵育时间终点对细胞进行染色，计算活细胞和死细胞比例，评价药效。数据表明，联合治疗具有相当大的效果(图9中B)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种联合用药物，其特征在于，包括：

第一活性成分，所述第一活性成分选自FGFR4抑制剂；

第二活性成分，所述第二活性成分选自格尔德霉素、伊马替尼、LY294002、小白菊内酯、坦螺旋霉素、曲古抑菌素A和伏立诺他的至少之一。

2.根据权利要求1所述联合用药物，其特征在于，所述FGFR4抑制剂选自FGF401和BLU-554的至少之一。

3.根据权利要求1所述联合用药物，其特征在于，所述第一活性成分选自FGF401，所述第二活性成分选自小白菊内酯和伊马替尼的至少之一。

4.根据权利要求1所述联合用药物，其特征在于，所述第一活性成分选自BLU-554，所述第二活性成分选自小白菊内酯、LY294002、曲古抑菌素A和伏立诺他的至少之一。

5.根据权利要求1所述联合用药物，其特征在于，包括：

第一活性成分，所述第一活性成分选自FGF401和BLU-554的至少之一；

第二活性成分，所述第二活性成分选自小白菊内酯。

6.权利要求1～5任一项所述联合用药物在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于预防或治疗肝癌；

优选地，所述肝癌选自原发性肝癌。

7.一种体外抑制肝细胞癌细胞系的方法，其特征在于，包括：采用权利要求1～5任一项所述联合用药物处理肝细胞癌细胞系。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述肝细胞癌细胞系选自Huh-7细胞或Hep3B细胞。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述肝细胞癌细胞系选自Huh7细胞；

所述第一活性成分选自FGF401，所述第二活性成分选自伊马替尼和小白菊内酯的至少之一；或者

所述第一活性成分选自BLU-554，所述第二活性成分选自伊马替尼、LY294002和小白菊内酯的至少之一。

10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述肝细胞癌细胞系选自Hep3B细胞；

所述第一活性成分选自FGF401，所述第二活性成分选自小白菊内酯；或者

所述第一活性成分选自BLU-554，所述第二活性成分选自LY294002、曲古抑菌素A、伏立诺他和小白菊内酯的至少之一。

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