CN115227690B - 土木香内酯在双表达型b细胞淋巴瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种土木香内酯在双表达型B细胞淋巴瘤中的应用。所述土木香内酯可用于制备抑制双表达型B细胞淋巴瘤的药物，所述药物为液体剂型。本发明提供的方案能显著抑制淋巴瘤的生长，甚至让淋巴瘤消失。

Description

土木香内酯在双表达型B细胞淋巴瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种土木香内酯在双表达型B细胞淋巴瘤中的应用。

背景技术

土木香内酯(alantolactone,ATL)是土木香的主要活性成分之一，为倍半萜内酯类化合物，分子式为C₁₅H₂₀O₂。近年来研究显示，其对多种实体肿瘤具备抗肿瘤活性，包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、骨髓癌等。申请号为“CN202010088831.4”，发明名称为“土木香内酯在制备治疗肿瘤恶病质疾病的药物中的应用”的中国专利，公开了土木香内酯在制备治疗肿瘤恶病质疾病的药物中的新用途，其中肿瘤包括消化道相关癌症、肝癌、肺癌和结肠癌等。目前关于土木香内酯在血液肿瘤中的研究较少，文献资料《土木香内酯药理作用研究进展》(任怡静，岳备等，2019年)公开了ATL对白血病有抑制作用的研究进展，其机制可能是激活了HL-60细胞ROS线粒体凋亡通路，从而诱导癌细胞凋亡，或者可能是抑制K562/ADR细胞的Ber/Abl信号通路，抑制细胞增殖等。但尚未见ATL在抑制B细胞淋巴瘤方面的报道。

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常见的亚型，具有高度侵袭性。不同病理亚型的DLBCL在生物学行为、细胞遗传学、分子生物学方面具有高度异质性。近年来，大量基因及蛋白表达的研究表明某些基因异常是DLBCL预后不良的因素，相关蛋白表达也在肿瘤的发展中起到关键作用。其中，MYC/8q24基因断裂和其他位点(包括BCL2/18q21、BCL6/3q27)同时发生易位的淋巴瘤，被称之为双打击或三打击淋巴瘤(DHL/THL)；同时存在MYC和BCL-2蛋白共表达的DLBCL称为双表达淋巴瘤(DPL)。DPL的恶性程度高，临床进展迅速，耐药率和复发率均较高，总体生存期较短，预后极差。传统的淋巴瘤标准治疗方案如CHOP能治愈50％以上的DLBCL患者，但是无论传统方案还是加强化疗方案对DPL患者治疗缓解率都远低于非双表达型患者。

综上所述，亟待开发一种新的方案以提高DPL的治疗效率。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种土木香内酯在双表达型B细胞淋巴瘤中应用的技术方案。具体技术方案如下。

土木香内酯在制备用于抑制B细胞淋巴瘤药物中的应用，所述B细胞淋巴瘤为双表达cMYC和BCL2蛋白的B细胞淋巴瘤。

进一步，所述药物为液体剂型，包括注射剂和口服溶剂。

进一步，所述液体剂型包括以下组分：0.01-0.03％土木香内酯、8-12％丙二醇、0.01-0.03％无水乙醇以及0.01M PBS溶液，所述PBS溶液包括0.8％NaCl、0.02％KCl、0.142％Na₂HPO₄和0.027％KH₂PO₄。

进一步，当所述液体剂型为注射剂的时候，给药方式为静脉输注或腹腔注射。

进一步，所述药物的给药方式为5-10mg/kg，连续给药10天。

进一步，所述土木香内酯用于抑制BCL2蛋白的表达和促进BAX蛋白的表达。

进一步，所述土木香内酯用于促进Fas蛋白和cMYC蛋白的表达。

进一步，所述土木香内酯用于抑制Wnt/β-catenin通路激活以抑制癌细胞增殖。

一种治疗B细胞淋巴瘤的药物，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤为双表达cMYC和BCL2蛋白的B细胞淋巴瘤；所述药物包括以下组分：0.01-0.03％土木香内酯、8-12％丙二醇、0.01-0.03％无水乙醇以及0.01M PBS溶液，所述PBS溶液包括0.8％NaCl、0.02％KCl、0.142％Na₂HPO₄和0.027％KH₂PO₄。

进一步，所述药物还含有药学上可接受的其他载体和/或助剂。

有益技术效果

本发明提出土木香内酯在cMYC和BCL2双表达型B细胞淋巴瘤中的应用。土木香内酯目前主要用于实体肿瘤的抗癌研究中。B细胞淋巴瘤属于血液肿瘤，其发病机制和抗癌靶点均与实体肿瘤有很大的差异。双表达淋巴瘤约占DLBCL患者的21％-34％，且一线治疗方案R-CHOP双表达淋巴瘤的治疗效果并不理想。本发明团队提供的方案，即含有土木香内酯的混悬剂(液体溶剂)能显著抑制淋巴瘤的生长，甚至是让淋巴瘤消失。在小鼠模型中，连续给药10天后，能明显观察到用F18标记的颈部和腹股沟处的淋巴瘤变小和消失，给药组小鼠的总体生存期延长。此外，本发明还揭示了土木香内酯抗双表达淋巴瘤的分子机制，具有重要的临床意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为不同浓度的土木香内酯抗肿瘤细胞效果图；

图2为不同浓度的土木香内酯处理淋巴瘤细胞系的凋亡流式散点图；

图3为土木香内酯促进淋巴细胞凋亡的柱形图；

图4为土木香内酯抗双表达淋巴瘤细胞通路机制图；

图5为双荧光细胞感染比例图；

图6为给药组双表达淋巴瘤小鼠实验图；

图7为另一幅给药组双表达淋巴瘤小鼠实验图；

图8为对照组双表达淋巴瘤小鼠实验图；

图9为另一幅对照组双表达淋巴瘤小鼠实验图；

图10为给药组和对照组淋巴瘤小鼠总体生存期对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围

的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

实施例1

使用不同浓度的土木香内酯(0～32μM)处理多种人源大B细胞淋巴瘤细胞系：Namalwa，Kasumi，Raji，Romas，SU-DHL-4和SU-DHL-6。所使用的剂量浓度分别为0μM、2μM，4μM，8μM，16μM，32μM。实验方法：

在96孔细胞培养板进行药物剂量效应实验，首先将对数生长期细胞计数，按照1×10⁴/孔细胞量接种细胞，同时给与不同浓度梯度的土木香内酯来处理细胞。药物浓度用培养基按照等比例稀释由高到低配置，最高浓度为32μM，最低浓度为2μM，对照组细胞培养基中加入与药物等体积的溶剂DMSO，每个处理孔DMSO含量为1/5500。所有细胞系经药物处理48小时后，分别进行CCK8细胞活性检测和细胞计数，统计药物半抑制浓度(图1)。

实验结果：

多种淋巴瘤细胞系对土木香内酯敏感性较高，包括Namalwa，Kasumi，Raji，SU-DHL-4和SU-DHL-6。其中Kasumi和Namalwa对土木香内酯的敏感性最高，在药物浓度为8μM时几乎没有细胞活性了。本实验结果显示结果土木香内酯对多种淋巴瘤细胞有较强杀伤力。

此外，由于不同细胞系对土木香内酯药物敏感性不同，根据不同浓度药物处理细胞后，CCK8的OD值计算药物与细胞的剂量效应关系，另依据给药组的活细胞数量/溶剂对照组的活细胞数量，同样得到CCK8相似的半数有效药物抑制浓度(表1)。表1中示出每种淋巴细胞真实的IC50浓度，其中，Namalwa为6.23μM，Kasumi为5.18μM，Raji为10.97μM，SU-DHL-4为5.91μM，SU-DHL-6为6.15μM。Romas为36.65μM，显示对土木香内酯不敏感。此外，Baf3作为正常细胞对照(正常B细胞)，也显示对土木香内酯不敏感。说明土木香内酯具有淋巴瘤细胞特异性，对正常细胞毒性低，安全范围大。

表1

实施例2

分别给与不同浓度药物(0μM，4μM，8μM，16μM)处理不同淋巴瘤细胞系，经流式凋亡检测发现淋巴瘤细胞凋亡率与药物剂量呈剂量相关性(图2，图3)。其中图2的Q3象限代表凋亡的细胞数，从左图的Q3到右图的Q3，可以明显看到随着药物浓度的提高，凋亡的细胞数量在增加。

此外，本发明还揭示了土木香内酯抑制淋巴癌细胞的分子机制。

BCL2和BAX基因为一对促癌基因和抑癌基因。本发明实验组用不同浓度药物处理Namalwa细胞，发现该细胞中的BCL2蛋白(BCL2为促癌基因)表达量与土木香内酯用量之间呈现剂量浓度依赖性降低。同时，抑癌基因BAX的蛋白表达量与土木香内酯药物浓度呈现剂量效应关系，该蛋白随着药物浓度增加而增加(图4A)。即，土木香内酯抑制了BCL2蛋白表达的同时，还增强了BAX蛋白的表达，实际上是达到了双重抑制淋巴癌的效果。

cMYC和Fas是同一个信号通路上的一对基因。cMYC同时具备促癌细胞增殖和抑制癌细胞增殖的功能。Fas是一个致死基因，只有当Fas的表达量增加的时候，才能使cMYC发挥抑制癌细胞增殖的功能。在用不同浓度药物处理的Namalwa细胞中，cMYC和Fas蛋白的表达量都随着药物浓度增加而增加，产生了Fas-cMYC蛋白复合物，达到了共同促进癌细胞凋亡的作用(图4B)。

Wnt/β-catenin通路位于cMYC上游，该信号通路上的蛋白AXIN1，GSK3β表达量随着药物浓度增加而增加，磷酸化的β-catenin表达水平因此而降低(图4C)。土木香内酯通过调节Wnt/β-catenin通路基因表达，抑制Wnt/β-catenin通路激活从而抑制癌细胞增殖。

综上所述，通过几种不同的分子机制的协同抗癌作用，土木香内酯进一步增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。

实施例3

收集C57小鼠骨髓细胞，用抗CD19抗体磁珠标记小鼠骨髓细胞，磁珠分选preB细胞，在含10％FBS和IL7(3ng/ml)条件培养基中，37℃培养箱，含5％CO₂中培养24h，待细胞处于对数生长期时分别用携带GFP和mCherry荧光的cMYC和BCL2病毒共同感染preB细胞。感染24h后，在流式检测双荧光preB细胞比例。从图5的Q2象限中可以观察到双阳性(即双荧光)的结果，双荧光细胞比例在5％左右，即证明此时小鼠已经感染了cMYC和BCL2病毒。

随后，以3.5Gy X射线辐照小鼠作为受体小鼠，按照移植总细胞数为1×10⁶/小鼠，构建双表达淋巴瘤模型。细胞移植3周后，PET-CT检测小鼠淋巴瘤模型建立情况(图6)。从图6中的箭头处可以看到小鼠的淋巴瘤细胞聚集情况，其分别在小鼠的颈部和腹股沟处。

成功建立淋巴瘤模型后，立即对小鼠尾静脉或腹部注射土木香内酯液体剂，给药剂量为每天5-10mg/kg，具体包括5mg/kg、8mg/kg和10mg/kg。所述土木香内酯液体剂由：0.01-0.03％土木香内酯、8-12％丙二醇、0.01-0.03％无水乙醇以及0.01M PBS溶液，所述PBS溶液包括0.8％NaCl、0.02％KCl、0.142％Na₂HPO₄和0.027％KH₂PO₄组成。连续给药10天，PET-CT用F18标记，检测肿瘤，PMOD软件作图整理分析，统计药物治疗效果。给药组小鼠淋巴瘤组织(箭头处)消失或减小(图6，图7)，而对照组淋巴瘤组织明显增加(图8，图9)；与对照组相比，给药组淋巴瘤小鼠总体生存期明显延长(P<0.05)(图10)。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (6)

1.土木香内酯在制备用于抑制B细胞淋巴瘤药物中的应用，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤为同时存在cMYC和BCL2蛋白共表达的双表达淋巴瘤；所述土木香内酯作用于所述双表达淋巴瘤细胞，用于抑制BCL2蛋白的表达和促进BAX蛋白的表达，以及同时促进Fas蛋白和cMYC蛋白的表达。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为液体剂型，包括注射剂和口服溶剂。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液体剂型包括以下组分：0.01-0.03% 土木香内酯、8-12% 丙二醇、0.01-0.03% 无水乙醇以及0.01M PBS溶液，所述PBS溶液包括0.8% NaCl、0.02% KCl、0.142% Na₂HPO₄和0.027% KH₂PO₄。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，当所述液体剂型为注射剂的时候，给药方式为静脉输注或腹腔注射。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为5-10mg/kg，连续给药10天。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述土木香内酯用于抑制Wnt/β-catenin通路激活以抑制癌细胞增殖。

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