CN112915101A - 一种抗肿瘤联合药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，公开了一种抗肿瘤联合药物组合物及其应用。本发明药物组合物包括顺铂纳米药和PD1/PD‑L1抑制剂。本发明发现顺铂纳米药可诱导肿瘤PD‑L1高表达，并具有剂量和时间依赖性；在静脉给药后可持续诱导肿瘤PD‑L1高表达，使PD1/PD‑L1抑制剂有更多的机会阻断PD1/PD‑L1信号通路、活化杀伤性T细胞；在与PD1/PD‑L1抑制剂联合用药中，两者可以起到协同增效作用，进一步增强对于肿瘤的抑制。本发明提供的顺铂纳米药和PD1/PD‑L1抑制剂联合可以协同增强对于肿瘤生长的抑制作用，在癌症治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

一种抗肿瘤联合药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体的说是涉及一种抗肿瘤联合药物组合物及其应用。
背景技术
PD1/PD-L1免疫治疗取得了显著的抗癌疗效，具有巨大的抗癌前景。然而，绝大多数、未经挑选的实体瘤中，单独使用PD-1/PD-L1抑制剂对于大多数癌症的有效率不超过30％。但由于免疫系统具有记忆功能，PD1/PD-L1抑制剂的疗效具有持久性，一旦PD1/PD-L1抑制剂起效，可使部分患者实现临床治愈，不复发、不进展、长期生存5年甚至10年。因此，提高PD1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤疗效将使更多的癌症患者受益。
已有报道指出肿瘤PD-L1表达不足是影响PD-1/PD-L1抑制剂起效的重要原因，且FDA批准的适用症中，特别限定只有在PD-L1表达阳性肿瘤中才能单独使用PD-1/PD-L1抑制剂，因此提高PD-L1表达有助于提升PD-1/PD-L1抑制剂的疗效。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对抑制肿瘤具有协同增效作用的联合药物组合物；
本发明的另外一个目的在于提供上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种抗肿瘤联合药物组合物，包括顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂，或由顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂组成。
作为优选，所述顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂的重量比为(0.1～5):1，进一步优选为(0.3～3):1；更优选为(0.6～1.2):1。
顺铂纳米药，是顺铂的纳米制剂。顺铂是一种含铂的抗癌药物，即顺式-二氯二氨合铂(II)，它与DNA结合，引起交叉联结，从而破坏DNA的功能，并抑制细胞有丝分裂，为一种细胞非特异性药物。其抗瘤谱较广，用于头颈部鳞癌；卵巢癌；胚胞性癌；精原性细胞瘤；肺癌；甲状腺癌；淋巴肉瘤及网状细胞肉瘤等。在FDA批准的使用中，PD-1/PD-L1抑制剂的多项适用症与铂类药物相关或与铂类药物联合使用。但在本发明的相关试验中却发现，顺铂原药在肿瘤处的滞留时间短、浓度低，无法有效诱导肿瘤PD-L1高表达，在与PD1/PD-L1抑制剂联合用药中，两者仅可以起到加和作用，对于肿瘤生长抑制的增强作用有限。
作为优选，所述顺铂纳米药为聚谷氨酸聚乙二醇共聚物络合顺铂poly(L-glutamic acid)-graft-methoxy-poly(ethylene glycol)/cisplatin。
进一步优选地，所述顺铂纳米药具有式I所示结构：
Figure BDA0002948503030000021
其中，R1是C2到C10的直链烷基或C3到C10的支链烷基、苯基或末端氨基酸单元；
R2是H，C2到C10的直链酰基或C3到C10的支链酰基基团；
R3是可以被官能团取代的烷基；
R4是H或者阳离子单元；所述阳离子单元优选自金属阳离子或有机阳离子；其中，金属阳离子包括钠，钾，镁的亚群，有机阳离子，优选自胺的阳离子，氨基酸的阳离子；
L是基团-CH2-CH2-(谷氨酸单元)；
m为聚合度，40≤m≤250；x，y，z为聚合度,10≤2x+y+z≤5000，优选在30和300之间；5％≤y/(2x+y+z)≤80％，优选5％和50％之间。
程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配体(PD-L1)抑制剂是免疫哨点单抗药物，本发明所述PD1/PD-L1抑制剂选自抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD1/PD-L1小分子抑制剂中的一种或两种以上；在本发明具体实施方式中为抗PD1抗体和BMS-202。
本发明发现顺铂纳米药可诱导肿瘤PD-L1高表达，并具有剂量和时间依赖性；在静脉给药后，顺铂纳米药在肿瘤处的滞留时间较长、浓度高，可持续诱导肿瘤PD-L1高表达，使PD1/PD-L1抑制剂有更多的机会阻断PD1/PD-L1信号通路、活化杀伤性T细胞；在与PD1/PD-L1抑制剂联合用药中，两者可以起到协同作用，可以进一步增强对于肿瘤的抑制。相比之下，顺铂原药在肿瘤处的滞留时间短、浓度低，无法有效诱导肿瘤PD-L1高表达，在与PD1/PD-L1抑制剂联合用药中，两者仅可以起到加和作用，对于肿瘤生长抑制的增强作用有限。
基于以上优异的技术效果，本发明提出了所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用或在向对象施用有效量药物组合物进行处理中的应用。其中，所述对象可以是体外的肿瘤细胞系。
作为优选，抗肿瘤药物针对的肿瘤为鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、纤维组织细胞癌、横纹肌肉癌、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤中的一种或两种以上。
依据应用，本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，包括本发明所述药物组合物和药学上可接受的辅料。本发明所述药物可以是以下形式中的任意一种：1)将顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或者不同，给药途径亦可相同或者不同。2)将顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂配置成复方制剂。在将顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
作为优选，所述药物的剂型片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、贴剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、注射剂、栓剂或它们的任意形式组合。
本发明还依据应用一种抗肿瘤的联合治疗方法，向对象施用有效量的本发明所述药物组合物，或为向对象联合施用有效量的顺铂纳米药，以及有效量的PD1/PD-L1抑制剂。所述的对象可以是体外的肿瘤细胞系，或者为哺乳动物或所述哺乳动物的肿瘤细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述对象可以是罹患肿瘤的患者，或者为罹患肿瘤的患者的离体肿瘤细胞。可以同步的或者顺序地给予有效量的顺铂纳米药和有效量的PD1/PD-L1抑制剂。基于顺铂纳米药能够在较长时间内造成肿瘤PD-L1高表达，本发明经研究发现，在与PD1/PD-L1抑制剂联合用药中，两者可以起到更显著的肿瘤治疗效果。
由以上技术方案可知，本发明发现顺铂纳米药可诱导肿瘤PD-L1高表达，并具有剂量和时间依赖性；在静脉给药后可持续诱导肿瘤PD-L1高表达，使PD1/PD-L1抑制剂有更多的机会阻断PD1/PD-L1信号通路、活化杀伤性T细胞；在与PD1/PD-L1抑制剂联合用药中，两者可以起到协同增效作用，进一步增强对于肿瘤的抑制。本发明提供的顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂联合可以协同增强对于肿瘤生长的抑制作用，在癌症治疗领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的实施不同剂量P-Cis(等同Cis当量)作用72h、25μMP-Cis(等同Cis当量)作用不同时间后，LLC、H1299、A549细胞PD-L1表达的变化；*，p<0.05；**，p<0.01；
图2为本发明实施例2中得到的实施不同剂量P-Cis(等同Cis当量)作用72h、25μMP-Cis(等同Cis当量)作用不同时间后，B16F10、U14、ID8细胞PD-L1表达的变化；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图3为本发明实施例3中得到的实施P-Cis联合BMS-202治疗LLC荷瘤小鼠后，治疗方案(A)、皮下荷瘤小鼠的肿瘤体积变化(B)、肿瘤抑制率(C)、Q值(D)及小鼠体重变化(E)；*，p<0.05；**，p<0.01；
图4为本发明实施例4中得到的实施P-Cis联合aPD1治疗LLC荷瘤小鼠后，治疗方案(A)、皮下荷瘤小鼠的肿瘤体积变化(B)、肿瘤抑制率(C)、Q值(D)、小鼠体重变化(E)、小鼠生存曲线(F)、小鼠平均生存天数(G)；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图5为本发明实施例5中得到的实施P-Cis联合aPD1、相似毒性Cis联合aPD1治疗LLC荷瘤小鼠后，治疗方案(A)、皮下荷瘤小鼠的肿瘤体积变化(B)、肿瘤抑制率(C)、小鼠体重变化(D)及Q值(E)；ns，p>0.05；*，p<0.05；
图6为本发明实施例6中得到的实施P-Cis联合aPD1、相似毒性Cis联合aPD1、相同剂量Cis联合aPD1治疗B16F10荷瘤小鼠后，治疗方案(A)、皮下荷瘤小鼠的肿瘤体积变化(B)、肿瘤抑制率(C)、小鼠体重变化(D)及Q值(E)；ns，p>0.05；*，p<0.05；***，p<0.001；
图7为本发明实施例7中得到的实施P-Cis联合BMS-202(治疗方案同图2)治疗LLC荷瘤小鼠后，肿瘤病理、Ki67、TUNEL(A)、各主要脏器病理(B)的变化、肿瘤PD-L1表达(C)、CD8+T细胞(D)、INFγ(E)的变化；P-Cis联合aPD1(治疗方案同图4)治疗LLC荷瘤小鼠后，肿瘤PD-L1表达(F)、INFγ(G)的变化；ns，p>0.05；*，p<0.05；***，p<0.001；****，p<0.0001。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种抗肿瘤联合药物组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述药物组合物及其应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述药物组合物及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明对于顺铂纳米制剂的来源不进行限定，市售或者本领域技术人员熟知的方法制备即可；优选可以按照CN201210382696.X公开的方法制备。在本发明具体实施方式中，本发明使用了式I所示结构的顺铂纳米药，其中R1-R4均是H；m＝113；100≤2x+y+z≤160；PLG与mPEG质量比为1:2。
本发明在对小鼠进行实验时，给药剂量优选为9mg/kg～15mg/kg。优选的，顺铂纳米药通过尾静脉的方式给药，而PD1/PD-L1抑制剂通过腹腔给药。
本发明所述顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂可以在接受治疗前、中、后向对象施用。
本发明通过一系列体外实验，发现顺铂纳米药(P-Cis)可以诱导多种肿瘤细胞PD-L1高表达，且具有剂量和时间依赖性，包括LLC、H1299、A549、B16F10、U14、ID8细胞。
在体内实验，发现在LLC模型上，P-Cis联合BMS-202或抗PD1抗体(aPD1)较单药组会明显抑制肿瘤生长，提高荷瘤小鼠生存期，且联合治疗具有协同性。
在LLC模型上，P-Cis与aPD1联用与顺铂原药(Cis)与aPD1联用毒性相似条件下，P-Cis与aPD1联用较单药组具有显著的优势，而Cis与aPD1联用较单药组未有明显优势，P-Cis与aPD1的联合药效显著优于Cis与aPD1的联合药效，且P-Cis与aPD1具有协同作用，而Cis与aPD1具有加和作用。
在B16F10模型上，P-Cis与aPD1联用、相同剂量Cis与aPD1联用较对应单药组具有显著优势，相似毒性Cis与aPD1联用较其单药组无显著优势；P-Cis与aPD1的联合药效大大优于相似毒性Cis与aPD1的联合药效，但无统计学差异，P-Cis与aPD1的联合药效与相同剂量Cis与aPD1的联合药效相似；且P-Cis与aPD1、相同剂量Cis与aPD1具有协同作用，而相似毒性Cis与aPD1具有加和作用。
本发明利用顺铂纳米药治疗后诱导的肿瘤高表达PD-L1为契入点，联合两种PD1/PD-L1抑制剂(BMS-202或抗PD1抗体)，可显著诱导CD8+T细胞向肿瘤浸润并活化，提高药物治疗效果，为癌症的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略，具有很好的应用前景。
以下就本发明所提供的一种抗肿瘤联合药物组合物及其应用做进一步说明。
实施例1：P-Cis对小鼠、人肺癌肿瘤细胞PD-L1表达的影响
将10-20万细胞种于六孔板中，过夜，以含有不同剂量顺铂纳米药(0、6.25、12.5、25、50μM)的新鲜培养基替换原培养液继续培养72h后，以荧光标记的PD-L1抗体标记相同细胞数量的细胞，以流式细胞技术分析PD-L1的表达(以PD-L1+％或平均荧光强度MFI表示)；将10-20万细胞种于六孔板中，过夜，以含有25μM顺铂纳米药的新鲜培养基替换原培养液继续培养不同时间(0、3、6、24、48、72h)后，以荧光标记的PD-L1抗体标记相同细胞数量的细胞，以流式细胞技术分析PD-L1或MHC-I的表达(以PD-L1+％或平均荧光强度表示)。
从图1可以看出，P-Cis诱导小鼠、人肺癌肿瘤细胞PD-L1高表达具有剂量依赖性，因为不同剂量P-Cis处理后，PD-L1的MFI值均较未处理组显著升高，且随着P-Cis剂量升高，PD-L1的MFI值也有所增加；而且P-Cis诱导小鼠、人肺癌肿瘤细胞PD-L1高表达具有时间依赖性，因为P-Cis处理不同时间后，PD-L1的MFI值均较未处理组显著升高，且随着时间延长，PD-L1的MFI值也有所增加。
实施例2：P-Cis对小鼠黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌细胞PD-L1表达的影响
将10-20万细胞种于六孔板中，过夜，以含有不同剂量顺铂纳米药(0、6.25、12.5、25、50μM)的新鲜培养基替换原培养液继续培养72h后，以荧光标记的PD-L1抗体标记相同细胞数量的细胞，以流式细胞技术分析PD-L1的表达(以平均荧光强度MFI表示)；将10-20万细胞种于六孔板中，过夜，以含有25μM顺铂纳米药的新鲜培养基替换原培养液继续培养不同时间(0、3、6、24、48、72h)后，以荧光标记的PD-L1抗体标记相同细胞数量的细胞，以流式细胞技术分析PD-L1或MHC-I的表达(以平均荧光强度表示)。
从图2可以看出，P-Cis诱导黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌细胞PD-L1高表达具有剂量依赖性，因为不同剂量P-Cis处理后，PD-L1的MFI值均较未处理组显著升高，且随着P-Cis剂量升高，PD-L1的MFI值也有所增加；而且P-Cis诱导黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌细胞PD-L1高表达具有时间依赖性，因为P-Cis处理不同时间后，PD-L1的MFI值均较未处理组显著升高，且随着时间延长，PD-L1的MFI值也有所增加。
实施例3：P-Cis和BMS-202联合治疗LLC荷瘤小鼠的抑瘤结果
将LLC细胞接种在C57BL/6小鼠皮下，当皮下肿瘤体积增长至约50mm3时，将小鼠随机分为4组：PBS、P-Cis、BMS-202、P-Cis+BMS-202，每组6只。P-Cis给药方式如下：12mg·kg-1，给药第一天尾静脉注射给药，共1次，以P12表示；BMS-202给药方式如下：50mg·kg-1,治疗开始第1、3、5天经腹腔注射给药一次，共3次，以B表示。全文中涉及P-Cis的剂量均是等同顺铂的剂量。每天观察小鼠状况，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤长径和短径，天平记录小鼠体重。通过计算小鼠肿瘤体积和肿瘤抑制率来评价各组药物治疗效果，通过测量小鼠体重变化来评价药物安全性。肿瘤体积和肿瘤抑制率通过以下公式进行计算：
小鼠肿瘤体积计算公式：V＝(a×b2)/2
肿瘤抑制率(TSR,％)＝[(Ac-Ax)/Ac]×100％
其中a是肿瘤长径，b是肿瘤短径；Ac是对照组平均肿瘤体积，Ax是治疗组平均肿瘤体积。
药物相互作用计算公式采用金正均Q值法:Q＝E(A+B)/EA+EB×(1-EA)，其中E(A+B)为A药和B药联合时的抑制率，EA和EB分别是A药和B药单独用药时的抑制率。根据Q值来判断联合用药疗效,Q＜0.85为拮抗作用，0.85≤Q＜1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用。
由图3可见，与PBS组相比，P12联合BMS-202均能显著地抑制肿瘤增长，且联合组治疗效果最佳。治疗结束时，联合组的肿瘤抑制率(TSR％)为70.3％，显著高于P12组(43.1％)和BMS-202(20.4％)。联合治疗的系统毒性主要来自于P12，因为P12+BMS202组与P12组小鼠都在第5天体重下降最大，分别到87％和82％，又在第8天恢复；而BMS0-202组小鼠体重均保持在95％以上，轻微发生了变化。通过计算得出Q值为1.28(＞1.15)，说明Pt-NPs和BMS-202联合应用能起到协同抑制肿瘤的作用。
实施例4：P-Cis和aPD1联合治疗LLC荷瘤小鼠的抑瘤结果
将LLC细胞接种在C57BL/6小鼠皮下，当皮下肿瘤体积增长至约50mm3时，将小鼠随机分为4组：PBS、P-Cis、aPD1、P-Cis+aPD1，每组6只。P-Cis给药方式如下：12mg·kg-1，给药第一天尾静脉注射给药，共1次，以P12表示；aPD1给药方式如下：50μg mouse-1,治疗开始第1、3、5天经腹腔注射给药一次，共3次，以a表示。全文中涉及P-Cis的剂量均是等同顺铂的剂量。每天观察小鼠状况，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤长径和短径，天平记录小鼠体重。通过计算小鼠肿瘤体积和肿瘤抑制率来评价各组药物治疗效果，通过测量小鼠体重变化来评价药物安全性。肿瘤体积和肿瘤抑制率通过以下公式进行计算：
小鼠肿瘤体积计算公式：V＝(a×b2)/2
肿瘤抑制率(TSR,％)＝[(Ac-Ax)/Ac]×100％
其中a是肿瘤长径，b是肿瘤短径；Ac是对照组平均肿瘤体积，Ax是治疗组平均肿瘤体积。
药物相互作用计算公式采用金正均Q值法:Q＝E(A+B)/EA+EB×(1-EA)，其中E(A+B)为A药和B药联合时的抑制率，EA和EB分别是A药和B药单独用药时的抑制率。根据Q值来判断联合用药疗效,Q＜0.85为拮抗作用，0.85≤Q＜1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用。
由图4可见，与PBS组相比，P12联合aPD1均能显著地抑制肿瘤增长，且联合组治疗效果最佳。治疗结束时，联合组的肿瘤抑制率(TSR％)为86.1％，显著高于P12组(40.4％)和aPD1(9.8％)。通过计算得出Q值为1.86(＞1.15)，说明P-Cis和aPD1联合应用能起到协同抑制肿瘤的作用。联合治疗的系统毒性主要来自于P12，因为P12+aPD1组小鼠在第5天体重最低为81％，从第7天稳定在83％；P12组小鼠在第5天体重最低为87％，第7天后体重慢慢恢复正常；而aPD1几乎不改变小鼠体重；而且P12+aPD1组小鼠自接受治疗以后，对药物耐受良好。鉴于抑瘤效果提升和小鼠耐受良好的情况，P12+aPD1最终显著延长了小鼠的生存期，相比于未治疗组小鼠平均存活11天，联合治疗组小鼠平均存活19.7天。所以，P-Cis与aPD1具有强的协同抗肿瘤效果。
实施例5：P-Cis联合aPD1与相似毒性Cis联合aPD1抑制LLC肿瘤效果对比
将LLC细胞接种在C57BL/6小鼠皮下，当皮下肿瘤体积增长至约50mm3时，将小鼠随机分为6组：PBS、P-Cis、Cis、aPD1、P-Cis+aPD1、Cis+aPD1，每组6只。P-Cis给药方式如下：15mg·kg-1，给药第一天尾静脉注射给药，共1次，以P15表示；Cis给药方式如下：7mg·kg-1，给药第一天尾静脉注射给药，共1次，以C7表示；aPD1给药方式如下：50μg mouse-1,治疗开始第1、3、5天经腹腔注射给药一次，共3次，以a表示。全文中涉及P-Cis的剂量均是等同顺铂的剂量。每天观察小鼠状况，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤长径和短径，天平记录小鼠体重。通过计算小鼠肿瘤体积和肿瘤抑制率来评价各组药物治疗效果，通过测量小鼠体重变化来评价药物安全性。肿瘤体积和肿瘤抑制率通过以下公式进行计算：
小鼠肿瘤体积计算公式：V＝(a×b2)/2
肿瘤抑制率(TSR,％)＝[(Ac-Ax)/Ac]×100％
其中a是肿瘤长径，b是肿瘤短径；Ac是对照组平均肿瘤体积，Ax是治疗组平均肿瘤体积。
药物相互作用计算公式采用金正均Q值法:Q＝E(A+B)/EA+EB×(1-EA)，其中E(A+B)为A药和B药联合时的抑制率，EA和EB分别是A药和B药单独用药时的抑制率。根据Q值来判断联合用药疗效,Q＜0.85为拮抗作用，0.85≤Q＜1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用。
由图5可见，P-Cis与aPD1联用较单药组具有显著的优势，因为P15、a、P15+a的肿瘤抑制率分别为66.5％、14.9％、81.7％；而Cis与aPD1联用较单药组未有明显优势，因为C7P-Cis、a、C7+a的肿瘤抑制率分别为53.1％、14.9％、63.3％；P-Cis与aPD1的联合药效显著优于Cis与aPD1的联合药效，因为两种联合治疗的肿瘤抑制率分别为81.7％和63.3％；且P-Cis与aPD1具有协同作用(Q为1.15)，而Cis与aPD1具有加和作用(Q为0.96)。C7+a组小鼠体重最低为22.9％，C7组小鼠体重最低为16.3％，P15+a组小鼠体重最低为22.9％,P15组小鼠体重最低为22.6％，a组小鼠体重变化可忽略，因此C7+a的主要毒性来自于C7，P15+a的主要毒性来自于P15，且P15+a与C7+a具有相似毒性。所以，P-Cis联合联合治疗的系统毒性主要来自于P12，因为P12+aPD1组小鼠在第5天体重最低为81％，从第7天稳定在83％；P12组小鼠在第5天体重最低为87％，第7天后体重慢慢恢复正常；而aPD1几乎不改变小鼠体重；而且P12+aPD1组小鼠自接受治疗以后，对药物耐受良好。鉴于抑瘤效果提升和小鼠耐受良好的情况，P12+aPD1最终显著延长了小鼠的生存期，相比于未治疗组小鼠平均存活11天，联合治疗组小鼠平均存活19.7天。所以，P-Cis联合aPD1与Cis联合aPD1具有相似毒性条件下，前者抑瘤能力显著优于后者。
实施例6：P-Cis联合aPD1与相似毒性Cis联合aPD1抑制B16F10肿瘤效果对比
将B16F10细胞接种在C57BL/6小鼠皮下，当皮下肿瘤体积增长至约50mm3时，将小鼠随机分为8组：PBS、P9、C4、C3×3、aPD1、P9+aPD1、C4+aPD1、C3×3+aPD1，每组6只。P-Cis给药方式如下：9mg·kg-1，给药第一天尾静脉注射给药，共1次，以P9表示；Cis给药方式如下：4mg·kg-1，给药第一天尾静脉注射给药，共1次，以C4表示，或3mg·kg-1，给药第一、四、七天尾静脉注射给药，共3次，以C3×3表示；aPD1给药方式如下：50μg mouse-1,治疗开始第1、3、5天经腹腔注射给药一次，共3次，以a表示。全文中涉及P-Cis的剂量均是等同顺铂的剂量。每天观察小鼠状况，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤长径和短径，天平记录小鼠体重。通过计算小鼠肿瘤体积和肿瘤抑制率来评价各组药物治疗效果，通过测量小鼠体重变化来评价药物安全性。肿瘤体积和肿瘤抑制率通过以下公式进行计算：
小鼠肿瘤体积计算公式：V＝(a×b2)/2
肿瘤抑制率(TSR,％)＝[(Ac-Ax)/Ac]×100％
其中a是肿瘤长径，b是肿瘤短径；Ac是对照组平均肿瘤体积，Ax是治疗组平均肿瘤体积。
药物相互作用计算公式采用金正均Q值法:Q＝E(A+B)/EA+EB×(1-EA)，其中E(A+B)为A药和B药联合时的抑制率，EA和EB分别是A药和B药单独用药时的抑制率。根据Q值来判断联合用药疗效,Q＜0.85为拮抗作用，0.85≤Q＜1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用。
由图6可见，P9、C4、C3×3、a、P9+a、C4+a和C3×3+a在第13天的肿瘤抑制率分别为16.5％、34.1％、24.1％、21.6％、66.2％、45.8％和62.7％，且P-Cis与aPD1联用、相同剂量Cis与aPD1联用较对应单药组具有显著优势，相似毒性Cis与aPD1联用较其单药组无显著优势；P-Cis与aPD1的联合药效大大优于相似毒性Cis与aPD1的联合药效，但无统计学差异，P-Cis与aPD1的联合药效与相同剂量Cis与aPD1的联合药效相似；且P-Cis与aPD1、相同剂量Cis与aPD1具有协同作用(P9+a的Q值为1.92，C3×3+a的Q值为1.55)，而相似毒性Cis与aPD1具有加和作用(C4+a的Q值为0.55)。从小鼠体重下降程度看，P9、C4、C3×3、a、P9+a、C4+a、C3×3+a组最低体重分别变化了2.7％、8.8％、2.8％、2.6％、1.7％、7.7％、10.0％，说明P9+a较相似毒性剂量C4+a和相同剂量C3×3+a对照组，均具有较低的毒副作用。综上，P-Cis联合aPD1与Cis联合aPD1具有相似毒性条件下，前者抑瘤能力优于后者；P-Cis联合aPD1与Cis联合aPD1具有相同剂量条件下，前者抑瘤能力与后者相当；且与aPD1联合治疗时，顺铂频繁给药或缓释药物较单次大剂量给药更有利于肿瘤治疗。
实施例7：P-Cis与BMS-202及P-Cis与aPD1协同治疗LLC荷瘤小鼠的作用机制
皮下LLC肿瘤模型、荷瘤鼠分组、药物给药方式与实施例3相同。治疗结束后，处死小鼠，剥离皮下肿瘤，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋肿瘤组织，进行H&E染色、免疫荧光染色(Ki67、TUNEL)；分离各脏器，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋肿瘤组织，进行H&E染色于倒置相差显微镜下观察H&E染色结果并拍照，于共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色，结果如图7(放大200倍)。
皮下LLC肿瘤模型、荷瘤鼠分组、药物给药方式与实施例3相同。治疗第5天，处死小鼠，以注射器研磨肿瘤并以胶原酶透明质酸酶消化，得到单分散的细胞。以荧光标记PD-L1、CD45、CD3、CD8直接标记单细胞，通过固定、通透，再标记IFNγ；以流式细胞仪检测并分析瘤内PD-L1表达、CD8+T细胞、INFγ的情况。
皮下LLC肿瘤模型、荷瘤鼠分组、药物给药方式与实施例5相同。治疗第5天，处死小鼠，收取肿瘤，加入蛋白裂解液并以注射器研磨肿瘤，制备肿瘤蛋白，加入至SDS-PAGE上样孔中，以电泳分离蛋白质，再转印至PVDF膜上，以抗PD-L1抗体4℃孵育过夜，再以相应二抗室温孵育1小时，在化学发光成像仪上显色，并以Image J软件分析各样品PD-L1表达；收取肿瘤，加入PBS并以注射器研磨肿瘤，制备肿瘤基质液，以ELISA试剂盒检测INFγ的水平。
从图7可以看出，P12+B组肿瘤的活细胞数最少，肿瘤组织稀松，因为蓝色标记的细胞核最少，肿瘤过多标记为粉红色的细胞质结构；而其他组的肿瘤细胞核很多，组织更加致密。从细胞增殖相关的标志蛋白Ki-67染色上看，Ki-67信号由弱至强依次为P12+B<P12<B<PBS，所以P12+B组肿瘤细胞的增值能力最弱。同时，代表细胞凋亡程度的TUNEL也被检测，从染色结果上看，TUNEL信号强度由强至弱依次为P12+B>P12>B>PBS，所以P12+B组肿瘤细胞具有最多的凋亡细胞。所以，P12+B较单药治疗可更好的杀伤肿瘤细胞。而从正常组织脏器染色方面看，各脏器保持其特征结构，未见异常，说明P12+B未明显增加毒副作用。从流式分析结果上看，P12治疗显著增加了肿瘤PD-L1表达，而联合BMS-202以后，PD-L1信号变弱，从相关报道可知，BMS-202会使PD-L1变为二聚体，这可能导致其不被抗体检测。从杀伤性T细胞(CD8+T细胞)数量来看，P12+B使肿瘤的杀伤性T细胞显著增多。ELISA结果可见，P12+B治疗后，杀伤性T细胞被活化，IFNγ水平升高。免疫印迹结果表明，在治疗72小时后，P15可显著上调肿瘤PD-L1表达，而C7则未使肿瘤PD-L1显著。Elisa结果表明单药aPD1治疗未显著提升IFNγ水平，说明单药aPD1疗效有限；C7与C7+a也未显著提升IFNγ水平，说明Cis可能因肿瘤驻留时间短，不能持续诱导肿瘤PD-L1高表达，而不能有效提升aPD1疗效；P15与P15+a显著提升IFNγ水平，且P15+a组IFNγ水平较P15组显著升高，说明P-Cis显著提升了aPD1的疗效。综上所述，P-Cis持续提升肿瘤PD-L1表达，最终使BMS-202或aPD1更好的阻断PD1/PD-L1信号通路，使肿瘤招募杀伤性T细胞，并激活免疫。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤联合药物组合物，其特征在于，包括顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂。
2.根据权利要求1所述药物组合物，其特征根在于，所述顺铂纳米药和PD1/PD-L1抑制剂的重量比为(0.1～5):1。
3.根据权利要求1或2所述药物组合物，其特征在于，所述顺铂纳米药为聚谷氨酸聚乙二醇共聚物络合顺铂poly(L-glutamic acid)-graft-methoxy-poly(ethylene glycol)/cisplatin。
4.根据权利要求3所述药物组合物，其特征在于，所述顺铂纳米药具有式I所示结构：
Figure FDA0002948503020000011
其中，R1是C2到C10的直链烷基或C3到C10的支链烷基、苯基或末端氨基酸单元；
R2是H，C2到C10的直链酰基或C3到C10的支链酰基基团；
R3是可以被官能团取代的烷基；
R4是H或者阳离子单元；
L是基团-CH2-CH2-(谷氨酸单元)；
m为聚合度，40≤m≤250；x，y，z为聚合度，10≤2x+y+z≤5000，5％≤y/(2x+y+z)≤80％。
5.根据权利要求1或2所述药物组合物，其特征在于，所述PD1/PD-L1抑制剂选自抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD1/PD-L1小分子抑制剂中的一种或两种以上。
6.权利要求1-5任意一项所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用或在向对象施用有效量药物组合物进行处理中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，抗肿瘤药物针对的肿瘤为鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、纤维组织细胞癌、横纹肌肉癌、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤中的一种或两种以上。
8.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1-5任意一项所述药物组合物和药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，所述药物的剂型片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、贴剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、注射剂、栓剂或它们的任意形式组合。
10.一种抗肿瘤的联合治疗方法，其特征在于，向对象施用有效量的权利要求1-5任意一项所述药物组合物。
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