CN115998896A - Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Fc‑III‑4C多肽‑高分子‑药物偶联物及其制备方法和应用，Fc‑III‑4C多肽‑高分子‑药物偶联物主链为聚谷/天冬氨酸，侧羧基键合Fc‑III‑4C多肽和细胞毒性药物或免疫调节剂类药物，是通过在聚谷/天冬氨酸侧链羧基键合Fc‑III‑4C多肽和细胞毒性药物或免疫调节剂类药物获得。本发明还提供抗体‑高分子‑药物偶联物，是将单克隆抗体与Fc‑III‑4C多肽‑高分子‑药物偶联物在水相溶液中共混得到。本发明还提供抗体‑高分子‑药物偶联物在制备抗癌药物上的应用。本发明的抗体‑高分子‑药物偶联物，制备方式便捷且不影响抗体Fab段结构，具有DAR可控、普适性强及易于储存与运输等优势。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
提高药物在肿瘤部位的递送效率一直是癌症治疗领域亟待解决的问题。近年来，通过渗透与滞留效应(EPR效应)实现肿瘤被动靶向的纳米药物改善了一定的药物肿瘤富集，但由于肿瘤多样性与异质性的存在，被动靶向型纳米药物对药物的肿瘤递送效率的提升仍然很少。
与被动靶向纳米药物相比，主动靶向纳米药物通过对肿瘤部位的主动识别作用大幅提高了药物的肿瘤递送效率，主要包括小分子靶向制剂、单克隆抗体、抗体偶联药物以及靶向纳米载药系统。其中，基于单克隆抗体对某些肿瘤的精确识别，有“魔法子弹”之称的抗体-药物偶联物(ADC)获得了广泛研究，疗效显著。ADC药物由抗体、连接子与细胞毒性药物三部分组成，通过可裂解或不可裂解的连接子将高活性小分子药物载荷通过化学键连接到单克隆抗体后，利用单克隆抗体对肿瘤上某些抗原的特异性识别作用，将细胞毒性药物递送至肿瘤。目前已有14款基于肿瘤蛋白HER2、Trop2和CD22等靶标的抗肿瘤ADC药物上市。例如，目前销量最高的ADC药物赫赛莱(T-DM1)由抗HER2单克隆抗体和微管蛋白抑制剂DM1组成，药物抗体比(DAR)为3.5，通过抗HER2单克隆抗体对HER2蛋白高表达肿瘤的特异性识别选择性地将细胞毒性药物递送到肿瘤部位，实现了良好的抗肿瘤效果。
然而，目前ADC药物的制备与纯化工艺仍有待提升。现有的ADC药物是通过抗体上的氨基或裸露的巯基与药物载荷直接结合获得的，制备用时往往在2天以上，在制备过程中药物载荷会与抗体的抗原结合片段(Fab段)或可结晶段(Fc段)随机地结合，药物与Fab段的结合会对单克隆抗体的肿瘤抗原识别作用具有潜在影响。不仅如此，因疏水性药物载荷的存在往往导致ADC药物长期放置后易聚沉而失效。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物及其制备方法和应用。本发明的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物与抗体用于制备抗体-高分子-药物偶联物，此方法制备方式便捷且不影响抗体Fab段结构，具有DAR可控、普适性强及易于储存与运输等优势。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，具有式(I)所示的结构：
式(I)中，R1是C2到C10的直链烷基、C3到C10的支链烷基或C6-C20的芳基；
R2是羟基、被官能团取代或不取代的烷氧基、或Fc-III-4C；
R3是氢离子或者阳离子；
R4是羟基、被官能团取代或不取代的烷氧基、或细胞毒性药物、或免疫调节剂类药物；
R5是氢原子、C2到C10的直链酰基或C3到C10的支链酰基基团；
L1、L2、L3独立的选自-CH2-或-CH2CH2-；
n为聚合度，10≤n≤300；x,y,z为百分比，x+y+z＝1，x>0,y>0,z>0。
优选的，所述R1为C3-C8的直链烷基、C5-C8的支链烷基或C8～C15的芳基；所述R2选自羟基或者Fc-III-4C；所述R3选自氢原子、金属阳离子或有机阳离子；所述R4选自羟基、或者单甲基澳瑞他汀E(Val-Cit-PAB-MMAE)、美登素、紫杉醇、长春瑞宾、多西他塞、羟基喜树碱、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、异环磷酰胺、达卡巴嗪、顺铂和奥沙利铂中任意一种药物；所述R5选自氢原子、甲酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基。
进一步优选的，所述R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、苯基、萘基、联苯基或蒽基，所述R3选自氢原子、钠离子、钾离子、铵离子或者带正电荷的氨基酸离子。
进一步优选的，所述R2为Fc-III-4C，所述R4为Val-Cit-PAB-MMAE，所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物具有式(II)所示的结构：
再进一步优选的，式(II)中，n＝160，x＝0.025，x为与Fc-III-4C接枝数的占比，y＝0.875，z为与Val-Cit-PAB-MMAE接枝数的占比，z＝0.1。
本发明还提供一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：
通过将高分子化合物的侧链羧基键合对免疫球蛋白Fc段具有高亲和力的Fc-III-4C多肽，随后在高分子化合物剩余的侧链羧基键合细胞毒性药物或免疫调节剂类药物，以获得Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物；
所述高分子化合物为聚谷氨酸、聚天冬氨酸或者谷氨酸天冬氨酸共聚物。
优选的，所述高分子化合物中侧链羧基与Fc-III-4C多肽的摩尔比是3～300:1，高分子化合物中侧链羧基与细胞毒性药物或免疫调节剂类药物的摩尔比是3～300:1。
本发明还提供一种抗体-高分子-药物偶联物，其是将含Fc段单克隆抗体与Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物在水相溶液中共混得到。
优选的，所述Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物中Fc-III-4C多肽与含Fc段单克隆抗体的摩尔比为1～2:1；
所述含Fc段单克隆抗体为抗PDL1、Trop2、HER2、PD1、CTLA-4、OX40、OX40L、CD16、4-1BB、EGFR、CD3、CD3ε、CD19、CD28、CD33、CD22、CD79b、BCMA、MET、EpCAM、CD13、CD73、CD20和Nectin-4中的一种抗体。
本发明还提供一种抗体-高分子-药物偶联物在制备抗癌药物上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其与抗体用于制备抗体-高分子-药物偶联物，此方法制备方式便捷且不影响抗体Fab段结构，具有DAR可控、普适性强及易于储存与运输等优势。
本发明制备的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物可以结合多种不同种类抗体和细胞毒性药物，从而简单高效的制备抗体-高分子-药物偶联物。
本发明提供了一种具有普适性的、简单方便的制备抗体-高分子-药物偶联物的方法。本发明制备的抗体-高分子-药物偶联物可以靶向种瘤部位，提高毒性药物在肿瘤部位的高富集。可用于制备抗体药物治疗癌症、制作抗感染药物等领域，具有广泛的应用领域和极高的临床应用前景。
本发明的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物与抗体可分开保存，使用时直接制备，避免了传统ADC药物在储存与运输过程中的聚沉风险。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明实施例1中得到的聚谷氨酸PLG的核磁共振氢谱。
图2为本发明实施例2中得到的Fc-PLG的核磁共振氢谱。
图3为本发明实施例3中得到的Fc-PLG-MMAE的载药量。
图4为本发明实施例3中得到的Fc-PLG-MMAE和实施例4中得到的IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE的粒径分布。
图5为本发明实施例4中得到的IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE采用CCK-8细胞增殖实验评价体外MC38细胞毒性，分组为：Fc-PLG-MMAE、IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE。
图6为本发明实施例4中得到的aPDL1+IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE治疗MC38荷瘤小鼠，包括治疗方案(A)、皮下荷瘤小鼠的肿瘤体积变化(B)、小鼠体重变化(C)，各组小鼠肿瘤体积变化(D)，图中分组为：PBS组，2.5mg·kg-1aPDL1+IgG-PLG-MMAE(2.17mg·kg- 1aPDL1、2.31mg·kg-1IgG与0.08mg·kg-1MMAE)组，1.25mg·kg-1aPDL1-PLG-MMAE(1.09mg·kg-1PDL1与0.04mg·kg-1MMAE)组和2.5mg·kg-1aPDL1-PLG-MMAE(2.17mg·kg-1PDL1与0.08mg·kg-1MMAE)组。
图7为本发明实例4中得到的aPDL1+IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE治疗MC38荷瘤小鼠肿瘤的H&E分析和TUNEL染色分析(A)和正常组织(心、肝、脾、肺、肾)H&E分析(B)。
图8为本发明实例4中得到的aPDL1+IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE治疗MC38荷瘤小鼠后小鼠全身毒性评价图。
具体实施方式
本发明的发明思想为：本发明提供了一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物及制备、抗体-高分子-药物偶联物及应用。本发明的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其主链为聚谷/天冬氨酸(PLG/A)，侧羧基键合Fc-III-4C多肽和细胞毒性药物如MMAE，其中接枝的MMAE还可以替换为接枝其他不同种类的细胞毒性药物。本发明通过聚谷/天冬氨酸(PLG/A)侧链羧基键合对免疫球蛋白(抗体)Fc段具有高亲和力的Fc-III-4C多肽，随后在聚谷/天冬氨酸(PLG/A)剩余的侧链羧基键合细胞毒性药物或免疫调节剂类药物，以获得Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物。由于Fc-III-4C多肽对人免疫球蛋白IgG(包括抗体)的解离常数(Kd)高达为2.45nM，且不影响抗体活性。因此，最后单克隆抗体与Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物在磷酸缓冲液中孵育可制备出抗体-高分子-药物偶联物。本发明的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物的制备，可以结合不同种类的含Fc段的抗体和接枝不同种类的细胞毒性药物。
大量研究表明，肿瘤细胞能够上调PD1蛋白(PDL1和PDL2)的表达，且PDL1蛋白是肿瘤细胞使用的主要PD1蛋白，所以PDL1蛋白在肿瘤部位均显示出较高的表达水平。因此，可以通过抗PDL1单克隆抗体等与肿瘤部位PDL1蛋白的特异性结合作用，促使抗PDL1单克隆抗体在肿瘤细胞表面大量富集。单甲基澳瑞他汀E(MMAE)是海兔毒素10的合成衍生物，具有极强的抗肿瘤作用，与长春碱一样属于抗微管类药物，通过抑制微管蛋白聚合而起到有效的有丝分裂抑制作用，但是毒性大约相当于长春碱的200倍。因此，本发明提供了一种以药物载荷为MMAE等的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物(Fc-PLG-MMAE)结合抗PDL1单克隆抗体的抗体-高分子-药物偶联物(aPDL1-PLG-MMAE)。通过抗PDL1抗体与肿瘤部位PDL1蛋白的特异性结合，经细胞内吞后被细胞内溶酶体降解释放出MMAE，抑制微管蛋白聚合而起到有效的有丝分裂抑制作用，促使肿瘤细胞死亡。通过相关实施例验证抗体-高分子-药物偶联物制备方法的可行性及药物的有效性。
本发明提供一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，主链为聚谷/天冬氨酸(PLG/A)，侧羧基键合Fc-III-4C多肽和细胞毒性药物或免疫调节剂类药物，具有式(I)所示的结构：
式(I)中，R1是C2到C10的直链烷基、C3到C10的支链烷基或C6-C20的芳基；
R2是羟基、被官能团取代或不取代的烷氧基、或Fc-III-4C；
R3是氢离子或者阳离子；
R4是羟基、被官能团取代或不取代的烷氧基、或细胞毒性药物、或免疫调节剂类药物；
R5是氢原子、C2到C10的直链酰基或C3到C10的支链酰基基团；
L1、L2、L3独立的选自-CH2-或-CH2CH2-；
n为聚合度，10≤n≤300；x,y,z为百分比，x+y+z＝1，x>0,y>0,z>0。
优选的，所述R1为C3-C8的直链烷基、C5-C8的支链烷基或C8～C15的芳基，进一步优选的，所述R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、苯基、萘基、联苯基或蒽基。
优选的，所述R2选自羟基或者Fc-III-4C，进一步优选的，所述R2为Fc-III-4C。
优选的，所述R3选自氢原子、金属阳离子或有机阳离子，进一步优选的，所述R3选自氢原子、钠离子、钾离子、铵离子或者带正电荷的氨基酸离子。
优选的，所述R4选自羟基、或者单甲基澳瑞他汀E(Val-Cit-PAB-MMAE)、美登素、紫杉醇、长春瑞宾、多西他塞、羟基喜树碱、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、异环磷酰胺、达卡巴嗪、顺铂和奥沙利铂等中任意一种药物，进一步优选的，所述R4为单甲基澳瑞他汀E(Val-Cit-PAB-MMAE)。
优选的，所述R5选自氢原子、甲酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基。
再进一步优选的，所述R2为Fc-III-4C，所述R4为Val-Cit-PAB-MMAE；
所述Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其主链为聚谷/天冬氨酸(PLG/A)，侧羧基键合Fc-III-4C多肽和MMAE，具有式(II)所示的结构：
式(II)中的R1、R3、R5，x、y、z、n，及L1、L2、L3，均与式(I)中的限定一致，这里不再赘述。
更进一步优选的，所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物的材料为聚谷氨酸均聚物(PLG)，对免疫球蛋白(抗体)可结晶段(Fc段)具有普遍高亲和力的Fc-III-4C多肽和细胞高毒性药物单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，式(II)中，n＝160，x＝0.025，x为与Fc-III-4C接枝数的占比，y＝0.875，z为与Val-Cit-PAB-MMAE接枝数的占比，z＝0.1。
本发明还提供一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：
通过聚谷/天冬氨酸(PLG/A)侧链羧基键合对免疫球蛋白(抗体)Fc段具有高亲和力的Fc-III-4C多肽，随后在聚谷/天冬氨酸(PLG/A)剩余的侧链羧基键合细胞毒性药物或免疫调节剂类药物，以获得Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物。
所述聚谷/天冬氨酸代表的是聚谷氨酸、聚天冬氨酸或者谷氨酸天冬氨酸共聚物。
优选的，所述PLG/A中侧链羧基与Fc-III-4C多肽的摩尔比是3～300:1，PLG/A中侧链羧基与细胞毒性药物或免疫调节剂类药物的摩尔比是3～300:1；进一步优选的，所述PLG/A中侧链羧基与Fc-III-4C多肽的摩尔比是40:1，PLG/A中侧链羧基与细胞毒性药物或免疫调节剂类药物的摩尔比是10:1。
本发明还提供一种抗体-高分子-药物偶联物，其是将含Fc段单克隆抗体与Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物在水相溶液中共混得到。
优选的，将含Fc段单克隆抗体与Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物在磷酸缓冲液中孵育3到5小时以获得抗体-高分子-药物偶联物。其优点在于：首先，抗体-高分子-药物偶联物制备方式简单快速；其次，Fc-III-4C多肽与抗体的结合不会影响对抗体的Fab段结构，亦即不影响抗体的抗原识别效果；最后，Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物与抗体可分开保存，使用时直接制备，避免了传统ADC药物在储存与运输过程中的聚沉风险。
优选的，所述Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物中Fc-III-4C多肽与含Fc段单克隆抗体的摩尔比为1～2:1；进一步优选的，二者的摩尔比为2:1。
所述含Fc段单克隆抗体为抗PDL1、Trop2、HER2、PD1、CTLA-4、OX40、OX40L、CD16、4-1BB、EGFR、CD3、CD3ε、CD19、CD28、CD33、CD22、CD79b、BCMA、MET、EpCAM、CD13、CD73、CD20和Nectin-4中的一种抗体。
进一步优选的，本发明的抗体-高分子-药物偶联物中，含Fc段单克隆抗体为抗PDL1抗体(aPDL1)、细胞毒性药物为单甲基澳瑞他汀E(Val-Cit-PAB-MMAE)。
优选的，本发明的抗体-高分子-药物偶联物中，含Fc段单克隆抗体与细胞毒性药物的摩尔比为1:8。
本发明还提供一种抗体-高分子-药物偶联物在制备抗癌药物上的应用。
本发明还提供了一种用于抑制肿瘤生长的制备抗体-高分子-药物偶联物的方法，所述的对象为哺乳动物或所述哺乳动物的肿瘤细胞，所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述对象可以是罹患肿瘤的患者，或者为罹患肿瘤的患者的离体肿瘤细胞。基于此，本发明研究发现抗体-高分子-药物偶联物起到了更加明显的肿瘤治疗效果。
按照本发明，更换单克隆抗体种类与细胞毒性药物后，所述抗体-高分子-药物偶联物还可以用于所述肿瘤包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、纤维组织细胞癌、横纹肌肉癌、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中的一种或几种的治疗。
本发明通过一系列体外实验，所制备的抗体-高分子-药物偶联物粒径分布均匀，体内实验，发现在小鼠MC38结肠癌肿瘤模型上，aPDL1-PLG-MMAE会明显抑制肿瘤生长，并对小鼠的体重没有太大的影响，为癌症的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略，具有很好的应用前景。
本发明提供了一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明对于上述Fc-III-4C的来源不进行限定，市售或者本领域技术人员熟知的方法制备即可；优选可以按照CN 107556385A公开的方法制备，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物及制备、抗体-高分子-药物偶联物及应用进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1：聚(L-谷氨酸)均聚物(PLG)的制备
将10.0gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体(BLG-NCA)在无水无氧条件下溶于100.0mL无水二氯甲烷(DCM)，搅拌溶解后加入21.0mg正己胺，并在30℃油浴环境中搅拌反应72小时。随后加入890.0μL乙酸酐反应12小时，反应结束后，用1.0L乙醚沉降所得到的反应液，离心分离获得下层聚合物后用乙醚重新洗涤，并在室温下真空干燥12小时，得到中间产物聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)(PBLG)。
将5.0g PBLG用50.0mL二氯乙酸在30℃条件下溶解，边搅拌边加入15.0mL含质量分数为33％的溴化氢-冰醋酸溶液，在温度为30℃的条件下搅拌反应1.5小时后，将得到的反应液沉降到700.0mL的乙醚中，离心，所得沉淀用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)复溶，再用去离子水透析，经冻干得到聚(L-谷氨酸)均聚物(PLG)，以氘代水为氘代试剂进行核磁共振分析(如图1)。结果表明，化学位移0.79ppm处为主链上的甲基(CH3-)信号峰(a)，化学位移1.22ppm处为主链上4个亚甲基(-CH2-CH2-CH2-CH2-)信号峰(b)，化学位移4.25ppm处为主链上的次甲基(-CH-)信号峰(c)，化学位移2.21ppm处为侧基上与羰基相连的亚甲基(-CH2-)信号峰(e)，化学位移1.77～2.01ppm处为侧基上与主链相连的亚甲基(-CH2-)信号峰(d)。根据核磁计算所得PLG的聚合度为160.7。
实施例2：Fc-PLG的制备
将100.0mg PLG与12.3mg N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)溶于20.0mL无水DMF，加入7.3mg三乙胺在30℃的无水无氧环境中反应12小时，再加入33.4mg Fc-III-4C多肽并继续6小时后，将反应物装入透析袋(Mw＝3.5kDa)中用DMF透析12小时，然后在pH值6.8至7.4之间的超纯水中透析72小时，冻干后获得PLG接枝Fc-III-4C多肽材料(Fc-PLG)，以氘代水为溶剂进行核磁共振分析。如图2，化学位移6.71～7.60ppm处为Fc-III-4C多肽的特征信号峰(峰d，e，f，g，h，i，j)。根据核磁计算接枝Fc-III-4C多肽4个。结果表明Fc-III-4C多肽成功接枝到PLG侧链，且合成过程可实现Fc-III-4C多肽接枝数可控。
实施例3：Fc-PLG-MMAE的制备
将20.0mg Fc-PLG与7.4mg DSC溶于20.0mL无水DMF，加入4.3mg三乙胺在30℃的无水无氧环境中反应12小时，再加入16.0mg组织蛋白酶B响应性MMAE前药(Val-Cit-PAB-MMAE)继续反应24小时后，将反应液装入透析袋(Mw＝7.0kDa)中用DMF透析12小时，然后在pH值6.8至7.4之间的超纯水中透析72小时，经冻干后得到Fc-PLG-MMAE产物。随后通过HPLC对MMAE接枝量进行测试，具体方法如下：在30.0μL吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(10.0mM吗啉乙磺酸钠盐，40.0μM二硫苏糖醇)中溶解Fc-PLG-MMAE(1.0mg·mL-1)，在37℃下孵育10分钟。随后在上述30.0μL MES缓冲液中加入人组织蛋白酶B(20.0ng·μL-1)，继续在37℃下孵育24小时，并用不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物处理。所有样品均使用配备Supersil ODS2色谱柱(4.6mm*250mm，5μm)的依利特Classical HPLC系统进行分析。洗脱条件如下：流动相A：水(0.1％甲酸)；流动相B：乙腈(0.1％甲酸)；流动梯度为A:B从75:25到1:99，洗脱时间6.8分钟；流速：0.5mL·min-1。结果如图3所示，Fc-PLG-MMAE中MMAE的载药量为26.34±0.97％。表明MMAE成功接枝到Fc-PLG侧链，且合成过程可实现MMAE接枝数可控。
实施例4：抗体-高分子-药物偶联物的制备
Fc-PLG-MMAE与不同抗体(IgG抗体或抗PDL1抗体)以摩尔比2:1在pH值7.4的磷酸缓冲液中孵育4小时，具体做法为：取0.14mg Fc-PLG-MMAE溶于1.0mL pH值7.4的磷酸缓冲液，分别加入1.0mg IgG抗体或108.5μL aPDL1抗体(8.67mg·mL-1)，在4℃条件下孵育4小时。利用Fc-PLG-MMAE上Fc-III-4C多肽对单克隆抗体(IgG、aPDL1)Fc段的高度亲和力获得抗体-高分子-药物偶联物IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE。
对所获得的IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE进行动态光散射分析，测定在水中形成的粒子的流体力学半径。如图4，实施例4制备的0.5mg·mL-1IgG-PLG-MMAE和0.5mg·mL- 1aPDL1-PLG-MMAE的动态光散射结果显示，IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE的流体力学半径分别为122.7±2.0nm和110.6±6.5nm。
实施例5：抗体-高分子-药物偶联物的体外细胞毒性实验
通过CCK-8细胞增殖实验研究Fc-PLG-MMAE、IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE对MC38细胞的毒性。在96孔板中，每孔植入5.0×103个细胞，孵育过夜，然后加入所需浓度的Fc-PLG-MMAE、IgG-PLG-MMAE和aPDL1-PLG-MMAE。孵育24小时后，每孔加入20.0μL CCK-8溶液再孵育1小时，使用酶标仪检测在450nm处每孔的吸光度。如图5所示，aPDL1-PLG-MMAE对MC38细胞具有较强的细胞毒作用，IC50为11.8nM。然而，即使在100.0nM的高浓度下，Fc-PLG-MMAE和IgG-PLG-MMAE仍不能有效抑制MC38细胞增殖。可见，aPDL1-PLG-MMAE对PDL1蛋白高水平表达的MC38细胞显著的肿瘤细胞识别作用。
实施例6：抗体-高分子-药物偶联物对MC38小鼠结肠癌肿瘤模型的抑瘤效果
选取C57BL/6小鼠(6周，体重20g左右，20只)为实验动物，皮下注射小鼠MC38结肠癌细胞构建小鼠结肠癌肿瘤模型并进行体内抑瘤效果评价。如图6(A)所示，待肿瘤长至约110mm3时记为第0天，将荷瘤小鼠随机分为4组，分别为PBS组，2.5mg·kg-1aPDL1+IgG-PLG-MMAE(2.17mg·kg-1aPDL1、2.31mg·kg-1IgG与0.08mg·kg-1MMAE)组，1.25mg·kg-1aPDL1-PLG-MMAE(1.09mg·kg-1aPDL1与0.04mg·kg-1MMAE)组和2.5mg·kg-1aPDL1-PLG-MMAE(2.17mg·kg-1aPDL1与0.08mg·kg-1MMAE)组。在第0天、第3天、第6天和第9天通过尾静脉注射药物，每3天量瘤一次监测肿瘤体积和体重变化，直至肿瘤长至约1800mm3，进行药效学与安全性评价。肿瘤体积通过以下公式进行计算：
小鼠肿瘤体积计算公式：V＝(a×b2)/2，肿瘤抑制率TSR＝(Ac-Ax)/Ac×100％。其中a是肿瘤长径，b是肿瘤短径；Ac是对照组平均肿瘤体积，Ax是治疗组平均肿瘤体积。
如图6(B)与图6(D)所示，与PBS组和aPDL1+IgG-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组相比，aPDL1-PLG-MMAE(1.25mg·kg-1)组和aPDL1-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组均能有效的抑制肿瘤生长，治疗结束时，aPDL1-PLG-MMAE(1.25mg·kg-1)组和aPDL1-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组的肿瘤抑制率分别为80.6％和92.3％，均比无靶向效果的IgG-PLG-MMAE组(TSR：29.2％)显著，在第21天抑瘤结束时aPDL1-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组治疗小鼠瘤体积为157.2±40.3mm3，是以静脉注射aPDL1-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组具有更好的治疗效果，这表明aPDL1可以靶向肿瘤细胞，提高纳米粒子在肿瘤的富集，可以提高纳米粒子杀伤肿瘤细胞的能力。
同时，如图6(C)，aPDL1-PLG-MMAE(1.25mg·kg-1)组和aPDL1-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组与PBS组和aPDL1+IgG-PLG-MMAE组一样均无明显体重下降，说明所使用的抗体-高分子-药物偶联物安全性与耐受性良好。
实施例7：免疫组织化学分析
抑瘤实验结束后对小鼠肿瘤与正常组织进行H&E染色与TUNEL染色，通过免疫组化分析抗体-高分子-药物偶联物的抗肿瘤作用及毒副作用。如图7(A)所示，H&E染色切片中，PBS组肿瘤核仁大，核质丰富，细胞密度大，说明生命力旺盛，增殖活性强。IgG-PLG-MMAE组显示出对肿瘤细胞的轻微杀伤，这是因药物的被动靶向作用而少量富集到肿瘤并释放出MMAE杀伤肿瘤。而具有主动肿瘤靶向效果的aPDL1-PLG-MMAE组则显示出大面积肿瘤细胞坏死，且剂量越高杀伤效果越强。在TUNEL染色切片中，PBS组肿瘤细胞密度大，细胞凋亡很少；IgG-PLG-MMAE组显示出少量肿瘤细胞坏死；而aPDL1-PLG-MMAE组则表现出大面积肿瘤细胞凋亡，随着药物浓度的增加，凋亡细胞数量增加。这是由于aPDL1-PLG-MMAE对PDL1高水平表达MC38细胞的特异性识别作用，与H&E结果一致。同时如图7(B)所示，所有组的正常组织(心、肝、脾、肺、肾)均未显示明显的细胞形态学改变，说明aPDL1-PLG-MMAE具有较好的安全性。
实施例8：生化指标检测
抑瘤实验结束后取小鼠血浆进行肝肾功能检查，评价各治疗组是否具有潜在毒副作用。如图8所示，与PBS健康对照组相比，经aPDL1+IgG-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组，aPDL1-PLG-MMAE(1.25mg·kg-1)组和aPDL1-PLG-MMAE(2.5mg·kg-1)组治疗后小鼠的谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、尿酸(UA)、谷草转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)均无显著性差异，且均在正常范围内，说明各治疗组处理后均未出现肝肾损伤，具有进一步临床应用的潜力。
综上所述，本发明提供了一种具有普适性的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，通过Fc-III-4C多肽与抗体的连接可以简单方便地制备抗体-高分子-药物偶联物，并制备了一种靶向小鼠肿瘤细胞表面的PDL1蛋白的抗体-高分子-药物偶联物，验证了其在抗肿瘤方面的价值。本发明通过聚谷/天冬氨酸(PLG/A)侧链羧基键合对免疫球蛋白(抗体)Fc段具有高亲和力的Fc-III-4C多肽，随后在聚谷/天冬氨酸(PLG/A)剩余的侧链羧基键合细胞毒性药物或免疫调节剂类药物，以获得Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物。最后，将单克隆抗体与Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物在磷酸缓冲液中孵育3到5小时以获得抗体-高分子-药物偶联物。该方法具有如下优点：首先，抗体-高分子-药物偶联物制备方式简单快速；其次，Fc-III-4C多肽与抗体的结合不会影响对抗体的Fab段结构，亦即不影响抗体的抗原识别效果；最后，Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物与抗体可分开保存，使用时直接制备，避免了传统ADC药物在储存与运输过程中的聚沉风险。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其特征在于，具有式(I)所示的结构：
式(I)中，R1是C2到C10的直链烷基、C3到C10的支链烷基或C6-C20的芳基；
R2是羟基、被官能团取代或不取代的烷氧基、或Fc-III-4C；
R3是氢离子或者阳离子；
R4是羟基、被官能团取代或不取代的烷氧基、或细胞毒性药物、或免疫调节剂类药物；
R5是氢原子、C2到C10的直链酰基或C3到C10的支链酰基基团；
L1、L2、L3独立的选自-CH2-或-CH2CH2-；
n为聚合度，10≤n≤300；x,y,z为百分比，x+y+z＝1，x>0,y>0,z>0。
2.根据权利要求1所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其特征在于，所述R1为C3-C8的直链烷基、C5-C8的支链烷基或C8～C15的芳基；所述R2选自羟基或者Fc-III-4C；所述R3选自氢原子、金属阳离子或有机阳离子；所述R4选自羟基、或者单甲基澳瑞他汀E(Val-Cit-PAB-MMAE)、美登素、紫杉醇、长春瑞宾、多西他塞、羟基喜树碱、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、异环磷酰胺、达卡巴嗪、顺铂和奥沙利铂中任意一种药物；所述R5选自氢原子、甲酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基。
3.根据权利要求1所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其特征在于，所述R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、苯基、萘基、联苯基或蒽基，所述R3选自氢原子、钠离子、钾离子、铵离子或者带正电荷的氨基酸离子。
4.根据权利要求1所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其特征在于，所述R2为Fc-III-4C，所述R4为Val-Cit-PAB-MMAE；
所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物具有式(II)所示的结构：
5.根据权利要求4所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物，其特征在于，式(II)中，n＝160，x＝0.025，x为与Fc-III-4C接枝数的占比，y＝0.875，z为与Val-Cit-PAB-MMAE接枝数的占比，z＝0.1。
6.一种权利要求1-5任意一项所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过将高分子化合物的侧链羧基键合对免疫球蛋白Fc段具有高亲和力的Fc-III-4C多肽，随后在高分子化合物剩余的侧链羧基键合细胞毒性药物或免疫调节剂类药物，以获得Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物；
所述高分子化合物为聚谷氨酸、聚天冬氨酸或者聚谷氨酸天冬氨酸共聚物。
7.根据权利要求6所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述高分子化合物中侧链羧基与Fc-III-4C多肽的摩尔比是3～300:1，高分子化合物中侧链羧基与细胞毒性药物或免疫调节剂类药物的摩尔比是3～300:1。
8.一种抗体-高分子-药物偶联物，其特征在于，其是将含Fc段单克隆抗体与权利要求1-5任意一项所述的Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物在水相溶液中共混得到。
9.根据权利要求8所述的抗体-高分子-药物偶联物，其特征在于，所述Fc-III-4C多肽-高分子-药物偶联物中Fc-III-4C多肽与含Fc段单克隆抗体的摩尔比为1～2:1；
所述含Fc段单克隆抗体为抗PDL1、Trop2、HER2、PD1、CTLA-4、OX40、OX40L、CD16、4-1BB、EGFR、CD3、CD3ε、CD19、CD28、CD33、CD22、CD79b、BCMA、MET、EpCAM、CD13、CD73、CD20和Nectin-4中的一种抗体。
10.一种权利要求8所述的抗体-高分子-药物偶联物在制备抗癌药物上的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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