CN102145176A - 一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水溶性的具有靶向功能的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物及其制备方法。本发明的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物的特征在于改善抗肿瘤药物的溶解性，延长药物的体内半衰期，通过大分子连接物被动靶向肿瘤作用和靶向蛋白特异结合肿瘤细胞的主动靶向肿瘤作用，将抗癌药物选择性地靶向释放至肿瘤细胞。本发明连接物制备方法的特征在于以聚乙二醇为原料，合成一端为羧基、另一端为马来酰亚胺基的异双功能聚乙二醇衍生物，利用该衍生物羧基端与抗癌药共价连接，马来酰亚胺基端与靶向蛋白共价连接，得到靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物。

Description

一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物
技术领域
本发明涉及一种具有靶向功能的水溶性的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物及其制备方法。
背景技术
癌症号称人类“杀手”，开发和研制高效低毒的抗癌药物是人类所面临的重大挑战。目前化疗仍然是临床上治疗癌症的主要途径之一，然而许多常用的化疗药物例如紫杉醇、喜树碱类似物等，由于水溶性极低，生物利用度低，制剂开发困难；再加上选择性差、细胞毒性过高、体内代谢快等缺点，大大限制了这些药物的临床应用。为克服上述缺陷，寻找新的、有效的治疗肿瘤的化疗药物仍然是研究者关注的热点。抗癌药物的聚乙二醇化就是其中一种，如紫杉醇、喜树碱、多柔比星等抗癌药的聚乙二醇化[Veronese F Met al：Exp.Opin.Ther.Patents，2004，14(6)：859-894.]。
当PEG分子与药物分子偶联，得到PEG修饰的药物分子，不仅改善药物溶解性和体内生物分布行为，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，降低其在肾脏的排泄速率，增加药物滞留时间，而且所形成的大分子连接物可因增强渗透和滞留(enhanced permeability and retention effect，EPR)效应，对肿瘤组织起到被动靶向作用[Duncan R et al：Nat Rev Drug Discov，2003，2：347-360]。因此抗癌药物经聚二醇修饰后，往往会具有以下优点：良好的肿瘤靶向性、更好的溶解性、更长的半衰期、血药浓度波动较小、较低的最大血药浓度、较小的毒性等，大大改善化疗药物毒性大、无选择性、难溶等缺点。
为了进一步提高PEG修饰小分子抗癌药物后对肿瘤的靶向作用，有必要再偶联一个具有主动靶向作用的分子。主要策略是设计一种异双功能PEG衍生物(Heterobifunctional PEG)，利用其一端连接抗癌药，另一端连接具有主动靶向作用的分子。通常利用肿瘤细胞过度表达的受体(如转铁蛋白受体)或者特异抗原，选择这些受体的配基(如转铁蛋白、转铁蛋白受体的抗体等)或者抗原的抗体(如人源单克隆抗体、抗体片段等)作为主动靶向肿瘤的分子，然后通过受体介导或抗原-抗体结合介导的内吞作用增强药物肿瘤细胞靶向释药。
异双功能PEG衍生物(Heterobifunctional PEG)，结构通式为A-PEG-B，其中A、B是不同的功能团，可分别与两个具有不同特性的大分子相连接。这样的异端双功能基PGE衍生物可用作连接两个分子的亲水、生物相容的间隔物。异双功能聚乙二醇衍生物的合成主要有两种方法[M.S.Thompson et al：Polymer 49(2008)：345-373]：第一种方法是开环聚合法(以环氧乙烷直接合成)，是利用一种异双功能的阴离子引发剂引发环氧乙烷开环聚合，然后用另一种官能团终止反应。第二种方法是末端修饰法(End Group ModificationFrom PEG)，是将PEG两端的羟基部分衍生化，通过分离纯化得到异双功能衍生物，例如NHS-PEG-MAL，一端为琥珀酰亚胺酯(NHS)活泼酯，可以与药物分子偶联；另一端为马来酰亚胺基(MAL)，可与巯基化的靶向蛋白连接，在靶向给药研究中经常使用[Benoit Frisch et al：Bioconjugate Chem，1996，7(2)：180-186；Aimee Guider Paige et al：Pharmaceutical Research1995，12(12)：1883-1888]。
转铁蛋白(transferrin，Tf)是一类广泛存在于脊椎动物体液及其细胞中的单体糖蛋白家族，包含血清转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳铁蛋白和黑素转铁蛋白，其中以血清转铁蛋白含量最高，且分布广泛。成熟的Tf由679个氨基酸组成，分子质量约80kDa。Tf主要在肝脏合成，其主要作用是运载细胞外的铁，通过细胞膜Tf受体(FfR)介导的内吞作用，将铁转入细胞。恶性肿瘤表面TfR的超量表达提供了转铁蛋白作为肿瘤导向分子靶向转运抗癌药的可能性，如Tf肿瘤靶向转运阿霉素、正定霉素等[Li et al：Trends Pharmacol Sci，2002，23(5)：206-209，Singh et al：Anticancer Res，1998，18(3A)：1323-1427，Kratz et al：Bioorganic&MedicinalChemistry Letters，1997，7(5)：617-622]。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)是一种主要癌胚蛋白，它是肿瘤细胞过量表达癌胚蛋白受体的一种配基，已有人使用甲胎蛋白靶向释放顺铂至肿瘤(Severin SE，et al，BiochemMol Biol Int，1995，37：385-392).
抗癌的单克隆抗体主要是免疫球蛋白G(IgG)类的抗体，每个单抗含有2个相同重链和2个相同轻链，两个重链之间通过二硫键相连。每个重链分成Fab部分和Fc部分，其中Fab部分又分为可变区片段(VH)和恒定区片段，轻链与重链Fab部分通过二硫键相连，构成抗体Fab片段，是识别和结合抗原的区域，现代研究表明抗体中抗原识别和结合域主要由重链可变区链(VH)和轻链可变区链(VL)连接构成，使用生物工程技术可将VH和VL通过人工接头连接成各种单链抗体。单克隆抗体、抗体Fab片段和单链抗体靶向释放化疗抗癌药物已有许多研究报道(Milenic DE.Curr Pharm Des.2002，8：1749-1764；Kontermann RE，CurrOpin Mol Ther.2006，8(1)：39-45.)
本发明利用PEG作为药物载体的优良性能以及靶向蛋白主动靶向功能，来克服抗肿瘤药物临床应用中存在的溶解性差、选择性低、毒副作用大等问题，发明一种具有主动和被动肿瘤靶向功能的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物及其制备方法。
本发明是以肿瘤特异的配体或抗体作为靶向蛋白，双功能PEG衍生物为中间基团，与抗肿瘤药物结合制备成具有被动靶向和主动靶向双重功能的转铁蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，具有以下通式：
TP-X-PEG-Y-G
其中，TP是能与癌细胞特异结合的各种蛋白质，包括与癌细胞受体结合的蛋白质配基分子(如转铁蛋白或转铁蛋白受体抗体、癌胚蛋白或癌胚蛋白受体抗体等)和与癌细胞抗原结合的抗体或抗体片段(如各种人源单克隆抗体、抗体Fab片段或单链抗体等)，这些TP靶向蛋白可通过以下试剂进行巯基化，这些试剂包括2-亚氨基硫烷盐酸(Traut’s试剂)、3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、甲基-4-巯基丁酰亚胺、S-乙酰巯基丁二酸酐(SAMSA)等，优选的巯基化试剂为2-亚氨基硫烷盐酸(Traut’s试剂)；交联剂X为一端是马来酰亚胺基团另一端是琥珀酰亚胺基团的异双功能交联剂，例如3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPS)、4-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(Mal-4-NHS、GMBS)、6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(Mal-6-NHS、EMCS)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)等，优选的交联剂X为3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPS)；PEG为具有-(OH2CH2O)n-重复结构的异双功能聚乙二醇衍生物，聚乙二醇平均分子量为2K～20KDa，n为45～450，优选分子量为2KDa和4KDa；连接臂Y是能够将两个末端羟基连接起来的饱和或不饱和的环状酸酐，例如丁二酸酐、戊二酸酐、马来酸酐等，优选的连接臂Y为丁二酸酐；抗肿瘤药物G为末端带有羟基且分子量小于0.5KDa的小分子抗癌药物，包括喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基-10羟基喜树碱(SN38)、紫杉醇、多西紫杉醇等，优选的药物分子是7-乙基-10羟基喜树碱(SN38)。
本发明所涉及的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物是通过异双功能PEG衍生物(例如一端为胺基另一端为羟基的聚乙二醇衍生物)的一端与巯基化的靶向蛋白共价连接，另一端与抗肿瘤药物共价连接，进而形成的。
本发明涉及靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物的制备方法，包括以下步骤：
(1)HO-PEG-NH2的制备
首先以PEG和对甲苯磺酰氯(TsCl)为原料，二氯甲烷为溶剂，Ag2O/KI为催化剂，室温搅拌数小时，得到的HO-PEG-OTs(I)。再加入氯化铵，浓氨水，30℃搅拌数天。硅胶柱层析法分离纯化：硅胶300-400目，湿法装柱，干法上样，梯度洗脱，得到HO-PEG-NH2(II)。
(2)Mal-PEG-COOH的制备
以HO-PEG-NH2为原料，无水二氯甲烷为溶剂，Mal-3-NHS(MPS)为交联剂，三乙胺(TEA)为催化剂，室温搅拌过夜，异丙醇重结晶，真空干燥得Mal-PEG-OH(III)。再加入丁二酸酐，二氯甲烷为溶剂，TEA为催化剂，室温搅拌过夜，异丙醇重结晶，得Mal-PEG-COOH(IV)。
(3)Mal-PEG-抗癌药的制备
以Mal-PEG-COOH和抗癌药为原料，无水氯仿为溶剂，无水吡啶和二氯磷酸苯酯为催化剂，N 2保护下，室温避光搅拌24h，异丙醇重结晶，硅胶柱层析分离纯化，得Mal-PEG-抗癌药(V)。
(4)TP-PEG-抗癌药的制备
首先将TP进行巯基化。以靶向蛋白TP和Traut’s试剂为原料，pH8.5的缓冲液中反应，室温避光轻微搅拌1h。超滤离心法进行浓缩和纯化，得到TP-SH溶液(VI)。再加入Mal-PEG-抗癌药(V)，在pH7.0的PBS液中反应，4℃避光轻微搅拌12h。超滤离心法进行浓缩和纯化。加入冻干保护剂，冷冻干燥，即得TP-PEG-抗癌药(VII)。
以TP-PEG-SN38为例，本发明靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药连接物合成的流程为：
Figure BSA00000470075500041
本发明所制成的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，一方面具有PEG化药物的优点，即可以改善抗肿瘤药物的溶解性，延长药物的体内半衰期，通过被动靶向作用增加药物在肿瘤组织中的摄取量；另一方面利用靶向蛋白的主动靶向肿瘤细胞的作用，即受体介导或抗原抗体结合介导的内吞作用，将抗癌药物选择性地蓄积于过度表达受体或抗原的肿瘤细胞内。
具体实施方案
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1Tf-PEG2K-SN38
(1)HO-PEG2K-NH2的合成
称取2g PEG(2K)于250ml的圆底烧瓶中，溶于25ml二氯甲烷。再加入0.4g氧化银，0.3g碘化钾，最后加入0.2g对甲苯磺酰氯，室温下磁力搅拌2-3h，硅藻土过滤，二氯甲烷洗涤，旋转蒸发除掉溶剂即得到HO-PEG-OTs(I)粗品约2g。薄层色谱法分析，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨水(5∶0.5∶0.1)，碘蒸气显色，HO-PEG-OTs的Rf为0.33。将粗品(I)溶于50ml浓氨水(25％-28％)，加入0.7g氯化铵，室温下磁力搅拌三天，用二氯甲烷萃取，收集有机层，旋转蒸发除掉溶剂得到HO-PEG-NH2粗品约1.8g。HO-PEG-NH2粗品溶于少量二氯甲烷，上样至硅胶层析柱，用二氯甲烷-甲醇-氨水(450∶30∶3→390∶30∶3)进行梯度洗脱，收集HO-PEG-NH2组分，旋蒸浓缩后，滴入过量的冰乙醚中，抽滤，真空干燥24h，得到白色的HO-PEG2K-NH2(II)纯品0.8006g，产率44.5％。薄层色谱法分析，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨水(3.5∶0.5∶0.1)，碘蒸气显色，HO-PEG2K-NH2的Rf为0.37。(II)的1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6，盐酸酸化)为：δ2.96(t，-CH2NH3 +)，3.5(br m，PEG)，4.59(s，OH)，7.83(s，NH3 +Cl-)。
(2)Mal-PEG-COOH的合成
称取NH2-PEG-OH(2K)0.5g，无水二氯甲烷8ml，三乙胺100μl，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(MPS)0.1g于圆底烧瓶中。室温磁力搅拌过夜。浓缩反应液，滴入冰乙醚中沉淀，抽滤得白色沉淀，异丙醇重结晶，真空干燥24h，即得白色产物Mal-PEG-OH(III)0.5105g，产率94.7％。薄层色谱法分析，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨水(4∶0.5∶0.1)，碘蒸气显色。1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6)：δ3.5(br m，PEG)，4.59(s，OH)，7.0(s，-CH＝CH-)，8.0(s，-CONH-)。
称取Mal-PEG-OH(III)0.3828g，丁二酸酐0.0957g，三乙胺28μl，无水二氯甲烷8ml于圆底烧瓶中。室温磁力搅拌5h。旋转蒸发除掉溶剂得到酒红色固体沾于瓶壁四周。异丙醇重结晶4次，真空干燥24h，得白色产物Mal-PEG-COOH(IV)0.2954g，产率75.5％。薄层色谱法分析，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨水(5∶1∶2滴)，碘蒸气显色。1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6)：δ3.5(brm，PEG)，4.13(t，-CH2-OCO-)，7.01(s，-CH＝CH-)，8.0(s，-CONH-)。
(3)Mal-PEG-SN38的合成
称取Mal-PEG-COOH(IV)0.20g，SN3830mg，无水氯仿10ml，无水吡啶0.6ml，二氯磷酸苯酯0.3ml于圆底烧瓶中。N2保护下，室温磁力搅拌24h。用1N HCl洗涤反应液，收集有机层，减压去除溶剂，异丙醇重结晶，硅胶柱层析分离纯化，真空干燥24h，得到黄绿色产物Mal-PEG-SN38(V)0.066g，产率54.4％。薄层色谱法分析，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨水(6∶1∶2滴)，紫外灯下显蓝色斑点。1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6)：δ1.8(s，H-19)，3.5(brm，PEG)，4.19(t，-CH2-OCO-)，5.34(t，s，H-5)，5.43(s，H-17)，6.48(s，20-OH)，7.01(s，-CH＝CH-)8.0(s，-CONH-)。
(4)Tf的巯基化
称取Tf 15.4mg于反应瓶中，加pH8.5缓冲液(0.1M硼酸纳/1mM EDTA)3ml，加入Traut’s试剂100μl，室温避光氮气保护下，轻微搅拌2h，反应液经超滤法(Amicon Ultra-4，30KD)浓缩到约0.2ml，再用2ml pH8.0PBS缓冲液洗涤超滤管，再次浓缩至0.2ml。重复三次。小心转移浓缩液至2ml容量瓶中，用pH7.5缓冲液(0.0025M硼酸纳/0.15MNaCl)洗涤超滤管数次，转移至10ml容量瓶内，定容，得Tf-SH的溶液(VI)。
Tf浓度的测定：紫外分光光度法测得Tf-SH的溶液中Tf的浓度为1.16mg/ml(ε280＝92300/M/cm)。巯基化程度测定：采用Ellman′s试剂测定Tf疏基化程度。取Tf-SH稀释液1mL(1.16mg/mL)，加pH8.0PBS缓冲液4mL，混匀，取3mL，加20uL的Ellmna试剂，反应10min后，于412nm测吸收值A，计算琉基的摩尔浓度(ε280＝13600/M/cm)。当Tf与Traut’s试剂比例为1∶20时，巯基化程度为4～5。
(5)Tf-PEG2K-SN38制备
称取Mal-PEG2K-SN38(V)7.698mg溶于上述Tf-SH(VI，10.36mg)的溶液中，避光，4℃下轻微搅拌12h。反应液经超滤离心至滤液无蓝色荧光(Amicon Ultra-4，30KD)，除去未反应的小分子物质。最后用pH7.5缓冲液(0.0025M硼酸纳/0.15MNaCl)洗涤超滤管数次，约至2ml，分装于小西林瓶中，冷冻干燥，得白色蓬松固体Tf-PEG2K-SN38(VII)。紫外扫描测得连接物吸收峰最大吸收波长为254、278、360nm；MALDI-TOF-MS测得连接物的分子量为99743.850与103922.060。
实施例2Tf-PEG4K-SN38
(1)HO-PEG4K-NH2的合成
称取2g PEG(4K)于250ml的圆底烧瓶中，溶于25ml二氯甲烷。再加入0.23g氧化银，0.17g碘化钾，最后加入0.11g对甲苯磺酰氯(TsCl)，室温下磁力搅拌2-3h。反应液硅藻土过滤，过量二氯甲烷洗涤，旋转蒸发除掉溶剂即得到HO-PEG-OTs(I)粗品约2g。
将粗品(I)溶于50ml浓氨水(25％-28％)，加入0.345g氯化铵，室温下磁力搅拌三天，二氯甲烷萃取，收集有机层，旋转蒸发得到HO-PEG-NH2粗品约1.8g，再经硅胶柱层析分离纯化，得到白色的HO-PEG4K-NH2纯品(II)0.694g，产率38.1％。薄层层析法分析同实施例1，(II)的1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6，盐酸酸化)：δ2.96(t，-CH2NH3 +)，3.5(br m，PEG)，4.59(s，OH)，7.83(s，NH3 +Cl-)。
(2)Mal-PEG4K-COOH的合成
称取上述II0.3864g，无水二氯甲烷8ml，三乙胺20μl，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(MPS)0.0310g于圆底烧瓶中，室温搅拌过夜，浓缩，冰乙醚中沉淀，过滤，异丙醇重结晶，真空干燥，即得白色产物Mal-PEG-OH(III)0.3725g，产率90.7％，1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6)：δ3.5(br m，PEG)，4.59(s，OH)，7.0(s，-CH＝CH-)，8.0(s，-CONH-)。
称取Mal-PEG4K-OH(III)0.2595g，丁二酸酐0.0320g，三乙胺18μl，无水二氯甲烷5ml于圆底烧瓶中，室温搅拌12h，旋转蒸发除掉溶剂，异丙醇重结晶，真空干燥，得白色产物Mal-PEG4K-COOH(IV)0.2138g，产率82.4％，1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6)：δ3.5(br m，PEG)，4.13(t，-CH2-OCO-)，7.01(s，-CH＝CH-)，8.0(s，-CONH-)。薄层色谱法分析同实施例1。
(3)Mal-PEG4K-SN38的合成
称取Mal-PEG4K-COOH(IV)0.1027g，SN3817mg，无水氯仿8ml，无水吡啶0.3ml，二氯磷酸苯酯0.15ml于圆底烧瓶中，N2保护下，室温搅拌24h，用1N HCl洗涤反应液，收集有机层，减压去除溶剂，异丙醇重结晶，硅胶柱层析分离纯化，真空干燥，得到黄绿色产物Mal-PEG4K-SN38(V)0.066g，产率54.7％。薄层色谱法分析，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨水(6∶1∶2滴)，紫外灯下显蓝色斑点。1H-NMR(300MHZ，DMSO-d6)：δ1.8(s，H-19)，3.5(br m，PEG)，4.19(t，-CH2-OCO-)，5.34(t，s，H-5)，5.43(，H-17)，6.48(s，20-OH)，7.01(s，-CH＝CH-)8.0(s，-CONH-)。
(4)Tf的巯基化
称取Tf 15.4mg于反应瓶中，加pH8.5缓冲液(0.1M硼酸纳/1mM EDTA)3ml，加入Traut’s试剂100μl，室温、避光氮气保护下，轻微搅拌2h，超滤法(Amicon Ultra-4，30KD)浓缩到约0.2ml。再用2ml pH8.0PBS缓冲液洗涤超滤管，浓缩至0.2ml，重复三次。小心转移浓缩液至10ml容量瓶中，用pH7.5缓冲液(0.0025M硼酸纳/0.15MNaCl)洗涤超滤管数次，定容，得Tf-SH的溶液(VI)。
Tf浓度的测定和巯基化程度测定方法同实施例1。当Tf与Traut’s试剂比例为1∶20时，巯基化程度为4～5。
(5)Tf-PEG4K-SN38制备
称取Mal-PEG4K-SN38(V)7.698mg溶于上述Tf-SH(VI，10.36mg)溶液中，避光，4℃下轻微搅拌12h。反应液经超滤离心至滤液无蓝色荧光(Amicon Ultra-4，30KD)，除去未反应的小分子物质。最后用pH7.5缓冲液(0.0025M硼酸纳/0.15MNaCl)洗涤超滤管数次，约至2ml，分装于小西林瓶中，冷冻干燥24h，得白色蓬松固体Tf-PEG4K-SN38(VII)。紫外扫描测得连接物的吸收峰最大吸收波长为254、278、360nm：MALDI-TOF-MS测得连接物的分子量为101743.850与105922.060。

Claims (6)

1.一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于具有以下通式：
TP-X-PEG-Y-G
TP为靶向癌细胞的蛋白质。
X为连接巯基与胺基的交联剂；
PEG为具有-(OH2CH2O)n-重复结构的聚乙二醇及其衍生物；
Y为连接两个羟基连接臂；
G为小分子抗癌药物。
2.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的TP靶向蛋白是能与癌细胞特异结合的各种蛋白质，包括与癌细胞受体结合的蛋白质配基分子(如转铁蛋白或转铁蛋白受体抗体、癌胚蛋白或癌胚蛋白受体抗体等)和与癌细胞抗原结合的抗体或抗体片段(如各种人源单克隆抗体、抗体Fab片段或单链抗体等)，这些TP靶向蛋白通常是通过以下试剂转化成为其巯基化衍生物，这些试剂包括2-亚氨基硫烷盐酸(Traut’s试剂)、3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、甲基4-巯基丁酰亚胺、S-乙酰巯基丁二酸酐(SAMSA)等，优选的巯基化试剂为2-亚氨基硫烷盐酸(Traut’s试剂)。
3.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的交联剂X是一端为马来酰亚胺基团另一端为琥珀酰亚胺基团的异双功能交联剂，包括3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPS)、4-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(Mal-4-NHS、GMBS)、6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(Mal-6-NHS、EMCS)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)等，优选的交联剂为3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPS)。
4.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的PEG聚乙二醇是异双能的聚乙二醇衍生物，例如一端为胺基另一端为羟基的聚乙二醇衍生物等，其中聚乙二醇平均分子量为2000-20000Da，n为45～450，优选分子量为2000Da和4000Da。
5.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的连接臂Y是能够将两个不同分子中羟基连接起来的饱和或不饱和环状酸酐，包括丁二酸酐、戊二酸酐、马来酸酐等，优选的连接臂为丁二酸酐。
6.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的抗肿瘤药物G为末端带有羟基且分子量小于500Da的小分子抗癌药物，包括喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基-10羟基喜树碱(SN38)、紫杉醇、多西紫杉醇等，优选的药物分子是7-乙基-10羟基喜树碱(SN38)。
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