CN1911447A - 转铁蛋白－聚乙二醇－药物分子复合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属化学制药领域，具体涉及转铁蛋白－聚乙二醇－药物分子复合物及其在肿瘤靶向治疗中的应用。本发明采用转铁蛋白为主动靶向配体，与PEG化药物共价结合成转铁蛋白－聚乙二醇－药物分子复合物，具有主动靶向与被动靶向的双重功能。体外实验结果表明能与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体特异性结合，竞争转铁蛋白受体；体内实验结果表明，比原药及PEG化药物，血浆半衰期长，在肿瘤组织中的蓄积程度高，肿瘤抑瘤率显著高。本发明可进一步制备抗肿瘤药物产品，为临床提供肿瘤靶向治疗。
Description
技术领域
本发明属化学制药领域，具体涉及转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物及其在肿瘤靶向治疗中的应用。
技术背景
蛋白质多肽类抗肿瘤药物是一类应用细胞生物学和分子生物学手段对机体免疫系统或肿瘤的生长进行调节，从而抑制肿瘤生长的药物，其特别对化疗及放疗后血细胞群的恢复能起到很好作用。目前此类药物在临床肿瘤治疗中受到重视，但其应用还存在一些问题，例如：体内不够稳定，半衰期很短；因缺乏选择性，导致相对平均的组织分布，在发挥治疗作用的同时，对正常组织和细胞毒副作用大；常产生一定的抗原性，导致免疫反应的发生等。因此，严重影响这些药物的抗肿瘤治疗价值。
转铁蛋白(Transferrin，Tf)是一种非血红素结合铁的β-球蛋白，广泛分布于脊椎动物的体液及细胞中。包括血清转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳铁蛋白、黑色素转铁蛋白等，均为具有两个Fe3+结合位点的单肽链糖蛋白，其中以血清转铁蛋白含量最多，且分布广泛，能提供机体大多数组织器官所需的铁。转铁蛋白的蛋白质部分由相对分子量为70kDa～80kDa的单一多肽链构成，含糖约6％[龙华等：生物工程进展，2001，21(2)：32-39.]。Tf具有热稳定性，在60℃加热时几乎无变性现象。Tf主要在肝脏合成，其主要作用是运载细胞外的铁，通过细胞膜受体介导的内吞作用，将铁转入细胞。
研究表明多数肿瘤细胞表面转铁蛋白受体(TfR)数目或活性高于正常细胞[Vyas SP and Sihorkar V：Adv Drug Deliv Rev，2000，43(2-3)：101-164]。如：TfR表达的改变与乳腺癌、膀胱癌、肺癌、皮肤癌等均有密切关系。恶性肿瘤表面TfR的超量表达提供了人体内源性蛋白——转铁蛋白作为肿瘤导向基团的可能性。近年来，以转铁蛋白受体介导靶向肿瘤细胞的研究有所发展。通过Tf-药物结合物可获得更加理想的组织分布，更长的药物血浆半衰期和控制药物从结合物中的释放，在动物模型和人体上研究显示通过Tf摄取途径治疗癌症的有效性[Li et al：Trends Pharmacol Sci，2002，23(5)：206-209]。
有研究显示，作为TfR配体的Tf与小分子抗癌药物阿霉素直接通过小分子间接连接而成的复合物，可选择性地杀死白血病细胞而对正常血细胞无毒性，对KB细胞毒实验中发现其IC50明显低于阿霉素，并且可避免阿霉素引起的心血管毒性和抗药性[Yeh et al：Clin Immunol Immunopathol.1984，32：1-11；Fritzer et al：Biochemical Pharmacology，1996，51：489-493；Singh et al：Anticancer Res，1998，18(3A)：1423-1427]。将马来酰亚胺基团引入小分子抗癌药物正定霉素后直接与巯基化的Tf结合形成的Tf-正定霉素复合物，体外黑色素瘤细胞实验表明该复合物比原药具有更高的抗肿瘤活性[Kratz et al：Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters.1997，7(5)：617-622.]。
将Tf连接在脂质体表面制得的Tf-脂质体或Tf-PEG-脂质体，细胞培养和动物实验表明可携带药物至TfR丰富的细胞，通过受体介导的细胞内吞作用进入肿瘤细胞；其体内滞留时间延长，网状内皮系统的摄取降低，肿瘤部位的累积量有所增加[Singh et al：Curr Pharm Des，1999，5(6)：443-451；Maruyama et al：AdvDrug Deliv Rev，1999，40：89-102；Voinea et al：Vascular Pharmacology，2002，39(1～2)：13-20；Ishida et al：.Pharmaceutical Research，2001，18(7)：1042-1048；Maruyama et al：J Control Release，2004，98：195-207]，但由于脂质体不够稳定，极易从脂质体中渗漏出的药物，失去了其靶向到肿瘤细胞的作用。
聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一类由乙二醇单体聚合而成的线性或分支的高分子材料，分子组成为：HOCH2CH2(OCH2CH2O)nCH2CH2OH。PEG分子具有良好的水溶性和生物相容性，为一种被广泛使用的生物修饰材料。目前大部分研究主要集中在PEG与蛋白质的化学复合方面，如：干扰素、超氧化物岐化酶、粒细胞集落刺激因子、牛血红蛋白、水蛭素、肿瘤坏死因子、胰岛素、白介素-2等[Hinds K.D.et al：Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54：505-530；Kodera Y.et al：Prog.Podlym.Sci.，1998，23：1233-1271；Veronese F.M：Biomaterials，2001，22：405-417]。PEG与生物大分子类药物的结合，可增加药物的稳定性；减弱或消除免疫原性；延长药物体内半衰期；虽然，抗肿瘤药物经PEG修饰后，可通过被动靶向作用来增加药物在肿瘤组织的摄取量，但由于其对肿瘤细胞无特异性识别作用，使其在肿瘤组织和正常组织中的分布无明显差别，靶向肿瘤作用不显著。
综上所述，肿瘤细胞表面TfR是一条可通过Tf将包括纳米粒、脂质体、基因和抗肿瘤药物等物质导入肿瘤细胞内的有效途径；PEG是一类具有广阔应用前景的高分子化合物，其在生物医学领域主要用作蛋白质、多肽、核酸、多糖等生物大分子的首选化学修饰剂。因此Tf的主动靶向性与PEG作为药物载体的优良性能结合，可能成为新的具有肿瘤靶向作用的治疗药物载体。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物。本发明的进一步目的在于提供上述药物分子复合物在肿瘤靶向治疗中的用途。
本发明以Tf为靶向头基，PEG为间隙基团与抗肿瘤药物结合制成药物分子复合物。
本发明所制成的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，一方面具有PEG化药物的优点，即可提高药物的稳定性，延长药物的血浆半衰期，通过被动靶向作用增加药物在肿瘤组织中的摄取量；另一方面利用转铁蛋白的主动靶向肿瘤细胞的作用，即可循细胞膜上TfR途径选择性地蓄积于过度表达TfR的肿瘤细胞内，释放药物后，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤组织生长，同时又不损伤正常组织。实验结果表明：Tf-PEG-药物分子复合物具有竞争TfR的特征和肿瘤组织靶向性，其进入血液循环系统后，与过度表达TfR的肿瘤细胞结合，所携带药物主动靶向肿瘤组织，与原药和PEG化药物相比，在肿瘤组织中的分布显著提高，抗肿瘤作用显著增强，毒副作用显著降低。
本发明所涉及的Tf-PEG-药物分子复合物包括不同分子量的PEG衍生物，结构为G-PEG-G’，其中聚乙二醇末端一个羟基被氨基、巯基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)衍生化，再与抗肿瘤药物共价结合。另一端羟基被马来酸亚胺基(MAL)、氨基(t-Boc-NH)或乙烯磺酸基(VS)等功能性基团(G)取代后再与Tf共价结合而成的分子复合物。
上述抗肿瘤药物是具有可与PEG衍生物一端氨基、巯基、醛基、磺酸基或羧基共价结合的带有羧基、氨基或巯基的抗肿瘤药物或带有羧基、氨基或巯基的蛋白质多肽类抗肿瘤药物。所述的带有羧基、氨基或巯基的蛋白质多肽类抗肿瘤药物选自肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核糖核酸酶(RNase)、干扰素类(IFN)或白介素类(IL)。
本发明采用如下技术方案实现本发明和达到上述发明目的。
1、制备Tf-PEG-药物分子复合物
本发明合成的Tf-PEG-药物分子复合物，其通式如下
X-PEG-Y
其中，X为转铁蛋白或其它可循细胞膜上转铁蛋白受体途径进入细胞的物质；PEG为具有-(OCH2CH2O)n-重复结构的聚乙二醇及其衍生物；Y为抗肿瘤药物。
所述的转铁蛋白或其它可循细胞膜上转铁蛋白受体途径进入细胞的物质，其对动物或人体细胞无毒副作用，它们包括：转铁蛋白家族(血清转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳铁蛋白、黑色素转铁蛋白等)以及抗转铁蛋白受体抗体(抗血清、体外杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体、基因工程抗体)。
上述聚乙二醇及其衍生物，平均分子量为3000～20,000，其特征在于所述的聚乙二醇末端一个羟基被氨基、巯基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)衍生化，再与抗肿瘤药物共价结合，另一端羟基被马来酸亚胺基(MAL)、氨基(t-Boc-NH)或乙烯磺酸基(VS)等功能性基团取代后再与转铁蛋白共价结合。
所述的抗肿瘤药物是具有可与PEG衍生物一端氨基、巯基、醛基、羧基或磺酸基共价结合的带有羧基、氨基或巯基的蛋白质多肽类抗肿瘤药物。
(1)制备聚乙二醇-药物化合物
取G-PEG-G’与药物，投料比为5∶1～60∶1，加入pH7～9的磷酸盐、HEPES或Tris-HCl等缓冲液溶解，反应温度4～25℃，缓慢搅拌15～120分钟，加入3-10倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应，即得G-PEG-药物化合物。
所得G-PEG-药物化合物经凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱或疏水作用色谱等分离技术得纯化的G-PEG-药物化合物。
所述G为MAL-、t-Boc-NH-或VS-等功能性基团。
所述G’为PEG一端羟基被氨基、巯基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)衍生化。
所述药物为肿瘤坏死因子-α、核糖核酸酶、干扰素或白介素的其中一种。
(2)制备Tf衍生物
①取无铁人血清转铁蛋白，加巯基化反应缓冲液溶解，加入1～10倍摩尔量的巯基化试剂，室温，氩气下，反应1～3h。反应产物经凝胶脱盐柱或透析袋，去除小分子未反应的巯基化试剂，超滤管离心浓缩，即得Tf-SH溶液。
所述巯基化反应缓冲液为pH8～9，15～30mM的HEPES和/或含1mM的EDTA的缓冲液，通入氩气脱气，密闭保存。
所述巯基化试剂为2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯、甲基-4-巯基丁酰亚胺、S-乙酰疏基琥珀酸酐等其中之一。
②取无铁人血清转铁蛋白与高碘酸钠，摩尔比为1∶5，加pH4～6的醋酸钠缓冲液溶解，冰浴、暗处反应60～120min，过凝胶过滤色谱柱(Sephadex G25PD10)纯化，即得Tf-CHO。
上述所制备的Tf衍生物，对Tf的生物学功能影响极小，不干扰Tf与细胞膜上的TfR特异结合活性。
(3)制备Tf-PEG-药物分子复合物
①取纯化G-PEG-药物化合物与Tf-SH，按PEG/-SH的摩尔比为1∶1～1∶3，在pH6.5～7.5的HEPES缓冲液中，氩气下，4～25℃反应24～48小时，即得Tf-PEG-药物分子复合物。
所述G为MAL-或VS-基团
②取纯化G-PEG-药物化合物，加适量三氟乙酸，反应10～60分钟，超滤2～3次后，得NH2-PEG-药物化合物，加Tf-CHO，按PEG/-CHO的摩尔比为1∶1～1∶3，在pH5～10反应缓冲液中，4～25℃下，反应1～10小时后，最后加入10～30倍摩尔量的氰基硼氢化钠，继续反应24～36小时，即得Tf-PEG-药物分子复合物。
上述G为t-Boc-NH-基团。
上述所制得Tf-PEG-药物分子复合物经凝胶过滤色谱分离得纯化的Tf-PEG-药物分子复合物。
所得Tf-PEG-药物分子复合物，加入200mM，pH7.5～8.0的柠檬酸-碳酸氢钠缓冲液，超滤浓缩1～2次，按Tf与Fe3+的摩尔比为1∶5的比例，加入Fe3+试剂，反应30～60分钟，使分子复合物中的每摩尔Tf与2摩尔的三价铁离子结合。
上述Fe3+试剂为：FeCl3溶于200mM，pH7.5～8.0的柠檬酸-碳酸氢钠缓冲液中，使Fe3+浓度为10mM。
本发明Tf-PEG-药物分子复合物可采用药剂学上允许的赋形剂、pH调节剂、渗透压调节剂等辅料配伍，按照药学领域的常规或用特定的生产方法制备成相应药物组合制剂。
所述药物组合制剂包括：肿瘤内和静脉注射的Tf-PEG-药物分子复合物的水针剂和冻干粉针剂。
2、Tf-PEG-药物分子复合物与细胞表面转铁蛋白受体结合特异性和亲和能力检测
采用放射性配体结合分析法，测定竞争抑制125I-Tf与肿瘤细胞膜表面转铁蛋白受体结合程度，了解Tf-PEG-药物分子复合物对肿瘤细胞膜表面转铁蛋白受体的特异性亲和能力。
3、Tf-PEG-药物分子复合物在正常和模型动物体内的行为
采用放射性同位素示踪法，检测不同时相内Tf-PEG-药物分子复合物在正常大鼠及荷瘤小鼠的正常组织和肿瘤组织中的分布，了解其被动物正常组织和肿瘤组织摄取情况以及药物动力学参数和对肿瘤组织的靶向性。
4、Tf-PEG-药物分子复合物在模型动物体内药效学检测
采用S-180荷瘤小鼠，分别尾静脉注射Tf-PEG-药物分子复合物、生理盐水、原药和PEG化药物后，不同时间下测量肿瘤体积大小，计算肿瘤抑制率，与原药和PEG化药物比较，评价Tf-PEG-药物分子复合物的抗肿瘤效果。
本发明所涉及的实验方法属本领域已知方法，实验所采用的试剂为市购。
经上述实验结果证实，本发明既具有PEG化药物的优点，又具有Tf的主动靶向肿瘤细胞的特点：Tf-PEG-药物分子复合物可循细胞膜上转铁蛋白受体途径选择性地蓄积于过度表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞；与药物和PEG-药物化合物相比，Tf-PEG-药物分子复合物血浆清除速度显著延长，肿瘤组织的摄取量显著提高；在肿瘤组织的分布量显著大于其它正常组织；抗肿瘤效果显著增强。此分子复合物具有主动靶向和被动靶向肿瘤细胞的双重功能，可产生高效、安全的抗肿瘤疗效。
附图说明
图1显示：A、125I-Tf(Fe)2和125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α与B、K562细胞特异性结合曲线和Scatchard图。
图2显示：与Tf和PEG-TNF-α对比，Tf-PEG-TNF-α分子复合物竞争抑制125I-Tf与K562细胞结合的竞争曲线。
图3显示：尾静脉注射后，TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α分子复合物在正常大鼠体内药动学曲线。
图4显示：尾静脉注射2h后，TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α分子复合物在S-180荷瘤小鼠中的组织分布图。
图5显示：尾静脉注射后，TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α分子复合物抑制S-180荷瘤小鼠肿瘤生长曲线。
具体实施方式
以下借助非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1 制备Tf-PEG-肿瘤坏死因子-α分子复合物(I)
取20nmol肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和100nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱(POROS 20HS，直径4.6mm，柱床体积1.66mL)，BioCAD工作站，紫外检测器(波长280nm)进行分离纯化，收集MAL-PEG-TNF-α组分。分别测定MAL-PEG-TNF-α组分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩尔比为1∶1.9，收率(与参加反应的TNF-α量对照)为18.90％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12
取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.2，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-TNF-α。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-TNF-α组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分别测定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α为0.8/1.9/1，收率为38.6％。
实施例2 制备Tf-PEG-肿瘤坏死因子-α分子复合物(II)
取20nmol TNF-α和400nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱(POROS 20HS，直径4.6mm，柱床体积1.66mL)，BioCAD工作站，紫外检测器(波长280nm)进行分离纯化，收集MAL-PEG-TNF-α组分。分别测定MAL-PEG-TNF-α组分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩尔比为1∶2.6，收率(与参加反应的TNF-α量对照)为50.44％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.2，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-TNF-α。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-TNF-α组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分别测定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α为0.9/2.6/1，收率为40.1％。
实施例3 制备Tf-PEG-肿瘤坏死因子-α分子复合物(III)
取20nmol TNF-α和800nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱(POROS 20HS，直径4.6mm，柱床体积1.66mL)，BioCAD工作站，紫外检测器(波长280nm)进行分离纯化，收集MAL-PEG-TNF-α组分。分别测定MAL-PEG-TNF-α组分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩尔比为1∶3.7，收率(与参加反应的TNF-α量对照)为60.81％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12
取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.2，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-TNF-α。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200 HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-TNF-α组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分别测定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α为0.9/3.7/1，收率为42.3％。
实施例4 制备Tf-PEG-肿瘤坏死因子-α分子复合物(IV)
取20nmol TNF-α和1200nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.0)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱(POROS 20HS，直径4.6mm，柱床体积1.66mL)，BioCAD工作站，紫外检测器(波长280nm)进行分离纯化，收集MAL-PEG-TNF-α组分。分别测定MAL-PEG-TNF-α组分中TNF-α和PEG的含量，得TNF-α和PEG的摩尔比为1∶4.8，收率(与参加反应的TNF-α量对照)为85.70％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12
取Tf-SH和Mal-PEG-TNF-α，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.2，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-TNF-α。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-TNF-α组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-TNF-α。分别测定Tf(Fe)2-PEG-TNF-α组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/TNF-α为1.1/4.8/1，收率为52.7％。
实施例5 制备Tf-PEG-干扰素-γ分子复合物(I)
取0.3nmol干扰素-γ(IFN-γ)和1.5nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。将反应混合物上样于凝胶过滤色谱柱(HiPrep 16/60，Sephacryl S-200HR，柱床体积120mL)，以流速为0.3mL/min，20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)进行洗脱，自动部分收集器以1.5mL/管收集，测定每管280nm处的吸收值，以洗脱体积对吸收值绘制洗脱曲线，按照分子量标准曲线求得MAL-PEG-IFN-γ组分峰浓度处分子量，从而计算得每个IFN-γ分子连接了2.1个PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ组分，超滤浓缩后，计算收率(与参加反应的IFN-γ量对照)为9.60％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.1，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200 HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-IFN-γ组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分别测定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ为0.7/2.1/1，收率为39.5％。
实施例6 制备Tf-PEG-干扰素-γ分子复合物(II)
取0.3nmol IFN-γ和3nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。将反应混合物上样于凝胶过滤色谱柱(HiPrep16/60，Sephacryl S-200HR，柱床体积120mL)，以流速为0.3mL/min，20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)进行洗脱，自动部分收集器以1.5mL/管收集，测定每管280nm处的吸收值，以洗脱体积对吸收值绘制洗脱曲线，按照分子量标准曲线求得MAL-PEG-IFN-γ组分峰浓度处分子量，从而计算得每个IFN-γ分子连接了4.1个PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ组分，超滤浓缩后，计算收率(与参加反应的IFN-γ量对照)为21.2％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.1，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-IFN-γ组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分别测定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ为1.0/4.1/1，收率为42.6％。
实施例7 制备Tf-PEG-干扰素-γ分子复合物(III)
取0.3nmol IFN-γ和6nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。将反应混合物上样于凝胶过滤色谱柱(HiPrep16/60，Sephacryl S-200HR，柱床体积120mL)，以流速为0.3mL/min，20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)进行洗脱，自动部分收集器以1.5mL/管收集，测定每管280nm处的吸收值，以洗脱体积对吸收值绘制洗脱曲线，按照分子量标准曲线求得MAL-PEG-IFN-γ组分峰浓度处分子量，从而计算得每个IFN-γ分子连接了6.8个PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ组分，超滤浓缩后，计算收率(与参加反应的IFN-γ量对照)为32.6％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.1，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60 Sephacryl S-200HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-IFN-γ组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分别测定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ为1.2/6.8/1，收率为49.3％。
实施例8 制备Tf-PEG-干扰素-γ分子复合物(III)
取0.3nmol IFN-γ和9nmol MAL-PEG-NHS(平均分子量5000)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.5)中，4℃下，反应1小时，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。将反应混合物上样于凝胶过滤色谱柱(HiPrep16/60，Sephacryl S-200HR，柱床体积120mL)，以流速为0.3mL/min，20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)进行洗脱，自动部分收集器以1.5mL/管收集，测定每管280nm处的吸收值，以洗脱体积对吸收值绘制洗脱曲线，按照分子量标准曲线求得MAL-PEG-IFN-γ组分峰浓度处分子量，从而计算得每个IFN-γ分子连接了7.9个PEG分子。收集MAL-PEG-IFN-γ组分，超滤浓缩后，计算收率(与参加反应的IFN-γ量对照)为51.6％。
取0.5μmol Tf于1mL的30mM HEPES缓冲液中(含1mM的EDTA，pH8.5)溶解，加入4μmol巯基化试剂2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，室温，氩气下，反应3h。反应产物过凝胶脱盐柱(Hitrap desalting)，去除小分子未反应巯基化试剂，超滤离心浓缩后，即得Tf-SH溶液，其中Tf/-SH的平均摩尔比为1∶3.03±0.12。
取Tf-SH和Mal-PEG-IFN-γ，按PEG/-SH摩尔比为1∶1.1，在20mM的HEPES缓冲液(pH7.1，含0.15M的NaCl)中，4℃，氩气下反应24小时，即得Tf-PEG-IFN-γ。凝胶过滤色谱法(HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-IFN-γ组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ。分别测定Tf(Fe)2-PEG-IFN-γ组分中PEG和Tf含量，得Tf/PEG/IFN-γ为1.5/7.9/1，收率为55.8％。
实施例9 制备TF-PEG-核糖核酸酶分子复合物(I)
取0.3nmol核糖核酸酶(RNase)和1.5nmol t-BOC-NH-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.5)中，室温下，反应0.5小时，加15μL三氟乙酸，反应30分钟，超滤2次后，得NH2-PEG-RNase。将反应混合物上样于凝胶过滤色谱柱(HiPrep 16/60，Sephacryl S-200HR，柱床体积120mL)，以流速为0.3mL/min，10mM的HEPES缓冲液(pH7.3，含0.15M的NaCl)进行洗脱，自动部分收集器以1.5mL/管收集，测定每管280nm处的吸收值，以洗脱体积对吸收值绘制洗脱曲线，按照分子量标准曲线求得NH2-PEG-RNase组分峰浓度处分子量，从而计算得每个RNase分子连接了2.2个PEG分子。收集NH2-PEG-RNase组分，超滤浓缩后，计算收率(与参加反应的RNase量对照)为10.7％。
取无铁人血清转铁蛋白与高碘酸钠，摩尔比为1∶5，加pH5的醋酸钠缓冲液1mL溶解，冰浴、暗处反应90分钟，反应产物过凝胶过滤色谱柱(Sephadex G25PD10)，以10mM的HEPES缓冲液(pH7.3，含0.15M的NaCl)进行洗脱，即得Tf糖链上的羟基被氧化成醛基的纯化的Tf-CHO。
氧化的Tf，按PEG/-CHO的摩尔比为1∶1，立即加到纯化的NH2-PEG-RNase溶液中，在pH7.3的HEPES缓冲液中，室温下，反应2小时，加入20倍摩尔量的氰基硼氢化钠，继续反应24小时，即得Tf-PEG-RNase。凝胶过滤色谱法(HiPrep16/60Sephacryl S-200HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-RNase组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-RNase。分别测定Tf(Fe)2-PEG-RNase组分中PEG和Tf含量超滤浓缩，得Tf/PEG/RNase为0.9/2.2/1，收率为41.8％。
实施例10 制备TF-PEG-核糖核酸酶分子复合物(II)
取0.3μnmol RNase和6μnmol t-BOC-NH-PEG-NHS(平均分子量3400)，在1mL的HEPES缓冲液(15mM，pH8.5)中，室温下，反应0.5小时，加60μL三氟乙酸，反应30分钟，超滤2次后，得NH2-PEG-RNase。将反应混合物上样于凝胶过滤色谱柱(HiPrep 16/60，Sephacryl S-200HR，柱床体积120mL)，以流速为0.3mL/min，10mM的HEPES缓冲液(pH7.3，含0.15M的NaCl)进行洗脱，自动部分收集器以1.5mL/管收集，测定每管280nm处的吸收值，以洗脱体积对吸收值绘制洗脱曲线，按照分子量标准曲线求得NH2-PEG-RNase组分峰浓度处分子量，从而计算得每个RNase分子连接了6.1个PEG分子。收集NH2-PEG-RNase组分，超滤浓缩后，计算收率(与参加反应的RNase量对照)为30.2％。
取无铁人血清转铁蛋白与高碘酸钠，摩尔比为1∶5，加pH5的醋酸钠缓冲液1mL溶解，冰浴、暗处反应90分钟，反应产物过凝胶过滤色谱柱(Sephadex G25PD10)，以10mM的HEPES缓冲液(pH7.3，含0.15M的NaCl)进行洗脱，即得Tf糖链上的羟基被氧化成醛基的纯化的Tf-CHO。
氧化的Tf，按PEG/-CHO的摩尔比为1∶1，立即加到纯化的NH2-PEG-RNase溶液中，在pH7.3的HEPES缓冲液中，室温下，反应2小时，加入20倍摩尔量的氰基硼氢化钠，继续反应24小时，即得Tf-PEG-RNase。凝胶过滤色谱法(HiPrep16/60Sephacryl S-200HR)，分离纯化。收集Tf-PEG-RNase组分，与Fe3+结合后，得橙红色的每摩尔Tf结合2摩尔的三价铁离子的Tf(Fe)2-PEG-RNase。分别测定Tf(Fe)2-PEG-RNase组分中PEG和Tf含量得Tf/PEG/RNase为1.4/6.1/1，收率为54.1％。
实施例11 Tf-PEG-TNF-α分子复合物(IV)与细胞表面转铁蛋白受体结合特性的评价
1.125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α与K562和KB细胞表面受体特异结合试验
K562和KB细胞用含10％(V/V)新生牛血清的RPMI1640培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)连续培养。将处于对数生长期的细胞用含1％BSA的RPMI1640培养液洗涤1次，分别取约含7.5×105个K562或1×106个KB细胞悬液0.4mL于牛血清白蛋白饱和的反应测试管内，加入0.1mL不同浓度的125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α(以Tf摩尔量计)或不同浓度的125I-Tf(Fe)2，4℃下孵育120min后，4℃、4000rpm离心10min，弃去上清液，并用4℃生理缓冲液洗涤两次，γ计数器测量沉淀放射性计数(cpm)，并进行衰变校正。各水平样品均采用3复管，设有总结合管和非特异性结合管。以特异结合125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2对加入125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2总量作图，得125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2与上述细胞的结合饱和曲线。用Graphpad Prism 4.0软件，按Scatchard模型求出125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α或125I-Tf(Fe)2与上述细胞结合的解离常数Kd和最大结合位点数n，Kd值越小，表明配体与细胞表面受体结合的亲和力越高；n值越大，表明配体与受体结合的数量越多。结果表明，125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α能与富含TfR的K562和KB细胞特异结合，其Kd和n值接近于Tf，可以认为125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α与TfR结合具有特异性和亲和性特征。表1是125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α和125I-Tf(Fe)2与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体特异结合参数
表1
| 细胞类型 | 实验组 | n(×104/个细胞) | Kd(nmol/L) |
| K562 | 125I-Tf(Fe)2 125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α | 17.18±0.6514.74±1.05 | 8.88±0.539.25±0.40 |
| KB | 125I-Tf(Fe)2 125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α | 13.46±0.6111.07±1.00 | 9.64±1.2610.53±2.2 |
2.125I-Tf(Fe)2-PEG-TNF-α对K562转铁蛋白受体的竞争结合试验
取对数生长期的K562细胞悬液0.4mL(约7.5×105个细胞)于反应测试管中，加入0.1mL的125I-Tf(Fe)2(反应体系中终浓度3.1nmol/L)和0.05mL不同浓度非标记竞争剂(Tf(Fe)2-PEG-TNF-α、MAL-PEG-TNF-α或Tf(Fe)2)，补足体积至1mL，在4℃条件下孵育120min后，按结合动力学试验中描述的方法测量各个水平沉淀物放射性计数。以特异结合占最大结合百分数(B/B0)对不同竞争剂浓度作图，得Tf(Fe)2-PEG-TNF-α、MAL-PEG-TNF-α或Tf(Fe)2竞争抑制K562细胞与125I-Tf结合的曲线。结果表明：Tf(Fe)2-PEG-TNF-α和Tf(Fe)2竞争抑制125I-Tf(Fe)2与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体结合的特征相似，两者抑制肿瘤细胞结合125I-Tf(Fe)250％时的浓度分别为5.4和3.1nM；而随着MAL-PEG-TNF-α浓度增大并不能降低Tf特异结合占最大结合百分数(B/B0)，说明MAL-PEG-TNF-α不能与Tf竞争K562细胞表面的TfR，即MAL-PEG-TNF-α对肿瘤细胞无特异亲和能力。三种竞争剂与125I-Tf(Fe)2竞争TfR结合的抑制曲线见附图2。
实施例12 Tf-PEG-TNF-α分子复合物(IV)的动物体内行为试验
1.Tf-PEG-TNF-α在正常大鼠体内药动学行为
取于温度25±2℃，相对湿度75±5％和自然光条件下，饲养一周的SD雄性大鼠，随机分成3组，每组5只，于无菌条件下，用注射用生理盐水分别配置125I标记的TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α(1μg/mL)注射液，大鼠尾静脉注射2.5mL，剂量为2.5μg/200g体重或20μCi/200g体重。给药后，分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48小时，眼眶取血0.5mL，置肝素钠抗凝的离心管中，4000rpm下，离心10分钟。精密吸取血浆200μL，置反应测试管中，加入10％三氯醋酸1mL，旋涡1分钟，6000rpm下，离心5分钟，吸去上清夜，将剩下的沉淀进行cpm测定。用3P87软件处理数据，计算药动学参数。结果表明，Tf-PEG-TNF-α的血浆半衰期分别为TNF-α和PEG-TNF-α的3.7和1.3倍；平均滞留时间分别为TNF-α和PEG-TNF-α的4.7和1.3倍；AUC0→∞分别为TNF-α和PEG-TNF-α的7.5和1.6倍。表2是TNF-α，PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α在正常大鼠体内血浆药动学参数。
表2
| 实验组 | 血浆半衰期(h) | 平均滞留时间(h) | AUC0→∞(×103h·cpm/μl) |
| TNF-αPEG-TNF-αTf-PEG-TNF-α | 5.10±0.7714.35±1.6418.64±3.56 | 4.72±0.6517.74±1.9722.41±4.62 | 1.82±0.228.69±0.5413.74±2.33 |
2.Tf-PEG-TNF-α在荷瘤小鼠体内组织分布
取于温度25±2℃，相对湿度75±5％和自然光条件下，饲养42±2日龄，体重18±1g的昆明种雌性小鼠，置超净台上，取生长良好的7-11天的S180瘤种，将瘤组织制成1～2×107/ml细胞悬液，小鼠右侧腋部皮下接种0.2ml/只。7天后将小鼠随机分组，每组5只。将无菌条件下配制的125I标记的TNF-α、PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α生理盐水注射液，尾静脉注射0.4μg/只或5μCi/只，给药后分别于第0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48小时，每种样品在每个时间点各取一组小鼠，眼眶取血后，颈椎脱臼处死。取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤等器官与组织，用滤纸将表面吸干，称重，测定各器官与组织的cpm数。结果表明，Tf-PEG-TNF-α在肿瘤组织中的半衰期分别是TNF-α和PEG-TNF-α的8.4和2.1倍；达峰浓度分别是TNF-α和PEG-TNF-α的3.5和1.8倍；Tf-PEG-TNF-α在肿瘤组织中的分布量分别为心、肝、脾、肺和肾的2.0、4.3、4.0、1.8、3.3倍，分别为TNF-α和PEG-TNF-α的9.7和2.3倍。表3是TNF-α，PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α在荷瘤小鼠肿瘤组织中的药动学参数。
表3
| 实验组 | 半衰期(h) | 达峰时间(h) | 达峰浓度(cpm/mg) | 平均滞留时间AUC0·∞ e | |
| (h) | (×103h·cpm/mg) | ||||
| TNF-αPEG-TNF-αTf-PEG-TNF-α | 6.18±2.4624.43±4.2851.98±11.43 | 0.50±0.310.9±0.222.0±1.22 | 255.02±23.62499.42±31.01888.27±88.85 | 6.99±1.5219.48±3.9730.42±6.23 | 1.49±0.286.36±2.5114.51±4.73 |
实施例13 Tf-PEG-TNF-α分子复合物(IV)在模型动物体内抗肿瘤作用评价
接种S-180肿瘤细胞24小时的昆明种雌性小鼠，随机分组，每组10只。分别尾静脉注射TNF-α，PEG-TNF-α和Tf-PEG-TNF-α注射液，0.67μg/只，两天一次，共8次。剩下2组小鼠，尾静脉注射生理盐水，0.3mL/只，两天一次，共8次，作为阴性对照组。于接种后第7、9、11、13、15和17天测量瘤体积，计算第17天的肿瘤抑制率
结果表明，Tf-PEG-TNF-α的肿瘤抑制率分别为TNF-α和PEG-TNF-α的5.3和1.8倍。
Claims (17)
1、一种转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于其具有以下通式：
X-PEG-Y
其中，X为转铁蛋白或其它可循细胞膜上转铁蛋白受体途径进入细胞的物质；PEG为具有-(OCH2CH2O)n-重复结构的聚乙二醇及其衍生物；Y为抗肿瘤药物。
2、按权利要求1所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的转铁蛋白或其它可循细胞膜上转铁蛋白受体途径进入细胞的物质是转铁蛋白家族，包括：血清转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳铁蛋白和黑色素转铁蛋白，或抗转铁蛋白受体抗体，包括抗血清、体外杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体和基因工程抗体。
3、按权利要求1所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的聚乙二醇是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量为3000～20,000。
4、按权利要求1所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的抗肿瘤药物是具有可与PEG衍生物一端氨基、巯基、醛基、磺酸基或羧基共价结合的带有羧基、氨基、巯基的抗肿瘤药物或带有羧基、氨基或巯基的蛋白质多肽类抗肿瘤药物。
5、按权利要求4所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的所述的带有羧基、氨基或巯基的蛋白质多肽类抗肿瘤药物选自肿瘤坏死因子-α、核糖核酸酶、干扰素类或白介素类。
6、按权利要求1或3所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的聚乙二醇末端一个羟基被氨基、巯基、醛基、磺酸基或羧基取代，或被N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生化后再与抗肿瘤药物的羧基、氨基或巯基共价结合，另一端羟基被马来酸亚胺基团、氨基或乙烯磺酸基功能性基团取代后再与转铁蛋白共价结合。
7、按权利要求1述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的转铁蛋白是具有可与PEG一端马来酸亚胺基团、氨基或乙烯磺酸基共价结合的带有巯基、醛基、氨基或羧基的转铁蛋白或转铁蛋白衍生物。
8、按权利要求3所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量为3000～10,000。
9、按权利要求3所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量为3400。
10、按权利要求3所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇的平均分子量为5000。
11、按权利要求3所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的聚乙二醇末端一个羟基被N-羟基琥珀酰亚胺酯取代后再与抗肿瘤药物的氨基共价结合，另一端羟基被马来酸亚胺基团取代后再与转铁蛋白衍生物共价结合。
12、按权利要求7所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的转铁蛋白衍生物是巯基化转铁蛋白。
13、按权利要求1或3所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的聚乙二醇末端一个羟基被N-羟基琥珀酰亚胺酯取代后再与抗肿瘤药物的氨基共价结合，另一端羟基被氨基取代后再与转铁蛋白共价结合
14、按权利要求12所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物，其特征在于所述的转铁蛋白衍生物是转铁蛋白糖链上的羟基被氧化成醛基的转铁蛋白。
15、权利要求1的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物在制备肿瘤靶向治疗药物中的用途。
16、一种用于肿瘤靶向治疗的药物组合，其特征在于由权利要求1所述的转铁蛋白-聚乙二醇-药物分子复合物和药用辅料混合制成，其制剂为水针剂和/或冻干粉针剂。
17、按权利要求16所述的用于肿瘤靶向治疗的药物组合，其特征在于所述药物辅料是药剂学上允许的赋形剂、pH调节剂和渗透压调节剂。
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2006
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