JP4593048B2 - 分岐型ポリアルキレングリコール類 - Google Patents

分岐型ポリアルキレングリコール類 Download PDF

Info

Publication number
JP4593048B2
JP4593048B2 JP2001548589A JP2001548589A JP4593048B2 JP 4593048 B2 JP4593048 B2 JP 4593048B2 JP 2001548589 A JP2001548589 A JP 2001548589A JP 2001548589 A JP2001548589 A JP 2001548589A JP 4593048 B2 JP4593048 B2 JP 4593048B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
group
mmol
added
substituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2001548589A
Other languages
English (en)
Inventor
基生 山▲崎▼
敏行 須澤
達也 村上
紀子 櫻井
錦也 山下
真由美 向井
隆 ▲桑▼原
聡 太田
一郎 三木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of JP4593048B2 publication Critical patent/JP4593048B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Description

技術分野
本発明は、生理活性を有するポリペプチド（生理活性ポリペプチド）の修飾剤として有用な分岐型構造を有するポリアルキレングリコール類および該ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドに関する。さらに、該ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドを含有する医薬に関する。
背景技術
生理活性ポリペプチドは特定の疾病に対する治療剤として有用であるが、血中に投与されると安定性が悪く、十分な薬理効果が期待できない場合が多い。例えば、分子量６０，０００程度以下のポリペプチドは血中に投与されても腎臓の糸球体より濾過され、大部分が尿中に排泄されるため、治療剤として用いたとしても大きな治療効果が得られず、繰り返しの投与が必要になる場合が多い。また、他のポリペプチドは血中に存在する加水分解酵素等によって分解され、生理活性を失うことがある。さらに、外因性の生理活性ポリペプチドにおいてもその生理活性が疾患の治療に有効なことがあるが、そのような外因性のポリペプチドや遺伝子組換えによって製造されたポリペプチド等は内因性のポリペプチドと構造が異なるため、血中に投与された場合には免疫反応を誘発し、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用を起こす場合があることが知られている。さらに、生理活性ポリペプチドによってはそれが治療剤として用いられる際に、溶解性が悪い等の物性が問題になることも多い。
生理活性ポリペプチドを治療剤として用いる際のこれらの問題を解決する方法の一つとして、１分子以上の不活性型ポリマー鎖をポリペプチドに化学的に結合させる方法が知られている。多くの場合、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類を該ポリペプチドに化学的に結合させることによって、該ポリペプチドや蛋白質に望ましい特性が付与されている。例えば、ポリエチレングリコールで修飾されたスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）では血中の半減期が著しく延長され、作用の持続性が見出されている［ファーマシューティカル リサーチ コミュニケーション（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９巻、２８７頁（１９８７年）］。また、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のポリエチレングリコール修飾も知られている［ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１５巻、８１４頁（１９９４年）］。その他にもアスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ウリカーゼ等のポリエチレングリコール修飾ポリペプチドの例がＧｉｌｌｉａｎ Ｅ．Ｆｒａｎｃｉｓらによってまとめられている［ファーマシューティカル バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３巻、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｒｔ Ｂ、２３５頁（１９９２年）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。また、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで修飾することによって得られる効果としては、熱安定性が高まること［生物物理、３８巻、２０８頁（１９９８年）］、有機溶媒に可溶となること［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．：ＢＢＲＣ）、１２２巻、８４５頁（１９８４年）］等も知られている。
一方、ペプチドや蛋白質とポリアルキレングリコールとの結合方法についても、例えばポリアルキレングリコールの末端にカルボン酸の活性エステル、マレイミド基、カーボネート、塩化シアヌル、ホルミル基、オキシラニル基等を導入してポリペプチドのアミノ基やチオール基に結合する方法が知られている［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］。これらの技術の中には、ポリペプチド中の特定のアミノ酸残基に特異的にポリエチレングリコールを結合し、該ペプチドまたは蛋白質の生理活性を損なわずに血中安定性を向上させた例も含まれる。ポリペプチド中の特定のアミノ酸残基特異的なポリエチレングリコール修飾の例としては、成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）のカルボキシ末端にノルロイシンのスペーサーを介してポリエチレングリコールを結合した例［ジャーナル オブ ペプチド リサーチ（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．）、４９巻、５２７頁（１９９７年）］、インターロイキン−２の３位に遺伝子組換えによってシステインを導入し、この部位に特異的にポリエチレングリコールを結合した例［バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、８巻、３４３頁（１９９０年）］等が知られている。
前記ポリアルキレングリコール修飾ポリペプチドの多くは、直鎖型ポリアルキレングリコールを結合させる方法により得られるが、高活性の化学修飾ポリペプチドを得る方法として、分岐型ポリエチレングリコールを結合させる方法が優れていることが見出されている。一般的に、ポリアルキレングリコールの分子量が大きいほど、あるいは修飾率が高いほど血中の持続性は向上することが知られているが［ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２６３巻、１５０６４頁（１９８８年）］、修飾率を高くするとポリペプチドの生理活性が損なわれることがある。これは、生理活性に必要なポリペプチド中の特定のアミノ基やチオール基等が化学修飾剤によって修飾されることが一つの原因である。修飾率に応じて生理活性が低下する例としては、インターロイキン−１５が知られている［ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７２巻、２３１２頁（１９９７年）］。一方、分子量の大きいポリアルキレングリコール類では、分子量分布が均一かつ純度の高いものを合成することが困難である。例えば、モノメトキシポリエチレングリコールの場合、不純物としてジオール成分の混入が知られている。そこで、現在利用できる分子量分布が狭くて高純度のポリアルキレングリコール類をスペーサーを介して分岐させることによって分子量の大きい修飾剤を製造しようとする試みが行われている。これによって、修飾率を低減しても持続性を保持したまま高い生理活性を有する化学修飾ポリペプチドが得られる。また、ポリアルキレングリコール類を分岐させることで生理活性ポリペプチド分子のより多くの表面をポリアルキレングリコールで覆うことができると考えられている。例えば、分岐構造を有する基に塩化シアヌルを利用した２本鎖型のポリエチレングリコール誘導体が知られている（特開平３−７２４６９、特開平３−９５２００）。この場合、平均分子量５，０００のメトキシポリエチレングリコールが利用されているが、この化合物ではトリアジン環由来の毒性が懸念される。また、特開平１−１５３０８８にはポリエチレングリコールと無水マレイン酸の共重合体である櫛形ポリエチレングリコールからは直鎖型ポリエチレングリコールと比較して低い修飾率で高活性の化学修飾ポリペプチドが得られることが開示されているが、この化合物ではポリペプチドとの反応サイトが多数存在し、かつ分子量分布が均一ではない。また、桂皮酸を原料に用いベンゼン環を介してポリエチレングリコールを分岐させた例（特開平３−８８８２２）も知られている。前述したトリアジン環やベンゼン環を介した分岐型ポリアルキレングリコールの場合、分岐点の構造が平面であるためポリアルキレングリコール鎖の空間的運動が束縛され、分子サイズの増大効果には不利であると考えられる。他の例としてリジンを分岐点としてポリエチレングリコールを２本分岐させた化合物（ＷＯ９６／２１４６９、ＵＳ５，６４３，５７５）等が知られているが、本発明の環状構造で分岐した化合物は知られていない。また、前述の従来型の分岐型ポリアルキレングリコール類は、ポリアルキレングリコール類を２分子以上結合することで分子量の増大を達成したものであるが、分岐型ポリアルキレングリコール類で生理活性ポリペプチドを修飾した場合、同じ分子量の直鎖型ポリアルキレングリコール類で修飾した場合に比較してより分子サイズを増大できるという性質は知られていない。
以上のような従来型ポリアルキレングリコール類の問題点を克服した、毒性が低く、安定性が改善され、分子サイズの増大効果に優れた修飾剤としての分岐型ポリアルキレングリコール類が求められている。
近年、インターフェロンβ製剤が、多発性硬化症の治療薬として注目されている［ザ ランセット（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ）、３５２巻、７号、１４９１頁（１９９８年）等］。多発性硬化症は原因不明の脱髄性自己免疫疾患であり、中枢神経白質の血管周囲の細胞浸潤とそれに引き続いて起こる髄鞘破壊を特徴とする。その発生機序は不明であるが、免疫担当細胞による中枢神経の軸索を覆うミエリン鞘の破壊が脱髄班を生じさせる結果、神経伝導障害が起こり、多様な神経機能の異常が発現すると考えられている。欧米ではインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）が、多発性硬化症の治療薬の主流となっているが、現在臨床で用いられているＩＦＮ−β１ｂ製剤は１日おきの皮下注射が必要である等の問題があり、活性が上昇し、かつ投与回数が少なくても有効な治療薬が要望されている。また、インターフェロン類は多発性硬化症に限らず、Ｃ型肝炎やＢ型肝炎等のウイルス性肝炎、白血病、リンパ腫、骨髄腫、骨肉腫、乳癌、腎癌、脳腫瘍等の各種癌の治療、ウイルス性あるいは炎症性皮膚疾患、眼疾患に有効であるほか［薬局、４１号、６巻、７６９頁（１９９０年）］、血管新生が関与する疾患の治療薬となる可能性が示唆されている［組織培養、２２号、７巻、２７８頁（１９９６年）］。これらの疾患でも同様に、投与量ならびに投与回数が少なく、持続性の高い有効な治療薬が要望されている。
発明の開示
本発明の目的は、第一に生理活性ポリペプチドの化学修飾剤である従来型の分岐型ポリアルキレングリコール類の欠点を克服し、分子サイズを増大させる効果に優れた分岐型ポリアルキレングリコール類を提供することにある。第二には、該分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ペプチドを提供することにある。
本発明者らは生理活性ポリペプチドを修飾するための新規構造を有する分岐型ポリアルキレングリコール修飾試剤について鋭意検討した。その結果、シクロアルカン等の立体的または運動性のある環状構造を有する化合物を用いてポリアルキレングリコール類を分岐させることで、分子量の増大効果および安定性に優れた修飾試剤が得られることを見出した。また生理活性ポリペプチドを上記分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾したところ、活性が向上することも見いだした。さらに、生理活性ポリペプチドを上記分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾したところ、修飾生理活性ポリペプチドにおいては、該生理活性を保持したまま、腎臓の糸球体での濾過が抑制されて、血中持続性が大幅に向上することを見出した。
以上のように、前記分岐型ポリアルキレングリコール類が化学修飾剤として優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は平面構造以外の環状構造を含有する基に２本の１本鎖ポリアルキレングリコール類が結合し、かつポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類、生理活性ポリペプチドまたはその誘導体の該ポリアルキレングリコール修飾体、および該ポリアルキレングリコール修飾体を含有する医薬あるいは治療剤を提供するものである。中でも平面構造以外の環状構造を含有する基が、式（ＩＩ）
［式中、Ｒ１０は（ＣＨ２）ｕ（式中、ｕは１〜１０の整数を表す）またはＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｕａ（式中、ｕａは０〜８の整数を表す）を表し、
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同一または異なって、水素原子、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミルを表し、
ＷはＯ、Ｓ、ＣＨ２またはＮＲ１４（式中、Ｒ１４は水素原子または低級アルキルを表す）を表す］で表される基から水素原子を３〜５個除いた基であるのが好ましい。上記の中で、さらに式（ＩＩ）において、ＷがＣＨ２であり、かつｕが４である場合が好ましい。また、別の観点からは、本発明は、生理活性ポリペプチドまたはその誘導体が少なくとも１個の上記ポリアルキレングリコール類で直接もしくはスペーサーを介して修飾された化学修飾ポリペプチド、および該化学修飾ポリペプチドを含有する医薬あるいは治療剤に関する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
平面構造以外の環状構造を含有する基としては、平面構造以外の環状構造を含有する基であればいかなる基も包含されるが、好ましくは平面構造以外の環状構造を含有する３分岐以上が可能な基、さらに好ましくは平面構造以外の環状構造を含有する３〜５分岐が可能な基があげられる。
平面構造以外の環状構造を含有する基に結合する１本鎖ポリアルキレングリコール類としては、平面構造以外の環状構造を含有する基に結合が可能な１本鎖ポリアルキレングリコール類であればいかなるものも包含されるが、好ましくはＲ１−Ｍｎ−Ｘ１（式中、Ｍ、ｎ、Ｒ１およびＸ１は下記と同義である）があげられる。
ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基、および該反応性を有する基に変換可能な基としては、ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基、あるいは該反応性を有する基に変換可能な基であればいかなるものも包含される。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類として好ましくは、式（Ｉ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）ｑ （Ｉ）｛式中、Ｌは平面構造以外の環状構造を含有する３〜５分岐が可能な基を表し、ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、
ｎは任意の正の整数を表し、
ｑは１〜３の整数を表し、
Ｒ１は水素原子、低級アルキルまたは低級アルカノイルを表し、
Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表し、
Ｘ１は結合、Ｏ、Ｓ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは１〜８の整数を表す）、（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記ｔａと同義である）、ＮＲ３（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキルを表す）、Ｒ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５［式中、Ｒ４は結合、アルキレンまたはＯ（ＣＨ２）ｔｃ（式中、ｔｃは前記ｔａと同義である）を表し、Ｒ５は結合、アルキレンまたはＯＲ５ａ（式中、Ｒ５ａは結合またはアルキレンを表す）を表す］、Ｒ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７［式中、Ｒ６は結合、アルキレンまたはＲ６ａＯ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ５ａと同義である）を表し、Ｒ７は結合、アルキレンまたは（ＣＨ２）ｔｄＯ（式中、ｔｄは前記ｔａと同義である）を表す］、Ｒ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記Ｒ５ａと同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記Ｒ５ａと同義である）を表し、
Ｘ２は結合、Ｏまたは（ＣＨ２）ｔｅＯ（式中、ｔｅは前記ｔａと同義である）を表し、
Ｘ３は結合またはアルキレンを表し、２つのＲ１−Ｍｎ−Ｘ１および１つ〜３つのＸ２−Ｘ３−Ｒ２はそれぞれ同一でも異なっていてもよい｝で表される化合物［以下、化合物（Ｉ）と称する。他の式番号の化合物についても同様とする］があげられる。
式（Ｉ）の各基の定義において、低級アルキルおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分は、直鎖状または分岐状の炭素数１〜８の、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を包含する。アルキレンは、炭素数１〜８の、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン等を包含する。
式（Ｉ）において、ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓはそれぞれ前記と同義である）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記と同義である）である場合、ｒおよびｓ並びにｒａおよびｓａは、好ましくは１〜１００，０００であり、さらに好ましくは１〜１，０００である。
式（Ｉ）において、ｎは任意の正の整数を表し、好ましくは１０〜１００，０００であり、さらに好ましくは１００〜１，０００である。
Ｍｎで表されるポリアルキレングリコール部分の平均分子量は、約１，０００〜１，０００，０００が好ましく、５，０００〜１００，０００がさらに好ましい。Ｍｎが−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−である場合、原料となるポリエチレングリコール類はＭｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）で表される分子量分布が１．１以下の単分散のものが望ましく、平均分子量３０，０００以下であれば市販のものを用いることができる。例えば、平均分子量が２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００等のモノメトキシポリエチレングリコールが利用できる。
本発明において開示される、平面構造以外の環状構造を含有する基に２本の１本鎖ポリアルキレングリコール類が結合し、かつポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類、式（Ｉ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００であることが望ましい。
式（Ｉ）において、ｑは１〜３の整数を表し、好ましくは１である。
式（Ｉ）において、Ｌは平面構造以外の環状構造を含有する３〜５分岐が可能な基であり、環状構造上の置換基として、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミル等を有していてもよい。ここで、低級アルキルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、置換低級アルキルにおける置換基としては、水酸基、アミノ、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイル、低級アルキルカルバモイルオキシ等があげられる。低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイルおよび低級アルキルカルバモイルオキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。Ｌとしては、例えば、シクロヘキサン類、シクロヘキセン類、単糖類等から水素原子３〜５個除いた基があげられる。上記シクロヘキサン類、シクロヘキセン類、単糖類の具体例としては、シクロヘキサントリカルボン酸、シクロヘキサントリオール、１，３，５−トリメチル−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Ｋｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ）、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジアミノシクロヘキサン、２，４，１０−トリオキサアダマンタン、イノシトール、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄ，Ｌ−ソルビトール、リボース、エリスリトール等およびそれらの立体異性体があげられる。Ｌとして好ましくは、式（ＩＩ）
（式中、Ｒ１０は前記と同義であり、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ前記と同義であり、Ｗは前記と同義である）で表される化合物から水素原子を３〜５個除いた基があげられる。
式（ＩＩ）において、ＷがＣＨ２であり、かつｕが４である場合が好ましい。
ここで、低級アルキルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、置換低級アルキルにおける置換基は、前記置換低級アルキルの置換基と同義である。
Ｌ部分の構造の構築は市販品の化合物をそのまま利用するか、一般の有機合成法によってポリアルキレングリコール類の結合に適した形に誘導体化して利用するか、あるいは官能基の保護を行った後に利用して行うことができる［日本化学会編、実験化学講座 第４版（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン ワイリー アンド サンズ インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］。
上記で例示した以外のシクロヘキサン類は、例えば木檜ら［大有機化学、第６巻、１８３頁（１９５８年）、朝倉書店］またはＧ．Ｅ．ＭｃＣａｓｌａｎｄとＥ．Ｃｌｉｄｅ Ｈｏｒｓｗｉｌｌ［ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、７６巻、２３７３頁（１９５４年）］の方法等に従って合成することができる。
また、例えば、ベンゼン環を有する化合物をＳ．ＩｓｏｄａとＨ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉの方法［ケミカル アンド ファーマシューティカル ブルチン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）、２８（８）巻、２３３７頁（１９８０年）］、Ｋ．ＰｒａｓａｄとＯ．Ｒｅｐｉｃの方法［テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２５（２３）巻、２４３５頁（１９８４年）］等で平面構造以外の環状構造を有する３〜５分岐が可能な化合物に変換してＬ部分の構造の構築を行うこともできる。
化合物（Ｉ）において、Ｘ１を介したポリアルキレングリコール類とＬとの結合は通常の有機合成法で知られている反応を容易に組み合わせて行うことができる［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９−２３頁（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善］。
式（Ｉ）において、Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表す。
すなわち、上記反応性を有する基としては、ポリペプチド中の、リジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン等の各側鎖、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基のいずれかと反応性を有する基が包含され、例えば水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィド、アジド等があげられる。
上記の各基の定義において、低級アルコキシカルボニルオキシ、ハロゲン化低級アルキル、低級アルカノイルオキシおよび低級アルカノイルオキシカルボニルの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アリールオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルオキシおよびアリールジスルフィドのアリール部分としては、炭素数６〜１４の、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル等があげられる。アロイルオキシカルボニルのアロイル部分としては、炭素数７〜１３の、例えばベンゾイル、ナフトイル、フタロイル等があげられる。ハロゲン化カルボニルおよびハロゲン化低級アルキルのハロゲン部分としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。
置換低級アルコキシカルボニルオキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば、水酸基、カルボキシ、ハロゲン等があげられる。ここで、ハロゲンは、前記と同義である。
置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば水酸基、カルボキシ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル等があげられる。ここで、ハロゲンおよび低級アルキルは、それぞれ前記と同義である。
Ｒ２で表される基は、Ｌ部分の構造を構築する原料に含まれていてもよいし、該原料化合物中の必要な官能基をあらかじめ適当な保護基［ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９１年）等］で保護し、Ｘ１を介してポリアルキレングリコール類をＬに結合して分岐させた後に脱保護、さらには必要により変換して形成してもよい。さらにポリアルキレングリコール類をＸ１を介してＬから分岐させた後に、通常の有機合成法によってＬに必要によりＸ２またはＸ３を介して前記Ｒ２を導入することもできる。
より具体的には、例えば以下の製造法で本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類を製造することができる。なお、本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類の製造法は、これらに限定されるものではない。
製造法１：Ｘ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ、または（ＣＨ２）ｔｂＯである化合物の製造
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは前記と同義である）、または（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記と同義である）である化合物（Ｉａ）は、例えば以下の方法により製造することができる。
水酸基を２個所以上有する環状ポリオール類（以下、本明細書において環状ポリオール類というときは、環状構造上の置換基として水酸基以外に、ヒドロキシ低級アルキル等を有する化合物も包含する）を、無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、ポリアルキレングリコールまたはそのモノアルキルエーテルもしくはモノカルボン酸エステル（以下、これらをまとめてポリアルキレングリコール類Ａという）のハロゲン化物もしくはトシル化物を１〜３モル相当加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて、２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物が得られる。
環状ポリオール類はシクロヘキサントリオール、キナ酸、シキミ酸、グルコース、ソルビトール、リボース、エリスリトール等の市販の化合物、または市販の化合物から導かれる化合物から選ばれる。市販の化合物から導かれる化合物としては、例えば、シクロヘキサントリカルボン酸やＫｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ等から選ばれる環状ポリカルボン酸を通常の有機合成法［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９〜２１巻（１９９２年）、丸善］に従って適当な還元剤で還元することによって得られる環状ポリオール類があげられる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
環状ポリオール類中の水酸基の配置は何れでもよく、反応に不必要な官能基をＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９１年）等に記載の方法によって適当に保護、あるいは誘導体化してから、反応に使用することができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物はＳａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙの総括［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に開示された各種の方法で容易に製造することができる。結合に使用するポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物としては分子量分布が均一であれば（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）いかなる平均分子量のものも用いられる。
得られた２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物はそのままの純度、あるいはイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で任意の純度の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類に精製、単離して、次のステップに用いることができる。ここまでの工程で、化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）のいくつかが得られる。
一方、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類とポリアルキレングリコール類Ａを使用することによっても目的の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を調製することができる。この場合、１〜３モル相当のポリアルキレングリコール類ＡをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１モル相当の環状ポリハライド類または環状ポリトシル類を加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて目的物が得られる。
環状ポリハライド類は市販の化合物であるか、前記環状ポリオール類をハロゲン化合物に変換［日本化学会編、実験化学講座、第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］して得られる。環状ポリトシル類は環状ポリオール類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、カリウムナフタレン等の適当な塩基の存在下、水酸基当たり１〜３モル相当のハロゲン化トシルを加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させることで得ることができる。
次に、得られた２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物または精製化合物に、Ｒ２を導入する。Ｒ２としては、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に結合した後、環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に残存している官能基をそのまま利用するか、あるいはあらかじめ環状ポリオール類に結合している官能基を保護しておき、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合後、官能基の保護基を除去して得られる基を利用してもよい。この場合、前記環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類中の１個所以上の水酸基、または他の官能基を適当な保護基で保護した後、前記と同様の方法で残りの水酸基、ハロゲンまたはトシル基部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を導入し、２本のポリアルキレングリコールが結合した化合物を合成し、保護基を除去した官能基をそのまま利用するか、あるいは該官能基の少なくとも一つを後述する方法に従ってＲ２に変換する。ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合する前、もしくは結合した後に環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類に存在する官能基としては、水酸基の他に、カルボキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、ホルミル、カルボニル等がある。適当な官能基の保護基としては水酸基の場合、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリル、ジフェニルｔｅｒｔ−ブチルシリル、トリメチルシリル、トリフェニルシリル、トシル、テトラヒドロピラニル等があげられ、アミノの場合、メチル、エチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｎ−フタルイミド、アセチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等があげられ、カルボキシの場合、ベンジル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、９−フルオレニルメチル、メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、シンナモイル、アリル、ニトロフェニル等があげられ、ホルミルの場合、ジメチルアセタール、ジエチルアセタール、ジベンジルアセタール、１，３−ジオキサニル等があげられる［ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９１年）］。
あらかじめ存在する官能基をそのまま、または保護、脱保護してＲ２として利用でき、Ｌ部分の構造を構築する原料となる環状ポリオール類、環状ポリハライド類または環状ポリトシル類の具体例としては、シキミ酸、キナ酸、Ｋｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ等があげられる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｌを含む化合物に新たに置換基Ｒ２を導入して得られる化合物の場合、例えば以下の製造方法で容易に製造を行うことができる。
製造法１−１
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がカルボキシである式（Ｉａａ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−ＣＯＯＨ）ｑ （Ｉａａ）（式中、Ｘ１ａは結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ、または（ＣＨ２）ｔｂＯを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がカルバモイルである式（Ｉａｂ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−ＣＯＮＨ２）ｑ （Ｉａｂ）（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がシアノである式（Ｉａｃ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−ＣＮ）ｑ （Ｉａｃ）（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は例えば以下のように合成することができる。
化合物（Ｉａａ）、化合物（Ｉａｂ）および化合物（Ｉａｃ）は、環状ポリオール類を用いて、例えば製造法１に従って得られる化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２として水酸基を有する化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を水、塩化メチレン、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中、触媒量または１〜２０％の塩基存在下、１〜３０モル相当のアクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル等と、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させて得ることができる。塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等があげられる。
また、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モル相当のα−ハロゲン化酢酸エステルと、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させた後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、γ−アミノ酪酸、グリシン、β−アラニン等のアミノ酸またはその誘導体と反応させることによっても得られる。
また、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を前記同様の塩基存在下、無水コハク酸、無水グルタル酸等の酸無水物と反応させることによっても化合物（Ｉａａ）を製造することができる。
また、化合物（Ｉａａ）は、例えば環状ポリハライド類を用いて製造法１に従って、化合物（Ｉａ）のうちＲ２がハロゲン化低級アルキルである化合物（Ｉａｉ）を製造した後、ヒドロキシカルボン酸エステル、マロン酸エステル、γ−アミノ酪酸のエステル体、β−アラニンのエステル体、グリシンのエステル体等をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、化合物（Ｉａｉ）を加え、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応を行った後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば前記環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類の一個所以上の水酸基またはハロゲンを、あらかじめカルボン酸あるいはカルボン酸の保護体を含む残基で置換し、これを用いて製造法１で示した方法で環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類の残りの２個所の水酸基またはハロゲンをポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物で置換することで得ることもできる。この場合、カルボン酸またはカルボン酸の保護体を含む残基の導入は、前記と同様にして行うことができる。カルボン酸を保護した場合には、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリオール類もしくは環状ポリハライド類に導入した後に脱保護して遊離カルボン酸を生成させる。
カルボン酸に変換された化合物は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で、任意の純度で精製、単離することができる。
製造法１−２
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がアミノである式（Ｉａｄ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−ＮＨ２）ｑ （Ｉａｄ）（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１−１で得られる化合物（Ｉａｃ）に適当な還元剤を作用させて得られる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物に５当量〜過剰量のエチレンジアミン、プロピレンジアミン等のジアミン類を適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
さらに、製造法１−１で示したのと同様に、化合物（Ｉａｄ）は、例えば化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、１当量〜過剰量のエチレンジアミンやプロピレンジアミン等のジアミン類と適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のアミノまたはアミノの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がマレイミドである式（Ｉａｅ）
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＯｓｋａｒ Ｋｅｌｌｅｒらの方法［ヘルベチカ キミカ アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、５８巻、５３１頁（１９７５年）］またはＴｉｍｏｔｈｙ Ｐ．Ｋｏｇａｎらの方法［シンセティック コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎ．）、２２巻、２４１７頁（１９９２年）］に従い、化合物（Ｉａｄ）とＮ−アルコキシカルボニルマレイミドとを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させることで得ることができる。Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミドとしてはＮ−エトキシカルボニルマレイミドやＮ−メトキシカルボニルマレイミドを用いることができる。
また、化合物（Ｉａｅ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のマレイミドを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｄ）、化合物（Ｉａｅ）およびそれらの合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−３
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がホルミルである式（Ｉａｆ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）ｑ （Ｉａｆ）（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａ）のうちＲ２としてヒドロキシメチルを有する化合物（Ｉａｇ）を適当な酸化剤で酸化することで得られる。酸化剤としては塩化クロム酸ピリジニウム、クロム酸、銀イオン、ジメチルスルホキシド等があげられる。また、化合物（Ｉａａ）を前記と同様に適当な還元剤で還元することによっても得ることができる。
また、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）、化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物にアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール、ハロゲン化エチルアセタール、ハロゲン化メチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
同様にして、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を用い、製造法１−１で示した方法に準じて水酸基を活性化し、続いてアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
また、化合物（Ｉａｆ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のアルデヒド、あるいはアルデヒドの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法でも得られる。
化合物（Ｉａｆ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−４
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化カルボニルである式（Ｉａｈ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ１）ｑ （Ｉａｈ）（式中、Ｚ１はハロゲンを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２がカルボキシである化合物（Ｉａａ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。
ハロゲン化カルボニルにおけるハロゲンは前記ハロゲンと同義である。
製造法１−５
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化低級アルキルである式（Ｉａｉ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｚ２）ｑ （Ｉａｉ）（式中、Ｚ２はハロゲン化低級アルキルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化低級アルキルにおけるハロゲンおよび低級アルキル部分はそれぞれ前記と同義である。
また、化合物（Ｉａｉ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）またはＲ２がアミノである化合物（Ｉａｄ）に、前記同様適当な塩基存在下、５当量〜過剰量のジブロモエタンやジブロモプロパン等のジハロゲン化アルキル類を反応させることによっても得られる。
さらに、化合物（Ｉａｉ）は、例えば前記製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上のハロゲン化低級アルキルを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｉ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−６
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソシアナートである式（Ｉａｋ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）ｑ （Ｉａｋ）（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば、化合物（Ｉａｄ）をトルエン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、ホスゲンまたは塩化オキサリルと０〜１５０℃で１〜２４時間反応させるか、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応させた後に室温で分解させて得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソチオシアナートである化合物（Ｉａｐ）はホスゲンの代わりにチオホスゲンを用いる以外は上記の方法に従って製造することができる。
製造法１−７
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルである式（Ｉａｌ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２ａ）ｑ （Ｉａｌ）
（式中、Ｒ２ａはスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、通常のエステル合成方法に従って製造することができる。例えば、化合物（Ｉａａ）１モルに対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、置換もしくは非置換のヒドロキシアリール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシフタルイミド１〜１０モルを、１〜１０モルのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤存在下、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中、−２０〜１００℃で１〜２４時間反応させることによって目的物を得ることができる。より詳しくは、Ａ．Ｆｒａｄｅｔら［ポリマー ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、４巻、２０５頁（１９８１年）］、またはＫ．Ｇｅｃｋｅｌｅｒら［ポリマー ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、１巻、６９１頁（１９７９年）］によるポリアルキレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法、カルボキシメチルポリアルキレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造方法等に準じて得ることができる。
ここで、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルは前記と同義である。アリールは前記と同義であり、置換アリールの置換基は、置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基と同義である。
製造法１−８
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がビニルスルホニルである式（Ｉａｍ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２）ｑ
（Ｉａｍ）
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば化合物（Ｉａｊ）を用いてＭａｒｇｈｅｒｉｔａ Ｍｏｒｐｕｒｇｏらの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、７巻、３６３頁（１９９６年）］で製造することができる。
製造法１−９
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである式（Ｉａｎ）
（Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１ａ）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２ｂ）ｑ （Ｉａｎ）
（式中、Ｒ２ｂは置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＴａｌｉａ ＭｉｒｏｎとＭｅｉｒ Ｗｉｌｃｈｅｋの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に準じて、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）と過剰量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、エチルクロロホルメート等とをジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等の塩基存在下で反応させることで得られる。
また、化合物（Ｉａｎ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用する環状ポリオール類等の化合物に１個所以上の置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を２個所置換させる方法で得ることもできる。
化合物（Ｉａｎ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法で任意の純度のものとして単離、精製することができる。
ここで、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシはそれぞれ前記と同義である。製造法２：Ｘ１がＳである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＳである化合物（Ｉｂ）は、例えば製造法１と同様に、環状ポリオール類を環状ポリハライド類に変換した化合物［日本化学会編、実験化学講座 第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］または市販の環状ポリハライド類と、ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
また、化合物（Ｉｂ）は、前記の工程とは逆に、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物を環状ポリチオール類と反応させることによっても得ることができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体は市販のものを用いるが、Ｓａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってまとめられた方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］で調製できる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法２−１
化合物（Ｉｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、Ｘ１が−Ｓ−である化合物を製造法２に従って製造した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法３：Ｘ１がＮＲ３である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＮＲ３（式中、Ｒ３は前記と同義である）である化合物（Ｉｃ）は、例えば製造法１と同様に、環状ポリオール類を環状ポリアミン類に変換した化合物または市販の環状ポリアミン類と、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
化合物（Ｉｃ）は、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を環状ポリハライド類と反応させることによっても得ることができる。
また、化合物（Ｉｃ）は環状ポリアルデヒド類１当量と、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体１〜１０当量とをメタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、水、緩衝液等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、−２０〜１００℃で１〜１００当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下で反応させることによっても得ることができる。
さらに、化合物（Ｉｃ）は、環状ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体を用いても製造することができる。
前記環状ポリアルデヒド類としては市販の化合物をそのまま用いるが、環状ポリアルコール類を酸化して用いるか、あるいは環状ポリカルボン酸類を還元して用いればよい。また、ポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体としては市販の化合物を利用できるし、また、ポリアルキレングリコール類Ａの末端のアルコールを酸化して用いることもできる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法３−１
化合物（Ｉｃ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｃ）を製造法３に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて製造することができる。
製造法４：Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５またはＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄａ）は、例えばシクロヘキサントリカルボン酸やＫｅｍｐ’ｓ ｔｒｉａｃｉｄ等から選ばれる環状ポリカルボン酸化合物をペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］に従い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中に溶解または懸濁し、次いで１〜３０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール等のアルコール体と、１〜３０当量のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩等の縮合剤を加え、さらに１〜３当量のポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を加えて反応させることによって得ることができる。反応は無水条件下、−２０℃〜１００℃で、１時間〜１０日間攪拌することによって行われる。
また、環状ポリカルボン酸分子中の１個以上のカルボキシをメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル等の適当な保護基で保護した後、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を残りの２個のカルボキシに前記の方法で導入し、続いてカルボキシの保護基を通常の脱保護法で除去することによって、Ｒ２がカルボキシである２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体を高純度に含む反応液を得ることもできる。この場合、カルボン酸の保護基の導入や該保護基の除去には通常のペプチドの合成法で用いられる方法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］を利用できる。環状ポリカルボン酸類中のカルボキシの配置は、立体配置を含めて何れでもよく、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体としては分子量分布が均一（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）であればいかなる平均分子量のものを用いてもよい。
また、化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄｂ）は、前記工程とは逆に、環状ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体の活性エステル、あるいはポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体とを反応させる方法でも得ることができる。ポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体はポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で、１〜２４時間加熱することによって得ることができる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法４−１
化合物（Ｉｄａ）および化合物（Ｉｄｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｄａ）または化合物（Ｉｄｂ）を製造法４に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法５：Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−ＯまたはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記と同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記と同義である）である化合物（Ｉｅ）は、例えばポリアルキレングリコール類Ａと環状ポリカルボン酸類、あるいはポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体と環状ポリオール類の組合わせを用いて、脱水縮合により得ることができる。脱水縮合の方法としては通常のエステル合成で用いられるような、酸または塩基触媒下に脱水する方法か、あるいはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ピリジン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤で対応するアルコール体とカルボン酸を縮合する方法等を利用することができる。さらに、上記工程において酸ハロゲン化物と、対応するアルコール体を反応させることによっても目的物を合成できる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法５−１
化合物（Ｉｅ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｅ）を製造法５に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法６：Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨまたはＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（式中、Ｒ６ａは前記と同義である）である化合物（Ｉｆａ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
市販の環状ポリアミン類、または前記製造法を組み合わせて環状ポリオール類より調製した環状ポリアミン類にポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体を１〜３モル過剰に反応させて、化合物（Ｉｆａ）を含む粗生成物が得られる。なお、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体は、ＴａｌｉａＭｉｒｏｎらの方法［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に従って製造することができる。また、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、イミダゾリルカルボニルオキシ誘導体等を利用することができる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ４は前記と同義である）である化合物（Ｉｆｂ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
化合物（Ｉｆｂ）は環状ポリオール類のカーボネート誘導体とポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体とを上記と同様に反応させることによって得ることができる。
他の製造法に準じて官能基の保護、脱保護を組み合わせることによって、化合物（Ｉｆａ）または化合物（Ｉｆｂ）を選択的に生成させることもできる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法６−１
化合物（Ｉｆ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｆ）を製造法６に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて調製することができる。
Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して１本鎖化合物を取得し、同様の反応で前記と同一または異なるＲ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して、２本鎖の化合物を取得することもできる。例えば、製造法１〜６に示した方法のうちいずれかの反応を利用してＬ中の１個所の官能基にポリアルキレングリコール類を結合させ、１本鎖化合物を得る。生成する１本鎖化合物の割合は、反応に使用するポリアルキレングリコール類と、Ｌ部分の構造を構築する原料の比を変えることで調節することができ、１本鎖化合物を主成分にすることも可能である。得られた１本鎖化合物はそのままの純度で、あるいは製造法１に示した方法に準じて任意の純度に、あるいは高純度に精製して次のステップに使用することができる。
このようにして得られた１本鎖化合物と、前記と同一または異なるポリアルキレングリコール類を製造法１〜６に示したいずれかの方法に準じて結合して、２本鎖化合物が調製できる。なお、２本目のポリアルキレングリコール類は１本鎖化合物を取得した反応と同様の反応に付すこともできるが、異なる反応に付し異なる結合様式を有するように調製してもよい。例えば、水酸基、アミノ、カルボキシ等の複数の官能基を有する化合物をＬ部分の構造を構築する原料に使用する場合、製造法１に示した方法でＸ１がＯである１本鎖化合物をまず取得し、次いで製造法４に示した方法で２本目のポリアルキレングリコール類をＸ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５となるように反応させることができる。以上のように製造法１〜６の組合わせで２つのポリアルキレングリコール類が同一または異なる結合様式でＬに結合した２本鎖化合物を得ることができる。さらに、使用するポリアルキレングリコール類は１本目と２本目の分子量が異なっていてもよく、各々のポリアルキレングリコール類をＬに結合させる反応で異なる平均分子量のポリアルキレングリコール類を使用することで容易に目的物が得られる。
また、Ｌにポリアルキレングリコール類を導入する反応において、Ｌ中の１個所以上の官能基（例えば製造法１の場合、１個所以上の水酸基）を残し、他の官能基を適当な保護基で保護してから、ポリアルキレングリコール類と反応、結合させ、その後、保護基を除去することも可能である。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類は、上記製造法で具体的に示された化合物以外であっても、上記製造法に準じて得ることができる。
なお、先にも述べたとおり、製造法１〜６の各工程において、原料に用いるポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるが、Ｓａｍｕｅｌ Ｚａｌｉｐｓｋｙ［バイオコンジュゲート ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］によってまとめられた各種の方法等によって容易に製造することも可能である。
得られた分岐型ポリアルキレングリコール類はシリカゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、再結晶、抽出等の方法によって、任意の純度の分岐型ポリアルキレングリコール類に精製することができる。
得られた分岐型ポリアルキレングリコール類は前記生理活性ポリペプチドのアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基に直接、あるいはスペーサーを介して結合させることができる。
スペーサーとしてはアミノ酸やペプチドが好ましいが、ポリアルキレングリコール類を結合することができればそれ以外であってもよい。アミノ酸としてはリジン、システイン等の天然アミノ酸等を用いることができ、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ホモシステイン等を用いることもできる。より好ましくは、システインがあげられる。ペプチドとしては、アミノ酸残基２〜１０からなるものが好ましい。アミノ酸、ペプチド以外のスペーサーとしては、グリセロール、エチレングリコール、糖等があげあれれる。ここで、糖としては、グルコース、ガラクトース、ソルボース、ガラクトサミン、ラクトース等の単糖類や二糖類等があげられる。
これらのスペーサーは、生理活性ポリペプチド分子中のリジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等の残基の側鎖とアミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等を介して結合するか、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基とアミド結合やエステル結合するかペプチドのＮ末端アミノ基とアミド結合する。これらの結合は、通常のペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］や遺伝子組換法を用いて行うことができる。
この場合、生理活性ポリペプチドを合成するのと同時にＣ末端カルボキシル基にスペーサーとなるアミノ酸、ペプチド等を導入することが望ましいが、生理活性ポリペプチドを合成した後にスペーサーを結合してもよい。また、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基等を化学合成的に活性化してスペーサーに結合することもできる。また、ポリアルキレングリコール類を予め結合したスペーサーを前記の方法で生理活性ポリペプチドに結合することもできる。
本発明で用いられる生理活性ポリペプチドとしては、ポリペプチド、抗体、およびそれらの誘導体等があげられる。ポリペプチドとしては、例えば、アスパラギナーゼ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、グルタミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）、ウリカーゼ（Ｕｒｉｃａｓｅ）、スーパーオキサイドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｉｎ）、ストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、プラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ）、アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、プラスミノーゲン活性化因子類（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、プラスミノーゲン（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）等の酵素、インターロイキン１〜１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１〜１８）、インターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）、インターフェロン−β（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、インターフェロン−ω（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ω）、インターフェロン−τ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−τ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、血小板増加因子（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）、繊維芽細胞増殖因子１〜１８（Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１〜１８）、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、オステオジェニックプロテイン１（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、形質転換成長因子類（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）等のサイトカイン、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、パラサイロイドホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、グルカゴン様ペプチド類（Ｇｌｕｃａｇｏｌ Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）等のホルモン、クローソ蛋白質（Ｋｌｏｔｈｏ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アンジオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｅ）、アミリン（Ａｍｙｌｉｎ）、インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）等があげられる。
本発明で使用される抗体は、公知の手段［アンティボディーズ ア ラボラトリー マニュアル、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８年）］を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
本発明で使用される抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片等があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体等があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であればいかなるものも用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のＣＤＲのアミノ酸配列をヒトの抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の適切な位置に移植した抗体を意味する。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片、相補性決定領域を含むペプチド等があげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖとも称す）は、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬとしては、本発明のモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも称す）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［プロテイン エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、７巻、６９７頁（１９９４年）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のジスルフィド安定化抗体に含まれるＶＨあるいはＶＬとしてはモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
生理活性ポリペプチドの誘導体としては、アミノ酸置換体、アミノ酸欠失体、糖鎖付加体、糖鎖欠失体、部分ペプチド等があげられる。
上記の生理活性ポリペプチドとしては、酵素、サイトカイン、ホルモン等が好ましい。より好ましくはインターフェロン−β、インターフェロン−α、インターフェロン−γ等のインターフェロン類、顆粒球コロニー刺激因子、スーパーオキサイドディスムターゼ等があげられる。それらの化学修飾ポリペプチドも好ましい。
上記の生理活性ポリペプチドを化学修飾した化学修飾ポリペプチドとしては、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドが好ましく、この化学修飾ポリペプチドを含有する医薬も好ましい。また、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドを含有する医薬としては、インターフェロン類を化学修飾した化学修飾ポリペプチドを含有する多発性硬化症治療薬、肝炎治療薬、血管新生が関与する疾患の治療薬、悪性腫瘍治療薬、眼疾患治療薬、皮膚疾患治療薬等があげられるが、好ましいのは多発性硬化症治療薬である。
これらの生理活性ポリペプチドは動物臓器や組織から抽出する方法でも得られるが、通常のペプチド合成法、あるいは遺伝子組換え法で製造することによっても得ることができる。さらに、市販のポリペプチドも用いることができる。
また、反応に使用する該ポリペプチドとしては粗精製物を用いることができ、またゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、抽出等の精製法により化学修飾に適した純度に精製したものを用いることもできる。
該ポリペプチドはリン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液もしくは水、またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の適当な有機溶媒中、あるいはこれらの有機溶媒と水溶液との混合溶媒中で製造され、化学修飾反応に用いられる。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類は、ポリペプチド、さらに詳細にはそして好ましくは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、インターフェロン、インターロイキン等の遊離システイン残基を有するあらゆる天然型または遺伝子組換え型のポリペプチドの共有結合による部位特異的修飾にも使用することができる。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドの製造は、分岐型ポリアルキレングリコール類を生理活性ポリペプチド１モルあたり１〜１０００モル程度、好ましくは１〜５０モル程度用いて反応させることによって行われる。分岐型ポリアルキレングリコール類の生理活性ポリペプチドへの修飾の度合いは生理活性ポリペプチドに対する分岐型ポリアルキレングリコール類のモル比、反応温度、ｐＨ、反応時間等を調節することによって、任意に選択することができる。また、反応に使用する溶媒は反応を妨害しないものであればいずれでもよく、例えばリン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン等、あらゆるものから選択することができる。反応の温度、ｐＨおよび時間は生理活性ポリペプチドの活性が損なわれない条件であればいずれでもよく、例えば０〜５０℃、１０分〜１００時間、ｐＨ４〜１０が好ましい。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドの精製は常法に従って、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過等により行うことができる。合成または精製された生理活性ポリペプチドまたは分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾された該生理活性ポリペプチドが該ポリペプチドの構造を有するものであることの確認は、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびアミノ酸分析計によるアミノ酸組成分析により、また気相プロテインシーケンサーによりエドマン分解して得られたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相ＨＰＬＣで分析することによるアミノ酸配列分析等により行うことができる。
本発明の化学修飾ポリペプチドは人間または動物用の薬剤組成物の形態で投与することができ、該組成物は通常の薬剤製造法によって製造することができる。 投与方法としては経口、静脈内、皮下、筋肉下、腹腔内、経皮投与または他の許容される方法等が可能であり、投与に適する組成物を用いることができる。これらの剤形には通常用いられる等張化剤、緩衝剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、酸化防止剤等の慣用の添加剤を添加して用いることができる。
化合物（Ｉ）の具体例を第１表に示す。
以下に、生理活性ポリペプチドおよび化学修飾ポリペプチドの活性について説明する。
試験例１ 化学修飾インターフェロン−βの抗ウイルス活性
実施例１１〜実施例１５および実施例３３で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−βおよび化学修飾天然型ｈＩＦＮ−β、未修飾ｒｈＩＦＮ−β、ならびに未修飾天然型ｈＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を下記のニュートラルレッド（ＮＲ）取り込み法で調べた。
＜ＮＲ取り込み法＞
小長谷らの方法［蛋白質核酸酵素（別冊）、３５５頁（１９８１年）］を参考に抗ウイルス活性を測定した。
すなわち、滅菌したトランスファープレートに５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加イーグルＭＥＭ培地を添加した。次に、ＩＦＮ国内標準品［α（ミドリ十字）およびβ（東レ）］溶液を各々５０μｌずつウェルに分注し、２倍ずつの段階希釈を行った。一方、所定の濃度に培地で調製した化学修飾ＩＦＮまたは未修飾ＩＦＮ溶液も同様に５０μｌずつウェルに分注した。これらの溶液を、所定の細胞数のヒト羊膜由来の株化細胞（ＦＬ細胞）を入れた９６穴プレートにトランスし、数秒間攪拌した。３７℃で一昼夜、ＣＯ２インキュベーターで培養し、抗ウイルス状態を作った。
次に、培養液を除去した後、ウイルス溶液を添加し、３７℃で２日間、ＣＯ２インキュベーターで培養してウイルスを感染させた。ＩＦＮにより細胞の抗ウイルス状態が変化し、細胞変性が起こった。続いて、培養液を除去し、ＮＲ溶液を添加した。３７℃で１時間、ＣＯ２インキュベーターに放置し、ＮＲ溶液を除去した。等張りん酸緩衝液でウェルを洗浄し、抽出液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸−３０％エタノール）を添加し、２〜３分間攪拌した。
ＮＲにより生き残った細胞を染色し、抽出後、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、定量曲線をプロットした。定量曲線より算出した未修飾ＩＦＮの活性を１００％としたときの化学修飾ＩＦＮの相対活性を算出した。
各ＩＦＮ−βの比活性を第２表、第３表および第４表に示す。
本件の化学修飾ｒｈＩＦＮ−βはいずれも抗ウイルス活性を保持していることが確認された。
試験例２ 化学修飾インターフェロン−αの抗ウイルス活性
実施例１６および実施例１７で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−α、および未修飾ｒｈＩＦＮ−αの抗ウイルス活性を試験例１に示したＮＲ取り込み法で調べた。
各ＩＦＮ−αを濃度１μｇ／ｍｌで作用させたときの活性を第５表に示す（未修飾ＩＦＮ−αの活性を１００％として表示した）。
化学修飾ｒｈＩＦＮ−αはいずれも抗ウイルス活性を保持していることが確認された。
試験例３ 化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
実施例２０〜実施例２３、実施例２５および実施例２６の化合物、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体および未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦのマウス白血病細胞ＮＦＳ６０［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、６６８７頁（１９８５年）］に対する増殖促進活性を、浅野らの方法［薬理と治療、１９巻、２７６７頁（１９９１年）］に従って測定した。
各化合物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させたときの結果を未修飾のポリペプチドの活性を１００として第６表および第７表に示す。
試験例４ 化学修飾スーパーオキサイドディスムターゼの酵素活性
実施例２７、実施例３０〜実施例３２および実施例３４で調製した化学修飾ＳＯＤの酵素活性をＭｃｃｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．とＦｒｉｄｏｖｉｃｈｉ，Ｉのキサンチン−キサンチンオキシダーゼ−シトクロムＣ系［ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４４巻、６０４９頁（１９６９年）］で測定した。ＳＯＤ活性１ユニット（Ｕ）とは、ｐＨ７．８、３０℃下で、シトクロムＣの還元速度を５０％阻害するＳＯＤの酵素量を示し、以下の式で算出した。
化学修飾ウシＳＯＤ、および化学修飾ヒトＳＯＤの酵素活性を各々第８表、第９表に示す。
ＳＯＤ ５０Ｕ／ｍｌ＝０．０００２５６ｍｇ（３９００Ｕ／ｍｇの場合）
ΔＡ／分：測定値
試験例５ 化学修飾インターフェロン−βの血中半減期延長効果
実施例１１で得られた５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−β、実施例１２で得られた５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−β、実施例１４で得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β、参考例２で得られた１０ＳＣＭ−ｒｈＩＦＮ−βおよび参考例６で得られた未修飾ｒｈＩＦＮ−βを等張リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１２．５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、８〜１０週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雄性マウス（日本チャールズリバー）に２００μｌずつ静脈内注射した。経時的にマウスを殺し血清を採取し、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により血中のＩＦＮ−βの濃度を算出した。
その結果を図１に示す。
未修飾ＩＦＮ−βが投与後１時間で検出限界以下になったのに対し、化学修飾ＩＦＮ−βでは数時間後も血中濃度が維持され、大幅な持続性が付与された。
また、本発明で開示された化合物、すなわち平均分子量約１０，０００の分岐型ポリエチレングリコールで修飾されたｒｈＩＦＮ−βは、平均分子量１０，０００の直鎖型ポリエチレングリコールで修飾されたｒｈＩＦＮ−βに比較してより血中持続性に優れていることが分かった。
試験例６ 化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ類の血中半減期延長効果
実施例２３、実施例２５および参考例３で得られる化学修飾体、ならびに参考例５および参考例９で得られる未修飾体を雄性ラットに０．１ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内注射し、２４時間後に尾静脈より血液を採取し、適宜希釈し、ＥＬＩＳＡにて血中の化合物濃度を測定した。２回の実験の平均値を第１０表に示す。
未修飾体が２４時間後に検出限界以下になったのに対し、化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体では血中濃度が維持され、大幅な血中持続性が付与された。
また、本発明で開示された化合物、すなわち、平均分子量１０，０００の分岐型ポリエチレングリコールで修飾されたｒｈＧ−ＣＳＦおよび同ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は、平均分子量１０，０００の直鎖型ポリエチレングリコールで修飾されたｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に比較してより血中持続性に優れていることが分かった。
試験例７ 化学修飾ｒｈＩＦＮ−βの電気泳動による分子サイズの比較
実施例１１および実施例１４で得られた２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ｒｈＩＦＮ−β、および参考例２で得られた直鎖型ポリエチレングリコール修飾ｒｈＩＦＮ−βのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られた乾燥ゲルを用いて各成分の見かけの分子量を分子量マーカーより算出した。各化学修飾ｒｈＩＦＮ−βの電気泳動により得られた見かけの分子量の一例を第１１表に示す。
直鎖型ポリエチレングリコール修飾体に比較して、分岐型ポリエチレングリコール修飾体は分子量がほぼ同じであるのに対し、電気泳動上の見かけの分子量は増大したことから、分子サイズが大きいことが示された。
試験例８ 化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の電気泳動による分子サイズの比較
実施例２１および実施例２３で得られた２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体、および参考例３で得られた直鎖型ポリエチレングリコール修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られた乾燥ゲルを用いて各成分の見かけの分子量を分子量マーカーより算出した。各化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の電気泳動により得られた見かけの分子量の一例を第１２表に示す。
直鎖型ポリエチレングリコール修飾体に比較して、分岐型ポリエチレングリコール修飾体は分子量がほぼ同じであるのに対し、電気泳動上の見かけの分子量は増大したことから、分子サイズが大きいことが示された。
試験例９ 化学修飾ＳＯＤの電気泳動による分子サイズの比較
実施例２７および実施例３０で得られた２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ＳＯＤ、および参考例４で得られた直鎖型ポリエチレングリコール修飾ＳＯＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られた乾燥ゲルを用いて各成分の見かけの分子量を分子量マーカーより算出した。各化学修飾ＳＯＤの電気泳動により得られた見かけの分子量の一例を第１３表に示す。
直鎖型ポリエチレングリコール修飾体に比較して、分岐型ポリエチレングリコール修飾体は分子量がほぼ同じであるのに対し、電気泳動上の見かけの分子量は増大したことから、分子サイズが大きいことが示された。
試験例１０ 光散乱測定による従来型の２本鎖分岐型ＰＥＧ誘導体との分子サイズの比較
実施例１０で得られた本発明の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体［５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）］と参考例８で得られた従来型２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体（５ＰＥＧ２ＧＡＢＡ）の水溶液中での分子サイズの比較を、光散乱光度計を用いて下記の条件で測定した。
＜測定条件＞
光散乱光度計：ＤＬＳ−７０００（大塚電子）
示差屈折計：ＤＲＭ−１０２１（大塚電子）
光源：アルゴンレーザー７５ｍＷ（６３２．８ｎｍ）
測定温度：２５℃
緩衝液：等張りん酸緩衝液
試料濃度：１．４ｍｇ／ｍｌ〜３．３ｍｇ／ｍｌ
前処理：０．２２μｍフィルター濾過
この結果、実施例１０の化合物は参考例８の化合物に比べて、約１．９倍の慣性二乗半径を有することが示唆された。従来型の平面構造のトリアジン環を介して分岐させたポリエチレングリコール誘導体に比べ、シクロヘキサンに結合したポリエチレングリコール鎖が水溶液中でより広がりを持った状態にあることを示しており、同一分子量でありながら本件のポリアルキレングリコール類の方が分子量増大効果に優れていることが示された。
試験例１１ 従来型２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体との化学修飾体への変換率の比較
本発明の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体としては実施例１０で得られた化合物５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）を実施例３６と同様の方法でＮＨＳエステルに変換したものを使用した。
比較には、平均分子量１０，０００の下記式で表される従来型のポリエチレングリコール誘導体ＰＥＧ２−ＮＨＳ［リジン誘導体、略号：５ＬＹＳ（２ＵＡ）、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製］
を用いた。
５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７）で調製した３．６８ｍｇ／ｍｌの参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に、ＮＨＳエステルを蛋白質１ｍｇあたり１．６、２．７、３．８、４．８または５．８ｍｇ加え、４℃で反応した。２０分後の反応液を実施例１１と同様ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用いたゲル濾過ＨＰＬＣで分析した。得られたクロマトグラムのピーク面積より化学修飾体への変換率を算出した。
結果を第１４表に示す。
第１４表から、従来型の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体に比べ、本発明の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類はタンパク質がより安定な中性条件で、蛋白質をより多く化学修飾体に変換できることが確認された。
試験例１２ 水溶液中における従来型の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体との安定性の比較
実施例１０で得られた本発明の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体［５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）］を使用した。比較には、平均分子量１０，０００の従来型ポリエチレングリコール誘導体ＰＥＧ２−ＮＨＳ［リジン誘導体、略号：５ＬＹＳ（２ＵＡ）、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製］の末端カルボン酸タイプを使用した。
両者の安定性を以下の手順で評価した。
中性（５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液 ｐＨ７．５）およびアルカリ性（５０ｍｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液 ｐＨ１０．０）の緩衝液を用いて、両試薬を２ｍｇ／ｍｌになるように調製し、調製した水溶液を３７℃で静置した。溶液調製直後から経時的にサンプリングし、１ｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液ｐＨ７．５を加えて中性にした後、電気泳動で両試薬のバンド（１０ｋＤａ）および分解物を比較した。
その結果、５ＬＹＳ（２ＵＡ）は中性では安定であったが、アルカリ条件下で経時的に１本鎖のバンド（５ｋＤａ）が検出され、次第に鮮明になることが確認された。一方、５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）では中性条件下、アルカリ条件下のサンプルともに１ヶ月間分解物が全く検出されなかった。
以上の結果は、従来型の２本鎖分岐型ＰＥＧ試薬５ＬＹＳ（２ＵＡ）ではアルカリ性の条件下で２本鎖から１本鎖への分解が生じ得ることを示している。一般に蛋白質のポリエチレングリコール修飾はｐＨ８からｐＨ１１程度のアルカリ性条件下で実施されることが多く、５ＬＹＳ（２ＵＡ）を用いた場合には化学修飾反応中に修飾剤が分解を起こす可能性が示唆された。
＜電気泳動条件＞
ゲル：ＮｕＰＡＧＥ４−１２％（ＮＯＶＥＸ製）
染色：０．１ｍｏｌ／Ｌヨウ素水溶液
分子量マーカー：ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００（日本油脂製）
試験例１３ 化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体のガングリオキシドＧＤ３に対する結合活性
実施例３９で調製した化学修飾ＫＭ−８７１の結合活性をＫｅｎｙａ．Ｓらの方法［キャンサー イムノロジー イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、３６巻、３７３−３８０頁（１９９３年）］に基づいて測定した。
その結果、未修飾ＫＭ−８７１のガングリオキシドＧＤ３に対する結合活性を１００％とした場合、化学修飾ＫＭ−８７１では約２０％のガングリオキシドＧＤ３に対する結合活性が残存していることを確認した。
試験例１４ 従来型２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体との化学修飾体への変換率の比較
本発明の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体としては実施例１０で得られた化合物５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）を実施例３６と同様の方法でＮＨＳエステルに変換したものを使用した。
比較には、試験例１１と同様に平均分子量１０，０００の従来型ポリエチレングリコール誘導体ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）を用いた。
５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６）で調製した２．０ｍｇ／ｍｌのウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記ポリエチレングリコール誘導体のＮＨＳエステルを蛋白質１モルに対して５０モル加え、４℃で１５時間反応した。その後、反応液を実施例１１と同様ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用いたゲル濾過ＨＰＬＣで分析した。得られたクロマトグラムのピーク面積より化学修飾体への変換率を算出した。
結果を第１５表に示す。
第１５表から、従来型の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール誘導体に比べ、本発明の２本鎖分岐型ポリアルキレングリコール類はタンパク質がより安定な中性条件で、化学修飾体への高い変換率を示すことが確認された。
試験例１５ モルモットＥＡＥモデルにおける化学修飾インターフェロン−βと未修飾インターフェロン−βとの活性の比較
多発性硬化症の動物モデルとして、実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、以後ＥＡＥと略す）が広く用いられている（ジャーナル オブ ニューロパソロジー アンド イクスペリメンタル ニューロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、５７巻、６０２−６１４頁（１９９８年））。このモデルにおいて、動物は全脊髄成分あるいはミエリン構成成分の蛋白質をアジュバントと共に感作されることにより、急性あるいは再発性の麻痺を示し、組織学的解析においては、多発性硬化症で見られるような中枢神経系のＴ細胞浸潤、脱髄病変を呈する。また細胞移入等の結果より、中枢神経ミエリン構成蛋白質に特異的に反応するＣＤ４＋Ｔ細胞が病態形成において重要な役割を担っていることも明らかになっている（クリニカル ニューロサイエンス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１５巻、２３−２７頁（１９９７年））。さらに、モルモットのＥＡＥにおいてヒトＩＦＮ−βが有効性を示すことが報告されており（第７２回日本薬理学会年会プログラム、２９２Ｐ、Ｐ−６８４、１９９９年）、モルモットＥＡＥモデルはヒトＩＦＮ−βの薬効評価系として有用であると考えられている。
＜使用動物＞
Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモット（メス、ＳＰＦ、３週齢、日本エスエルシー、引佐生育所、浜松市）を購入し、恒温（２２±３℃）、恒湿（５０±２０％）の条件下の動物室で１週間飼育後、使用した。
＜エマルジョン調製＞
ａ）Ｆｒｅｓｈ ｇｕｉｎｉａ ｐｉｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＣＮＳ）ホモジネートの調製：
ネンブタール麻酔下でモルモットのＣＮＳを回収し、ＣＮＳ湿重量１ｇにつき１ｍＬの生理食塩水（大塚製薬、東京）を加えた。この溶液をポリトロン（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて９０秒間ホモジネートし、ＣＮＳ原液とした。この液を生理食塩水で４倍希釈し、使用した。
ｂ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（以下Ｈ３７Ｒａと表記）：
Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）をめのう乳鉢で粉砕し、Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ、Ｄｉｆｃｏ、ＭＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になる様に懸濁した。等量のａ）とｂ）を混合し，ポリトロンを用いて完全にエマルジョン化した。
＜薬物および調製方法＞
使用した薬物とその投与量を以下に記す．
ヒトＩＦＮ−β（ＩＦＮ−β）：２．４ Ｍｉｌｌｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｔｓ（ＭＩＵ）／ｋｇ
ＰＥＧ化ヒトＩＦＮ−β（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）：２．４ＭＩＵ／ｋｇ
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−βを用いて、後記の実施例１４の方法に準じて製造した。ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ＩＦＮ−βの投与用量は、薮内らの報告を参考にした（第７２回日本薬理学会プログラム、２９２Ｐ、Ｐ−６８４、１９９９）。ＩＦＮ−βおよびＰＥＧ−ＩＦＮ−βとしては、それぞれ９５．５ＭＩＵ／ｍＬ、１０９．０４ＭＩＵ／ｍＬの濃度で６０％エチレングリコール（関東化学、東京）、５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）（ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、和光純薬、大阪）、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（和光純薬）溶液に溶解した状態のものを用いた。各薬物は、投与直前にりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｍａｇｎｅｃｉｕｍ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．））に２．４ＭＩＵ／ｍＬとなるように、かつ含有溶媒量が等量になるよう希釈した。
＜投与方法＞
それぞれの薬物はｄａｙ０からｄａｙ２０まで、１日１回モルモット背部皮下に投与した。
＜群分けおよび感作＞
モルモットの体重を測定し、各群の平均体重がほぼ等しくなるように群分けした後、エーテル麻酔下でモルモットの頚部に前述のエマルジョンを２００ｍＬずつ３個所に（６００ｍＬ／ｂｏｄｙ）皮内投与した（Ｎｏｒｍａｌ群には感作および薬物投与のいずれも施さなかった）。以下にグループ１〜４について示す。
グループ１（Ｎｏｒｍａｌ群）は「感作なし、薬物投与なし」
グループ２（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群）は「感作あり、６０％エチレングリコール、５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液をＰＢＳで希釈した溶液を投与」
グループ３（ＩＦＮ−β投与群）は「感作あり、ＩＦＮ−β（２．４ＭＩＵ／ｋｇ）投与」
グループ４（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β投与群）は「感作あり、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β（２．４ＭＩＵ／ｋｇ）投与」
感作当日をｄａｙ０とし、以下に示した基準で、ｄａｙ０〜６までは３日おきに、ｄａｙ８〜２２までは毎日、外見的症状につきスコアリングを行った。
スコアリング基準は、下記の通りである。
０：異常なし
１：立ち上がり反射の異常
２：後肢の不完全麻痺
３：後肢の完全麻痺
４：前肢の麻痺、瀕死
５：死亡
＜統計解析＞
解析は、統計解析ソフトＳＡＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ ６．１２，ＳＡＳ Ｉｎｃ，Ｃａｒｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して行った。スコアの有意差検定は各日毎にＷｉｌｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔで検定した。
＜結果＞
図２にモルモットＥＡＥモデルにおけるグループ１〜４のクリニカルスコア（外見的症状）の経時的な変化を示した。
モルモットＥＡＥモデルにおいて、ＣＮＳ感作を行った後に溶媒のみを投与したグループ２（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群）ではｄａｙ９〜１３までに全個体が発症し、感作後２１日目には全個体が死亡した。グループ３（ＩＦＮ−β投与群）におけるクリニカルスコアの変化はグループ２（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群）とほぼ同様であり、明らかな作用は認められなかった。一方、グループ４（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β投与群）では全例が発症したが、グループ３（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群）と比較するとｄａｙ２１，２２では有意なクリニカルスコアの抑制が認められた。
以上のように、ＰＥＧで化学修飾したＩＦＮ−βは、未修飾のＩＦＮ−βに比べて、多発性硬化症において有効であることが示唆された。
またインターフェロンは、多発性硬化症以外にも、肝炎を始めとしたウイルス性疾患、悪性腫瘍等の疾患に有用であることが知られており、ＰＥＧ等で化学修飾したＩＦＮ−βは、ウイルス性疾患（肝炎等）、悪性腫瘍等の疾患にも有用であると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであり、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。実施例中の略号は特に断らない限り、それぞれ以下のことを意味する。なお、本明細書において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告［ヨーロピアン・ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１３８巻、９頁（１９８４年）］に従った。
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｍＰＥＧ：モノメトキシポリエチレングリコール（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）
ＩＦＮ：インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｈＩＦＮ：ヒトインターフェロン（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｒｈＩＦＮ：組換えヒトインターフェロン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）
ｒｈＧ−ＣＳＦ：組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）
ＳＯＤ：スーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ｂＳＯＤ：ウシスーパーオキサイドディスムターゼ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ｈＳＯＤ：ヒトスーパーオキサイドディスムターゼ（ｈｕｍａｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）
ＤＳＣ：Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）
ＴＥＡ：トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）
Ｔｓ：ｐ−トルエンスルホニル（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）
ＴｓＣｌ：塩化ｐ−トルエンスルホニル（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
ＬＡＨ：水素化アルミニウムリチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
実施例１ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）（化合物番号１）
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール二水和物（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）（Ｆｌｕｋａ社製）４２０．５ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ３．２ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）をアルゴン気流中アセトニトリル２０ｍｌに溶解し、ＴＥＡ２．１ｍｌ（１２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜攪拌した。溶媒を減圧下除去し、クロロホルムおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えて抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）シクロヘキサン［ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｔｒｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ］３５７ｍｇ（０．６４ｍｍｏｌ）を得た（収率：２５．７％）。
次に、モノメトキシポリエチレングリコールプロピルアミン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）（ｍＰＥＧ−ＮＨ２）［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、および上記で合成したシクロヘキサントリオールのトリスクシンイミジルカーボネート誘導体を塩化メチレン１２．５ｍｌに溶解し、ＴＥＡ２８μｌを加え、室温で２時間攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、残渣を４７２ｍｇ取得した（収率９４．４％）。そのうち、３７２ｍｇを逆相ＨＰＬＣで精製した。カラムにはＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔ（３０ｍｍ×２５０ｍｍ）（東ソー）を用い、０．１％ＴＦＡ水溶液を移動相として、１０ｍｌ／分の流量で流し、０〜９０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させた。平均分子量１０，０００の目的の画分３０ｍｌを回収し、減圧下アセトニトリルを除去し、クロロホルムで抽出した。これをジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を濾取し減圧乾燥して目的物１２１．７ｍｇを得た（回収率３２．７％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．７ｍｌ／分
検出：ＲＩ
分離カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）（東ソー）
カラム温度：室温
保持時間：１２．２分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６１（ｓ，８ｎＨ），３．４１（ｓ，６Ｈ），４．６９（ｂｒ，４Ｈ），１．７７（ｂｒｍ，４Ｈ），５．３０（ｂｒ，２Ｈ），０．８−３．４（ｍ，９Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ）
実施例２ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）（化合物番号２）
８４．０ｍｇ（０．３８８ｍｍｏｌ）のｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（Ｆｌｕｋａ社製）をＤＭＦ５０ｍｌに溶解し、２７０．２ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＨＯＢｔおよび１．０４ｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰを加えて０℃で３０分間攪拌した。５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）のモノメトキシポリエチレングリコールプロピルアミン［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］、続いて２１９．７μｌ（１．９ｍｍｏｌ）のＮＭＭを加え、一昼夜攪拌した。１ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を回収し、目的の化合物を含む粗生成物を３．７８ｇ（収率７５．６％）取得した。次に、３００ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。水に溶解した粗生成物をカラムに添加し、さらに水６００ｍｌでカラムを洗浄した後、０．６〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。その後、目的物画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧下除去して目的物を６１０．４ｍｇ（収率６５．２％）取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．０分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．５６（ｍ，３Ｈ），２．１−２．５（ｍ，６Ｈ），１．７７（ｍ，４Ｈ），２．１−２．３（ｂｒ，４Ｈ），３．３８（ｂｒ，４Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３６（ｓ，６Ｈ），６．４６（ｔ，Ｊ＝５．２３Ｈｚ，２Ｈ）
実施例３ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）（化合物番号３）
ｍＰＥＧ［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５０ｇ（１０ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのトルエンに溶解し、脱水還流した。そこへＴＥＡ３．５ｍｌ（２５ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間かけて、臭化チオニル／トルエン溶液（臭化チオニル１．５５ｍｌをトルエン１３．６ｍｌに溶解）を滴下した。１時間還流した後、セライトを用いて濾過し、４時間室温で静置した。次に５０℃に加熱して活性炭を５ｇ加えた。セライトを用いて活性炭を除去し、４℃で１昼夜静置した。翌日上清を除去した後、残渣を６０℃のエタノール２５０ｍｌへ溶解した。そこへ３ｇの活性炭を加え、セライトを用いて活性炭を除去した後４℃で一昼夜静置した。翌日残渣を冷エタノールとジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した後、臭素化したｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−Ｂｒ）を３２．８７ｇ（収率６５．７４％）取得した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）
次に、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール二水和物（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）１．３２２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を十分乾燥後、無水ＤＭＦ２５ｍｌに溶解し、アルゴン気流中、水素化ナトリウム０．４８ｇ（１１ｍｍｏｌ）へ滴下し、３０分間攪拌した。そこへＤＭＦ２５ｍｌに溶解した上記のＰＥＧ−Ｂｒ１０ｇ（２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、沈殿を減圧下乾燥した。次に、乾燥した粉末を適量の水に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨを３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解し、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥してｍＰＥＧがシクロヘキサントリオール（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌ）に１分子結合した１本鎖型粗生成物を７．５ｇ（収率７５．０％）取得した。
この粗生成物５ｇにトルエン５０ｍｌを加え、一昼夜脱水還流を行った。また、ｍＰＥＧ−Ｂｒ５．５ｇ（１．１ｍｍｏｌ）をトルエン５０ｍｌに溶解し、１６０℃で一昼夜脱水還流を行った。次に、上記粗生成物のトルエン溶液に水素化ナトリウム１４４ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した後、ｍＰＥＧ−Ｂｒのトルエン溶液を滴下し、一昼夜脱水還流を行った後、濾過して不溶物を除去し、減圧下乾燥した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ１〜２に調整し、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下除去し、残渣に塩化メチレン少量を加えて溶解した後、ジエチルエーテルに滴下した。生成した白色沈殿を減圧乾燥し、目的の化合物を含む粗生成物を７．７３ｇ（収率７３．６％）取得した。
粗生成物１．５ｇを８％水酸化カリウム水溶液に溶解した後、アクリルアミド１５０ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で７時間攪拌した。さらにアクリルアミド１５０ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４日間攪拌した。反応液を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾別し、減圧乾燥して粗目的物１．０１７ｇ（６７．８％）を得た。
６０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にカラムに添加し、０．４〜１．４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。目的物を含む画分をクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧除去し、目的物を５２ｍｇ取得した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．５９（ｔ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，２Ｈ），０．８−３．４（ｍ，９Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例４ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）（化合物番号４）
ｍＰＥＧ［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］４００ｇ（８０ｍｍｏｌ）をトルエン１Ｌおよび塩化メチレン５００ｍｌの混合溶媒に溶解した。ＴｓＣｌ５０ｇ、次いでＴＥＡ４６．４ｍｌを加え、室温で８時間攪拌した。次にＴｓＣｌ５０ｇを添加し、１６時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を少量のクロロホルムに溶解して、ジエチルエーテル中に滴下した。生成した白色沈殿を回収し、減圧下で乾燥してトシルエステル化ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＴｓ）３４４ｇを得た（収率８６．０％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．４５（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，４ｎＨ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）
ｍＰＥＧ−ＯＴｓ３４４ｇをＤＭＦ１Ｌに溶解後、ヨウ化ナトリウム５４ｇを加え、８０〜９０℃で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。残渣を１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液１．５Ｌに溶解し、しばらく攪拌した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を減圧除去し、ヨウ素化したｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−Ｉ）３１４ｇを得た（収率７８．５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．２７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｓ，４ｎＨ）
４０ｇのｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Ｆｌｕｋａ社製）を１−プロパノール１Ｌおよび濃硫酸２０ｍｌに溶解し、室温で７２時間攪拌した。その後、反応液に適当量の酢酸エチルを添加し、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸ｎ−プロピルエステル（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｎ−ｐｒｏｐｙｌｅｓｔｅｒ）７２．４ｇ（収率定量的）を得た。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．９４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，９Ｈ），１．６５（ｍ，６Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．５６，２．２５，２．４０（各々ｍ，計９Ｈ）
１．１９ｇのＬＡＨを５０ｍｌのジエチルエーテルに溶解後、アルゴン雰囲気下、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸ｎ−プロピルエステル３．２ｇのジエチルエーテル溶液１２．５ｍｌを滴下した。さらに攪拌しながら４１時間還流した。次いで、水２．５ｍｌを滴下し、そのまま１５分間攪拌した。さらにエタノール５ｍｌを滴下し、室温で３時間攪拌した。反応液を濾過し、不溶物を沸騰エタノールで抽出した。このエタノール溶液を先程の濾液と合わせ、溶媒を減圧下除去した。得られた残渣を沸騰１，４−ジオキサンで抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下除去し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）１．５０ｇ（収率９１．７％）を得た。
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋１７５
理論値：Ｃ９Ｈ１８Ｏ３＝１７４
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．２１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，６Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，３Ｈ），０．４３，１．４０，１．７５（各々ｍ，計９Ｈ）
ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール２．５ｇ（１４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ１０ｍｌに溶解し、０℃、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム２．２８ｇ（４６．２ｍｍｏｌ）へ滴下し、３０分間攪拌した。そこへＤＭＦ５０ｍｌに溶解した４０ｇ（８ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ−Ｉを滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧下乾燥させた。次に乾燥させた粉末を適量の水に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して、ｍＰＥＧがｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールに２分子結合した２本鎖型粗生成物３３．０ｇ（８３．０％）を得た。
この粗生成物１４．０ｇを８％水酸化カリウム水溶液に溶解した後、アクリルアミド１．１８ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で７時間攪拌した。さらにアクリルアミド１．１８ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４日間攪拌した。反応液を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３に調整し、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗生成物１０．２ｇ（７３％）を得た。この粗生成物を１０００ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて精製した。溶出は０．４〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で行った。目的物を含む画分をクロロホルムで抽出し、クロロホルム層から減圧下溶媒除去し、残渣をジエチルエーテルで沈殿させて目的物を５００ｍｇ得た。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），０．８５，１．２６（各々ｍ，計９Ｈ）
実施例５ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＵ）（化合物番号５）
実施例４と同様にしてｍＰＥＧがシクロヘキサントリメタノールに２分子結合した２本鎖粗生成物を取得した。この粗生成物２．７ｇを実施例１に示したＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ１２０−Ｔカラムを用いた逆相ＨＰＬＣで精製し、２本鎖ＰＥＧ誘導体のみを含む画分を回収した。この画分から減圧下アセトニトリルを除去し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥し２２７ｍｇの２本鎖ＰＥＧ誘導体を得た（粗生成物からの収率８．４％）。２本鎖ＰＥＧ誘導体２０ｍｇ（２μｍｏｌ）を減圧乾燥し、１．２ｍｇ（１０μｍｏｌ）のＤＭＡＰおよび２．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）のＤＳＣを加え、塩化メチレンを１ｍｌ添加してアルゴン気流中室温で６時間攪拌した。反応液を濾過し、濾液をジエチルエーテル中に滴下した。生成した沈殿を回収し、減圧乾燥して、目的物を１５ｍｇ得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６１（ｓ，８ｎＨ），３．４１（ｓ，６Ｈ），０．５−２．０（ｍ，９Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ）
実施例６ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＱＮＡ（２ＵＡ）（化合物番号６）
３ｍｇの（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−（−）キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を乾燥ＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１７μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。さらに３４４ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）を添加し、室温で１時間攪拌した。１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物３０６ｍｇ（８８％）を得た。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例２と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して目的化合物３６ｍｇ（収率１０．５％）を得た。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：５．７−４．８（ｍ，３Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ）
実施例７ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキセン誘導体の合成
略号：５ＳＫＡ（２ＵＡ）（化合物番号７）
３．２ｍｇのシキミ酸を乾燥ＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１５μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。さらに３００ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）を添加し、室温で１時間攪拌した。１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物２７０ｍｇ（８９％）を得た。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例２と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して目的化合物４ｍｇ（収率１．３％）を得た。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：６．６−５．１（ｍ，４Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ）
実施例８ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＲａ）（化合物番号８）
５０ｍｇのｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールを脱水ＤＭＦ０．５ｍｌに溶解した後、水素化ナトリウム１７ｍｇを添加し、０℃で１５分間攪拌した。３−ブロモプロピオンアルデヒドジメチルアセタール４７μｌを添加し、室温で１６時間攪拌した。シリカゲルカラムで精製し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールの１位にプロピオンアルデヒドジメチルアセタール（ｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｌ）が結合した化合物を１５ｍｇ得た（収率３８％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６２（ｍ，９Ｈ），１．５４−１．８８（ｍ，９Ｈ），１．８３（ｑ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．３３（ｓ，６Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，４Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．２０Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｔ，Ｊ＝５．７０Ｈｚ，１Ｈ）＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋２７７
理論値：Ｃ１４Ｈ２８Ｏ５＝２７６
得られた化合物１５ｍｇを脱水ＤＭＦ１ｍｌに溶解し、３１μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。５９８ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯ（平均分子量５，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ製）を添加し、室温で２時間攪拌した。溶液を１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。得られた白色固体５７８ｍｇを実施例１と同様な逆相ＨＰＬＣで精製し、３８３ｍｇを得た。このうち１００ｍｇを７０％酢酸水溶液に溶解し、４０℃で１６時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応液を中和し、クロロホルムで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下反応液を濃縮した。１０倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。逆相ＨＰＬＣで再度精製し、目的物を３９ｍｇ得た（収率４１％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），９．７９（ｔ，Ｊ＝１．５６Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ）
実施例９ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＭ）（化合物番号９）
実施例４と同様にして合成したｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール１００ｍｇおよびＤＳＣ７３５ｍｇを約１０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、ＤＭＡＰ２１０ｍｇを加えて室温で５時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、塩化メチレンおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を適量加え抽出した。有機層を減圧乾燥し、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−トリス（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシメチル）シクロヘキサン［ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−ｔｒｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ］を３３３ｍｇ得た（収率９７％）［ＦＡＢ−ＭＳ：５９８（Ｍ＋Ｈ）＋］。
この化合物３０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）とｍＰＥＧ−ＮＨ２［平均分子量５，０００、日本油脂（株）製］５００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、ＴＥＡ２０μｌを加え、室温で２時間攪拌した。続いて、プロピレンジアミン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ）４２μｌ（０．５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ製）を加え、室温でさらに２時間攪拌した。反応液を濾過し濾液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して４３０ｍｇの粉末を得た（収率８６％）。この粉末４２５ｍｇを水２００ｍｌに溶解し、２０ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、２本鎖ＰＥＧを含む目的画分よりクロロホルムで抽出し、得られた有機層をジエチルエーテルに滴下し、精製した沈殿を減圧乾燥した。得られた粉末６２．５ｍｇ（６．２５μｍｏｌ）を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液０．５ｍｌに溶解し、氷冷下エトキシカルボニルマレイミド２．１ｍｇを加えて１０分間攪拌した。続いて水１．５ｍｌを加え室温で１５分間攪拌し、クロロホルムで３回抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去し２５ｍｇの粉末を得た（収率４０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様にして分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６３−０．７５（ｍ，３Ｈ），１．７５−１．７８（ｍ，１２Ｈ），３．１−３．３（ｍ，１２Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），５．２０（ｂｒ，３Ｈ），６．７３（ｓ，２Ｈ）
実施例１０ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）（化合物番号１０）
実施例４と同様Ｃとして調製した１００ｍｇのｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールを脱水ＤＭＳＯ２３ｍｌに溶解した後、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウムのｔｅｒｔ−ブタノール溶液（１Ｍ）９５８ｍｌを添加し、室温で１時間攪拌した。ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを添加し、９０℃で１６時間攪拌した。室温まで放冷した後、シリカゲルカラムで精製し、１−０−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−ｃｙｓ，ｃｙｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（１−０−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｓ，ｃｙｓ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）を２２ｍｇ得た（収率１３％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６０（ｍ，９Ｈ），１．５５−１．９０（ｍ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），３．３６（ｄ，Ｊ＝６．４２Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝６．１５Ｈｚ，４Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋２８９
理論値：Ｃ１５Ｈ２８Ｏ５＝２８８
上記で取得した化合物２２ｍｇをアルゴン雰囲気下脱水ピリジン２００μｌに溶解し、そこへ脱水ピリジン２００μｌに溶解した塩化トシル２３ｍｇを添加した。０℃で３時間攪拌した後、水を２０μｌ添加し、さらにその後１００μｌ添加した。反応液を氷冷したクロロホルムで抽出し、氷冷した１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の順で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、シリカゲルカラムで精製することにより、１−０−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−３−０，５−０−ジトシル−１，３，５−シクロヘキサントリメタノール（１−０−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−３−０，５−０−ｄｉｔｏｓｙｌ−１，３，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈａｎｏｌ）を２２ｍｇ得た（収率４８％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：１．２６（ｍ，９Ｈ），１．７５（ｍ，９Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），２．４６（ｓ，６Ｈ），３．２９（ｄ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｍ，４Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．１０Ｈｚ，２Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ＋２Ｈ）＋５４１
理論値：Ｃ２９Ｈ４０Ｏ９Ｓ２＝５９６
１．４ｇのｍＰＥＧ（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）を脱水トルエン２ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム２６ｍｇへ滴下し、３０分間攪拌した。そこへ脱水トルエン５００μｌに溶解した７６ｍｇの１−０−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−３−０，５−０−ジトシル−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールを滴下し、室温で一昼夜攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。得られた白色固体１．２ｇを１２０ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラムで実施例４と同様に精製し、目的物を１５４ｍｇを得た（収率１１％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１２．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｓ，８ｎＨ），０．５８（ｍ，９Ｈ），１．７２−１．９３（ｍ，９Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ）
実施例１１ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−β
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．３ｍｇ／ｍｌの参考例６で得られるｒｈＩＦＮ−β１．２ｍｌに、実施例１で取得した化合物１５ｍｇ（蛋白質１モル当たり２０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分１４．５ｍｌを回収し、水１４．５ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．２４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．４ｍｌを回収した（収率２１．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜５分子結合体のバンドを確認した。
＜電気泳動条件＞
ゲル：ＰＡＧＥＬ ＳＰＧ ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＦＡＳＴ ＳＴＡＩＮＴＭ
分子量マーカー：Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
分離カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ×２本連結）（東ソー社製）
保持時間：４０．３分（１〜４分子結合体）
実施例１２ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例２の化合物１００ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）を、１．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．７ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中、０℃で３０分間攪拌した。その後３時間室温で攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例２の化合物のＮＨＳエステルを６５．０ｍｇ得た（収率６５．０％）。
塩化ナトリウムを含む２００ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した参考例６で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．２８ｍｌ（１．０６７ｍｇ／ｍｌ）へ、上記ＮＨＳエステルを１７ｍｇ（蛋白質１モルに対して２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分２４ｍｌを回収し、水２４ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．４９ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分１．５ｍｌを回収した（収率４４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを２本用い、実施例１１と同様の条件で分析した。
保持時間：４３．９分（１分子結合体）
４１．０分（２分子結合体）
実施例１３ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
十分に乾燥した実施例３の化合物２０ｍｇを塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ１．１５ｍｇおよびＤＣＣ２．０６ｍｇを加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥してＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率７２．５％）。
塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した参考例６で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液０．７８ｍｌ（０．９３７ｍｇ／ｍｌ）に、上記ＮＨＳエステルを９．１ｍｇ（蛋白質１モルに対して２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラム２４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてゲル濾過した。溶離液にはエチレングリコールおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液を使用した。目的物を含む画分８．５ｍｌを回収し、水８．５ｍｌを加えて希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製した。ゲル濾過で得られた画分を同カラムに通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．０６７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分０．５ｍｌを回収した（収率４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様の条件で分析した。
保持時間：３５．９分（１〜３分子結合体）
実施例１４ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
乾燥した実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ１６．８ｍｇ（１４６．０μｍｏｌ）およびＤＣＣ３０．１ｍｇ（１４５．９μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥してＮＨＳエステルを２６０．０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
続いて、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例６で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．２ｍｌ（１．２２ｍｇ／ｍｌ）に上記ＮＨＳエステルを１４．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、３ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、０．２〜１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、分画した。０．１９４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分３．７５ｍｌを回収した（収率４９．７％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜２分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．９分（１分子結合体）
４０．２分（２分子結合体）
実施例１５ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾天然型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−天然型ｈＩＦＮ−β
天然型ｈＩＦＮ−β １０μｇ（ＳＴＲＡＴＨＭＡＮＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧＭＢＨ）を等張リン酸緩衝液２００μｌに溶解し、実施例１４と同様にして得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステルを１．５ｍｇ（蛋白質１モルに対して３００モル）加え、２０℃で一昼夜反応した。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（ＮＡＰ−５、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液に緩衝液交換し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。反応液０．５ｍｌをカラムに添加後、同緩衝液５ｍｌでカラムを洗浄した後、０．３５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出した。目的画分１．０ｍｌを濃縮し、０．０２１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．１９ｍｌ得た（収率３９．９％）。
実施例１６ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−αの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌに、実施例１２と同様にして得られた５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１．５ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液８０μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−５、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これを、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）２．０ｍｌで洗浄後、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。８０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率４０．０％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１１と同様の条件で分析した。
保持時間：４３．１分（１分子結合体）
４０．５分（２分子結合体）
実施例１７ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−αの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した０．９５ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α（ＩＢＬ）０．１ｍｌに、実施例１４と同様にして得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル１．５ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、一昼夜４℃で反応を行った。次に、反応液０．１ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−５、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これを、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）２．０ｍｌで洗浄後、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。５０μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．６ｍｌを得た（収率３１．６％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１１と同様の条件で分析した。
保持時間：４２．９分（１分子結合体）
４１．２分（２分子結合体）
実施例１８ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−γ
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例７で得られるｒｈＩＦＮ−γ（０．１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌに、実施例１２と同様にして得られた５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２００モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例１９ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−γ
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例７で得られるｒｈＩＦＮ−γ（０．８ｍｇ／ｍｌ）０．８ｍｌに、実施例１４と同様にして得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル１０．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり３０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例２０ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．２ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに実施例１の化合物１．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で１０倍に希釈し、そのうち９００μｌを同緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）４．９ｍｌで洗浄後、７５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的物を含む画分を統合し、濃縮した。４０２μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液３６０μｌを得た（収率５０．３％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．８分（１分子結合体）
４１．３分（２分子結合体）
実施例２１ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに５．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）の実施例１２と同様にして得られた５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を１０倍に希釈し、そのうち９００μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム、（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）４．９ｍｌで洗浄後、１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を濃縮し、１７９μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液５００μｌを得た（収率２５．８％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．８分（１分子結合体）
４０．３分（２分子結合体）
実施例２２ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１００μｌに６．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）の実施例１３と同様にして得られた５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）のＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を１０倍に希釈し、そのうち９００μｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．３ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）４．９ｍｌで洗浄後、１００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後濃縮し、３３５μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４５０μｌを得た（収率４４．２％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．６分（１分子結合体）
３９．５分（２分子結合体）
実施例２３ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
十分に乾燥した実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ１６．８ｍｇ（１４６．０μｍｏｌ）、ＤＣＣ３０．１ｍｇ（１４５．９μｍｏｌ）を加え、氷冷下３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下した。沈殿を回収し、減圧乾燥して化合物４のＮＨＳエステルを２６０．０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
等張リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１．２５ｍｌ（４．０ｍｇ／ｍｌ）に上記ＮＨＳエステルを２６．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液１．０ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．５ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム５．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。１０ｍｌの緩衝液で未吸着成分を洗浄後、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出した。目的物を含む画分１０ｍｌを３倍に希釈し、再度５．０ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラムで同様に精製した。目的物を含む画分１５ｍｌを回収後、濃縮し、１．８６ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．７ｍｌを取得した（収率３２．５％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４８．７分（１分子結合体）
４６．９分（２分子結合体）
実施例２４ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに、実施例５の化合物を１．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例２５ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製したｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．９ｍｌに、実施例１４と同様にして得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル２８．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり１５当量）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液０．８ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．５ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム５．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に添加した。酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌを流した後、０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出、分画した。目的画分１０ｍｌを回収後、濃縮し、１．３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１．０ｍｌを得た（収率３３．０％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．８分（１分子結合体）
４０．１分（２分子結合体）
実施例２６ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．２ｍｌに、実施例１２と同様にして得られた５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）のＮＨＳエステル１０．０ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５当量）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。
反応液０．２ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−５、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．０ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に添加した。酢酸ナトリウム緩衝液２．５ｍｌを流した後、０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出、分画した。目的画分３．５ｍｌを回収後、濃縮し、０．７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３ｍｌを得た（収率２６．８％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．９分（１分子結合体）
４０．４分（２分子結合体）
実施例２７ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｂＳＯＤ
十分乾燥した実施例２の化合物３０ｍｇ（３μｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍｌに溶解し、ＮＨＳ１．７ｍｇ（０．０１５ｍＭ）およびＤＣＣ３．１ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分間攪拌した。その後３時間室温で攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例２の化合物のＮＨＳエステルを２１ｍｇ得た（収率７０％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例２８ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ
実施例３の化合物２０ｍｇを実施例１３と同様の条件で活性化し、ＮＨＳエステルを１３ｍｇ得た（収率６５％）。
次に、ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例２９ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｂＳＯＤ
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに実施例１で得た化合物の水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例３０ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を実施例１４と同様の条件で活性化し、ＮＨＳエステルを２６０ｍｇ得た。（収率５３．４％）
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例３１ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの精製
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｂＳＯＤ（精製品）
実施例４の化合物３６０ｍｇ（３６．０μｍｏｌ）を実施例１４と同様の条件で活性化し、ＮＨＳエステルを１８１．９ｍｇ得た（収率５０．５％）。
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、和光純薬製）２．２ｍｌに上記ＮＨＳエステル３３．９ｍｇ（蛋白質１モルあたり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。次に、この反応液を４．３ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。カラムに反応液をカラムに添加し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）でカラムを洗浄した後、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。その後、未修飾ＳＯＤの含まれない目的画分を濃縮し、３．７３ｍｇ／ｍｌの溶液を２００μｌ得た（収率１７．２％）。さらにＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加えて活性を回復した。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例３２ ５ｋＤａ ２本鎖型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｈＳＯＤ
実施例４の化合物４８７ｍｇ（４８．７μｍｏｌ）を実施例１４と同様の条件で活性化し、ＮＨＳエステルを２６０ｍｇ得た（収率５３．４％）。
ヒトＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（１．９ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９ほう酸緩衝液、ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製）５０μｌに使用直前に調製した上記ＮＨＳエステルの水溶液（１５６ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１０μｌ（蛋白質１モルあたり５０モル）を加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例３３ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−１７Ｓｅｒ ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．６）で調製した１７Ｓｅｒ ｒｈＩＦＮ−β（Ｃｈｉｒｏｎ社製）の溶液０．１ｍｌ（１．０ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１４と同様にして得られた５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）のＮＨＳエステル１．３ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＮＡＰ−５、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．２５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈｉａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、４．０ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、０．２〜０．３５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。３９μｇ／ｍｌの目的物を含む画分０．７５ｍｌを回収した（収率３９％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜３分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４１．３分（１〜３分子結合体）
実施例３４ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＭ）−ｈＳＯＤ
実施例９の化合物［５ＣＨＴＭ（２ＵＭ）］３．１３ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）をヒトＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液．［２．６３ｍｇ／ｍｌ、りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）、ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製］０．６ｍｌに加えて４℃で一昼夜静置して反応した。次に、２０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で精製した。未反応のＳＯＤを含まない修飾体の画分を回収し、０．５ｍｌまで濃縮した。この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−５、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）に緩衝液交換し、０．８ｍｌを回収した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に添加した。同緩衝液３．５ｍｌを流した後、０．５〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を回収後、濃縮した。さらに、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を含む溶液各々１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加え、ＳＯＤの活性を回復した。０．２５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液を１８０μｌ取得した（収率４．５％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
実施例３５ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー形成刺激因子誘導体の調製
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＲａ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに実施例８で得られた５．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり５０モル）のＰＥＧ誘導体［５ＣＨＴＭ（２ＵＲａ）］を添加し、１２０ｍｍｏｌ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウム１０μｌを加え、室温で１８時間反応させた。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
実施例３６ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー形成刺激因子誘導体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例１０の化合物１００ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）を１．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ３．５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ６．２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中、０℃で９０分間、その後室温で２時間攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥してＮＨＳエステルを５６．５ｍｇ得た（収率５６．５％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体２１０μｌに４．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり１０モル）の上記ＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−５、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、続いてＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。７５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、０．３１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分を９６５μｌ得た（収率３９．６％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．２分（１分子結合体）
４０．６分（２分子結合体）
実施例３７ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シクロヘキサン誘導体の合成
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＡ）（化合物番号３７）
１００ｍｇのｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリメタノールを脱水ＤＭＳＯ２３ｍｌに溶解した後、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウムのｔｅｒｔ−ブタノール溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）９５８μｌを添加し、室温で１時間攪拌した。ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを添加し、９０℃で１６時間攪拌した。室温まで放冷した後、シリカゲルカラムで精製し、下記に示す化合物を２２ｍｇ得た（収率１３％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．５−１．９（ｍ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），３．３６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ＋Ｈ）＋２８９
理論値：Ｃ１５Ｈ２８Ｏ５＝２８８
８６７ｍｇの上記化合物をアルゴン雰囲気下、脱水アセトニトリル５ｍｌに溶解し、そこへＤＳＣ１．９５ｇ、続いてＤＭＡＰ５２６ｍｇを添加し、室温で終夜攪拌した。反応液を氷冷し、同じく氷冷した０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加し、塩化メチレンで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧下除去し、下記に示す化合物を１．８４ｇ得た（定量的）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．７−１．９（ｍ，９Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），２．８２（ｓ，８Ｈ），３．３７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：（Ｍ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ＋２Ｈ）＋５１５
理論値：Ｃ２５Ｈ３４Ｎ２Ｏ１３＝５７０
１．８４ｇの上記化合物を３６ｍｌの塩化メチレンに溶解した。そこへ３３ｇのｍＰＥＧ−ＮＨ２（日本油脂（株）製）を含む塩化メチレン溶液３６ｍｌを滴下し、その後、ＴＥＡ９３５μｌを添加し、室温で４時間攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧下で乾燥した。得られた白色固体を１７３ｍｌのトリフルオロ酢酸／塩化メチレン／水（５００／５００／ｌ）混合溶液に溶解し、室温で４時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和し、クロロホルムで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧下除去し、白色固体３３ｇを得た。これを１０００ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で実施例３と同様に精製し、目的物１３ｇを得た。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：０．６−２．０（ｍ，９Ｈ），１．７５（ｍ，６Ｈ），３．２８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６２（ｓ，８ｎＨ），４．０２（ｓ，２Ｈ），５．２８（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．４分
実施例３８ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例３７の化合物１ｇ（０．１ｍｍｏｌ）を、１０．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ３４．５ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ６２ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した後、２時間室温で攪拌し、反応液をジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を減圧乾燥して実施例３７の化合物のＮＨＳエステルを６５０ｍｇ得た（収率６５％）。
続いて、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例６で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１０ｍｌ（１．１８ｍｇ／ｍｌ）へ、上記ＮＨＳエステルを１４７．３ｍｇ（蛋白質１モルに対して２５モル）加え、４℃で一昼夜反応した。反応液１０ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でエチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換し、１２ｍｌを回収した。これをＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、２．３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１．１ｍｌを得た（収率２１．４％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜４分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１１と同様の条件で分析した。
保持時間：４３．０分（１分子結合体）
４０．２分（２分子結合体）
実施例３９ ５ｋＤａ ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の製造
略号：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）−ＫＭ−８７１
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２．６ｍｇ／ｍｌに調製したＫＭ−８７１溶液０．５ｍｌ（特開平５−３０４９８９に従って調製）に、実施例３６で得られた化合物５ＣＨＴＭ（２ＥＡ２）のＮＨＳエステル１．０ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応した。反応液０．５ｍｌをＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１．２ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、０．５９ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３８ｍｌを得た（収率１７．１％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
参考例１ １０ｋＤａ １本鎖型ポリエチレングリコール誘導体の合成
略号：１０ＳＣＭ
構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＣＨ２ＣＯＯＨ
Ｓ．ＺａｌｉｐｓｋｙとＧ．Ｂａｒａｎｙの方法［ジャーナル オブ バイオアクティブ アンド コンパチブル ポリマーズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）５巻、２２７頁（１９９０年）］に準じて以下の方法で製造した。
乾燥したモノメトキシポリエチレングリコール［平均分子量１０，０００、日本油脂（株）社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＶＦＭ−３０１０Ｍ］１０ｇを乾燥トルエン５０ｍｌに溶解し、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウム１．１２ｇを加え蒸留し、初めの留分３０ｍｌを除去した。アルゴン気流中、５０℃に冷却後、α−ブロモ酢酸エチル１．１ｍｌを加え、一昼夜攪拌を続けた。反応混合物を５００ｍｌのジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾過により回収し、減圧下乾燥した。続いて、得られた乾燥粉末９．２ｇを１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１５０ｍｌに溶解し、室温で１時間攪拌した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１６０ｍｌを加え、クロロホルム５００ｍｌで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、１０ｍｌまで減圧濃縮した後、３００ｍｌのジエチルエーテル中に滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥して白色粉末７．５ｇを得た（収率７５％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．６４（ｓ，４ｎＨ），３．３８（ｓ，３Ｈ），４．１５（ｓ，２Ｈ）
参考例２ １０ｋＤａ １本鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの製造
略号：１０ＳＣＭ−ｒｈＩＦＮ−β
十分に乾燥した参考例１の化合物１．０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、アルゴン気流中、ＮＨＳ２１．８ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ３９．０ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）を加え氷冷下、３０分間、続いて室温で２時間攪拌した。不溶物を濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿を減圧下乾燥してＮＨＳエステルを５０６．８ｍｇ得た（収率５０．７％）。
続いて、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例６で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液３．０ｍｌ（０．８１ｍｇ／ｍｌ）に上記ＮＨＳエステルを１６．２ｍｇ加え、４℃で一昼夜反応した。次に、反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて脱塩した。ゲル濾過で得られた画分４．５ｍｌをＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、０．０５〜１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。０．２２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む画分４．０ｍｌを回収した（収率３６．２％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様に分析し、ポリエチレングリコールが１〜３分子結合した修飾体を確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４４．２分（１分子結合体）
４１．０分（２分子結合体）
参考例３ １０ｋＤａ １本鎖型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：１０ＳＣＭ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体２．５ｍｌに２１．３ｍｇ（蛋白質１モル当たり４モル）の参考例２と同様にして得られた１０ＳＣＭのＮＨＳエステルを添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、４．０ｍｌを回収した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム１０．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、５０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合し、２２．５ｍｌを回収し、そのうち１１ｍｌを濃縮し、２．０ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液８６０μｌを得た（収率３４．４％）。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１１と同様にして分析した。
保持時間：４２．０分（１分子結合体）
３９．５分（２分子結合体）
参考例４ １０ｋＤａ １本鎖型ポリエチレングリコール修飾ウシＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：１０ＳＣＭ−ｂＳＯＤ
ウシＣｕ，Ｚｎ型ＳＯＤ溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）、和光純薬製）１．０ｍｌに参考例２と同様にして得られた１０ＳＣＭのＮＨＳエステル１８．８ｍｇ（蛋白質１モルあたり１５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。次に、この反応液を２．０ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出した後、未修飾ＳＯＤを含まない目的画分を濃縮し、５．９ｍｇ／ｍｌの溶液を１２０μｌ得た（収率３５．４％）。さらにＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４水溶液を各々、１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加えて活性を回復した。
＜電気泳動＞
実施例１１と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
参考例５ 組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体の調製
配列番号３に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、特公平７−９６５５８に記載の方法により取得した。
上記のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＣｆＢＤ２８ ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７９）をＬＧ培地［バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース１ｇを水１Ｌに溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．０とする］で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４０．６％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、塩化ナトリウム０．５％、カザミノ酸０．５％、ＭｇＳＯ４１ｍｍｏｌ／Ｌ、ビタミンＢ１４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌに摂取し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ ２００、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで、３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
菌体残渣からマーストンらの方法［バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、第２巻、８００頁（１９８４年）］に準じ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例６ 組換え型ヒトインターフェロン−β（未修飾ｒｈＩＦＮ−β）の製造
ｒｈＩＦＮ−βは、水上ら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ、第８巻、６０５頁（１９８６年）］および久我ら［現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人］の方法に従って製造した。
ｒｈＩＦＮ−βをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭＧ−１を保有する大腸菌Ｋ−１２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−βの生産には２リッタージャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して数日間２０℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液から凍結融解法［ＤＮＡ、２巻、２６５頁（１９８３年）］で抽出液を調製した。さらに、菌体残渣から特開昭６１−６９７９９に開示された方法に従ってｒｈＩＦＮ−βを得た。
参考例７ 組換え型ヒトインターフェロン−γの製造
ｒｈＩＦＮ−γは、前記ｒｈＩＦＮ−βの製造法に準じ、伊藤ら［医科分子生物学、３５５頁（１９８７年）、南江堂］および久我ら（現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人］の方法に従って製造した。
ｒｈＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＹＰ１０を保有する大腸菌ｐＧＫＡ２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−γの生産には２リッタージャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して１〜２日間、３７℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ ２００、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで、３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
さらに、菌体残渣に尿素や塩酸グアニジン等の強力な蛋白質変性剤を加えてｒｈＩＦＮ−γを溶解した後に、マーストンらの方法［バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、２巻、８００頁（１９８４年）］に準じ、ｒｈＩＦＮ−γを抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例８ 従来型２本鎖分岐型ＰＥＧ試薬の調製
略号：５ＰＥＧ２ＧＡＢＡ
構造：
平均分子量５，０００のモノメトキシポリエチレングリコール［日本油脂（株）社製］２．０ｇ、酸化亜鉛４４４ｍｇ、乾燥ベンゼン１０ｍｌをナスフラスコに入れ、オイルバスで９０〜９５℃に加熱し、初留４ｍｌを除去した。さらに、５時間還流し、室温まで冷却後、塩化シアヌル３６ｍｇ、モレキュラーシーブス４Ａ１ｇを加え、３日間脱水還流した。反応液を冷却後、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を回収し、減圧乾燥した。得られた白色粉末１ｇをγ−アミノ酪酸３０ｍｇを含む０．１ｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ１０．０）１０ｍｌに溶解し、４℃で３日間反応した。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨを１〜２に調整した後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を濃縮し、ジエチルエーテルに滴下して生成した沈殿９３０ｍｇを回収した。これを９３０ｍｌの水に溶解し、８０ｍｌのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を回収し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ１〜２に調整した後、適当量のクロロホルムで抽出し、減圧濃縮した。濃縮液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を減圧乾燥し、目的物を６１８ｍｇ得た（収率６２％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様に分析した。
保持時間：１２．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９２），１．９５（ｍ，２Ｈ），５．６６（ｂｒｔ，Ｊ＝６．３３Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｂｒｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），３．６４（ｂｒｓ，８ｎＨ）
参考例９ 組換え型ヒト顆粒球コロニー形成刺激因子の調製
配列番号３に示したアミノ酸配列を有するｒｈＧ−ＣＳＦを参考例５に記載した方法に準じて調製した。
産業上の利用可能性
本発明の新規な分岐型の構造を有するポリアルキレングリコール類は生理活性ポリペプチド類の化学修飾試剤として有用である。さらに、該ポリアルキレングリコール修飾生理活性ペプチドは非修飾ペプチドと同様の生物活性を保持しているだけでなく、体内に投与されたときに長時間有効にその生理活性を示し、該生理活性に関連した症状の改善剤または治療剤として有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、化学修飾インターフェロン−βと未修飾インターフェロン−βをマウスに投与した場合の、各インターフェロン−βの血中濃度の推移を表す。図１において、符号（―◆―、―■―、―▲―、―〇―、―□―）は各々下記の意味を表す。
―◆―：未修飾ｒｈＩＦＮ−βをマウスに静脈内注射したときの血中濃度推移
―■―：５ＣＨＴＯ（２ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−βをマウスに静脈内注射したときの血中濃度推移
―▲―：５ＣＨＴＭ（２ＥＡ）−ｒｈＩＦＮ−βをマウスに静脈内注射したときの血中濃度推移
―○―：５ＣＨＴＣ（２ＡＡ）−ｒｈＩＦＮ−βをマウスに静脈内注射したときの血中濃度推移
―□―：１０ＳＣＭ−ｒｈＩＦＮ−βをマウスに静脈内注射したときの血中濃度推移
図２は、モルモットＥＡＥモデルにおける、グループ１（Ｎｏｒｍａｌ群）、グループ２（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、グループ３（ＩＦＮ−β投与群）、グループ４（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β投与群）のクリニカルスコアの変化を表す。図２において、符号（―○―、―●―、―□―、―■―）は各々下記の意味を表す。また値は平均値±標準偏差（ＳＥ）を意味し、＊はｐ＜０．０５（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群対比）を表す。
―〇―：グループ１（Ｎｏｒｍａｌ群）
―●―：グループ２（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群）
―□―：グループ３（ＩＦＮ−β投与群）
―■―：グループ４（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β投与群）

Claims (6)

  1. 式（Ｉ）
    （Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１）２Ｌ（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）ｑ（Ｉ）
    ｛式中、Ｌは式（ＩＩ−ａ）または（ＩＩＩ−ａ）
    で表される結合基から、水素原子が3〜5個取り除かれた式（ＩＩ ）または式（ＩＩＩ）
    で表される平面構造以外の環状構造を有する基を表し、
    uは１〜１０の整数を表し、
    uaは0〜8の整数を表し、
    R 11 、R 12 およびR 13 はそれぞれ同一または異なって、水素原子、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミルを表し、
    ＷはＣＨ ２ を表し、
    ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒは１〜１００，０００の整数を表し、ｓは１〜１００，０００の整数を表し）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、
    ｎは１０〜１００，０００の整数を表し、
    ｑは１〜３の整数を表し、
    Ｒ１は水素原子、低級アルキルまたは低級アルカノイルを表し、
    Ｒ２は水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィドまたはアジドを表し、
    Ｘ１は結合、Ｏ、Ｓ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは１〜８の整数を表す）、（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記ｔａと同義である）、ＮＲ３（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキルを表す）、Ｒ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５［式中、Ｒ４は結合、アルキレンまたはＯ（ＣＨ２）ｔｃ（式中、ｔｃは前記ｔａと同義である）を表し、Ｒ５は結合、アルキレンまたはＯＲ５ａ（式中、Ｒ５ａは結合またはアルキレンを表す）を表す］、Ｒ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７［式中、Ｒ６は結合、アルキレンまたはＲ６ａＯ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ５ａと同義である）を表し、Ｒ７は結合、アルキレンまたは（ＣＨ２）ｔｄＯ（式中、ｔｄは前記ｔａと同義である）を表す］、Ｒ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記Ｒ５ａと同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記Ｒ５ａと同義である）を表し、
    Ｘ２は結合、Ｏまたは（ＣＨ２）ｔｅＯ（式中、ｔｅは前記ｔａと同義である）を表し、
    Ｘ３は結合またはアルキレンを表し、
    ２つのＲ１−Ｍｎ−Ｘ１および１つ〜３つのＸ２−Ｘ３−Ｒ２はそれぞれ同一でも異なっていてもよい｝
    で表される分岐型ポリアルキレングリコール類。
  2. uが４である請求の範囲第1項記載の分岐型ポリアルキレングリコール類。
  3. ｑが１である請求の範囲第２項記載の分岐型ポリアルキレングリコール類。
  4. 分子量が５００〜１，０００，０００である請求の範囲第１項から３項のいずれかに記載の分岐型ポリアルキレングリコール類。
  5. 生理活性ポリペプチドまたはその誘導体が少なくとも1個の請求の範囲第１項〜４項のいずれかに記載の分岐型ポリアルキレングリコール類で直接もしくはスペーサーを介して修飾された化学修飾ポリペプチド。
  6. 生理活性ポリペプチドが酵素、サイトカインまたはホルモンである請求の範囲第５項記載の化学修飾ポリペプチド。
JP2001548589A 1999-12-24 2000-12-22 分岐型ポリアルキレングリコール類 Expired - Fee Related JP4593048B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP36631299 1999-12-24
PCT/JP2000/009159 WO2001048052A1 (fr) 1999-12-24 2000-12-22 Glycols de polyalkylene ramifies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP4593048B2 true JP4593048B2 (ja) 2010-12-08

Family

ID=18486472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001548589A Expired - Fee Related JP4593048B2 (ja) 1999-12-24 2000-12-22 分岐型ポリアルキレングリコール類

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7691367B2 (ja)
EP (1) EP1270642B1 (ja)
JP (1) JP4593048B2 (ja)
AT (1) ATE522563T1 (ja)
AU (1) AU2223401A (ja)
CA (1) CA2395254C (ja)
WO (1) WO2001048052A1 (ja)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020182172A1 (en) * 2000-11-30 2002-12-05 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of triazine derivatives
DE60236796D1 (de) 2001-01-30 2010-08-05 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Verzweigte polyalkylenglykole
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7144978B2 (en) * 2002-01-15 2006-12-05 Pan Asia Bio Co., Ltd. Multidrop tree branching functional polyethylene glycol, methods of preparing and using same
US20040136952A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
KR101238517B1 (ko) 2002-12-26 2013-02-28 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. 생물학적 효능이 향상된 인터페론-베타의 중합체 접합체
WO2004060965A2 (en) * 2002-12-31 2004-07-22 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
US7432331B2 (en) * 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
EP1587546A4 (en) * 2002-12-31 2007-02-14 Medtronic Minimed Inc HYDROPHILIC CROSSLINKING AGENTS FOR USE IN ENZYMATIC SENSORS
ES2420581T3 (es) 2003-03-14 2013-08-26 Biogenerix Gmbh Polímeros solubles en agua ramificados y sus conjugados
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
EP1666496B1 (en) * 2003-08-25 2014-03-12 Toray Industries, Inc. Interferon-beta composite
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
JP5743368B2 (ja) 2004-01-08 2015-07-01 ラショファーム ゲーエムベーハー ペプチドのｏ結合型グリコシル化
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
US20080176790A1 (en) 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20070154992A1 (en) 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
JP5216580B2 (ja) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリコペグ化第ｉｘ因子
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US20080242607A1 (en) 2006-07-21 2008-10-02 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
JP5515224B2 (ja) 2007-02-28 2014-06-11 日油株式会社 多分岐鎖ポリオキシアルキレン誘導体
KR20100016160A (ko) 2007-04-03 2010-02-12 바이오제너릭스 에이지 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
JP2011507913A (ja) * 2007-12-29 2011-03-10 バイオスティード ジーン エクスプレッション テック． カンパニー リミテッド Ｙ型ポリエチレングリコール修飾したｇ−ｃｓｆならびにその製造方法および使用
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
CN101809038B (zh) * 2008-04-03 2013-10-30 厦门伯赛基因转录技术有限公司 双链聚乙二醇修饰的生长激素及其制备方法和应用
JP5767207B2 (ja) 2010-03-26 2015-08-19 協和発酵キリン株式会社 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント
CN110591079B (zh) * 2018-06-13 2022-08-02 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 单官能化非线性聚乙二醇的制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0215041A (ja) * 1988-03-14 1990-01-18 Sandoz Ag アルキル及びアルケニルカテコール類のカルボキシレート類及びエトキシレート類
JPH04108827A (ja) * 1990-08-28 1992-04-09 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
JPH08510255A (ja) * 1993-05-10 1996-10-29 プロティン．デリバリー．インコーポレイテッド 接合−安定化ポリペプチド組成物
JPH09504299A (ja) * 1993-10-27 1997-04-28 エンゾン，インコーポレーテッド 非抗原性分枝ポリマー複合体
JPH10502401A (ja) * 1994-06-24 1998-03-03 エンゾン，インコーポレーテッド 非抗原性アミン誘導ポリマーおよびポリマー複合体
JPH11514396A (ja) * 1995-09-15 1999-12-07 ブラッコ・エッセ・ピ・ア 選択的に官能化しうるデスデンドリマー類

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4157384A (en) * 1972-01-28 1979-06-05 Wilkinson Sword Limited Compositions having a physiological cooling effect
JP2997004B2 (ja) 1989-05-26 2000-01-11 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5229366A (en) * 1990-10-23 1993-07-20 Fuji Photo Film Co., Ltd. Peptide-containing polyethylene glycol derivatives and application thereof
WO1996041813A2 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
DE19640092A1 (de) * 1996-09-28 1998-04-16 Beiersdorf Ag Strukturen mit Lipid-Doppelmembranen, in deren lipophilen Bereich längerkettige Moleküle eintauchen oder durch hydrophobe Wechselwirkungen an solche Moleküle angedockt sind
EA003789B1 (ru) 1998-04-28 2003-10-30 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0215041A (ja) * 1988-03-14 1990-01-18 Sandoz Ag アルキル及びアルケニルカテコール類のカルボキシレート類及びエトキシレート類
JPH04108827A (ja) * 1990-08-28 1992-04-09 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
JPH08510255A (ja) * 1993-05-10 1996-10-29 プロティン．デリバリー．インコーポレイテッド 接合−安定化ポリペプチド組成物
JPH09504299A (ja) * 1993-10-27 1997-04-28 エンゾン，インコーポレーテッド 非抗原性分枝ポリマー複合体
JPH10502401A (ja) * 1994-06-24 1998-03-03 エンゾン，インコーポレーテッド 非抗原性アミン誘導ポリマーおよびポリマー複合体
JPH11514396A (ja) * 1995-09-15 1999-12-07 ブラッコ・エッセ・ピ・ア 選択的に官能化しうるデスデンドリマー類

Also Published As

Publication number Publication date
CA2395254C (en) 2010-05-11
EP1270642A1 (en) 2003-01-02
EP1270642B1 (en) 2011-08-31
US20030219404A1 (en) 2003-11-27
WO2001048052A1 (fr) 2001-07-05
US7691367B2 (en) 2010-04-06
AU2223401A (en) 2001-07-09
CA2395254A1 (en) 2001-07-05
ATE522563T1 (de) 2011-09-15
EP1270642A4 (en) 2006-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4593048B2 (ja) 分岐型ポリアルキレングリコール類
US7547765B2 (en) Branched polyalkylene glycols
ES2866674T3 (es) Conjugados de una fracción de IL-2 y un polímero
KR102209395B1 (ko) 새로운 약물-단백질 접합체
AU2021258008A1 (en) Conjugates of an IL-15 moiety and a polymer
JP2022163194A (ja) Ｉｌ－７部分とポリマーとのコンジュゲート
JP2009503111A (ja) Ｇ−ｃｓｆ部分および重合体の複合体
JP2002517515A (ja) 二価抗体フラグメント
JP4142569B2 (ja) 軟膏剤
JP2006517995A (ja) 活性化されたポリエチレングリコールエステル類
KR100480432B1 (ko) Ｇ-ｃｓｆ와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
WO2005085283A1 (ja) 修飾インターロイキン−１１及びそれを含有する医薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070521

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070521

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100317

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100514

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100818

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20100915

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130924

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130924

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140924

Year of fee payment: 4

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees