JP2002517515A

JP2002517515A - 二価抗体フラグメント

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Publication number: JP2002517515A
Application number: JP2000553466A
Authority: JP
Inventors: チャップマン、アンドリュー、ポール; キング、デビッド、ジョン
Original assignee: セルテックセラピューティックスリミテッド
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2002-06-18
Anticipated expiration: 2019-06-08
Also published as: DE69922003T2; CA2330186A1; GB2354242B; EP1090037B1; WO1999064460A1; AU763246B2; CA2330186C; GB9812545D0; DE69922003D1; GB2354242A; EP1090037A1; ATE282637T1; GB0030176D0; AU4278399A; PT1090037E; JP4456758B2; DE19983347T1; US8067005B1; ES2232185T3

Abstract

(57)【要約】二価抗体フラグメントが記載されており、そのそれぞれは、ポリアルキレン、ポリアルケニレン、ポリオキシアルキレンまたは多糖類から選択された合成または天然に存在するポリマーを含有する、一つまたはそれ以上の分子鎖間架橋を有している。各架橋はホモまたはヘテロ二官能性架橋剤の残基であり、そして分子鎖中に存在するシステイン残基の硫黄原子を経て各抗原フラグメントの二つの重鎖をつなぐように働いている。各フラグメントは、一つないしそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子に連結され、そして、ポリマー分子の同じ数および型を有しているが、しかしポリマー分子が無作為に連結されている他の抗体フラグメントと比較するとき、著しく改善された結合および／または薬物動力学的性質を有しており、治療または診断に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、修飾二価抗体フラグメント、それらの製造方法、それらを含有する
組成物および医薬におけるそれらの使用に関する。

【０００２】抗体は、診断および治療目的のための臨床における使用が増加している。各々
の場合の目標は、抗体・抗原相互反応の高特異性と親和性の組合せを開拓するこ
と、検出を可能にすることおよび／または特定病変の治療、である。抗体は単独
で使用され、あるいは放射性同位元素または細胞毒性薬のような別の原子または
分子に負荷される。

【０００３】抗体の薬物動力学および生体分布は、臨床におけるその使用が成功であるかど
うかを決定する主要な役割を演じている。それゆえ、抗体は、その作用部位に運
搬されることができ、そしてその目的を達成するに好適な長さの時間そこに保持
されねばならない。また、その標的外では毒性値以下でのみ存在しなければなら
ないし、明確な形で代謝分解されねばならない。

【０００４】多くの使用のためには、抗体の薬物動力学は理想的でない。このことは、特に
、抗体−放射性同位元素または−薬物結合体を用いた腫瘍診断および治療につい
ては、真実である。そのような結合体を用いた診断のためには、長い半減期は、
腫瘍対バックグランドの比率が制限され、それで病変検出の感度が制限される。
治療のためには、長い半減期は、抗体結合体に対し正常組織の長期間曝露となり
、それゆえ線量限度毒性を来す。

【０００５】抗体の薬物動力学を取り扱うためには多くの手段が可能であり、それらは通常
それらの生体分布に影響する。最も単純で、最も一般的に応用され得る手段は、
抗体フラグメントの使用である。それらは、抗体全体ごとよりも循環から、より
急速に消失し、血液から組織に、より急速に分布し、これはいくつかの応用、例
えば腫瘍画像化および治療に、特に優れている。

【０００６】抗体フラグメントの薬物動力学を改善するために、更に我々はポリマーの使用
を研究した。ポリエチレングリコール（ＰＧＥ）のような重合物質のタンパク質
分子への結合はよく確立されており、ポリマーの結合は、タンパク質分子の薬理
学的性質を実質的に変化させることができることが明らかにされている。例えば
、タンパク質のＰＥＧ修飾は、タンパク質のｉｎｖｉｖｏ循環の半減期、抗原
性および免疫原性、溶解性、機械的安定性およびタンパク質分解に対する抵抗性
を変化させることができる［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔａｌ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２，３５７８−３５８１，３５８２−３５８６；
Ｎｕｃｃｉ，Ｍ．Ｌ．ｅｔａｌ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅ
ｖｉｅｗｓ（１９９１）６，１３３−１５１；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．ｅｔａｌ
．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．３（
Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｔ．ｅｄ．）；タンパク質製剤の安定性：タンパク質
安定化のための分解および戦略のインビボ的方法（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆ
ＰｒｏｔｅｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎｖｉｖｏＰａｔｈ
ｗａｙｓｏｆＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆ
ｏｒＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（１９９１）、２３５−
２６３頁（Ａｈｅｒｎ，Ｔ．Ｊ．およびＭａｎｎｉｎｇ，Ｍ．著）Ｐｌｅｎｕ
ｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ］。

【０００７】ＰＥＧのタンパク質分子への結合は、多くの異なった化学的方法を用いて達成
され、そのほとんどはＰＥＧのタンパク質の表面上のリジン残基または他のアミ
ノ酸残基への乱雑な結合である［Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．＆Ｌｅｅ，Ｃ．、ポ
リ（エチレングリコール）の化学：生物工学的および生物医学的応用（Ｐｏｌｙ
（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（１９９
２）、３４７−３７０頁（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．著），Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ］。これは、しばしば、タンパク質の機能の部分的損傷、例えば酵素
は触媒活性を減じてしまう［Ｎｕｃｃｉ，Ｍ．Ｌ．ら、同書］。

【０００８】ＰＥＧ結合部位を導入するためのタンパク質の部位特異的修飾は報告されてい
る。例えば、インターロイキン−２は、突然変異によって修飾され、通常グリコ
シル化されるスレオニン残基をＰＥＧの結合をさせるためにシステインによって
置換される［Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．＆Ｋａｒｔｅ，Ｎ．Ｖ．Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８，３４３−３４６］。通常グリコシル化され
る部位は、タンパク質構造の摂動なしにＰＥＧ修飾に耐えることができると考え
られていたので、選択された。別の例において、酵素プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼが、選択的にアルギニン残基をリジンに置換するよう修飾され、この例
では、酵素分子当り１８まで付加的な可能性のあるＰＥＧ結合部位をもたらした
［Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９９１）
，８８，７１８５−７１８９］。

【０００９】抗体および抗体フラグメントを用いたこれまでの研究では、リジン残基を経た
無作為ＰＥＧ結合［例えば、Ｌｉｎｇ，Ｔ．Ｇ．Ｉ．＆Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ
，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８３），５９，３２７−３３
７；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉ．ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ（
１９８７）１５，１７−２２；Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒＲｅｓ．（１９９１），５１，４３１０−４３１５；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．
ｅｔａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６），７３，１７５−１８２］お
よびチオール化誘導体［Ｐｅｄｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．ｅｔａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ（１９９４），７０，１１２６−１１３０］が用いられてきた。無作為結
合はしばしば、減少した親和性、結合活性または特異性で標的抗原と結合するこ
とだけができる修飾抗体を生みだした。このことを克服する一つの試みにおいて
、抗原結合（ＣＤＲ）ループにおいて臨界的リジン残基をアルギニンと置換して
免疫反応性のロスが少ない修飾を可能とした［Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．ｅｔａｌ．
ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）５，３２１−３２
６］。

【００１０】抗体のおよびヒンジ部領域における特異性部位は、エフェクターおよびレポー
ター分子の範囲の部位特異性結合を可能ならしめるように作り替えることができ
る［Ｌｙｏｎｓ，Ａ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９０），３，７０
３−７０９；ＥＰ特許明細書第３４８４４２号および第３４７４３３号］。本発
明者らは、無作為結合プロセスに前以て関連する免疫反応性の喪失を避けるため
に、二価抗体に対するポリマーの部位特異的結合を使用することができることを
、決定した。更に、このようにして修飾したフラグメントは、ポリマー分子の同
じ数および形で無作為に修飾したフラグメントと比較して、著しく改善された結
合および／または薬物動力学的性質を有していた。

【００１１】それゆえ、本発明の一観点によれば、我々は、二つの抗体重鎖および共有結合
した少なくとも一つのポリマー分子を含み、各重鎖は、一方の鎖のシステイン残
基の硫黄原子が他方の鎖のシステイン残基の硫黄原子に結合した、少なくとも一
つの非ジスルフィド分子鎖間架橋によって他に共有結合しており、該システイン
残基は各鎖の可変部ドメインの外側に配置されている、ことを含む二価抗体フラ
グメントで、少なくとも、一つの非ジスルフィド分子鎖間架橋が共有結合したポ
リマー分子を有することを特徴とする二価抗体フラグメント、を提供する。

【００１２】ここで使用される、用語「非ジスルフィド」は、例えば、抗体に普通に見出さ
れるようなＳ−Ｓ架橋は除かれるという意味を意図している。本発明によるフラ
グメントに存在するタイプの分子鎖間架橋は、しかしながら、以下に記載するよ
うなＳ−Ｓ結合を経由して重鎖に結合されている。

【００１３】本発明の抗体フラグメントは、一般的に、抗原に選択的に結合することができ
る。抗原は、いずれも細胞関連抗原でもよく、例えば、Ｔ細胞、内皮細胞または
腫瘍細胞マーカーのような細胞表面抗原であり、あるいは可溶性抗原である。細
胞表面抗原の特別な例は、接着分子、例えば、β１インテグリン、例えばＶＬＡ
−４のようなインテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンまたはＬ−セレク
チン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１
１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３
８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒ
ト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１および２）、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラ
スＩＩ抗原、およびＶＥＧＦ、ならびに適切なこれらのレセプター、を包含する
。可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−
６、ＩＬ−８またはＩＬ−１２のようなインターロイキン、ウイルス抗原、例え
ばＲＳウイルスまたはサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇ
Ｅ、インターフェロン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−βま
たはインターフェロン−γ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、コロニー刺激因
子、例えばＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ、および血小板由来増殖因子、例えば
ＰＤＧＦ−α、およびＰＤＧＦ−β、ならびに適切なそれらのレセプター、を包
含する。各抗原は、例えば、ヒト抗原である。

【００１４】本発明による特別な抗原フラグメントは、特に後記する実施例に記載された腫
瘍壊死因子αおよび血小板由来増殖因子、およびこれらのレセプター、に選択的
に結合するものを包含する。

【００１５】有用な抗原結合性質を達成するために、本発明によるフラグメント中の各重鎖
は、相補的抗体軽鎖またはそのフラグメントと対を成している、そして本発明は
、そのような構成に延長されている。所望により、重鎖−軽鎖対は、共役結合で
あり、例えば、天然に存在する抗体中に見出されるジスルフィド結合および／ま
たは例えば組替え一本鎖抗体中に見出されるようなペプチド結合、であり得る。

【００１６】一般的に、各重鎖および、存在するならば、軽鎖は、可変部領域を有する。こ
こで使用される用語、「可変部領域」は、抗原結合部位を含有する重鎖または軽
鎖の部分を意味することを意図している（以後、Ｖ_HまたはＶ_L領域と云う）。Ｖ _H またはＶ_L領域は、いかなるサイズまたはアミノ酸組成でもよく、一般的に、少
なくとも一つの、枠組み配列中に埋め込まれた抗原結合の原因である、超可変ア
ミノ酸配列を含む。

【００１７】各Ｖ_HまたはＶ_L領域は、いかなる天然に存在する可変部またはそれらの遺伝子
工学処理変化物でもよい。遺伝子工学処理変化物によるとは、組換えＤＮＡ工学
技術を用いて創造された可変部領域を意味している。そのような遺伝子工学処理
変化物は、例えば、天然抗体のアミノ酸配列においてまたはそれに対して挿入、
欠失または交換によって天然の抗体可変部から創造されたものを包含する。この
タイプの特別な例としては、少なくとも一つのＣＤＲ、および、所望により、一
つまたはそれ以上の枠組みアミノ酸および第二の抗体からの可変部領域の残部、
を含有する遺伝子工学処理されたＶ_HまたはＶ_L領域を包含する。

【００１８】各Ｖ_H領域は、一般的に、少なくとも一つのシステイン残基に共有結合されて
いる。各システイン残基の位置は、必要な抗体フラグメントのサイズおよび性質
に従って変化する。それゆえ、極端な一例では、システイン残基は、Ｖ_H領域の
Ｃ末端アミノ酸に直接結合している。このタイプの二つのＶ_H領域は、かくして
、本発明のフラグメントを形成するように架橋される。

【００１９】しかしながら、実際には、Ｖ_H領域は、Ｃ末端アミノ酸において、システイン
残基を含有する少なくとも一つの別の抗体領域またはそのフラグメントに共有結
合していることが一般的に好ましい。それゆえ、例えば、Ｖ_H領域は、免疫グロ
ブリンＣ_H１領域またはそのフラグメントに結合している。ＣＨ１領域は、例え
ば免疫グロブリンに一般に見出されるようなヒンジ部領域を提供するように、ま
たは更に、例えば抗体ＣＨ２およびＣＨ３領域のような、領域を提供するように
、更にアミノ酸で延長され得る。上記の場合の各々において、少なくとも一つの
システイン残基が、ポリマー分子を含有する分子鎖間架橋のための架橋部位を形
成するどのような領域を通してどのような点に位置することができる。

【００２０】同様に、本発明によるフラグメント中に存在するいかなるＶ_L領域も、抗体軽
鎖定常部（Ｃ_L）またはそのフラグメントに結合することができる。

【００２１】本発明によるフラグメント中に存在するポリマーは、一般的に、合成または天
然に存在するポリマー、例えば、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリア
ルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーまたは、分枝
または非分枝多糖類、例えばホモまたはヘテロ多糖類、である。

【００２２】上に挙げた合成ポリマー上に存在する特別な任意の置換基は、一つないしそれ
以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基を包含している。合成ポリマーの特
別の例は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）
、ポリ（プロピレングリコール）、またはポリ（ビニルアルコール）およびそれ
らの誘導体、特に、置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えば
メトキシ（エチレングリコール）およびそれらの誘導体である。特別な天然に存
在するポリマーは、乳糖、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンおよび
これらの誘導体を包含する。ここに使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例
えばスクシンイミドエステル等のような活性エステルを包含することを意図して
いる。反応性基は、ポリマーに直接またはリンカーセグメントを通してポリマー
に結合している。そのような基の残基は、ある種の例では、ポリマーおよび分枝
鎖間架橋の間を結合する基として本発明の生成物の部分を形成する。

【００２３】ポリマーのサイズは、記載したように変化し得る、しかし、一般的に、およそ
５００Ｄａからおよそ５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、そ
して２５０００から４００００Ｄａを含む範囲の平均分子量である。ポリマーサ
イズは、特に、生成物の意図する使用を基にして選択される。それゆえ、例えば
、生成物を循環および浸透組織に残存させることを意図する場合、例えば、腫瘍
の治療に使用するためには、小分子量のポリマー、例えばおよそ５０００Ｄａ、
を使用することが有利である。生成物が循環中に残るような応用のためには、高
分子量のポリマー、例えば２５０００Ｄａないし４００００Ｄａの範囲、を使用
することが有利である。

【００２４】一般的に、本発明による抗体フラグメントにおける各ポリマー分子は分枝鎖間
架橋の部分を形成する。各架橋は、二つの重鎖をつなぐように働き、そして各鎖
においてはシステイン残基の硫黄原子に共有的につながっている。共有結合は、
一般的に、ジスルフィド結合または、特に、硫黄−炭素結合である。

【００２５】各分枝鎖間架橋は、一般的に、どんな所望の長さまたは組成であってもよい。
好適な架橋は、ホモまたはヘテロ官能性架橋剤、特に、丁度先程記載したような
一つないしそれ以上の共有結合したポリマー分子を含有するホモまたはヘテロ二
官能性架橋剤、を包含する。

【００２６】ホモまたはヘテロ官能性架橋剤は、多価、特に、二つのチオール反応性官能基
を含有する、脂肪族、ヘテロ脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、芳香
族またはヘテロ芳香族基の、二価基を包含する。本発明による各フラグメントは
、各チオール反応性官能基がシステイン残基の硫黄原子と共有結合にあるような
試薬から誘導された分枝鎖間架橋を有している。特別なチオール反応性官能基は
、αハロカルボキシル酸またはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、
例えばマレイミド、ビニルスルフォンまたはジスルフィド、を包含する。

【００２７】特別な架橋は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ_4-20アルキレン、
Ｃ_4-20アルケニレンまたはＣ_4-20アルキニレン鎖を包含し、これらは一つまたは
それ以上のヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、例えば、−Ｏ−または−Ｓ−原
子または−Ｎ（Ｒ¹）−［ここで、Ｒ¹は、水素原子またはＣ_1-6アルキル基］、
−ＣＯＮ（Ｒ¹）−，−Ｎ（Ｒ¹）ＣＯ−、−ＳＯ₂Ｎ（Ｒ¹）−，−Ｎ（Ｒ¹）Ｓ
Ｏ₂−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）₂−、−ＯＣＯＮ（Ｒ¹）−、
−Ｎ（Ｒ¹）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−基により、またはシクロペンチレン
、シクロヘキシレン、フェニレンまたは置換フェニレン基によって中断されてい
てもよい。任意の置換基は、例えば、一つまたはそれ以上のアミノ基または置換
アミノ基、例えば、−Ｎ（Ｒ¹）₂基、ここで各Ｒ¹原子または基は同じかまたは
異なる、を包含する。

【００２８】ポリマーは、分枝鎖間架橋中の任意の位置に、一般的には、特定の分枝鎖間架
橋に関して先程記載したヘテロ原子またはヘテロ原子含有基を通して、共有結合
している。

【００２９】本発明による特別に有用なフラグメントは、単一の分枝鎖間架橋を含有するも
のである。これら特別のフラグメントにおいて、ポリマーは、特に合成ポリマー
であり、特にポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、ま
たは特にメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、そして
特に約２５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量のものである。架橋
は、特に、前記したように、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ_4-20ア
ルキレン鎖で、一つまたはそれ以上のヘテロ原子またはヘテロ原子含有基によっ
て中断されていてもよい。

【００３０】本発明によるフラグメント中の各重鎖は、好ましくは、例えば、免疫グロブリ
ン中に天然に見出される、ヒンジ部ドメインによって末端が置換されたＶ_H−Ｃ
Ｈ１鎖である。各鎖は、好ましくは、軽鎖と対をなしており、特にＶ_H−Ｃ_L鎖、
それゆえ、例えば、Ｆａｂ’フラグメントである。そのようなタイプの重鎖また
は重鎖−軽鎖対を含有する本発明の好ましいフラグメントにおいては、特に各重
鎖のヒンジ配列に位置するシステイン残基を架橋する、一つの分子鎖間架橋が存
在する。これは、各ヒンジ配列中に存在する唯一のシステイン残基であることが
望ましい。

【００３１】所望ならば、本発明による抗体フラグメントは、更に、それに結合した一つま
たはそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子を有し、そして本発明はその
ような修飾抗体にも拡張される。エフェクターまたはレポーター分子は、フラグ
メント中に位置している得られ得るアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例
えば、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、を通して抗体
フラグメントに結合している。

【００３２】エフェクター分子は、例えば、抗腫瘍剤、トキシン（例えば、細菌または植物
由来の酵素的活性トキシンおよびそれらのフラグメント、例えば、リシンまたは
そのフラグメント）、生理活性タンパク質、例えば酵素、核酸およびこれらのフ
ラグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらのフラグメント、放射性核種、
特に放射性ヨード、およびキレート金属、を包含する。好適なレポーター基は、
キレート金属、蛍光化合物またはＮＭＲまたはＥＳＲ分光法によって検出される
化合物を包含する。

【００３３】特別の抗腫瘍剤は、細胞毒性および細胞分裂阻止剤、例えば、アルキル化剤、
例えばナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、メルファラン、メ
クロルエタミン、シクロフォスファミド、またはウラシルマスタード）およびこ
れらの誘導体、トリエチレンフォスフォルアミド、トリエチレンチオフォスフォ
ルアミド、ブスルファン、またはシスプラチン；抗代謝剤、例えば、メトトレキ
セート、フルオロウラシル、フロキシウリジン、シタラビン、メルカプトプリン
、チオグアニン、フルオロ酢酸またはフルオロクエン酸、抗生物質、例えば、ブ
レオマイシン類（例えば、硫酸ブレオマイシン）ドキソルビシン、ダウノルビシ
ン、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン類（例
えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリケマイシンおよびその誘導体
、またはエスペラマイシンおよびその誘導体；分裂阻害剤、例えば、エトポシド
、ビンクリスチンまたはビンブラスチンおよびそれらの誘導体；アルカロイド類
、例えば、エリプチシン；ポリオール類、例えばタキシシン−Ｉまたはタキシシ
ン−ＩＩ；ホルモン類、例えばアンドロゲン類（例えば、ドロモスタノロンまた
はテストラクトン）、プロゲスチン類（例えば、酢酸メゲストールまたは酢酸メ
ドロキシプロゲステロン）、エストロゲン類（例えば、ジメチルスチルベストロ
ール二リン酸、リン酸ポリエストラジオールまたはリン酸エストラムスチン）ま
たは抗エストロゲン類（例えば、タモキシフェン）；アントラキノン類、例えば
ミトキサントロン、尿素類、例えばヒドロキシウレア；ヒドラジン類、例えばプ
ロカルバジン；またはイミダゾール類、例えばダカルバジン、を包含する。

【００３４】特別に有用なエフェクター群は、カリケマイシンおよびその誘導体である（例
えば、南ア特許明細書第８５／８７９４号、第８８／８１２７号および第９０／
２８３９号を見よ）。

【００３５】キレート金属は、２から８（両端の数値を含む）の配位数を有する二価または
三価の陽イオン金属を包含する。そのような金属の特別の例は、テクネチウム（
Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（
Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ
）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、および
スカンジウム（Ｓｃ）を包含する。一般的に、金属は、好ましくは、放射核種で
ある。特別な放射核種は、^99mＴｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、⁵⁸Ｃｏ、⁶⁰Ｃｏ、⁶⁷Ｃ
ｕ、¹⁹⁵Ａｕ、¹⁹⁹Ａｕ、¹¹⁰Ａｇ、²⁰³Ｐｂ、²⁰⁶Ｂｉ、²⁰⁷Ｂｉ、¹¹¹Ｉｎ、⁶⁷Ｇ
ａ、⁶⁸Ｇａ、⁸⁸Ｙ、⁹⁰Ｙ、¹⁶⁰Ｔｂ、¹⁵³Ｇｄおよび⁴⁷Ｓｃ、を包含する。

【００３６】キレート金属は、好適なポリデントキレート化剤、例えば、鎖状または環状ポ
リアミン、ポリエーテル、（例えばクラウンエーテルおよびそれらの誘導体）；
ポリアミド；ポルフィリン；および炭素環状誘導体、でキレートされた金属の、
例えば、上記のタイプの一つである。

【００３７】一般的に、キレート化剤のタイプは、使用する金属による。本発明による共役
体におけるキレート化剤の特に有用な群は、しかしながら、鎖状および環状ポリ
アミン、特に、ポリアミノカルボン酸、例えばジエチレントリアミン五酢酸およ
びその誘導体、および大環状アミン、例えばサイクリックトリアザおよびテトラ
アザ誘導体（例えば、国際公開特許明細書ＷＯ第９２／２２５８３号に記載され
たように）；およびポリアミド、特にデスフェリオキシアミンおよびその誘導体
）である。

【００３８】本発明による抗体フラグメントは、Ｖ_H領域の外側に位置する重鎖反応性シス
テイン残基を含有する抗体フラグメントをここに定義したようなポリマーを含有
するチオール選択性架橋試薬と反応することによって製造される。反応は、一般
的に、溶媒中、例えば酢酸またはリン酸バッファーのような水性バッファー溶液
、で、およそ中性ｐＨ，例えばおよそｐＨ４．５ないしｐＨ８．０で、例えば室
温で、実施される。抗体は、一般的に、架橋試薬の濃度に比較して過剰の濃度が
採用される。ある種の例では、適切に反応性システイン残基を発生させるためβ
−メルカプトエチルアミンのような試薬と共に、出発物質の抗体を減らす必要が
ある（例えば、後記する実施例１に記載のように）。必要ならば、所望の生成物
は、未反応の出発物質または製造プロセス中に生じたその他の望ましくない生成
物から常法、例えばクロマトグラフィによって、分離することができる。

【００３９】抗体フラグメント出発物質は、［常法の免疫化および細胞融合手段によって調
製される］いかなる抗体全体ごと、特にモノクローナル抗体全体ごとからも、例
えば、ペプシン処理による、好適な標準的酵素開裂および／または消化技術を用
いて、得ることができる。代りに、抗体フラグメント出発物質は、抗体可変部お
よび／または定常部をコードするＤＮＡの操作および再発現を含む、組換えＤＮ
Ａ技術の使用によって調製することができる。そのようなＤＮＡは、公知および
／または、例えば、ファージ・抗体ライブラリー［Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．
ａｎｄＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．Ｔｉｂｔｅｃｈ．１０，８０−８４（１９
９２）を参照］を含むＤＮＡライブラリーから容易に得られる、または所望によ
り合成することができる。標準分子生物学および／または化学手段は、ＤＮＡの
配列決定および操作するのに、例えば、システイン残基を創造するのにコドンを
導入するため、他のアミノ酸または領域を所望のように修飾、付加または除去す
るために、使用することができる。

【００４０】ここからは、ＤＮＡを含有する一つまたはそれ以上の複製し得る発現ベクター
が、適切な細胞系、例えば、抗体フラグメントの産生が起こる、非産生ミエロー
マ細胞株、例えばマウスＮＳＯ系または細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ株、を形質転
換するために調製および使用することができる。効率的な転写および翻訳を得る
ために、各ベクターのＤＮＡ配列は、適切な制御配列、特に可変領域配列に操作
可能に結合したプロモーターおよびリーダー配列、を含んでいなければならない
。この方法で、抗体フラグメントを製造する特別な方法は、一般的によく知られ
ており、常法として使用されている。例えば、基礎的な分子生物学手段は、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら［分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏ
ｒｋ、１９８９］に記載されており；ＤＮＡ配列決定はＳａｎｇｅｒら［ＰＮＡ
Ｓ，７４，５４６３（１９７７）］およびＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌｐｌｃｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋに記載されたよ
うにして実施することができる；および部位特異的突然変異誘発は、Ｋｒａｍｅ
ｒら［Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，９４４１，（１９８４）］および
ＡｎｇｌｉａｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄｈａｎｄｂｏｏｋの方
法に従って実行することができる。更に、ＤＮＡの操作によって抗体を調製する
ために適した技術、発現ベクターの創生および好適な細胞の形質転換の詳細につ
いては、例えば、ＭｏｕｎｔａｉｎＡ．およびＡｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．生物工
学および遺伝工学総説（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃ
ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｖｉｅｗｓ）[Ｔｏｍｂｓ，Ｍ．Ｐ．編、１０
巻，１章，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｄｎｏｖｅｒ，ＵＫ]により、そ
してＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９１／０９９６７号において総説されているよ
うに、特許明細書を含め、多くの刊行物がある。

【００４１】本発明による抗体フラグメントの調製において使用するためのチオール選択的
架橋試薬は、（例えば、α−ハロカルボン酸またはエステル、例えばヨードアセ
タミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルフォン、またはジスルフィドの
ようなチオール反応性基を含有する）チオール選択的架橋剤を適切に機能化した
ポリマーと反応することによって得ることができる。好適なポリマー出発物質は
、市販品（例えば、ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃ．、Ｈｕ
ｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ，ＵＳＡから）得られ、または、市販品の出発物質から
常法の化学手段、例えばＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ＆Ｌｅｅ，Ｃ．同書、によって記
載されたようにして、を用いて製造することができる。反応は、一般的に、機能
化されたポリマー、例えばポリマーの活性エステル、と架橋試薬中に存在する適
切な官能基、例えばアミン、の間での常法のカップリング反応である。標準的な
反応条件が、例えば、活性エステルとアミンのカップリングについて後記の実験
の部において記載するように、使用される。好適な架橋試薬は、市販のものから
容易に得られ、または、市販の材料から常法手段を用いて、例えば、ＥＰ特許明
細書第３８４６２４号およびＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９２／２２５８３号お
よび後記の実験の部に記載するように、簡単に合成することができる。

【００４２】エフェクターまたはレポーター分子に結合した、本発明による抗体フラグメン
トを得ようとする場合は、抗体フラグメントが直接またはカップリング剤を経由
して、適切な活性ポリマーとの反応前または後のいずれかにエフェクターまたは
レポーター分子に結合する、標準的化学または組替えＤＮＡ手段によって、製造
することができる。特別の化学的手段は、例えば、ＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第
９３／０６２３１号、ＷＯ第９２／２２５８３号、ＷＯ第９０／０９１９５号お
よびＷＯ第８９／０１４７６号に記載された方法を包含する。代りに、エフェク
ターまたはレポーター分子が、タンパク質またはポリペプチドである場合、結合
は、例えば、ＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第８６／０１５３３号およびＥＰ特許明
細書第３９２７４５号に記載されているように、組換えＤＮＡ手段を用いて達成
することができる。

【００４３】本発明による抗体フラグメントは、多くの疾病または疾患の検出または治療に
おいて有用である。そのような疾病または疾患は、感染症、例えばウイルス感染
；炎症性疾患／自己免疫、例えば関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患；
癌；アレルギ―性／アトピー性疾患、例えば喘息、湿疹；先天性疾病、例えば嚢
胞性線維症、鎌状赤血球貧血；皮膚病、例えば乾癬；神経疾患、例えば多発性硬
化症；移植、例えば臓器移植拒絶、移植片対宿主病；および代謝性／特発性疾患
、例えば糖尿病、の一般標題の基に記載されているものに包含されている。

【００４４】本発明による抗体フラグメントは、治療および／または診断において使用され
るように製剤化することができ、本発明の更なる観点によれば、我々は、共有結
合中に一価抗体フラグメントおよび少なくとも一つのポリマー分子を含む修飾一
価抗体フラグメントを含む医薬組成物であって、各共有結合が、フラグメントの
可変部領域の外側の抗体フラグメント中に位置しているシステイン残基の硫黄原
子を経由し、それと共に、一つないしそれ以上の医薬として許容される賦形剤、
稀釈剤または担体を有していることを特徴とする、医薬組成物を提供する。

【００４５】上記に説明したように、本発明のこの観点における抗体フラグメントは、一つ
ないしそれ以上のエフェクターまたはレポーター基に結合していてもよい。

【００４６】医薬組成物は、投与のためのどのような好適な形態をも取ることができ、そし
て、好ましくは、例えば注射または点滴、例えばボーラス注射または連続点滴に
よる、非経口投与に適した形態である。組成物が注射または点滴用である場合、
油性または水性ベヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ること
ができ、そして、処方用剤、例えば懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散
剤を含有することができる。

【００４７】代りに、抗体組成物は、適切な滅菌溶液と共に使用前に再構成するような乾燥
形態であってもよい。

【００４８】もし、抗体組成物が、経口投与に適したものであれば、製剤は、有効成分に加
えて、添加剤、例えば、澱粉、例えば馬鈴薯、トウモロコシまたは小麦澱粉また
はセルロースまたは澱粉誘導体例えば微結晶セルロース；シリカ；種々の糖類、
例えば乳糖；炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウム、を含有するこ
とができる。もし、製剤が経口投与用であるなら、患者の消化系に充分に耐え得
るようであることが望ましい。そのために、製剤に粘液形成剤および樹脂を含有
することが望ましい。また、胃液中で不溶であるカプセル中に抗体を製剤化する
ことによって耐性を改善することが望ましい。また、更に、制御放出製剤に抗体
または組成物を含有することが好ましい。

【００４９】抗体組成物が、直腸投与に適するためには、製剤は、結合剤および／または滑
沢剤；例えば、高分子化グリコール、ゼラチン、ココアバターまたはその他の植
物ワックスまたは脂肪、を含有する。

【００５０】本発明による治療および診断用途は、典型的には、ヒト患者に抗体フラグメン
トの有効量を投与することを含む。投与されるべき正確な量は、抗体の使用およ
び患者の年齢、性および状態に従って変化するが、しかし、典型的には、約０．
１ｍｇから１０００ｍｇ、例えば約１ｍｇから５００ｍｇと変化し得る。抗体は
、単回投与または時間をかけて連続投与により投与され得る。投与は、適切に繰
返すことができる。典型的な一回投与量は、例えば、単回の治療投与当り０．１
−５０ｍｇ／ｋｇ体重の間、特に単回の治療投与に対し０．１−２０ｍｇ／ｋｇ
体重の間であり得る。

【００５１】以下の実施例は本発明を例示するものである。

【００５２】以下の略号が使用される。ＰＥＧ：ＣＨ₃Ｏ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₂− ＤＦＭ−ＰＥＧ：２つのＦａｂ’フラグメントがＰＥＧ化ジマレイミド架橋と架
橋されている本発明による抗体フラグメント。ＤＴＰＤ：４，４’−ジチオジピリジンＡＵＣ：血中濃度−時間曲線下面積ＲＴ：室温ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸ＢＯＣ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルＣＢＺ：カルボキシベンジルオキシＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＥＤＣ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドＢＭＨ：ビスマレイミドヘキサンＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水

【００５３】中間体架橋基の調製

【００５４】

【化１】

【００５５】Ｎ（α）Ｎ（ε）ジ−ＣＢＺ−（Ｌ）−リジン（１８．０ｇ、４３．３ｍＭ）
を無水ＤＭＦ（８０ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ＢＯＣ−１，６−ジアミノヘキサン
塩酸塩（１１．０６、４３．７５ｍＭ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
（６．４３ｇ、４７．６３ｍＭ）、４−メチルモルホリン（５．２ｍｌ、４７．
６３ｍＭ）およびＥＤＣ（９．１３ｇ、４７．６３ｍＭ）を加え、そして混合物
を室温で５時間攪拌した。反応混合物をＨ₂Ｏ中に加え、酢酸エチル（４Ｘ１０
０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、１０％クエン酸（２Ｘ５０ｍｌ）、飽和
ＮａＨＣＯ₃（２Ｘ５０ｍｌ）食塩水（１Ｘ５０ｍｌ）で洗滌し、ＭｇＳＯ₄で乾
燥した。溶媒を減圧除去して、中間体１（２６．１５ｇ、１００％）を白色固体
として得た。¹ＨＮＭＲ（（ＣＤ₃）₂ＳＯ）δ７．７９（１Ｈ、ｔ）、７．３８
−７．１９（１１Ｈ、ｍ）、６．７２（（１Ｈ、ｔ）、５．００−４．９９（４
Ｈ、ｍ）、３．９５−３．９０（１Ｈ、ｍ）、３．０８−２．８７（６Ｈ、ｍ）
および１．６０−１．０５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。

【００５６】

【化２】

【００５７】中間体１（２６．１５ｇ、４２．７ｍＭ）をエタノール（７００ｍｌ）に溶解
（加温しつつ）し、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．２ｇ）にて処理した。反応は、温水バ
ス（〜３０℃）中で４時間Ｈ₂ガス下に攪拌し、次いで冷却した。ＣＨ₂Ｃｌ₂（
２０ｍｌ）を加え、混合物を濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂およびエタノールでよく洗滌し
た。溶媒を減圧下除去して、中間体２を油状泡沫として得た（１３．８ｇ、９４
％）。¹ＨＮＭＲ（（ＣＨ₃）₂ＳＯ）δ７．７８（１Ｈ、ｔ）、３．０６−２．
９１（３Ｈ、ｍ）、２．８９−２．８４（４Ｈ、ｍ）、２．５２−２．４３（４
Ｈ、ｂｓ）および１．５７−１．１５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。

【００５８】

【化３】

【００５９】中間体２（１．４７ｇ、４．４７ｍＭ）を、無水ＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し
、そしてＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネート（２２．３８ｇ、
８．９７ｍＭ）を加えた。反応混合物を、室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧下
除去し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）を加え、次いで飽和ＮａＨＣＯ₃（５０
ｍｌ）を加えた。層を分離し、水層をＣＨ₂Ｃｌ₂（２Ｘ５０ｍｌ）で洗滌した。
有機層を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ₃（２Ｘ５０ｍｌ）で洗滌し、そしてＭｇＳＯ₄ で乾燥した。溶媒を減圧除去して、残渣をジエチルエーテルにて処理し、得られ
た固体を濾過し、ジエチルエーテルで、よく洗滌して、乾燥し、中間体３（２．
０５ｇ、７４％）を白色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（（ＣＤ₃）₂ＳＯ）δ８．
０５（１Ｈ、ｄ）、７．７５（１Ｈ、ｔ）、６．９８（４Ｈ、ｓ）、６．７２（
１Ｈ、ｂｔ）、４．２１−４．０７（１Ｈ、ｍ）、３．６２（４Ｈ、ｔ）、３．
１２−２．８１（８Ｈ、ｍ）、２．４１（２Ｈ、ｔ）および１．５５−１．０５
（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。マススペクトル、ＥＳ＋ｖｅ６６９（ＭＮａ ⁺ 、１００％）、６．４７（ＭＨ⁺、２０％）、５４７（ＭＨ⁺、−Ｃ₅Ｈ₈Ｏ₂、１
５％）。

【００６０】

【化４】

【００６１】中間体３（０．３ｇ、０．４６ｍＭ）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＴＦＡ（１０ｍｌ）の
１：１混合物に溶解し、３４５分、室温で攪拌した。溶媒を減圧下除去して、残
渣をトルエン（３Ｘ５ｍｌ）で共沸した。酢酸エチルを加え、固体を得て濾過し
、酢酸エチル次いでジエチルエーテルでよく洗滌し、減圧下乾燥して中間体４を
白色固体として得た（０．２１ｇ、６８％）。¹ＨＮＭＲ（（ＣＤ₃）₂ＳＯ）δ
８．０３（１Ｈ、ｄ）、７．９０（１Ｈ、ｔ）、７．８０（１Ｈ、ｔ）、７．６
９（２Ｈ、ｂｓ）、６．９９（４Ｈ、ｓ）、４．０９（１Ｈ、ｍ）、３．５８（
４Ｈ、ｔ）、３．３３（ＨＯＤ）、３．１０−２．９３（４Ｈ、ｍ）、２．７６
（２Ｈ、ｂｍ）２．４１−２．２７（４Ｈ、ｍ）および１．５１−１．００（１
４Ｈ、ｍ）。

【００６２】実施例１ＰＥＧ化（４０ＫＤａ）架橋基の調製ＤＭＦ中の中間体４に、Ｎ−メチルモルフォリンの１モル当量、および、アミ
ン反応性ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ＰＥＧ−ＮＨＳエステル；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
ＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）の５倍モ
ルを加えた。混合物を、時々攪拌しながら、２時間室温でインキュベートした。
未反応のＰＥＧは、２ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．
０、中の１Ｍグリシン保存溶液から、ＰＥＧに対し１００倍モル過剰のグリシン
を加えて不活性化し、そして、混合物を更に１０分だけインキュベートして、所
望のＰＥＧ化架橋基を得た。

【００６３】Ｆａｂ’の調製ヒトＰＤＧＦβレセプター（以下、ＰＤＧＦβＲ）を認識する、遺伝子操作処
理ヒト抗体ｇ１６２からのＦａｂ’を、ＰＣＴ国際特許明細書ＰＣＴ／ＧＢ９７
／０３４００に記載されたようにして、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた。Ｆａｂ’フ
ラグメントは、架橋に使用できるヒンジ部領域中に存在する単一のシステイン残
基を有している。細胞を、遠心分離によって醗酵培養から収穫し、１０ｍＭ・Ｅ
ＤＴＡを含有する１００ｍＭトリス、ｐＨ７．４、に細胞を再懸濁することによ
って、Ｆａｂ’を抽出し、６０℃で一夜インキュベートした。Ｆａｂ’を、１Ｍ
グリシン／グリシネート、ｐＨ８．０、で前平衡化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ・
ＡＴＭ（ファルマシア）のカラムを用いて拡張床クロマトグラフィによって精製
した。試料を、グリシンに関して１Ｍにし、そして、拡張床法でカラムに適用す
る前に、５０％（ｗ／ｖ）ナトリウムグリシネートでｐＨを７．５に調節した。
平衡化バッファーで洗滌後、カラムの材料を充填床に充填し、Ｆａｂ’を０．１
Ｍクエン酸、ｐＨ３．０、で溶出した。

【００６４】更なる精製は、２Ｍトリスで、溶出液のｐＨを７．５に調節し、リン酸塩緩衝
食塩水、ｐＨ７．４、で前平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ・Ｇセファロースのカラム
に適用することによって、達成された。平衡化バッファーで洗滌後、Ｆａｂ’を
０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７、で溶出した。溶出したＦａｂ’のｐＨ
を、次いで、２Ｍトリスで６．０に調節した。

【００６５】抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ（部位特異的）の調製精製した抗ＰＤＧＦβＲ・Ｆａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バ
ッファー、ｐＨ６．０、中に透析濾過した。ヒンジチオールをβ−メルカプトエ
チルアミンで還元して活性化した。Ｆａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有、０．１Ｍ
リン酸バッファー、ｐＨ６．０、中で、５ｍＭβ−メルカプトエチルアミンと３
７℃、３０分間、インキュベートした。試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５（
ＰＤ１０）カラムを用いて、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、
ｐＨ６．０、中に脱塩した。Ｆａｂ’分子当りのチオール基の数は、以前記載さ
れた［Ｌｙｏｎｓら、（１９９０）、同書］ようにしてＤＴＤＰで滴定すること
によって測定した。Ｆａｂ’を、中間体４から調製したＰＥＧ化クロスリンカー
と、Ｆａｂ’：リンカーのモル比２．２：１で、３７℃にて、架橋した。クロス
リンカーは、５分間隔で、５分割量で加え、そして試料を１時間以上インキュベ
ートした。

【００６６】目的のＤＦＭ−ＰＥＧを、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で（未反応
のＦａｂ’を除くため）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−４００ＨＲを用いてゲル濾過
クロマトグラフィにより、次いで、ＤＦＭおよびＦａｂ’−ＰＥＧからＤＦＭ−
ＰＥＧを分離するためにモノＳを用いた陽イオン交換クロマトグラフィにより、
精製した。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５、で平衡化し
たカラムを用いて行い、試料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合し
た物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより溶出した。精製した物質を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験し、未修飾ＤＦＭまたはＦａｂ’よりも遅い移動度を
有することを示したことから、ＰＥＧの結合が成功したことが明らかになった（
図１）。

【００６７】無作為にＰＥＧ化された抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの調製比較の目的のために、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭを調製し、ＰＥＧで無作為に誘
導体化した。抗ＰＤＧＦβＲ・Ｆａｂ’を、上記したようにして還元した。Ｆａ
ｂ’を、Ｆａｂ’：ＢＭＨモル比２．２：１、３７℃にて、ＤＭＦ中に溶解した
ＢＭＨと架橋した。クロスリンカーは、５分間隔で、５分割量で加え、そして試
料を１時間以上インキュベートした。得られたＤＦＭ（ＢＭＨと架橋したジＦａ
ｂ’）を、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰを用いた疎水性クロマトグラフィに
より、未反応のＦａｂ’から精製した。

【００６８】精製したＤＦＭを、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ８．０、に
バッファー交換した。２−イミノチオレン（Ｔｒａｕｔ試薬）の４倍モルで、室
温にて、１時間、反応することによって、チオールをリジン残基に無作為に導入
した。ＰＤ１０カラムを用いて、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有、０．１Ｍリン酸塩、ｐ
Ｈ６．０、に脱塩した後、導入されたチオールの数をＤＴＤＰで滴定して決定し
た。チオール化ＤＦＭを、３時間、チオールより３．５倍過剰モルのＰＥＧマレ
イミド（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃ．、前記に同じ）と
反応した。ゲル濾過ＨＰＬＣ分析によって定量した結果、平均１．３ＰＥＧ分子
が１ＤＦＭ当り結合していた。ＰＥＧ−ＤＦＭを、モノＳを用いた陽イオン交換
クロマトグラフィによって精製した。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸
、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行い、試料を適用し、平衡化バッフ
ァーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより
溶出した。

【００６９】ＢＩＡｃｏｒｅによる抗原結合分析ＰＤＧＦβＲに対する抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ結合のオン・オフ比を
決定するための動力学的分析を、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＢｉａｃｏｒｅＡ
Ｂ）を用いて行った。測定は、センサーチップ表面の固定化された、抗マウスＩ
ｇＧによる、ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ融合分子の捕捉、次いで、抗ＰＤＧ
ＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの注入によることを含む。ヤギ抗マウスＩｇのＡｆｆｉ
ｎｉｐｕｒｅ・Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃフラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩ
ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５に、アミン
・カップリング・ケミストリーを経由して１１５００ＲＵのレベルに固定化した
。ブランク表面を、固定化処置に次いで、但し捕捉分子の注入を省略して、調製
した。ＨＢＳバッファー（１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ・Ｎ
ａＣｌ、３ｍＭ・ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ
ＡＢ）を、ランニングバッファーとして、流速１０ｍｌ／分で、用いた。ＣＯＳ
細胞上清からのｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲの注入は、固定化抗マウスＩｇＧ
によって、２００−２５０ＲＵの間のレベルに捕捉された。抗ＰＤＧＦβＲ・Ｄ
ＦＭ−ＰＥＧ分子を、捕捉されたｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ上で、２ｍｇ／
ｍｌから０．５２ｍｇ／ｍｌまで滴定した。表面は、３０ｍＭ塩酸１０ｍｌを注
入して再生された。ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲおよび抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦ
Ｍ−ＰＥＧの各濃度の注入は、対照としてのブランク表面上で繰返された。各抗
ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ濃度に対するセンサーグラムは、ｍｌｇＧ・Ｆｃ
−ＰＤＧＦβＲ注入および再生ステップを除去した後、ブランク表面に対する対
応するセンサーグラムで補正した。動力学パラメータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔ
ｉｏｎ２．１ソフトウエアを使用して計算された。

【００７０】ＰＥＧ化中間体４（部位特異的）および無作為に誘導体化した抗ＰＤＧＦβＲ
・ＤＦＭ−ＰＥＧから調製した、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの結果を表１
に示す。クロスリンカーとしてのＢＭＨと一緒に調製された非修飾ＤＦＭおよび
ＩｇＧを、結合パラメータを比較するために使用した。Ｋｄ値によって定量され
た結合親和性は、ＩｇＧと非修飾ＤＦＭの間で類似しており、それぞれ、１．０
７Ｘ１０^-10Ｍおよび１．２７Ｘ１０^-10Ｍ、であった。ＰＥＧとの無作為修飾（
ジＦａｂ’当り１．３）の結果は、結合親和性が、８．９７Ｘ１０^-10Ｍと、実
質的に損失であった。同サイズのＰＥＧ分子での部位特異的ＰＥＧ化の結果は、
Ｋｄ値、２．１０Ｘ１０^-10Ｍと、より改善された結合親和性であった。

【００７１】

【表１】

【００７２】薬物動力学薬物動力学的解析のために、試料を、標準的方法により、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕ
ｎｔｅｒ試薬を用いて¹²⁵Ｉで放射標識し、リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ６．８、
中に脱塩して、未反応の¹²⁵Ｉを除去した。一群６匹の雄ウイスターラットに、
尾静脈に標識物質２０ｍｇを、ｉ．ｖ．注射した。一定の時間に、血液試料を採
取し、ガンマカウンターで計測し、血液ｇ当りの投与量％を計算した。クリアラ
ンス値および血中濃度−時間曲線下面積を、ＳＩＰＨＡＲソフトウエアパッケー
ジを使用して決定した。

【００７３】結果（図２）は、非修飾ＤＦＭに比べてＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の血中クリアラ
ンスが遅いことを明らかにしている。このことは、また、薬物動力学パラメータ
の計算においても、反映された。ＩｇＧおよびＤＦＭの薬物動力学は、２コンパ
ートメントモデルに最もよく適合し、これに対しＤＦＭ−ＰＥＧは、１コンパー
トメントモデルに最もよく適合していた。結果は、ＤＦＭに比較してＤＦＭ−Ｐ
ＥＧは、著しく長い半減期と増加した血中濃度−時間曲線下面積を示した（表２
）。

【００７４】

【表２】

【００７５】バイオアッセイ抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭおよびＤＦＭ−ＰＥＧ試料の力価を、ＰＤＧＦ・ＢＢ
に応答するＳＫ−５皮膚線維芽細胞による、３Ｈチミジンの取り込み阻害によっ
て試験した。ＳＫ−５細胞（ＤＭＥＭ＋１０％加熱不活化ウシ胎児血清、１％グ
ルタミン、１％ピルビン酸ナトリウムおよび０．０２５Ｍ・ＨＥＰＥＳバッファ
ー中で増殖）を、８０％集密でトリプシン処理し、そして、９６穴組織培養プレ
ートに、１ウエル当り、５０００細胞／０．１ｍｌで、無血清培地（１：１ＤＭ
ＥＭ：ＨＡＭ’ｓ・Ｆ１２＋５μｇ／ｍｌインスリン、１６ｎｇ／ｍｌセレン、
２０μｇ／ｍｌトランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１％グル
タミン、０．０２５Ｍ・ＨＥＰＥＳバッファー、およびペニシリン、ストレプト
マイシン）中に植えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％湿度、のインキュ
ベーターで２４時間静置した。培地のみ、抗体のみ、ＰＤＧＦ・ＢＢ最終濃度１
０ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌ、またはＰＤＧＦ・ＢＢを異なった抗体濃度
で、ウエルに、最終容積０．２ｍｌを加えた。各条件は、５ないし１０ウエルの
間で使用した。６−８時間後、３Ｈチミジン（１ウエル当り０．５ｍＣｉ）を加
え、細胞を一夜放置した。プレートをインキュベーターから取り出し、収穫を容
易にするため、−２０℃で２４時間おいた。プレートを解凍し、ＤＮＡをＳｋａ
ｔｒｏｎＭｉｃｒｏ９６Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて、フィルターマット上
に採取した。マットを、６７℃で、９０分間、乾燥し、ＢｅｔａｐｌａｔｅＳ
ｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ）を加え、マットをＬＫＢＷａｌｌａｃ１２０５
ＢＥＴＡＰＬＡＴＥＲ液体シンチレーションカウンターで測定した。

【００７６】１０ｎｇ／ｍｌ・ＰＤＧＦ・ＢＢ、および抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭまたはＤＦ
Ｍ−ＰＥＧの１０ｍｇ／ｍｌにおいて、３Ｈチミジンの取り込みは、全ての型の
抗体によって８５−９２％阻害された。抗体の濃度が減少すると、無作為ＰＥＧ
結合と部位特異的結合の間の差が、明らかになった（図３）。このことは、ＰＤ
ＧＦ・ＢＢの濃度が２０ｎｇ／ｍｌに増加することによって同じく示された（図
４）。無作為にＰＥＧ修飾された４０ｋＤａ・ＤＦＭと部位特異的４０ｋＤａ・
ＤＦＭの間において、少なくとも、２倍の増加がある。

【００７７】実施例２１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸誘導体の部位特
異的結合中間体４を２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸エステル（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒＬａｂｓ）、または、１０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸エ
ステル（ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｓ）で誘導体化し、実施例１に記載したように
、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧを製造するために使用した。この場合、ＤＦ
Ｍ−ＰＥＧ複合体の精製は、モノＳのイオン交換クロマトグラフィを用いて達成
された。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．５、で平衡化し
たカラムを用いて行い、試料を適用し平衡化バッファーで洗滌後、結合した物質
を塩化ナトリウムのリニアグラジエントで溶出した。このステップに続いて、Ｄ
ＦＭ−ＰＥＧを、水で１：１に稀釈したリン酸塩緩衝食塩水で、Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ・Ｓ−２００によるゲル濾過を用いて、更に精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析の結果、ＰＥＧの結合が成功していることが明らかにされた（図１）。

【００７８】抗体結合の分析は、実施例１記載のようにして、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって
行った。表３に示した結果は、これらのＰＥＧ誘導体は、抗体結合親和性を少し
失っただけで結合することができることを、明らかにしている。

【００７９】

【表３】

【００８０】これらのＤＦＭ−ＰＥＧ結合体を、実施例１に記載の方法を用いて、ラットに
おいて、薬物動力学的研究を行った。結果（図５）は、非修飾ＤＦＭに比較して
ＤＦＭ−ＰＥＧは、顕著に遅延した血中クリアランス（より長いｉｎｖｉｖｏ
半減期）を明らかにしている。

【００８１】実施例３５ｋＤａ・ＰＥＧ−ＳＣＭ、２０ｋＤａ・ＰＥＧ−ＳＰＡ、１０ｋ・ＰＥＧ２−
ＮＨＳおよび２０ｋ・ＰＥＧ２−ＮＨＳの誘導体を使用したＤＦＭ−ＰＥＧ
複合体の調製中間体４を、２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（Ｓｈｅａ
ｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒＩｎｃ．同上）、またはカルボキシメチル化Ｐ
ＥＧの５ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルエステル（ＳｈｅａｗａｔｅｒＰｏ
ｌｙｍｅｒｓＩｎｃ．）、または１０ｋＤａ・ＰＥＧ２−スクシンイミド（２
Ｘ５ｋＤａ、ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｓ）または２０ｋＤａ・ＰＥＧ２スクシン
イミド（２Ｘ１０ｋＤａ、ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｓ）、で誘導体化した、そし
て実施例１および２に記載したように、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ複合体
を調製するために使用した。これらのＤＦＭ−ＰＥＧ誘導体は、実施例２に記載
したようにイオン交換クロマトグラフィ、次いでゲル濾過を用いて精製した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ＰＥＧへの結合は、全ての場合において成功したこ
とが明らかされた（図６）。ＢＩＡｃｏｒｅ分析を、また、抗体結合親和性を決
定するために、実施した。表４に示した結果は、これらのＰＥＧ誘導体は、抗体
結合親和性を少し失っただけで結合することができることを、明らかにしている
。

【００８２】

【表４】

【００８３】これらのＤＦＭ−ＰＥＧ結合体を、実施例１に記載の方法を用いて、ラットに
おいて、薬物動力学的研究を行った。結果（図７）は、非修飾ＤＦＭに比較して
ＤＦＭ−ＰＥＧは、顕著に遅延した血中クリアランス（より長いｉｎｖｉｖｏ
半減期）を明らかにしている。

【００８４】実施例４Ｆａｂ’の調製ｈＴＮＦ４０Ｆａｂ’（ヒトＴＮＦαを認識する）を、１０Ｌファーメンター
で増殖したＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０で、発現させた。Ｆａｂ’フラグメントは、
架橋に使用し得る、そのヒンジ部中に存在する単一のシステイン残基を有してい
る。細胞抽出物は、実施例１記載のようにして調製した。細胞抽出物は、伝導度
３．５ｍＳ／ｃｍに稀釈し、ｐＨ４．５に調節し、そして５０ｍＭ酢酸バッファ
ー、ｐＨ４．５、で平衡化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ^TMＳＰ（ファルマシア）の
カラムに適用した。平衡化バッファーで洗滌後、Ｆａｂ’を５０ｍＭ酢酸バッフ
ァー、ｐＨ４．５、中２００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した。溶出物質のｐＨを
、２Ｍトリスで７．５に調節し、ＰＢＳで平衡化したｐｒｏｔｅｉｎＧ・Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅカラムに適用した。ＰＢＳで洗滌後、Ｆａｂ’を０．１Ｍグリシン
塩酸、ｐＨ２．７、で溶出し、直ちにｐＨを６に再調節した。精製したＦａｂ’
を２ｍＭ・ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６、に透析濾過
した。

【００８５】ｈＴＮＦ４０ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の調製Ｆａｂ’のヒンジチオールを、実施例１記載のように、β−メルカプトエチル
アミンで還元によって活性化した。試料を、２ｍＭのＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン
酸バッファー、ｐＨ６．０、中に脱塩した。Ｆａｂ’分子当りのチオール基の数
は、実施例１に記載されたようにして測定した。Ｆａｂ’を、中間体４から調製
したＰＥＧ化クロスリンカー（４０ｋＤａ・ＰＥＧビスマレイミド、Ｓｈｅａｒ
ｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳ
Ａ）と、Ｆａｂ’：リンカーの比２．２：１で、室温にて、架橋した。

【００８６】目的のＤＦＭ−ＰＥＧを、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で（未反応
のＦａｂ’を除くため）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−２００ＨＲを用いてゲル濾過
クロマトグラフィにより、次いで、Ｆａｂ’−ＰＥＧからＤＦＭ−ＰＥＧを分離
するためにＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰを用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィにより、精製した。ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィは、
５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行った。試
料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムの
リニアグラジエントにより溶出した。精製した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験
し、未修飾ＤＦＭよりも遅い移動度を有することが示され、ＰＥＧの結合が成功
したことが明らかになった（図８）。

【００８７】ＢＩＡｃｏｒｅによる抗原結合分析抗原結合活性を、ＴＮＦ結合に対する親和性を測定する、ＢＩＡｃｏｒｅ測定
によって評価した。Ｆａｂ’、ＤＦＭ、ＩｇＧまたはＰＥＧ−ＤＦＭを固定化抗
Ｆａｂ’抗体で捕捉し、表面にヒトＴＮＦを通過させた。次いでＴＮＦ結合の動
力学を分析した。この分析からの結果は、表５に示される。クロスリンカーとし
てのＢＭＨと調製した非修飾ＤＦＭおよびＩｇＧを、結合パラメータを比較する
ために使用した。Ｋｄ値によって定量された結合親和性は、ＩｇＧおよびＤＦＭ
（それぞれ、１．７９Ｘ１０^-10Ｍおよび１．０７Ｘ１０^-10Ｍ）に類似していた
。ＤＦＭの部位特異性ＰＥＧ化は、１．８２Ｘ１０^-10Ｍと、ほとんど同一の結
合親和性の結果となり、ＰＥＧ修飾後抗体結合機能の喪失がないことを示してい
る。

【００８８】

【表５】

【００８９】薬物動力学薬物動力学解析のために、これら試料を、実施例１に記載した方法を用いてラ
ットで研究した。クリアランス率および血中濃度−時間曲線下面積値は、ＳＩＰ
ＨＡＲまたはＷＩＮＮＯＮＬＩＮソフトウエアのいずれかを使用して決定された
。

【００９０】結果（図９）は、非修飾ＤＦＭに比べてＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の血中クリアラ
ンスが遅いこと（より長いｉｎｖｉｖｏ半減期）を明らかにした。このことは
、また、薬物動力学パラメータの計算においても反映され、２コンパートメント
モデルに適合した。結果は、ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、著しく長い半
減期と増加した血中濃度−時間曲線下面積を明らかにした（表６）。

【００９１】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】非還元（レーン１−５）および還元（レーン６−９）条件下でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析。

【図２】ラットにおける、ＤＦＭおよびＩｇＧと比較した、¹²⁵Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の薬物動力学。

【図３】抗ＰＤＧＦβＲＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ランダム）、ＤＦＭ−ＰＥＧ
（４０ｋＤａ、部位特異的）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａＳＳ−リンカー、
部位特異的）、ＤＦＭおよびＩｇＧによる１０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦＢＢに対す
るＳＫ−５増殖応答の阻害。

【図４】抗ＰＤＧＦβＲＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ランダム）、ＤＦＭ−ＰＥＧ
（４０ｋＤａ、部位特異的）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａＳＳ−リンカー、
部位特異的）、ＤＦＭおよびＩｇＧの１マイクログラム／ｍｌによる１０ｎｇ／
ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦＢＢに対するＳＫ−５増殖応答の阻害。

【図５】ラットにおける、ＤＦＭと比較した、¹²⁵Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲＤＦＭ−Ｐ
ＥＧ（１０ｋＤａ、ＳＳリンカー）およびＤＦＭ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ、ＳＳリ
ンカー）の薬物動力学。

【図６】非還元（レーン１−７）および還元（レーン８−１３）条件下でのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析。

【図７】ラットにおける、非修飾ＤＦＭと比較した、種々のタイプの¹²⁵Ｉ標識抗ＰＤ
ＧＦβＲＤＦＭ−ＰＥＧ（部位特異的）の薬物動力学。

【図８】非還元（レーン２−３）および還元（レーン４−５）条件下でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析。

【図９】ラットにおける、ＤＦＭおよびＩｇＧと比較した、¹²⁵Ｉ標識抗ｈＴＮＦ４０
ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の薬物動力学。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ０７Ｋ 16/24 16/28 16/28 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C076 AA12 AA17 AA22 AA53 BB01 BB17 CC03 CC04 CC18 CC21 EE06A EE23A EE59 4C085 AA13 AA14 AA40 BB31 BB36 BB43 DD32 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA57 CA40 DA76 EA20 EA50 FA52 FA74 GA23 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】二つの抗体重鎖および共有結合した少なくとも１つのポリマ
ー分子を含み、各重鎖が、一方の鎖のシステイン残基の硫黄原子が他方の鎖のシ
ステイン残基の硫黄原子に結合した、少なくとも一つの非ジスルフィド分子鎖間
架橋によって他に共有結合しており、該システイン残基は各鎖の可変部ドメイン
の外側に配置されている、二価抗体フラグメントで、少なくとも一つの非ジスル
フィド分子鎖間架橋が共有結合したポリマー分子を含むことを特徴とする二価抗
体フラグメント。
【請求項２】各重鎖が、単一の非ジスルフィド架橋によって他に共有結合
し、該架橋が共有結合したポリマー分子を含有している請求項１記載の抗体フラ
グメント。
【請求項３】各重鎖が軽鎖と対をなしている、請求項１または請求項２記
載の抗体フラグメント。
【請求項４】各重鎖が、ヒンジ部ドメインによって末端が置換されたＶ_H
−ＣＨ１鎖である、請求項１ないし請求項３のいずれか一つに記載の抗体フラグ
メント。
【請求項５】存在する各非ジスルフィド架橋が、一つの重鎖のヒンジ部ド
メインに位置するシステイン残基の硫黄原子を、他の鎖のヒンジ部ドメインのシ
ステイン残基の硫黄原子に連結している、請求項４記載の抗体フラグメント。
【請求項６】ポリマーが、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリア
ルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー、または分枝
または非分枝多糖類である、請求項１ないし請求項５のいずれか一つに記載の抗
体フラグメント。
【請求項７】ポリマーが置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリ（エ
チレングリコール）またはその誘導体である、請求項６記載の抗体フラグメント
。
【請求項８】ポリマーがメトキシ（ポリエチレングリコール）またはその
誘導体である、請求項７記載の抗体フラグメント。
【請求項９】ポリマーが約２５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の
分子量を有する、請求項８記載の抗体フラグメント。
【請求項１０】各分子鎖間架橋が、ホモまたはヘテロ二官能性架橋剤の残
基である、前記各請求項のいずれか一つに記載の抗体フラグメント。
【請求項１１】各架橋が、一つまたはそれ以上のヘテロ原子またはヘテロ
原子含有基によって中断されていてもよい、置換されていてもよいＣ_4-20アルキ
レン鎖である、請求項１０記載の抗体フラグメント。
【請求項１２】一つまたはそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子
に共有結合している、請求項１ないし請求項１１のいずれか一つに記載の抗体フ
ラグメント。
【請求項１３】細胞表面または可溶性抗原に選択的に結合することができ
る、前記各請求項のいずれか一つに記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】抗原がヒト腫瘍壊死因子αまたは血小板由来増殖因子また
はそのレセプターである請求項１３記載の抗体フラグメント。
【請求項１５】一つまたはそれ以上の医薬品として許容される賦形剤、稀
釈剤または担体と共に前記各請求項のいずれかに記載の抗体フラグメントを含む
医薬組成物。