JP4456758B2 - 二価抗体フラグメント - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、修飾二価抗体フラグメント、それらの製造方法、それらを含有する組成物および医薬におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
抗体は、診断および治療目的のための臨床における使用が増加している。各々の場合の目標は、抗体・抗原相互反応の高特異性と親和性の組合せを開拓すること、検出を可能にすることおよび／または特定病変の治療、である。抗体は単独で使用され、あるいは放射性同位元素または細胞毒性薬のような別の原子または分子に負荷される。
【０００３】
抗体の薬物動力学および生体分布は、臨床におけるその使用が成功であるかどうかを決定する主要な役割を演じている。それゆえ、抗体は、その作用部位に運搬されることができ、そしてその目的を達成するに好適な長さの時間そこに保持されねばならない。また、その標的外では毒性値以下でのみ存在しなければならないし、明確な形で代謝分解されねばならない。
【０００４】
多くの使用のためには、抗体の薬物動力学は理想的でない。このことは、特に、抗体−放射性同位元素または−薬物結合体を用いた腫瘍診断および治療については、真実である。そのような結合体を用いた診断のためには、長い半減期は、腫瘍対バックグランドの比率が制限され、それで病変検出の感度が制限される。治療のためには、長い半減期は、抗体結合体に対し正常組織の長期間曝露となり、それゆえ線量限度毒性を来す。
【０００５】
抗体の薬物動力学を取り扱うためには多くの手段が可能であり、それらは通常それらの生体分布に影響する。最も単純で、最も一般的に応用され得る手段は、抗体フラグメントの使用である。それらは、抗体全体ごとよりも循環から、より急速に消失し、血液から組織に、より急速に分布し、これはいくつかの応用、例えば腫瘍画像化および治療に、特に優れている。
【０００６】
抗体フラグメントの薬物動力学を改善するために、更に我々はポリマーの使用を研究した。ポリエチレングリコール（ＰＧＥ）のような重合物質のタンパク質分子への結合はよく確立されており、ポリマーの結合は、タンパク質分子の薬理学的性質を実質的に変化させることができることが明らかにされている。例えば、タンパク質のＰＥＧ修飾は、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ循環の半減期、抗原性および免疫原性、溶解性、機械的安定性およびタンパク質分解に対する抵抗性を変化させることができる［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２，３５７８−３５８１，３５８２−３５８６；Ｎｕｃｃｉ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９１）６，１３３−１５１；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｔ．ｅｄ．）；タンパク質製剤の安定性：タンパク質安定化のための分解および戦略のインビボ的方法（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（１９９１）、２３５−２６３頁（Ａｈｅｒｎ，Ｔ．Ｊ．および Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．著）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。
【０００７】
ＰＥＧのタンパク質分子への結合は、多くの異なった化学的方法を用いて達成され、そのほとんどはＰＥＧのタンパク質の表面上のリジン残基または他のアミノ酸残基への乱雑な結合である［Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．＆ Ｌｅｅ，Ｃ．、ポリ（エチレングリコール）の化学：生物工学的および生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（１９９２）、３４７−３７０頁（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．著），Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。これは、しばしば、タンパク質の機能の部分的損傷、例えば酵素は触媒活性を減じてしまう［Ｎｕｃｃｉ，Ｍ．Ｌ．ら、同書］。
【０００８】
ＰＥＧ結合部位を導入するためのタンパク質の部位特異的修飾は報告されている。例えば、インターロイキン−２は、突然変異によって修飾され、通常グリコシル化されるスレオニン残基をＰＥＧの結合をさせるためにシステインによって置換される［Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．＆ Ｋａｒｔｅ，Ｎ．Ｖ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８，３４３−３４６］。通常グリコシル化される部位は、タンパク質構造の摂動なしにＰＥＧ修飾に耐えることができると考えられていたので、選択された。別の例において、酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼが、選択的にアルギニン残基をリジンに置換するよう修飾され、この例では、酵素分子当り１８まで付加的な可能性のあるＰＥＧ結合部位をもたらした［Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９９１），８８，７１８５−７１８９］。
【０００９】
抗体および抗体フラグメントを用いたこれまでの研究では、リジン残基を経た無作為ＰＥＧ結合［例えば、Ｌｉｎｇ，Ｔ．Ｇ．Ｉ．＆ Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８３），５９，３２７−３３７；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８７）１５，１７−２２；Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９１），５１，４３１０−４３１５；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６），７３，１７５−１８２］およびチオール化誘導体［Ｐｅｄｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９４），７０，１１２６−１１３０］が用いられてきた。無作為結合はしばしば、減少した親和性、結合活性または特異性で標的抗原と結合することだけができる修飾抗体を生みだした。このことを克服する一つの試みにおいて、抗原結合（ＣＤＲ）ループにおいて臨界的リジン残基をアルギニンと置換して免疫反応性のロスが少ない修飾を可能とした［Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）５，３２１−３２６］。
【００１０】
抗体のおよびヒンジ部領域における特異性部位は、エフェクターおよびレポーター分子の範囲の部位特異性結合を可能ならしめるように作り替えることができる［Ｌｙｏｎｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９０），３，７０３−７０９；ＥＰ特許明細書第３４８４４２号および第３４７４３３号］。本発明者らは、無作為結合プロセスに前以て関連する免疫反応性の喪失を避けるために、二価抗体に対するポリマーの部位特異的結合を使用することができることを、決定した。更に、このようにして修飾したフラグメントは、ポリマー分子の同じ数および形で無作為に修飾したフラグメントと比較して、著しく改善された結合および／または薬物動力学的性質を有していた。
【００１１】
それゆえ、本発明の一観点によれば、我々は、二つの抗体重鎖および共有結合した少なくとも一つのポリマー分子を含み、各重鎖は、一方の鎖のシステイン残基の硫黄原子が他方の鎖のシステイン残基の硫黄原子に結合した、少なくとも一つの非ジスルフィド分子鎖間架橋によって他に共有結合しており、該システイン残基は各鎖の可変部ドメインの外側に配置されている、ことを含む二価抗体フラグメントで、少なくとも、一つの非ジスルフィド分子鎖間架橋が共有結合したポリマー分子を有することを特徴とする二価抗体フラグメント、を提供する。
【００１２】
ここで使用される、用語「非ジスルフィド」は、例えば、抗体に普通に見出されるようなＳ−Ｓ架橋は除かれるという意味を意図している。本発明によるフラグメントに存在するタイプの分子鎖間架橋は、しかしながら、以下に記載するようなＳ−Ｓ結合を経由して重鎖に結合されている。
【００１３】
本発明の抗体フラグメントは、一般的に、抗原に選択的に結合することができる。抗原は、いずれも細胞関連抗原でもよく、例えば、Ｔ細胞、内皮細胞または腫瘍細胞マーカーのような細胞表面抗原であり、あるいは可溶性抗原である。細胞表面抗原の特別な例は、接着分子、例えば、β１インテグリン、例えばＶＬＡ−４のようなインテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンまたはＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１および２）、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原、およびＶＥＧＦ、ならびに適切なこれらのレセプター、を包含する。可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８またはＩＬ−１２のようなインターロイキン、ウイルス抗原、例えばＲＳウイルスまたはサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇＥ、インターフェロン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、コロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ、および血小板由来増殖因子、例えばＰＤＧＦ−α、およびＰＤＧＦ−β、ならびに適切なそれらのレセプター、を包含する。各抗原は、例えば、ヒト抗原である。
【００１４】
本発明による特別な抗原フラグメントは、特に後記する実施例に記載された腫瘍壊死因子αおよび血小板由来増殖因子、およびこれらのレセプター、に選択的に結合するものを包含する。
【００１５】
有用な抗原結合性質を達成するために、本発明によるフラグメント中の各重鎖は、相補的抗体軽鎖またはそのフラグメントと対を成している、そして本発明は、そのような構成に延長されている。所望により、重鎖−軽鎖対は、共役結合であり、例えば、天然に存在する抗体中に見出されるジスルフィド結合および／または例えば組替え一本鎖抗体中に見出されるようなペプチド結合、であり得る。
【００１６】
一般的に、各重鎖および、存在するならば、軽鎖は、可変部領域を有する。ここで使用される用語、「可変部領域」は、抗原結合部位を含有する重鎖または軽鎖の部分を意味することを意図している（以後、ＶHまたはＶL領域と云う）。ＶHまたはＶL領域は、いかなるサイズまたはアミノ酸組成でもよく、一般的に、少なくとも一つの、枠組み配列中に埋め込まれた抗原結合の原因である、超可変アミノ酸配列を含む。
【００１７】
各ＶHまたはＶL領域は、いかなる天然に存在する可変部またはそれらの遺伝子工学処理変化物でもよい。遺伝子工学処理変化物によるとは、組換えＤＮＡ工学技術を用いて創造された可変部領域を意味している。そのような遺伝子工学処理変化物は、例えば、天然抗体のアミノ酸配列においてまたはそれに対して挿入、欠失または交換によって天然の抗体可変部から創造されたものを包含する。このタイプの特別な例としては、少なくとも一つのＣＤＲ、および、所望により、一つまたはそれ以上の枠組みアミノ酸および第二の抗体からの可変部領域の残部、を含有する遺伝子工学処理されたＶHまたはＶL領域を包含する。
【００１８】
各ＶH領域は、一般的に、少なくとも一つのシステイン残基に共有結合されている。各システイン残基の位置は、必要な抗体フラグメントのサイズおよび性質に従って変化する。それゆえ、極端な一例では、システイン残基は、ＶH領域のＣ末端アミノ酸に直接結合している。このタイプの二つのＶH領域は、かくして、本発明のフラグメントを形成するように架橋される。
【００１９】
しかしながら、実際には、ＶH領域は、Ｃ末端アミノ酸において、システイン残基を含有する少なくとも一つの別の抗体領域またはそのフラグメントに共有結合していることが一般的に好ましい。それゆえ、例えば、ＶH領域は、免疫グロブリンＣH１領域またはそのフラグメントに結合している。ＣＨ１領域は、例えば免疫グロブリンに一般に見出されるようなヒンジ部領域を提供するように、または更に、例えば抗体ＣＨ２およびＣＨ３領域のような、領域を提供するように、更にアミノ酸で延長され得る。上記の場合の各々において、少なくとも一つのシステイン残基が、ポリマー分子を含有する分子鎖間架橋のための架橋部位を形成するどのような領域を通してどのような点に位置することができる。
【００２０】
同様に、本発明によるフラグメント中に存在するいかなるＶL領域も、抗体軽鎖定常部（ＣL）またはそのフラグメントに結合することができる。
【００２１】
本発明によるフラグメント中に存在するポリマーは、一般的に、合成または天然に存在するポリマー、例えば、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーまたは、分枝または非分枝多糖類、例えばホモまたはヘテロ多糖類、である。
【００２２】
上に挙げた合成ポリマー上に存在する特別な任意の置換基は、一つないしそれ以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基を包含している。合成ポリマーの特別の例は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、またはポリ（ビニルアルコール）およびそれらの誘導体、特に、置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシ（エチレングリコール）およびそれらの誘導体である。特別な天然に存在するポリマーは、乳糖、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンおよびこれらの誘導体を包含する。ここに使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えばスクシンイミドエステル等のような活性エステルを包含することを意図している。反応性基は、ポリマーに直接またはリンカーセグメントを通してポリマーに結合している。そのような基の残基は、ある種の例では、ポリマーおよび分枝鎖間架橋の間を結合する基として本発明の生成物の部分を形成する。
【００２３】
ポリマーのサイズは、記載したように変化し得る、しかし、一般的に、およそ５００Ｄａからおよそ５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、そして２５０００から４００００Ｄａを含む範囲の平均分子量である。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図する使用を基にして選択される。それゆえ、例えば、生成物を循環および浸透組織に残存させることを意図する場合、例えば、腫瘍の治療に使用するためには、小分子量のポリマー、例えばおよそ５０００Ｄａ、を使用することが有利である。生成物が循環中に残るような応用のためには、高分子量のポリマー、例えば２５０００Ｄａないし４００００Ｄａの範囲、を使用することが有利である。
【００２４】
一般的に、本発明による抗体フラグメントにおける各ポリマー分子は分枝鎖間架橋の部分を形成する。各架橋は、二つの重鎖をつなぐように働き、そして各鎖においてはシステイン残基の硫黄原子に共有的につながっている。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合または、特に、硫黄−炭素結合である。
【００２５】
各分枝鎖間架橋は、一般的に、どんな所望の長さまたは組成であってもよい。好適な架橋は、ホモまたはヘテロ官能性架橋剤、特に、丁度先程記載したような一つないしそれ以上の共有結合したポリマー分子を含有するホモまたはヘテロ二官能性架橋剤、を包含する。
【００２６】
ホモまたはヘテロ官能性架橋剤は、多価、特に、二つのチオール反応性官能基を含有する、脂肪族、ヘテロ脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、芳香族またはヘテロ芳香族基の、二価基を包含する。本発明による各フラグメントは、各チオール反応性官能基がシステイン残基の硫黄原子と共有結合にあるような試薬から誘導された分枝鎖間架橋を有している。特別なチオール反応性官能基は、αハロカルボキシル酸またはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルフォンまたはジスルフィド、を包含する。
【００２７】
特別な架橋は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ4-20アルキレン、Ｃ4-20アルケニレンまたはＣ4-20アルキニレン鎖を包含し、これらは一つまたはそれ以上のヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、例えば、−Ｏ−または−Ｓ−原子または−Ｎ（Ｒ1）−［ここで、Ｒ1は、水素原子またはＣ1-6アルキル基］、−ＣＯＮ（Ｒ1）−，−Ｎ（Ｒ1）ＣＯ−、−ＳＯ2Ｎ（Ｒ1）−，−Ｎ（Ｒ1）ＳＯ2−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−ＯＣＯＮ（Ｒ1）−、−Ｎ（Ｒ1）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−基により、またはシクロペンチレン、シクロヘキシレン、フェニレンまたは置換フェニレン基によって中断されていてもよい。任意の置換基は、例えば、一つまたはそれ以上のアミノ基または置換アミノ基、例えば、−Ｎ（Ｒ1）2基、ここで各Ｒ1原子または基は同じかまたは異なる、を包含する。
【００２８】
ポリマーは、分枝鎖間架橋中の任意の位置に、一般的には、特定の分枝鎖間架橋に関して先程記載したヘテロ原子またはヘテロ原子含有基を通して、共有結合している。
【００２９】
本発明による特別に有用なフラグメントは、単一の分枝鎖間架橋を含有するものである。これら特別のフラグメントにおいて、ポリマーは、特に合成ポリマーであり、特にポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、または特にメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、そして特に約２５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量のものである。架橋は、特に、前記したように、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ4-20アルキレン鎖で、一つまたはそれ以上のヘテロ原子またはヘテロ原子含有基によって中断されていてもよい。
【００３０】
本発明によるフラグメント中の各重鎖は、好ましくは、例えば、免疫グロブリン中に天然に見出される、ヒンジ部ドメインによって末端が置換されたＶH−ＣＨ１鎖である。各鎖は、好ましくは、軽鎖と対をなしており、特にＶH−ＣL鎖、それゆえ、例えば、Ｆａｂ’フラグメントである。そのようなタイプの重鎖または重鎖−軽鎖対を含有する本発明の好ましいフラグメントにおいては、特に各重鎖のヒンジ配列に位置するシステイン残基を架橋する、一つの分子鎖間架橋が存在する。これは、各ヒンジ配列中に存在する唯一のシステイン残基であることが望ましい。
【００３１】
所望ならば、本発明による抗体フラグメントは、更に、それに結合した一つまたはそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子を有し、そして本発明はそのような修飾抗体にも拡張される。エフェクターまたはレポーター分子は、フラグメント中に位置している得られ得るアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、を通して抗体フラグメントに結合している。
【００３２】
エフェクター分子は、例えば、抗腫瘍剤、トキシン（例えば、細菌または植物由来の酵素的活性トキシンおよびそれらのフラグメント、例えば、リシンまたはそのフラグメント）、生理活性タンパク質、例えば酵素、核酸およびこれらのフラグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨード、およびキレート金属、を包含する。好適なレポーター基は、キレート金属、蛍光化合物またはＮＭＲまたはＥＳＲ分光法によって検出される化合物を包含する。
【００３３】
特別の抗腫瘍剤は、細胞毒性および細胞分裂阻止剤、例えば、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、メルファラン、メクロルエタミン、シクロフォスファミド、またはウラシルマスタード）およびこれらの誘導体、トリエチレンフォスフォルアミド、トリエチレンチオフォスフォルアミド、ブスルファン、またはシスプラチン；抗代謝剤、例えば、メトトレキセート、フルオロウラシル、フロキシウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸またはフルオロクエン酸、抗生物質、例えば、ブレオマイシン類（例えば、硫酸ブレオマイシン）ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン類（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリケマイシンおよびその誘導体、またはエスペラマイシンおよびその誘導体；分裂阻害剤、例えば、エトポシド、ビンクリスチンまたはビンブラスチンおよびそれらの誘導体；アルカロイド類、例えば、エリプチシン；ポリオール類、例えばタキシシン−Ｉまたはタキシシン−ＩＩ；ホルモン類、例えばアンドロゲン類（例えば、ドロモスタノロンまたはテストラクトン）、プロゲスチン類（例えば、酢酸メゲストールまたは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン類（例えば、ジメチルスチルベストロール二リン酸、リン酸ポリエストラジオールまたはリン酸エストラムスチン）または抗エストロゲン類（例えば、タモキシフェン）；アントラキノン類、例えばミトキサントロン、尿素類、例えばヒドロキシウレア；ヒドラジン類、例えばプロカルバジン；またはイミダゾール類、例えばダカルバジン、を包含する。
【００３４】
特別に有用なエフェクター群は、カリケマイシンおよびその誘導体である（例えば、南ア特許明細書第８５／８７９４号、第８８／８１２７号および第９０／２８３９号を見よ）。
【００３５】
キレート金属は、２から８（両端の数値を含む）の配位数を有する二価または三価の陽イオン金属を包含する。そのような金属の特別の例は、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、およびスカンジウム（Ｓｃ）を包含する。一般的に、金属は、好ましくは、放射核種である。特別な放射核種は、99mＴｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、67Ｃｕ、195Ａｕ、199Ａｕ、110Ａｇ、203Ｐｂ、206Ｂｉ、207Ｂｉ、111Ｉｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、88Ｙ、90Ｙ、160Ｔｂ、153Ｇｄおよび47Ｓｃ、を包含する。
【００３６】
キレート金属は、好適なポリデントキレート化剤、例えば、鎖状または環状ポリアミン、ポリエーテル、（例えばクラウンエーテルおよびそれらの誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；および炭素環状誘導体、でキレートされた金属の、例えば、上記のタイプの一つである。
【００３７】
一般的に、キレート化剤のタイプは、使用する金属による。本発明による共役体におけるキレート化剤の特に有用な群は、しかしながら、鎖状および環状ポリアミン、特に、ポリアミノカルボン酸、例えばジエチレントリアミン五酢酸およびその誘導体、および大環状アミン、例えばサイクリックトリアザおよびテトラアザ誘導体（例えば、国際公開特許明細書ＷＯ第９２／２２５８３号に記載されたように）；およびポリアミド、特にデスフェリオキシアミンおよびその誘導体）である。
【００３８】
本発明による抗体フラグメントは、ＶH領域の外側に位置する重鎖反応性システイン残基を含有する抗体フラグメントをここに定義したようなポリマーを含有するチオール選択性架橋試薬と反応することによって製造される。反応は、一般的に、溶媒中、例えば酢酸またはリン酸バッファーのような水性バッファー溶液、で、およそ中性ｐＨ，例えばおよそｐＨ４．５ないしｐＨ８．０で、例えば室温で、実施される。抗体は、一般的に、架橋試薬の濃度に比較して過剰の濃度が採用される。ある種の例では、適切に反応性システイン残基を発生させるためβ−メルカプトエチルアミンのような試薬と共に、出発物質の抗体を減らす必要がある（例えば、後記する実施例１に記載のように）。必要ならば、所望の生成物は、未反応の出発物質または製造プロセス中に生じたその他の望ましくない生成物から常法、例えばクロマトグラフィによって、分離することができる。
【００３９】
抗体フラグメント出発物質は、［常法の免疫化および細胞融合手段によって調製される］いかなる抗体全体ごと、特にモノクローナル抗体全体ごとからも、例えば、ペプシン処理による、好適な標準的酵素開裂および／または消化技術を用いて、得ることができる。代りに、抗体フラグメント出発物質は、抗体可変部および／または定常部をコードするＤＮＡの操作および再発現を含む、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。そのようなＤＮＡは、公知および／または、例えば、ファージ・抗体ライブラリー［Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．Ｔｉｂｔｅｃｈ．１０，８０−８４（１９９２）を参照］を含むＤＮＡライブラリーから容易に得られる、または所望により合成することができる。標準分子生物学および／または化学手段は、ＤＮＡの配列決定および操作するのに、例えば、システイン残基を創造するのにコドンを導入するため、他のアミノ酸または領域を所望のように修飾、付加または除去するために、使用することができる。
【００４０】
ここからは、ＤＮＡを含有する一つまたはそれ以上の複製し得る発現ベクターが、適切な細胞系、例えば、抗体フラグメントの産生が起こる、非産生ミエローマ細胞株、例えばマウスＮＳＯ系または細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ株、を形質転換するために調製および使用することができる。効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクターのＤＮＡ配列は、適切な制御配列、特に可変領域配列に操作可能に結合したプロモーターおよびリーダー配列、を含んでいなければならない。この方法で、抗体フラグメントを製造する特別な方法は、一般的によく知られており、常法として使用されている。例えば、基礎的な分子生物学手段は、Ｍａｎｉａｔｉｓら［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９］に記載されており；ＤＮＡ配列決定はＳａｎｇｅｒら［ＰＮＡＳ，７４，５４６３（１９７７）］およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されたようにして実施することができる；および部位特異的突然変異誘発は、Ｋｒａｍｅｒら［Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１，（１９８４）］およびＡｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従って実行することができる。更に、ＤＮＡの操作によって抗体を調製するために適した技術、発現ベクターの創生および好適な細胞の形質転換の詳細については、例えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａ．および Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．生物工学および遺伝工学総説（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ）[Ｔｏｍｂｓ，Ｍ．Ｐ．編、１０巻，１章，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｄｎｏｖｅｒ，ＵＫ]により、そしてＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９１／０９９６７号において総説されているように、特許明細書を含め、多くの刊行物がある。
【００４１】
本発明による抗体フラグメントの調製において使用するためのチオール選択的架橋試薬は、（例えば、α−ハロカルボン酸またはエステル、例えばヨードアセタミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルフォン、またはジスルフィドのようなチオール反応性基を含有する）チオール選択的架橋剤を適切に機能化したポリマーと反応することによって得ることができる。好適なポリマー出発物質は、市販品（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ，ＵＳＡから）得られ、または、市販品の出発物質から常法の化学手段、例えばＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ＆Ｌｅｅ，Ｃ．同書、によって記載されたようにして、を用いて製造することができる。反応は、一般的に、機能化されたポリマー、例えばポリマーの活性エステル、と架橋試薬中に存在する適切な官能基、例えばアミン、の間での常法のカップリング反応である。標準的な反応条件が、例えば、活性エステルとアミンのカップリングについて後記の実験の部において記載するように、使用される。好適な架橋試薬は、市販のものから容易に得られ、または、市販の材料から常法手段を用いて、例えば、ＥＰ特許明細書第３８４６２４号およびＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９２／２２５８３号および後記の実験の部に記載するように、簡単に合成することができる。
【００４２】
エフェクターまたはレポーター分子に結合した、本発明による抗体フラグメントを得ようとする場合は、抗体フラグメントが直接またはカップリング剤を経由して、適切な活性ポリマーとの反応前または後のいずれかにエフェクターまたはレポーター分子に結合する、標準的化学または組替えＤＮＡ手段によって、製造することができる。特別の化学的手段は、例えば、ＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９３／０６２３１号、ＷＯ第９２／２２５８３号、ＷＯ第９０／０９１９５号およびＷＯ第８９／０１４７６号に記載された方法を包含する。代りに、エフェクターまたはレポーター分子が、タンパク質またはポリペプチドである場合、結合は、例えば、ＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第８６／０１５３３号およびＥＰ特許明細書第３９２７４５号に記載されているように、組換えＤＮＡ手段を用いて達成することができる。
【００４３】
本発明による抗体フラグメントは、多くの疾病または疾患の検出または治療において有用である。そのような疾病または疾患は、感染症、例えばウイルス感染；炎症性疾患／自己免疫、例えば関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患；癌；アレルギ―性／アトピー性疾患、例えば喘息、湿疹；先天性疾病、例えば嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血；皮膚病、例えば乾癬；神経疾患、例えば多発性硬化症；移植、例えば臓器移植拒絶、移植片対宿主病；および代謝性／特発性疾患、例えば糖尿病、の一般標題の基に記載されているものに包含されている。
【００４４】
本発明による抗体フラグメントは、治療および／または診断において使用されるように製剤化することができ、本発明の更なる観点によれば、我々は、共有結合中に一価抗体フラグメントおよび少なくとも一つのポリマー分子を含む修飾一価抗体フラグメントを含む医薬組成物であって、各共有結合が、フラグメントの可変部領域の外側の抗体フラグメント中に位置しているシステイン残基の硫黄原子を経由し、それと共に、一つないしそれ以上の医薬として許容される賦形剤、稀釈剤または担体を有していることを特徴とする、医薬組成物を提供する。
【００４５】
上記に説明したように、本発明のこの観点における抗体フラグメントは、一つないしそれ以上のエフェクターまたはレポーター基に結合していてもよい。
【００４６】
医薬組成物は、投与のためのどのような好適な形態をも取ることができ、そして、好ましくは、例えば注射または点滴、例えばボーラス注射または連続点滴による、非経口投与に適した形態である。組成物が注射または点滴用である場合、油性または水性ベヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ることができ、そして、処方用剤、例えば懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤を含有することができる。
【００４７】
代りに、抗体組成物は、適切な滅菌溶液と共に使用前に再構成するような乾燥形態であってもよい。
【００４８】
もし、抗体組成物が、経口投与に適したものであれば、製剤は、有効成分に加えて、添加剤、例えば、澱粉、例えば馬鈴薯、トウモロコシまたは小麦澱粉またはセルロースまたは澱粉誘導体例えば微結晶セルロース；シリカ；種々の糖類、例えば乳糖；炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウム、を含有することができる。もし、製剤が経口投与用であるなら、患者の消化系に充分に耐え得るようであることが望ましい。そのために、製剤に粘液形成剤および樹脂を含有することが望ましい。また、胃液中で不溶であるカプセル中に抗体を製剤化することによって耐性を改善することが望ましい。また、更に、制御放出製剤に抗体または組成物を含有することが好ましい。
【００４９】
抗体組成物が、直腸投与に適するためには、製剤は、結合剤および／または滑沢剤；例えば、高分子化グリコール、ゼラチン、ココアバターまたはその他の植物ワックスまたは脂肪、を含有する。
【００５０】
本発明による治療および診断用途は、典型的には、ヒト患者に抗体フラグメントの有効量を投与することを含む。投与されるべき正確な量は、抗体の使用および患者の年齢、性および状態に従って変化するが、しかし、典型的には、約０．１ｍｇから１０００ｍｇ、例えば約１ｍｇから５００ｍｇと変化し得る。抗体は、単回投与または時間をかけて連続投与により投与され得る。投与は、適切に繰返すことができる。典型的な一回投与量は、例えば、単回の治療投与当り０．１−５０ｍｇ／ｋｇ体重の間、特に単回の治療投与に対し０．１−２０ｍｇ／ｋｇ体重の間であり得る。
【００５１】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【００５２】
以下の略号が使用される。
ＰＥＧ：ＣＨ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）2ＮＨＣＯ（ＣＨ2）2−
ＤＦＭ−ＰＥＧ：２つのＦａｂ’フラグメントがＰＥＧ化ジマレイミド架橋と架橋されている本発明による抗体フラグメント。
ＤＴＰＤ：４，４’−ジチオジピリジン
ＡＵＣ：血中濃度−時間曲線下面積
ＲＴ：室温
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＢＯＣ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＣＢＺ：カルボキシベンジルオキシ
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＤＣ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
ＢＭＨ：ビスマレイミドヘキサン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
【００５３】
中間体架橋基の調製
【００５４】
【化１】
【００５５】
Ｎ（α）Ｎ（ε）ジ−ＣＢＺ−（Ｌ）−リジン（１８．０ｇ、４３．３ｍＭ）を無水ＤＭＦ（８０ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ＢＯＣ−１，６−ジアミノヘキサン塩酸塩（１１．０６、４３．７５ｍＭ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（６．４３ｇ、４７．６３ｍＭ）、４−メチルモルホリン（５．２ｍｌ、４７．６３ｍＭ）およびＥＤＣ（９．１３ｇ、４７．６３ｍＭ）を加え、そして混合物を室温で５時間攪拌した。反応混合物をＨ2Ｏ中に加え、酢酸エチル（４Ｘ１００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、１０％クエン酸（２Ｘ５０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２Ｘ５０ｍｌ）食塩水（１Ｘ５０ｍｌ）で洗滌し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を減圧除去して、中間体１（２６．１５ｇ、１００％）を白色固体として得た。1ＨＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ７．７９（１Ｈ、ｔ）、７．３８−７．１９（１１Ｈ、ｍ）、６．７２（（１Ｈ、ｔ）、５．００−４．９９（４Ｈ、ｍ）、３．９５−３．９０（１Ｈ、ｍ）、３．０８−２．８７（６Ｈ、ｍ）および１．６０−１．０５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。
【００５６】
【化２】
【００５７】
中間体１（２６．１５ｇ、４２．７ｍＭ）をエタノール（７００ｍｌ）に溶解（加温しつつ）し、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．２ｇ）にて処理した。反応は、温水バス（〜３０℃）中で４時間Ｈ2ガス下に攪拌し、次いで冷却した。ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）を加え、混合物を濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2およびエタノールでよく洗滌した。溶媒を減圧下除去して、中間体２を油状泡沫として得た（１３．８ｇ、９４％）。1ＨＮＭＲ（（ＣＨ3）2ＳＯ）δ７．７８（１Ｈ、ｔ）、３．０６−２．９１（３Ｈ、ｍ）、２．８９−２．８４（４Ｈ、ｍ）、２．５２−２．４３（４Ｈ、ｂｓ）および１．５７−１．１５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。
【００５８】
【化３】
【００５９】
中間体２（１．４７ｇ、４．４７ｍＭ）を、無水ＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、そしてＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネート（２２．３８ｇ、８．９７ｍＭ）を加えた。反応混合物を、室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、そしてＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）を加え、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（５０ｍｌ）を加えた。層を分離し、水層をＣＨ2Ｃｌ2（２Ｘ５０ｍｌ）で洗滌した。有機層を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ3（２Ｘ５０ｍｌ）で洗滌し、そしてＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を減圧除去して、残渣をジエチルエーテルにて処理し、得られた固体を濾過し、ジエチルエーテルで、よく洗滌して、乾燥し、中間体３（２．０５ｇ、７４％）を白色固体として得た。1ＨＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ８．０５（１Ｈ、ｄ）、７．７５（１Ｈ、ｔ）、６．９８（４Ｈ、ｓ）、６．７２（１Ｈ、ｂｔ）、４．２１−４．０７（１Ｈ、ｍ）、３．６２（４Ｈ、ｔ）、３．１２−２．８１（８Ｈ、ｍ）、２．４１（２Ｈ、ｔ）および１．５５−１．０５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。マススペクトル、ＥＳ＋ｖｅ６６９（ＭＮａ+、１００％）、６．４７（ＭＨ+、２０％）、５４７（ＭＨ+、−Ｃ5Ｈ8Ｏ2、１５％）。
【００６０】
【化４】
【００６１】
中間体３（０．３ｇ、０．４６ｍＭ）を、ＣＨ2Ｃｌ2／ＴＦＡ（１０ｍｌ）の１：１混合物に溶解し、３４５分、室温で攪拌した。溶媒を減圧下除去して、残渣をトルエン（３Ｘ５ｍｌ）で共沸した。酢酸エチルを加え、固体を得て濾過し、酢酸エチル次いでジエチルエーテルでよく洗滌し、減圧下乾燥して中間体４を白色固体として得た（０．２１ｇ、６８％）。1ＨＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ８．０３（１Ｈ、ｄ）、７．９０（１Ｈ、ｔ）、７．８０（１Ｈ、ｔ）、７．６９（２Ｈ、ｂｓ）、６．９９（４Ｈ、ｓ）、４．０９（１Ｈ、ｍ）、３．５８（４Ｈ、ｔ）、３．３３（ＨＯＤ）、３．１０−２．９３（４Ｈ、ｍ）、２．７６（２Ｈ、ｂｍ）２．４１−２．２７（４Ｈ、ｍ）および１．５１−１．００（１４Ｈ、ｍ）。
【００６２】
実施例１
ＰＥＧ化（４０ＫＤａ）架橋基の調製
ＤＭＦ中の中間体４に、Ｎ−メチルモルフォリンの１モル当量、および、アミン反応性ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ＰＥＧ−ＮＨＳエステル；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）の５倍モルを加えた。混合物を、時々攪拌しながら、２時間室温でインキュベートした。未反応のＰＥＧは、２ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中の１Ｍグリシン保存溶液から、ＰＥＧに対し１００倍モル過剰のグリシンを加えて不活性化し、そして、混合物を更に１０分だけインキュベートして、所望のＰＥＧ化架橋基を得た。
【００６３】
Ｆａｂ’の調製
ヒトＰＤＧＦβレセプター（以下、ＰＤＧＦβＲ）を認識する、遺伝子操作処理ヒト抗体ｇ１６２からのＦａｂ’を、ＰＣＴ国際特許明細書ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３４００に記載されたようにして、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた。Ｆａｂ’フラグメントは、架橋に使用できるヒンジ部領域中に存在する単一のシステイン残基を有している。細胞を、遠心分離によって醗酵培養から収穫し、１０ｍＭ・ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭトリス、ｐＨ７．４、に細胞を再懸濁することによって、Ｆａｂ’を抽出し、６０℃で一夜インキュベートした。Ｆａｂ’を、１Ｍグリシン／グリシネート、ｐＨ８．０、で前平衡化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ・ＡＴＭ（ファルマシア）のカラムを用いて拡張床クロマトグラフィによって精製した。試料を、グリシンに関して１Ｍにし、そして、拡張床法でカラムに適用する前に、５０％（ｗ／ｖ）ナトリウムグリシネートでｐＨを７．５に調節した。平衡化バッファーで洗滌後、カラムの材料を充填床に充填し、Ｆａｂ’を０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．０、で溶出した。
【００６４】
更なる精製は、２Ｍトリスで、溶出液のｐＨを７．５に調節し、リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ７．４、で前平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ・Ｇセファロースのカラムに適用することによって、達成された。平衡化バッファーで洗滌後、Ｆａｂ’を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７、で溶出した。溶出したＦａｂ’のｐＨを、次いで、２Ｍトリスで６．０に調節した。
【００６５】
抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ（部位特異的）の調製
精製した抗ＰＤＧＦβＲ・Ｆａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中に透析濾過した。ヒンジチオールをβ−メルカプトエチルアミンで還元して活性化した。Ｆａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有、０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中で、５ｍＭβ−メルカプトエチルアミンと３７℃、３０分間、インキュベートした。試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５（ＰＤ１０）カラムを用いて、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中に脱塩した。Ｆａｂ’分子当りのチオール基の数は、以前記載された［Ｌｙｏｎｓら、（１９９０）、同書］ようにしてＤＴＤＰで滴定することによって測定した。Ｆａｂ’を、中間体４から調製したＰＥＧ化クロスリンカーと、Ｆａｂ’：リンカーのモル比２．２：１で、３７℃にて、架橋した。クロスリンカーは、５分間隔で、５分割量で加え、そして試料を１時間以上インキュベートした。
【００６６】
目的のＤＦＭ−ＰＥＧを、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で（未反応のＦａｂ’を除くため）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−４００ＨＲを用いてゲル濾過クロマトグラフィにより、次いで、ＤＦＭおよびＦａｂ’−ＰＥＧからＤＦＭ−ＰＥＧを分離するためにモノＳを用いた陽イオン交換クロマトグラフィにより、精製した。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行い、試料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより溶出した。精製した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験し、未修飾ＤＦＭまたはＦａｂ’よりも遅い移動度を有することを示したことから、ＰＥＧの結合が成功したことが明らかになった（図１）。
【００６７】
無作為にＰＥＧ化された抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの調製
比較の目的のために、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭを調製し、ＰＥＧで無作為に誘導体化した。抗ＰＤＧＦβＲ・Ｆａｂ’を、上記したようにして還元した。Ｆａｂ’を、Ｆａｂ’：ＢＭＨモル比２．２：１、３７℃にて、ＤＭＦ中に溶解したＢＭＨと架橋した。クロスリンカーは、５分間隔で、５分割量で加え、そして試料を１時間以上インキュベートした。得られたＤＦＭ（ＢＭＨと架橋したジＦａｂ’）を、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰを用いた疎水性クロマトグラフィにより、未反応のＦａｂ’から精製した。
【００６８】
精製したＤＦＭを、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ８．０、にバッファー交換した。２−イミノチオレン（Ｔｒａｕｔ試薬）の４倍モルで、室温にて、１時間、反応することによって、チオールをリジン残基に無作為に導入した。ＰＤ１０カラムを用いて、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有、０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ６．０、に脱塩した後、導入されたチオールの数をＤＴＤＰで滴定して決定した。チオール化ＤＦＭを、３時間、チオールより３．５倍過剰モルのＰＥＧマレイミド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、前記に同じ）と反応した。ゲル濾過ＨＰＬＣ分析によって定量した結果、平均１．３ＰＥＧ分子が１ＤＦＭ当り結合していた。ＰＥＧ−ＤＦＭを、モノＳを用いた陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行い、試料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより溶出した。
【００６９】
ＢＩＡｃｏｒｅによる抗原結合分析
ＰＤＧＦβＲに対する抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ結合のオン・オフ比を決定するための動力学的分析を、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて行った。測定は、センサーチップ表面の固定化された、抗マウスＩｇＧによる、ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ融合分子の捕捉、次いで、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの注入によることを含む。ヤギ抗マウスＩｇのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ・Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に、アミン・カップリング・ケミストリーを経由して１１５００ＲＵのレベルに固定化した。ブランク表面を、固定化処置に次いで、但し捕捉分子の注入を省略して、調製した。ＨＢＳバッファー（１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ・ＮａＣｌ、３ｍＭ・ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を、ランニングバッファーとして、流速１０ｍｌ／分で、用いた。ＣＯＳ細胞上清からのｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲの注入は、固定化抗マウスＩｇＧによって、２００−２５０ＲＵの間のレベルに捕捉された。抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ分子を、捕捉されたｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ上で、２ｍｇ／ｍｌから０．５２ｍｇ／ｍｌまで滴定した。表面は、３０ｍＭ塩酸１０ｍｌを注入して再生された。ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲおよび抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの各濃度の注入は、対照としてのブランク表面上で繰返された。各抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ濃度に対するセンサーグラムは、ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ注入および再生ステップを除去した後、ブランク表面に対する対応するセンサーグラムで補正した。動力学パラメータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．１ソフトウエアを使用して計算された。
【００７０】
ＰＥＧ化中間体４（部位特異的）および無作為に誘導体化した抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧから調製した、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの結果を表１に示す。クロスリンカーとしてのＢＭＨと一緒に調製された非修飾ＤＦＭおよびＩｇＧを、結合パラメータを比較するために使用した。Ｋｄ値によって定量された結合親和性は、ＩｇＧと非修飾ＤＦＭの間で類似しており、それぞれ、１．０７Ｘ１０-10Ｍおよび１．２７Ｘ１０-10Ｍ、であった。ＰＥＧとの無作為修飾（ジＦａｂ’当り１．３）の結果は、結合親和性が、８．９７Ｘ１０-10Ｍと、実質的に損失であった。同サイズのＰＥＧ分子での部位特異的ＰＥＧ化の結果は、Ｋｄ値、２．１０Ｘ１０-10Ｍと、より改善された結合親和性であった。
【００７１】
【表１】
【００７２】
薬物動力学
薬物動力学的解析のために、試料を、標準的方法により、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いて125Ｉで放射標識し、リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ６．８、中に脱塩して、未反応の125Ｉを除去した。一群６匹の雄ウイスターラットに、尾静脈に標識物質２０ｍｇを、ｉ．ｖ．注射した。一定の時間に、血液試料を採取し、ガンマカウンターで計測し、血液ｇ当りの投与量％を計算した。クリアランス値および血中濃度−時間曲線下面積を、ＳＩＰＨＡＲソフトウエアパッケージを使用して決定した。
【００７３】
結果（図２）は、非修飾ＤＦＭに比べてＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の血中クリアランスが遅いことを明らかにしている。このことは、また、薬物動力学パラメータの計算においても、反映された。ＩｇＧおよびＤＦＭの薬物動力学は、２コンパートメントモデルに最もよく適合し、これに対しＤＦＭ−ＰＥＧは、１コンパートメントモデルに最もよく適合していた。結果は、ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、著しく長い半減期と増加した血中濃度−時間曲線下面積を示した（表２）。
【００７４】
【表２】
【００７５】
バイオアッセイ
抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭおよびＤＦＭ−ＰＥＧ試料の力価を、ＰＤＧＦ・ＢＢに応答するＳＫ−５皮膚線維芽細胞による、３Ｈチミジンの取り込み阻害によって試験した。ＳＫ−５細胞（ＤＭＥＭ＋１０％加熱不活化ウシ胎児血清、１％グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウムおよび０．０２５Ｍ・ＨＥＰＥＳバッファー中で増殖）を、８０％集密でトリプシン処理し、そして、９６穴組織培養プレートに、１ウエル当り、５０００細胞／０．１ｍｌで、無血清培地（１：１ＤＭＥＭ：ＨＡＭ’ｓ・Ｆ１２＋５μｇ／ｍｌインスリン、１６ｎｇ／ｍｌセレン、２０μｇ／ｍｌトランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１％グルタミン、０．０２５Ｍ・ＨＥＰＥＳバッファー、およびペニシリン、ストレプトマイシン）中に植えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2、９５％湿度、のインキュベーターで２４時間静置した。培地のみ、抗体のみ、ＰＤＧＦ・ＢＢ最終濃度１０ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌ、またはＰＤＧＦ・ＢＢを異なった抗体濃度で、ウエルに、最終容積０．２ｍｌを加えた。各条件は、５ないし１０ウエルの間で使用した。６−８時間後、３Ｈチミジン（１ウエル当り０．５ｍＣｉ）を加え、細胞を一夜放置した。プレートをインキュベーターから取り出し、収穫を容易にするため、−２０℃で２４時間おいた。プレートを解凍し、ＤＮＡをＳｋａｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ９６ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて、フィルターマット上に採取した。マットを、６７℃で、９０分間、乾燥し、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ）を加え、マットをＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ １２０５ ＢＥＴＡＰＬＡＴＥＲ液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００７６】
１０ｎｇ／ｍｌ・ＰＤＧＦ・ＢＢ、および抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭまたはＤＦＭ−ＰＥＧの１０ｍｇ／ｍｌにおいて、３Ｈチミジンの取り込みは、全ての型の抗体によって８５−９２％阻害された。抗体の濃度が減少すると、無作為ＰＥＧ結合と部位特異的結合の間の差が、明らかになった（図３）。このことは、ＰＤＧＦ・ＢＢの濃度が２０ｎｇ／ｍｌに増加することによって同じく示された（図４）。無作為にＰＥＧ修飾された４０ｋＤａ・ＤＦＭと部位特異的４０ｋＤａ・ＤＦＭの間において、少なくとも、２倍の増加がある。
【００７７】
実施例２
１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸誘導体の部位特異的結合
中間体４を２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸エステル（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）、または、１０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸エステル（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）で誘導体化し、実施例１に記載したように、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧを製造するために使用した。この場合、ＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の精製は、モノＳのイオン交換クロマトグラフィを用いて達成された。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行い、試料を適用し平衡化バッファーで洗滌後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントで溶出した。このステップに続いて、ＤＦＭ−ＰＥＧを、水で１：１に稀釈したリン酸塩緩衝食塩水で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−２００によるゲル濾過を用いて、更に精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ＰＥＧの結合が成功していることが明らかにされた（図１）。
【００７８】
抗体結合の分析は、実施例１記載のようにして、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって行った。表３に示した結果は、これらのＰＥＧ誘導体は、抗体結合親和性を少し失っただけで結合することができることを、明らかにしている。
【００７９】
【表３】
【００８０】
これらのＤＦＭ−ＰＥＧ結合体を、実施例１に記載の方法を用いて、ラットにおいて、薬物動力学的研究を行った。結果（図５）は、非修飾ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、顕著に遅延した血中クリアランス（より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期）を明らかにしている。
【００８１】
実施例３
５ｋＤａ・ＰＥＧ−ＳＣＭ、２０ｋＤａ・ＰＥＧ−ＳＰＡ、１０ｋ・ＰＥＧ２−ＮＨＳおよび２０ｋ・ＰＥＧ２−ＮＨＳの誘導体を使用したＤＦＭ−ＰＥＧ
複合体の調製
中間体４を、２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．同上）、またはカルボキシメチル化ＰＥＧの５ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルエステル（Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．）、または１０ｋＤａ・ＰＥＧ２−スクシンイミド（２Ｘ５ｋＤａ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）または２０ｋＤａ・ＰＥＧ２スクシンイミド（２Ｘ１０ｋＤａ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）、で誘導体化した、そして実施例１および２に記載したように、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ複合体を調製するために使用した。これらのＤＦＭ−ＰＥＧ誘導体は、実施例２に記載したようにイオン交換クロマトグラフィ、次いでゲル濾過を用いて精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ＰＥＧへの結合は、全ての場合において成功したことが明らかされた（図６）。ＢＩＡｃｏｒｅ分析を、また、抗体結合親和性を決定するために、実施した。表４に示した結果は、これらのＰＥＧ誘導体は、抗体結合親和性を少し失っただけで結合することができることを、明らかにしている。
【００８２】
【表４】
【００８３】
これらのＤＦＭ−ＰＥＧ結合体を、実施例１に記載の方法を用いて、ラットにおいて、薬物動力学的研究を行った。結果（図７）は、非修飾ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、顕著に遅延した血中クリアランス（より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期）を明らかにしている。
【００８４】
実施例４
Ｆａｂ’の調製
ｈＴＮＦ４０Ｆａｂ’（ヒトＴＮＦαを認識する）を、１０Ｌファーメンターで増殖したＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０で、発現させた。Ｆａｂ’フラグメントは、架橋に使用し得る、そのヒンジ部中に存在する単一のシステイン残基を有している。細胞抽出物は、実施例１記載のようにして調製した。細胞抽出物は、伝導度３．５ｍＳ／ｃｍに稀釈し、ｐＨ４．５に調節し、そして５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で平衡化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅTMＳＰ（ファルマシア）のカラムに適用した。平衡化バッファーで洗滌後、Ｆａｂ’を５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、中２００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した。溶出物質のｐＨを、２Ｍトリスで７．５に調節し、ＰＢＳで平衡化したｐｒｏｔｅｉｎＧ・Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用した。ＰＢＳで洗滌後、Ｆａｂ’を０．１Ｍグリシン塩酸、ｐＨ２．７、で溶出し、直ちにｐＨを６に再調節した。精製したＦａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６、に透析濾過した。
【００８５】
ｈＴＮＦ４０ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の調製
Ｆａｂ’のヒンジチオールを、実施例１記載のように、β−メルカプトエチルアミンで還元によって活性化した。試料を、２ｍＭのＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中に脱塩した。Ｆａｂ’分子当りのチオール基の数は、実施例１に記載されたようにして測定した。Ｆａｂ’を、中間体４から調製したＰＥＧ化クロスリンカー（４０ｋＤａ・ＰＥＧビスマレイミド、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）と、Ｆａｂ’：リンカーの比２．２：１で、室温にて、架橋した。
【００８６】
目的のＤＦＭ−ＰＥＧを、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で（未反応のＦａｂ’を除くため）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−２００ＨＲを用いてゲル濾過クロマトグラフィにより、次いで、Ｆａｂ’−ＰＥＧからＤＦＭ−ＰＥＧを分離するためにＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰを用いた陽イオン交換クロマトグラフィにより、精製した。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行った。試料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより溶出した。精製した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験し、未修飾ＤＦＭよりも遅い移動度を有することが示され、ＰＥＧの結合が成功したことが明らかになった（図８）。
【００８７】
ＢＩＡｃｏｒｅによる抗原結合分析
抗原結合活性を、ＴＮＦ結合に対する親和性を測定する、ＢＩＡｃｏｒｅ測定によって評価した。Ｆａｂ’、ＤＦＭ、ＩｇＧまたはＰＥＧ−ＤＦＭを固定化抗Ｆａｂ’抗体で捕捉し、表面にヒトＴＮＦを通過させた。次いでＴＮＦ結合の動力学を分析した。この分析からの結果は、表５に示される。クロスリンカーとしてのＢＭＨと調製した非修飾ＤＦＭおよびＩｇＧを、結合パラメータを比較するために使用した。Ｋｄ値によって定量された結合親和性は、ＩｇＧおよびＤＦＭ（それぞれ、１．７９Ｘ１０-10Ｍおよび１．０７Ｘ１０-10Ｍ）に類似していた。ＤＦＭの部位特異性ＰＥＧ化は、１．８２Ｘ１０-10Ｍと、ほとんど同一の結合親和性の結果となり、ＰＥＧ修飾後抗体結合機能の喪失がないことを示している。
【００８８】
【表５】
【００８９】
薬物動力学
薬物動力学解析のために、これら試料を、実施例１に記載した方法を用いてラットで研究した。クリアランス率および血中濃度−時間曲線下面積値は、ＳＩＰＨＡＲまたはＷＩＮＮＯＮＬＩＮソフトウエアのいずれかを使用して決定された。
【００９０】
結果（図９）は、非修飾ＤＦＭに比べてＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の血中クリアランスが遅いこと（より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期）を明らかにした。このことは、また、薬物動力学パラメータの計算においても反映され、２コンパートメントモデルに適合した。結果は、ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、著しく長い半減期と増加した血中濃度−時間曲線下面積を明らかにした（表６）。
【００９１】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 非還元（レーン１−５）および還元（レーン６−９）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図２】 ラットにおける、ＤＦＭおよびＩｇＧと比較した、125Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の薬物動力学。
【図３】 抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ランダム）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ ＳＳ−リンカー、部位特異的）、ＤＦＭおよびＩｇＧによる１０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ ＢＢに対するＳＫ−５増殖応答の阻害。
【図４】 抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ランダム）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ ＳＳ−リンカー、部位特異的）、ＤＦＭおよびＩｇＧの１マイクログラム／ｍｌによる１０ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ ＢＢに対するＳＫ−５増殖応答の阻害。
【図５】 ラットにおける、ＤＦＭと比較した、125Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ、ＳＳリンカー）およびＤＦＭ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ、ＳＳリンカー）の薬物動力学。
【図６】 非還元（レーン１−７）および還元（レーン８−１３）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図７】 ラットにおける、非修飾ＤＦＭと比較した、種々のタイプの125Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（部位特異的）の薬物動力学。
【図８】 非還元（レーン２−３）および還元（レーン４−５）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図９】 ラットにおける、ＤＦＭおよびＩｇＧと比較した、125Ｉ標識抗ｈＴＮＦ４０ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の薬物動力学。
本発明は、修飾二価抗体フラグメント、それらの製造方法、それらを含有する組成物および医薬におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
抗体は、診断および治療目的のための臨床における使用が増加している。各々の場合の目標は、抗体・抗原相互反応の高特異性と親和性の組合せを開拓すること、検出を可能にすることおよび／または特定病変の治療、である。抗体は単独で使用され、あるいは放射性同位元素または細胞毒性薬のような別の原子または分子に負荷される。
【０００３】
抗体の薬物動力学および生体分布は、臨床におけるその使用が成功であるかどうかを決定する主要な役割を演じている。それゆえ、抗体は、その作用部位に運搬されることができ、そしてその目的を達成するに好適な長さの時間そこに保持されねばならない。また、その標的外では毒性値以下でのみ存在しなければならないし、明確な形で代謝分解されねばならない。
【０００４】
多くの使用のためには、抗体の薬物動力学は理想的でない。このことは、特に、抗体−放射性同位元素または−薬物結合体を用いた腫瘍診断および治療については、真実である。そのような結合体を用いた診断のためには、長い半減期は、腫瘍対バックグランドの比率が制限され、それで病変検出の感度が制限される。治療のためには、長い半減期は、抗体結合体に対し正常組織の長期間曝露となり、それゆえ線量限度毒性を来す。
【０００５】
抗体の薬物動力学を取り扱うためには多くの手段が可能であり、それらは通常それらの生体分布に影響する。最も単純で、最も一般的に応用され得る手段は、抗体フラグメントの使用である。それらは、抗体全体ごとよりも循環から、より急速に消失し、血液から組織に、より急速に分布し、これはいくつかの応用、例えば腫瘍画像化および治療に、特に優れている。
【０００６】
抗体フラグメントの薬物動力学を改善するために、更に我々はポリマーの使用を研究した。ポリエチレングリコール（ＰＧＥ）のような重合物質のタンパク質分子への結合はよく確立されており、ポリマーの結合は、タンパク質分子の薬理学的性質を実質的に変化させることができることが明らかにされている。例えば、タンパク質のＰＥＧ修飾は、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ循環の半減期、抗原性および免疫原性、溶解性、機械的安定性およびタンパク質分解に対する抵抗性を変化させることができる［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２，３５７８−３５８１，３５８２−３５８６；Ｎｕｃｃｉ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９１）６，１３３−１５１；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｔ．ｅｄ．）；タンパク質製剤の安定性：タンパク質安定化のための分解および戦略のインビボ的方法（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（１９９１）、２３５−２６３頁（Ａｈｅｒｎ，Ｔ．Ｊ．および Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．著）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。
【０００７】
ＰＥＧのタンパク質分子への結合は、多くの異なった化学的方法を用いて達成され、そのほとんどはＰＥＧのタンパク質の表面上のリジン残基または他のアミノ酸残基への乱雑な結合である［Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．＆ Ｌｅｅ，Ｃ．、ポリ（エチレングリコール）の化学：生物工学的および生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（１９９２）、３４７−３７０頁（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．著），Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。これは、しばしば、タンパク質の機能の部分的損傷、例えば酵素は触媒活性を減じてしまう［Ｎｕｃｃｉ，Ｍ．Ｌ．ら、同書］。
【０００８】
ＰＥＧ結合部位を導入するためのタンパク質の部位特異的修飾は報告されている。例えば、インターロイキン−２は、突然変異によって修飾され、通常グリコシル化されるスレオニン残基をＰＥＧの結合をさせるためにシステインによって置換される［Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．＆ Ｋａｒｔｅ，Ｎ．Ｖ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８，３４３−３４６］。通常グリコシル化される部位は、タンパク質構造の摂動なしにＰＥＧ修飾に耐えることができると考えられていたので、選択された。別の例において、酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼが、選択的にアルギニン残基をリジンに置換するよう修飾され、この例では、酵素分子当り１８まで付加的な可能性のあるＰＥＧ結合部位をもたらした［Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９９１），８８，７１８５−７１８９］。
【０００９】
抗体および抗体フラグメントを用いたこれまでの研究では、リジン残基を経た無作為ＰＥＧ結合［例えば、Ｌｉｎｇ，Ｔ．Ｇ．Ｉ．＆ Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８３），５９，３２７−３３７；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８７）１５，１７−２２；Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９１），５１，４３１０−４３１５；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６），７３，１７５−１８２］およびチオール化誘導体［Ｐｅｄｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９４），７０，１１２６−１１３０］が用いられてきた。無作為結合はしばしば、減少した親和性、結合活性または特異性で標的抗原と結合することだけができる修飾抗体を生みだした。このことを克服する一つの試みにおいて、抗原結合（ＣＤＲ）ループにおいて臨界的リジン残基をアルギニンと置換して免疫反応性のロスが少ない修飾を可能とした［Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）５，３２１−３２６］。
【００１０】
抗体のおよびヒンジ部領域における特異性部位は、エフェクターおよびレポーター分子の範囲の部位特異性結合を可能ならしめるように作り替えることができる［Ｌｙｏｎｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９０），３，７０３−７０９；ＥＰ特許明細書第３４８４４２号および第３４７４３３号］。本発明者らは、無作為結合プロセスに前以て関連する免疫反応性の喪失を避けるために、二価抗体に対するポリマーの部位特異的結合を使用することができることを、決定した。更に、このようにして修飾したフラグメントは、ポリマー分子の同じ数および形で無作為に修飾したフラグメントと比較して、著しく改善された結合および／または薬物動力学的性質を有していた。
【００１１】
それゆえ、本発明の一観点によれば、我々は、二つの抗体重鎖および共有結合した少なくとも一つのポリマー分子を含み、各重鎖は、一方の鎖のシステイン残基の硫黄原子が他方の鎖のシステイン残基の硫黄原子に結合した、少なくとも一つの非ジスルフィド分子鎖間架橋によって他に共有結合しており、該システイン残基は各鎖の可変部ドメインの外側に配置されている、ことを含む二価抗体フラグメントで、少なくとも、一つの非ジスルフィド分子鎖間架橋が共有結合したポリマー分子を有することを特徴とする二価抗体フラグメント、を提供する。
【００１２】
ここで使用される、用語「非ジスルフィド」は、例えば、抗体に普通に見出されるようなＳ−Ｓ架橋は除かれるという意味を意図している。本発明によるフラグメントに存在するタイプの分子鎖間架橋は、しかしながら、以下に記載するようなＳ−Ｓ結合を経由して重鎖に結合されている。
【００１３】
本発明の抗体フラグメントは、一般的に、抗原に選択的に結合することができる。抗原は、いずれも細胞関連抗原でもよく、例えば、Ｔ細胞、内皮細胞または腫瘍細胞マーカーのような細胞表面抗原であり、あるいは可溶性抗原である。細胞表面抗原の特別な例は、接着分子、例えば、β１インテグリン、例えばＶＬＡ−４のようなインテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンまたはＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１および２）、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原、およびＶＥＧＦ、ならびに適切なこれらのレセプター、を包含する。可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８またはＩＬ−１２のようなインターロイキン、ウイルス抗原、例えばＲＳウイルスまたはサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇＥ、インターフェロン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、コロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ、および血小板由来増殖因子、例えばＰＤＧＦ−α、およびＰＤＧＦ−β、ならびに適切なそれらのレセプター、を包含する。各抗原は、例えば、ヒト抗原である。
【００１４】
本発明による特別な抗原フラグメントは、特に後記する実施例に記載された腫瘍壊死因子αおよび血小板由来増殖因子、およびこれらのレセプター、に選択的に結合するものを包含する。
【００１５】
有用な抗原結合性質を達成するために、本発明によるフラグメント中の各重鎖は、相補的抗体軽鎖またはそのフラグメントと対を成している、そして本発明は、そのような構成に延長されている。所望により、重鎖−軽鎖対は、共役結合であり、例えば、天然に存在する抗体中に見出されるジスルフィド結合および／または例えば組替え一本鎖抗体中に見出されるようなペプチド結合、であり得る。
【００１６】
一般的に、各重鎖および、存在するならば、軽鎖は、可変部領域を有する。ここで使用される用語、「可変部領域」は、抗原結合部位を含有する重鎖または軽鎖の部分を意味することを意図している（以後、ＶHまたはＶL領域と云う）。ＶHまたはＶL領域は、いかなるサイズまたはアミノ酸組成でもよく、一般的に、少なくとも一つの、枠組み配列中に埋め込まれた抗原結合の原因である、超可変アミノ酸配列を含む。
【００１７】
各ＶHまたはＶL領域は、いかなる天然に存在する可変部またはそれらの遺伝子工学処理変化物でもよい。遺伝子工学処理変化物によるとは、組換えＤＮＡ工学技術を用いて創造された可変部領域を意味している。そのような遺伝子工学処理変化物は、例えば、天然抗体のアミノ酸配列においてまたはそれに対して挿入、欠失または交換によって天然の抗体可変部から創造されたものを包含する。このタイプの特別な例としては、少なくとも一つのＣＤＲ、および、所望により、一つまたはそれ以上の枠組みアミノ酸および第二の抗体からの可変部領域の残部、を含有する遺伝子工学処理されたＶHまたはＶL領域を包含する。
【００１８】
各ＶH領域は、一般的に、少なくとも一つのシステイン残基に共有結合されている。各システイン残基の位置は、必要な抗体フラグメントのサイズおよび性質に従って変化する。それゆえ、極端な一例では、システイン残基は、ＶH領域のＣ末端アミノ酸に直接結合している。このタイプの二つのＶH領域は、かくして、本発明のフラグメントを形成するように架橋される。
【００１９】
しかしながら、実際には、ＶH領域は、Ｃ末端アミノ酸において、システイン残基を含有する少なくとも一つの別の抗体領域またはそのフラグメントに共有結合していることが一般的に好ましい。それゆえ、例えば、ＶH領域は、免疫グロブリンＣH１領域またはそのフラグメントに結合している。ＣＨ１領域は、例えば免疫グロブリンに一般に見出されるようなヒンジ部領域を提供するように、または更に、例えば抗体ＣＨ２およびＣＨ３領域のような、領域を提供するように、更にアミノ酸で延長され得る。上記の場合の各々において、少なくとも一つのシステイン残基が、ポリマー分子を含有する分子鎖間架橋のための架橋部位を形成するどのような領域を通してどのような点に位置することができる。
【００２０】
同様に、本発明によるフラグメント中に存在するいかなるＶL領域も、抗体軽鎖定常部（ＣL）またはそのフラグメントに結合することができる。
【００２１】
本発明によるフラグメント中に存在するポリマーは、一般的に、合成または天然に存在するポリマー、例えば、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーまたは、分枝または非分枝多糖類、例えばホモまたはヘテロ多糖類、である。
【００２２】
上に挙げた合成ポリマー上に存在する特別な任意の置換基は、一つないしそれ以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基を包含している。合成ポリマーの特別の例は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、またはポリ（ビニルアルコール）およびそれらの誘導体、特に、置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシ（エチレングリコール）およびそれらの誘導体である。特別な天然に存在するポリマーは、乳糖、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンおよびこれらの誘導体を包含する。ここに使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えばスクシンイミドエステル等のような活性エステルを包含することを意図している。反応性基は、ポリマーに直接またはリンカーセグメントを通してポリマーに結合している。そのような基の残基は、ある種の例では、ポリマーおよび分枝鎖間架橋の間を結合する基として本発明の生成物の部分を形成する。
【００２３】
ポリマーのサイズは、記載したように変化し得る、しかし、一般的に、およそ５００Ｄａからおよそ５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、そして２５０００から４００００Ｄａを含む範囲の平均分子量である。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図する使用を基にして選択される。それゆえ、例えば、生成物を循環および浸透組織に残存させることを意図する場合、例えば、腫瘍の治療に使用するためには、小分子量のポリマー、例えばおよそ５０００Ｄａ、を使用することが有利である。生成物が循環中に残るような応用のためには、高分子量のポリマー、例えば２５０００Ｄａないし４００００Ｄａの範囲、を使用することが有利である。
【００２４】
一般的に、本発明による抗体フラグメントにおける各ポリマー分子は分枝鎖間架橋の部分を形成する。各架橋は、二つの重鎖をつなぐように働き、そして各鎖においてはシステイン残基の硫黄原子に共有的につながっている。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合または、特に、硫黄−炭素結合である。
【００２５】
各分枝鎖間架橋は、一般的に、どんな所望の長さまたは組成であってもよい。好適な架橋は、ホモまたはヘテロ官能性架橋剤、特に、丁度先程記載したような一つないしそれ以上の共有結合したポリマー分子を含有するホモまたはヘテロ二官能性架橋剤、を包含する。
【００２６】
ホモまたはヘテロ官能性架橋剤は、多価、特に、二つのチオール反応性官能基を含有する、脂肪族、ヘテロ脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、芳香族またはヘテロ芳香族基の、二価基を包含する。本発明による各フラグメントは、各チオール反応性官能基がシステイン残基の硫黄原子と共有結合にあるような試薬から誘導された分枝鎖間架橋を有している。特別なチオール反応性官能基は、αハロカルボキシル酸またはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルフォンまたはジスルフィド、を包含する。
【００２７】
特別な架橋は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ4-20アルキレン、Ｃ4-20アルケニレンまたはＣ4-20アルキニレン鎖を包含し、これらは一つまたはそれ以上のヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、例えば、−Ｏ−または−Ｓ−原子または−Ｎ（Ｒ1）−［ここで、Ｒ1は、水素原子またはＣ1-6アルキル基］、−ＣＯＮ（Ｒ1）−，−Ｎ（Ｒ1）ＣＯ−、−ＳＯ2Ｎ（Ｒ1）−，−Ｎ（Ｒ1）ＳＯ2−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−ＯＣＯＮ（Ｒ1）−、−Ｎ（Ｒ1）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−基により、またはシクロペンチレン、シクロヘキシレン、フェニレンまたは置換フェニレン基によって中断されていてもよい。任意の置換基は、例えば、一つまたはそれ以上のアミノ基または置換アミノ基、例えば、−Ｎ（Ｒ1）2基、ここで各Ｒ1原子または基は同じかまたは異なる、を包含する。
【００２８】
ポリマーは、分枝鎖間架橋中の任意の位置に、一般的には、特定の分枝鎖間架橋に関して先程記載したヘテロ原子またはヘテロ原子含有基を通して、共有結合している。
【００２９】
本発明による特別に有用なフラグメントは、単一の分枝鎖間架橋を含有するものである。これら特別のフラグメントにおいて、ポリマーは、特に合成ポリマーであり、特にポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、または特にメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、そして特に約２５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量のものである。架橋は、特に、前記したように、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ4-20アルキレン鎖で、一つまたはそれ以上のヘテロ原子またはヘテロ原子含有基によって中断されていてもよい。
【００３０】
本発明によるフラグメント中の各重鎖は、好ましくは、例えば、免疫グロブリン中に天然に見出される、ヒンジ部ドメインによって末端が置換されたＶH−ＣＨ１鎖である。各鎖は、好ましくは、軽鎖と対をなしており、特にＶH−ＣL鎖、それゆえ、例えば、Ｆａｂ’フラグメントである。そのようなタイプの重鎖または重鎖−軽鎖対を含有する本発明の好ましいフラグメントにおいては、特に各重鎖のヒンジ配列に位置するシステイン残基を架橋する、一つの分子鎖間架橋が存在する。これは、各ヒンジ配列中に存在する唯一のシステイン残基であることが望ましい。
【００３１】
所望ならば、本発明による抗体フラグメントは、更に、それに結合した一つまたはそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子を有し、そして本発明はそのような修飾抗体にも拡張される。エフェクターまたはレポーター分子は、フラグメント中に位置している得られ得るアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、を通して抗体フラグメントに結合している。
【００３２】
エフェクター分子は、例えば、抗腫瘍剤、トキシン（例えば、細菌または植物由来の酵素的活性トキシンおよびそれらのフラグメント、例えば、リシンまたはそのフラグメント）、生理活性タンパク質、例えば酵素、核酸およびこれらのフラグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨード、およびキレート金属、を包含する。好適なレポーター基は、キレート金属、蛍光化合物またはＮＭＲまたはＥＳＲ分光法によって検出される化合物を包含する。
【００３３】
特別の抗腫瘍剤は、細胞毒性および細胞分裂阻止剤、例えば、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、メルファラン、メクロルエタミン、シクロフォスファミド、またはウラシルマスタード）およびこれらの誘導体、トリエチレンフォスフォルアミド、トリエチレンチオフォスフォルアミド、ブスルファン、またはシスプラチン；抗代謝剤、例えば、メトトレキセート、フルオロウラシル、フロキシウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸またはフルオロクエン酸、抗生物質、例えば、ブレオマイシン類（例えば、硫酸ブレオマイシン）ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン類（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリケマイシンおよびその誘導体、またはエスペラマイシンおよびその誘導体；分裂阻害剤、例えば、エトポシド、ビンクリスチンまたはビンブラスチンおよびそれらの誘導体；アルカロイド類、例えば、エリプチシン；ポリオール類、例えばタキシシン−Ｉまたはタキシシン−ＩＩ；ホルモン類、例えばアンドロゲン類（例えば、ドロモスタノロンまたはテストラクトン）、プロゲスチン類（例えば、酢酸メゲストールまたは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン類（例えば、ジメチルスチルベストロール二リン酸、リン酸ポリエストラジオールまたはリン酸エストラムスチン）または抗エストロゲン類（例えば、タモキシフェン）；アントラキノン類、例えばミトキサントロン、尿素類、例えばヒドロキシウレア；ヒドラジン類、例えばプロカルバジン；またはイミダゾール類、例えばダカルバジン、を包含する。
【００３４】
特別に有用なエフェクター群は、カリケマイシンおよびその誘導体である（例えば、南ア特許明細書第８５／８７９４号、第８８／８１２７号および第９０／２８３９号を見よ）。
【００３５】
キレート金属は、２から８（両端の数値を含む）の配位数を有する二価または三価の陽イオン金属を包含する。そのような金属の特別の例は、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、およびスカンジウム（Ｓｃ）を包含する。一般的に、金属は、好ましくは、放射核種である。特別な放射核種は、99mＴｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、67Ｃｕ、195Ａｕ、199Ａｕ、110Ａｇ、203Ｐｂ、206Ｂｉ、207Ｂｉ、111Ｉｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、88Ｙ、90Ｙ、160Ｔｂ、153Ｇｄおよび47Ｓｃ、を包含する。
【００３６】
キレート金属は、好適なポリデントキレート化剤、例えば、鎖状または環状ポリアミン、ポリエーテル、（例えばクラウンエーテルおよびそれらの誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；および炭素環状誘導体、でキレートされた金属の、例えば、上記のタイプの一つである。
【００３７】
一般的に、キレート化剤のタイプは、使用する金属による。本発明による共役体におけるキレート化剤の特に有用な群は、しかしながら、鎖状および環状ポリアミン、特に、ポリアミノカルボン酸、例えばジエチレントリアミン五酢酸およびその誘導体、および大環状アミン、例えばサイクリックトリアザおよびテトラアザ誘導体（例えば、国際公開特許明細書ＷＯ第９２／２２５８３号に記載されたように）；およびポリアミド、特にデスフェリオキシアミンおよびその誘導体）である。
【００３８】
本発明による抗体フラグメントは、ＶH領域の外側に位置する重鎖反応性システイン残基を含有する抗体フラグメントをここに定義したようなポリマーを含有するチオール選択性架橋試薬と反応することによって製造される。反応は、一般的に、溶媒中、例えば酢酸またはリン酸バッファーのような水性バッファー溶液、で、およそ中性ｐＨ，例えばおよそｐＨ４．５ないしｐＨ８．０で、例えば室温で、実施される。抗体は、一般的に、架橋試薬の濃度に比較して過剰の濃度が採用される。ある種の例では、適切に反応性システイン残基を発生させるためβ−メルカプトエチルアミンのような試薬と共に、出発物質の抗体を減らす必要がある（例えば、後記する実施例１に記載のように）。必要ならば、所望の生成物は、未反応の出発物質または製造プロセス中に生じたその他の望ましくない生成物から常法、例えばクロマトグラフィによって、分離することができる。
【００３９】
抗体フラグメント出発物質は、［常法の免疫化および細胞融合手段によって調製される］いかなる抗体全体ごと、特にモノクローナル抗体全体ごとからも、例えば、ペプシン処理による、好適な標準的酵素開裂および／または消化技術を用いて、得ることができる。代りに、抗体フラグメント出発物質は、抗体可変部および／または定常部をコードするＤＮＡの操作および再発現を含む、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。そのようなＤＮＡは、公知および／または、例えば、ファージ・抗体ライブラリー［Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．Ｔｉｂｔｅｃｈ．１０，８０−８４（１９９２）を参照］を含むＤＮＡライブラリーから容易に得られる、または所望により合成することができる。標準分子生物学および／または化学手段は、ＤＮＡの配列決定および操作するのに、例えば、システイン残基を創造するのにコドンを導入するため、他のアミノ酸または領域を所望のように修飾、付加または除去するために、使用することができる。
【００４０】
ここからは、ＤＮＡを含有する一つまたはそれ以上の複製し得る発現ベクターが、適切な細胞系、例えば、抗体フラグメントの産生が起こる、非産生ミエローマ細胞株、例えばマウスＮＳＯ系または細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ株、を形質転換するために調製および使用することができる。効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクターのＤＮＡ配列は、適切な制御配列、特に可変領域配列に操作可能に結合したプロモーターおよびリーダー配列、を含んでいなければならない。この方法で、抗体フラグメントを製造する特別な方法は、一般的によく知られており、常法として使用されている。例えば、基礎的な分子生物学手段は、Ｍａｎｉａｔｉｓら［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９］に記載されており；ＤＮＡ配列決定はＳａｎｇｅｒら［ＰＮＡＳ，７４，５４６３（１９７７）］およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されたようにして実施することができる；および部位特異的突然変異誘発は、Ｋｒａｍｅｒら［Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１，（１９８４）］およびＡｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従って実行することができる。更に、ＤＮＡの操作によって抗体を調製するために適した技術、発現ベクターの創生および好適な細胞の形質転換の詳細については、例えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａ．および Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．生物工学および遺伝工学総説（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ）[Ｔｏｍｂｓ，Ｍ．Ｐ．編、１０巻，１章，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｄｎｏｖｅｒ，ＵＫ]により、そしてＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９１／０９９６７号において総説されているように、特許明細書を含め、多くの刊行物がある。
【００４１】
本発明による抗体フラグメントの調製において使用するためのチオール選択的架橋試薬は、（例えば、α−ハロカルボン酸またはエステル、例えばヨードアセタミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルフォン、またはジスルフィドのようなチオール反応性基を含有する）チオール選択的架橋剤を適切に機能化したポリマーと反応することによって得ることができる。好適なポリマー出発物質は、市販品（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ，ＵＳＡから）得られ、または、市販品の出発物質から常法の化学手段、例えばＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ＆Ｌｅｅ，Ｃ．同書、によって記載されたようにして、を用いて製造することができる。反応は、一般的に、機能化されたポリマー、例えばポリマーの活性エステル、と架橋試薬中に存在する適切な官能基、例えばアミン、の間での常法のカップリング反応である。標準的な反応条件が、例えば、活性エステルとアミンのカップリングについて後記の実験の部において記載するように、使用される。好適な架橋試薬は、市販のものから容易に得られ、または、市販の材料から常法手段を用いて、例えば、ＥＰ特許明細書第３８４６２４号およびＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９２／２２５８３号および後記の実験の部に記載するように、簡単に合成することができる。
【００４２】
エフェクターまたはレポーター分子に結合した、本発明による抗体フラグメントを得ようとする場合は、抗体フラグメントが直接またはカップリング剤を経由して、適切な活性ポリマーとの反応前または後のいずれかにエフェクターまたはレポーター分子に結合する、標準的化学または組替えＤＮＡ手段によって、製造することができる。特別の化学的手段は、例えば、ＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第９３／０６２３１号、ＷＯ第９２／２２５８３号、ＷＯ第９０／０９１９５号およびＷＯ第８９／０１４７６号に記載された方法を包含する。代りに、エフェクターまたはレポーター分子が、タンパク質またはポリペプチドである場合、結合は、例えば、ＰＣＴ国際特許明細書ＷＯ第８６／０１５３３号およびＥＰ特許明細書第３９２７４５号に記載されているように、組換えＤＮＡ手段を用いて達成することができる。
【００４３】
本発明による抗体フラグメントは、多くの疾病または疾患の検出または治療において有用である。そのような疾病または疾患は、感染症、例えばウイルス感染；炎症性疾患／自己免疫、例えば関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患；癌；アレルギ―性／アトピー性疾患、例えば喘息、湿疹；先天性疾病、例えば嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血；皮膚病、例えば乾癬；神経疾患、例えば多発性硬化症；移植、例えば臓器移植拒絶、移植片対宿主病；および代謝性／特発性疾患、例えば糖尿病、の一般標題の基に記載されているものに包含されている。
【００４４】
本発明による抗体フラグメントは、治療および／または診断において使用されるように製剤化することができ、本発明の更なる観点によれば、我々は、共有結合中に一価抗体フラグメントおよび少なくとも一つのポリマー分子を含む修飾一価抗体フラグメントを含む医薬組成物であって、各共有結合が、フラグメントの可変部領域の外側の抗体フラグメント中に位置しているシステイン残基の硫黄原子を経由し、それと共に、一つないしそれ以上の医薬として許容される賦形剤、稀釈剤または担体を有していることを特徴とする、医薬組成物を提供する。
【００４５】
上記に説明したように、本発明のこの観点における抗体フラグメントは、一つないしそれ以上のエフェクターまたはレポーター基に結合していてもよい。
【００４６】
医薬組成物は、投与のためのどのような好適な形態をも取ることができ、そして、好ましくは、例えば注射または点滴、例えばボーラス注射または連続点滴による、非経口投与に適した形態である。組成物が注射または点滴用である場合、油性または水性ベヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ることができ、そして、処方用剤、例えば懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤を含有することができる。
【００４７】
代りに、抗体組成物は、適切な滅菌溶液と共に使用前に再構成するような乾燥形態であってもよい。
【００４８】
もし、抗体組成物が、経口投与に適したものであれば、製剤は、有効成分に加えて、添加剤、例えば、澱粉、例えば馬鈴薯、トウモロコシまたは小麦澱粉またはセルロースまたは澱粉誘導体例えば微結晶セルロース；シリカ；種々の糖類、例えば乳糖；炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウム、を含有することができる。もし、製剤が経口投与用であるなら、患者の消化系に充分に耐え得るようであることが望ましい。そのために、製剤に粘液形成剤および樹脂を含有することが望ましい。また、胃液中で不溶であるカプセル中に抗体を製剤化することによって耐性を改善することが望ましい。また、更に、制御放出製剤に抗体または組成物を含有することが好ましい。
【００４９】
抗体組成物が、直腸投与に適するためには、製剤は、結合剤および／または滑沢剤；例えば、高分子化グリコール、ゼラチン、ココアバターまたはその他の植物ワックスまたは脂肪、を含有する。
【００５０】
本発明による治療および診断用途は、典型的には、ヒト患者に抗体フラグメントの有効量を投与することを含む。投与されるべき正確な量は、抗体の使用および患者の年齢、性および状態に従って変化するが、しかし、典型的には、約０．１ｍｇから１０００ｍｇ、例えば約１ｍｇから５００ｍｇと変化し得る。抗体は、単回投与または時間をかけて連続投与により投与され得る。投与は、適切に繰返すことができる。典型的な一回投与量は、例えば、単回の治療投与当り０．１−５０ｍｇ／ｋｇ体重の間、特に単回の治療投与に対し０．１−２０ｍｇ／ｋｇ体重の間であり得る。
【００５１】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【００５２】
以下の略号が使用される。
ＰＥＧ：ＣＨ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）2ＮＨＣＯ（ＣＨ2）2−
ＤＦＭ−ＰＥＧ：２つのＦａｂ’フラグメントがＰＥＧ化ジマレイミド架橋と架橋されている本発明による抗体フラグメント。
ＤＴＰＤ：４，４’−ジチオジピリジン
ＡＵＣ：血中濃度−時間曲線下面積
ＲＴ：室温
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＢＯＣ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＣＢＺ：カルボキシベンジルオキシ
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＤＣ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
ＢＭＨ：ビスマレイミドヘキサン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
【００５３】
中間体架橋基の調製
【００５４】
【化１】
Ｎ（α）Ｎ（ε）ジ−ＣＢＺ−（Ｌ）−リジン（１８．０ｇ、４３．３ｍＭ）を無水ＤＭＦ（８０ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ＢＯＣ−１，６−ジアミノヘキサン塩酸塩（１１．０６、４３．７５ｍＭ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（６．４３ｇ、４７．６３ｍＭ）、４−メチルモルホリン（５．２ｍｌ、４７．６３ｍＭ）およびＥＤＣ（９．１３ｇ、４７．６３ｍＭ）を加え、そして混合物を室温で５時間攪拌した。反応混合物をＨ2Ｏ中に加え、酢酸エチル（４Ｘ１００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、１０％クエン酸（２Ｘ５０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２Ｘ５０ｍｌ）食塩水（１Ｘ５０ｍｌ）で洗滌し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を減圧除去して、中間体１（２６．１５ｇ、１００％）を白色固体として得た。1ＨＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ７．７９（１Ｈ、ｔ）、７．３８−７．１９（１１Ｈ、ｍ）、６．７２（（１Ｈ、ｔ）、５．００−４．９９（４Ｈ、ｍ）、３．９５−３．９０（１Ｈ、ｍ）、３．０８−２．８７（６Ｈ、ｍ）および１．６０−１．０５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。
【００５６】
【化２】
中間体１（２６．１５ｇ、４２．７ｍＭ）をエタノール（７００ｍｌ）に溶解（加温しつつ）し、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．２ｇ）にて処理した。反応は、温水バス（〜３０℃）中で４時間Ｈ2ガス下に攪拌し、次いで冷却した。ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）を加え、混合物を濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2およびエタノールでよく洗滌した。溶媒を減圧下除去して、中間体２を油状泡沫として得た（１３．８ｇ、９４％）。1ＨＮＭＲ（（ＣＨ3）2ＳＯ）δ７．７８（１Ｈ、ｔ）、３．０６−２．９１（３Ｈ、ｍ）、２．８９−２．８４（４Ｈ、ｍ）、２．５２−２．４３（４Ｈ、ｂｓ）および１．５７−１．１５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。
【００５８】
【化３】
中間体２（１．４７ｇ、４．４７ｍＭ）を、無水ＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、そしてＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネート（２２．３８ｇ、８．９７ｍＭ）を加えた。反応混合物を、室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧下除去し、そしてＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）を加え、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（５０ｍｌ）を加えた。層を分離し、水層をＣＨ2Ｃｌ2（２Ｘ５０ｍｌ）で洗滌した。有機層を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ3（２Ｘ５０ｍｌ）で洗滌し、そしてＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を減圧除去して、残渣をジエチルエーテルにて処理し、得られた固体を濾過し、ジエチルエーテルで、よく洗滌して、乾燥し、中間体３（２．０５ｇ、７４％）を白色固体として得た。1ＨＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ８．０５（１Ｈ、ｄ）、７．７５（１Ｈ、ｔ）、６．９８（４Ｈ、ｓ）、６．７２（１Ｈ、ｂｔ）、４．２１−４．０７（１Ｈ、ｍ）、３．６２（４Ｈ、ｔ）、３．１２−２．８１（８Ｈ、ｍ）、２．４１（２Ｈ、ｔ）および１．５５−１．０５（２３Ｈ、ｍ、９Ｈを含む、ｓ）。マススペクトル、ＥＳ＋ｖｅ６６９（ＭＮａ+、１００％）、６．４７（ＭＨ+、２０％）、５４７（ＭＨ+、−Ｃ5Ｈ8Ｏ2、１５％）。
【００６０】
【化４】
中間体３（０．３ｇ、０．４６ｍＭ）を、ＣＨ2Ｃｌ2／ＴＦＡ（１０ｍｌ）の１：１混合物に溶解し、３４５分、室温で攪拌した。溶媒を減圧下除去して、残渣をトルエン（３Ｘ５ｍｌ）で共沸した。酢酸エチルを加え、固体を得て濾過し、酢酸エチル次いでジエチルエーテルでよく洗滌し、減圧下乾燥して中間体４を白色固体として得た（０．２１ｇ、６８％）。1ＨＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ８．０３（１Ｈ、ｄ）、７．９０（１Ｈ、ｔ）、７．８０（１Ｈ、ｔ）、７．６９（２Ｈ、ｂｓ）、６．９９（４Ｈ、ｓ）、４．０９（１Ｈ、ｍ）、３．５８（４Ｈ、ｔ）、３．３３（ＨＯＤ）、３．１０−２．９３（４Ｈ、ｍ）、２．７６（２Ｈ、ｂｍ）２．４１−２．２７（４Ｈ、ｍ）および１．５１−１．００（１４Ｈ、ｍ）。
【００６２】
実施例１
ＰＥＧ化（４０ＫＤａ）架橋基の調製
ＤＭＦ中の中間体４に、Ｎ−メチルモルフォリンの１モル当量、および、アミン反応性ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ＰＥＧ−ＮＨＳエステル；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）の５倍モルを加えた。混合物を、時々攪拌しながら、２時間室温でインキュベートした。未反応のＰＥＧは、２ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中の１Ｍグリシン保存溶液から、ＰＥＧに対し１００倍モル過剰のグリシンを加えて不活性化し、そして、混合物を更に１０分だけインキュベートして、所望のＰＥＧ化架橋基を得た。
【００６３】
Ｆａｂ’の調製
ヒトＰＤＧＦβレセプター（以下、ＰＤＧＦβＲ）を認識する、遺伝子操作処理ヒト抗体ｇ１６２からのＦａｂ’を、ＰＣＴ国際特許明細書ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３４００に記載されたようにして、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた。Ｆａｂ’フラグメントは、架橋に使用できるヒンジ部領域中に存在する単一のシステイン残基を有している。細胞を、遠心分離によって醗酵培養から収穫し、１０ｍＭ・ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭトリス、ｐＨ７．４、に細胞を再懸濁することによって、Ｆａｂ’を抽出し、６０℃で一夜インキュベートした。Ｆａｂ’を、１Ｍグリシン／グリシネート、ｐＨ８．０、で前平衡化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ・ＡＴＭ（ファルマシア）のカラムを用いて拡張床クロマトグラフィによって精製した。試料を、グリシンに関して１Ｍにし、そして、拡張床法でカラムに適用する前に、５０％（ｗ／ｖ）ナトリウムグリシネートでｐＨを７．５に調節した。平衡化バッファーで洗滌後、カラムの材料を充填床に充填し、Ｆａｂ’を０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．０、で溶出した。
【００６４】
更なる精製は、２Ｍトリスで、溶出液のｐＨを７．５に調節し、リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ７．４、で前平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ・Ｇセファロースのカラムに適用することによって、達成された。平衡化バッファーで洗滌後、Ｆａｂ’を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７、で溶出した。溶出したＦａｂ’のｐＨを、次いで、２Ｍトリスで６．０に調節した。
【００６５】
抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ（部位特異的）の調製
精製した抗ＰＤＧＦβＲ・Ｆａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中に透析濾過した。ヒンジチオールをβ−メルカプトエチルアミンで還元して活性化した。Ｆａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有、０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中で、５ｍＭβ−メルカプトエチルアミンと３７℃、３０分間、インキュベートした。試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５（ＰＤ１０）カラムを用いて、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中に脱塩した。Ｆａｂ’分子当りのチオール基の数は、以前記載された［Ｌｙｏｎｓら、（１９９０）、同書］ようにしてＤＴＤＰで滴定することによって測定した。Ｆａｂ’を、中間体４から調製したＰＥＧ化クロスリンカーと、Ｆａｂ’：リンカーのモル比２．２：１で、３７℃にて、架橋した。クロスリンカーは、５分間隔で、５分割量で加え、そして試料を１時間以上インキュベートした。
【００６６】
目的のＤＦＭ−ＰＥＧを、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で（未反応のＦａｂ’を除くため）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−４００ＨＲを用いてゲル濾過クロマトグラフィにより、次いで、ＤＦＭおよびＦａｂ’−ＰＥＧからＤＦＭ−ＰＥＧを分離するためにモノＳを用いた陽イオン交換クロマトグラフィにより、精製した。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行い、試料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより溶出した。精製した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験し、未修飾ＤＦＭまたはＦａｂ’よりも遅い移動度を有することを示したことから、ＰＥＧの結合が成功したことが明らかになった（図１）。
【００６７】
無作為にＰＥＧ化された抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの調製
比較の目的のために、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭを調製し、ＰＥＧで無作為に誘導体化した。抗ＰＤＧＦβＲ・Ｆａｂ’を、上記したようにして還元した。Ｆａｂ’を、Ｆａｂ’：ＢＭＨモル比２．２：１、３７℃にて、ＤＭＦ中に溶解したＢＭＨと架橋した。クロスリンカーは、５分間隔で、５分割量で加え、そして試料を１時間以上インキュベートした。得られたＤＦＭ（ＢＭＨと架橋したジＦａｂ’）を、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰを用いた疎水性クロマトグラフィにより、未反応のＦａｂ’から精製した。
【００６８】
精製したＤＦＭを、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ８．０、にバッファー交換した。２−イミノチオレン（Ｔｒａｕｔ試薬）の４倍モルで、室温にて、１時間、反応することによって、チオールをリジン残基に無作為に導入した。ＰＤ１０カラムを用いて、２ｍＭ・ＥＤＴＡ含有、０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ６．０、に脱塩した後、導入されたチオールの数をＤＴＤＰで滴定して決定した。チオール化ＤＦＭを、３時間、チオールより３．５倍過剰モルのＰＥＧマレイミド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、前記に同じ）と反応した。ゲル濾過ＨＰＬＣ分析によって定量した結果、平均１．３ＰＥＧ分子が１ＤＦＭ当り結合していた。ＰＥＧ−ＤＦＭを、モノＳを用いた陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行い、試料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより溶出した。
【００６９】
ＢＩＡｃｏｒｅによる抗原結合分析
ＰＤＧＦβＲに対する抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ結合のオン・オフ比を決定するための動力学的分析を、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて行った。測定は、センサーチップ表面の固定化された、抗マウスＩｇＧによる、ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ融合分子の捕捉、次いで、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの注入によることを含む。ヤギ抗マウスＩｇのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ・Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に、アミン・カップリング・ケミストリーを経由して１１５００ＲＵのレベルに固定化した。ブランク表面を、固定化処置に次いで、但し捕捉分子の注入を省略して、調製した。ＨＢＳバッファー（１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ・ＮａＣｌ、３ｍＭ・ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を、ランニングバッファーとして、流速１０ｍｌ／分で、用いた。ＣＯＳ細胞上清からのｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲの注入は、固定化抗マウスＩｇＧによって、２００−２５０ＲＵの間のレベルに捕捉された。抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ分子を、捕捉されたｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ上で、２ｍｇ／ｍｌから０．５２ｍｇ／ｍｌまで滴定した。表面は、３０ｍＭ塩酸１０ｍｌを注入して再生された。ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲおよび抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの各濃度の注入は、対照としてのブランク表面上で繰返された。各抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ濃度に対するセンサーグラムは、ｍｌｇＧ・Ｆｃ−ＰＤＧＦβＲ注入および再生ステップを除去した後、ブランク表面に対する対応するセンサーグラムで補正した。動力学パラメータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．１ソフトウエアを使用して計算された。
【００７０】
ＰＥＧ化中間体４（部位特異的）および無作為に誘導体化した抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧから調製した、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧの結果を表１に示す。クロスリンカーとしてのＢＭＨと一緒に調製された非修飾ＤＦＭおよびＩｇＧを、結合パラメータを比較するために使用した。Ｋｄ値によって定量された結合親和性は、ＩｇＧと非修飾ＤＦＭの間で類似しており、それぞれ、１．０７Ｘ１０-10Ｍおよび１．２７Ｘ１０-10Ｍ、であった。ＰＥＧとの無作為修飾（ジＦａｂ’当り１．３）の結果は、結合親和性が、８．９７Ｘ１０-10Ｍと、実質的に損失であった。同サイズのＰＥＧ分子での部位特異的ＰＥＧ化の結果は、Ｋｄ値、２．１０Ｘ１０-10Ｍと、より改善された結合親和性であった。
【００７１】
【表１】
薬物動力学
薬物動力学的解析のために、試料を、標準的方法により、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いて125Ｉで放射標識し、リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ６．８、中に脱塩して、未反応の125Ｉを除去した。一群６匹の雄ウイスターラットに、尾静脈に標識物質２０ｍｇを、ｉ．ｖ．注射した。一定の時間に、血液試料を採取し、ガンマカウンターで計測し、血液ｇ当りの投与量％を計算した。クリアランス値および血中濃度−時間曲線下面積を、ＳＩＰＨＡＲソフトウエアパッケージを使用して決定した。
【００７３】
結果（図２）は、非修飾ＤＦＭに比べてＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の血中クリアランスが遅いことを明らかにしている。このことは、また、薬物動力学パラメータの計算においても、反映された。ＩｇＧおよびＤＦＭの薬物動力学は、２コンパートメントモデルに最もよく適合し、これに対しＤＦＭ−ＰＥＧは、１コンパートメントモデルに最もよく適合していた。結果は、ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、著しく長い半減期と増加した血中濃度−時間曲線下面積を示した（表２）。
【００７４】
【表２】
バイオアッセイ
抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭおよびＤＦＭ−ＰＥＧ試料の力価を、ＰＤＧＦ・ＢＢに応答するＳＫ−５皮膚線維芽細胞による、３Ｈチミジンの取り込み阻害によって試験した。ＳＫ−５細胞（ＤＭＥＭ＋１０％加熱不活化ウシ胎児血清、１％グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウムおよび０．０２５Ｍ・ＨＥＰＥＳバッファー中で増殖）を、８０％集密でトリプシン処理し、そして、９６穴組織培養プレートに、１ウエル当り、５０００細胞／０．１ｍｌで、無血清培地（１：１ＤＭＥＭ：ＨＡＭ’ｓ・Ｆ１２＋５μｇ／ｍｌインスリン、１６ｎｇ／ｍｌセレン、２０μｇ／ｍｌトランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１％グルタミン、０．０２５Ｍ・ＨＥＰＥＳバッファー、およびペニシリン、ストレプトマイシン）中に植えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2、９５％湿度、のインキュベーターで２４時間静置した。培地のみ、抗体のみ、ＰＤＧＦ・ＢＢ最終濃度１０ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌ、またはＰＤＧＦ・ＢＢを異なった抗体濃度で、ウエルに、最終容積０．２ｍｌを加えた。各条件は、５ないし１０ウエルの間で使用した。６−８時間後、３Ｈチミジン（１ウエル当り０．５ｍＣｉ）を加え、細胞を一夜放置した。プレートをインキュベーターから取り出し、収穫を容易にするため、−２０℃で２４時間おいた。プレートを解凍し、ＤＮＡをＳｋａｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ９６ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて、フィルターマット上に採取した。マットを、６７℃で、９０分間、乾燥し、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ）を加え、マットをＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ １２０５ ＢＥＴＡＰＬＡＴＥＲ液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００７６】
１０ｎｇ／ｍｌ・ＰＤＧＦ・ＢＢ、および抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭまたはＤＦＭ−ＰＥＧの１０ｍｇ／ｍｌにおいて、３Ｈチミジンの取り込みは、全ての型の抗体によって８５−９２％阻害された。抗体の濃度が減少すると、無作為ＰＥＧ結合と部位特異的結合の間の差が、明らかになった（図３）。このことは、ＰＤＧＦ・ＢＢの濃度が２０ｎｇ／ｍｌに増加することによって同じく示された（図４）。無作為にＰＥＧ修飾された４０ｋＤａ・ＤＦＭと部位特異的４０ｋＤａ・ＤＦＭの間において、少なくとも、２倍の増加がある。
【００７７】
実施例２
１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸誘導体の部位特異的結合
中間体４を２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸エステル（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）、または、１０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸エステル（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）で誘導体化し、実施例１に記載したように、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧを製造するために使用した。この場合、ＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の精製は、モノＳのイオン交換クロマトグラフィを用いて達成された。モノＳクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行い、試料を適用し平衡化バッファーで洗滌後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントで溶出した。このステップに続いて、ＤＦＭ−ＰＥＧを、水で１：１に稀釈したリン酸塩緩衝食塩水で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−２００によるゲル濾過を用いて、更に精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ＰＥＧの結合が成功していることが明らかにされた（図１）。
【００７８】
抗体結合の分析は、実施例１記載のようにして、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって行った。表３に示した結果は、これらのＰＥＧ誘導体は、抗体結合親和性を少し失っただけで結合することができることを、明らかにしている。
【００７９】
【表３】
これらのＤＦＭ−ＰＥＧ結合体を、実施例１に記載の方法を用いて、ラットにおいて、薬物動力学的研究を行った。結果（図５）は、非修飾ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、顕著に遅延した血中クリアランス（より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期）を明らかにしている。
【００８１】
実施例３
５ｋＤａ・ＰＥＧ−ＳＣＭ、２０ｋＤａ・ＰＥＧ−ＳＰＡ、１０ｋ・ＰＥＧ２−ＮＨＳおよび２０ｋ・ＰＥＧ２−ＮＨＳの誘導体を使用したＤＦＭ−ＰＥＧ
複合体の調製
中間体４を、２０ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｃ．同上）、またはカルボキシメチル化ＰＥＧの５ｋＤａ・ＰＥＧスクシンイミジルエステル（Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．）、または１０ｋＤａ・ＰＥＧ２−スクシンイミド（２Ｘ５ｋＤａ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）または２０ｋＤａ・ＰＥＧ２スクシンイミド（２Ｘ１０ｋＤａ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ）、で誘導体化した、そして実施例１および２に記載したように、抗ＰＤＧＦβＲ・ＤＦＭ−ＰＥＧ複合体を調製するために使用した。これらのＤＦＭ−ＰＥＧ誘導体は、実施例２に記載したようにイオン交換クロマトグラフィ、次いでゲル濾過を用いて精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ＰＥＧへの結合は、全ての場合において成功したことが明らかされた（図６）。ＢＩＡｃｏｒｅ分析を、また、抗体結合親和性を決定するために、実施した。表４に示した結果は、これらのＰＥＧ誘導体は、抗体結合親和性を少し失っただけで結合することができることを、明らかにしている。
【００８２】
【表４】
これらのＤＦＭ−ＰＥＧ結合体を、実施例１に記載の方法を用いて、ラットにおいて、薬物動力学的研究を行った。結果（図７）は、非修飾ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、顕著に遅延した血中クリアランス（より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期）を明らかにしている。
【００８４】
実施例４
Ｆａｂ’の調製
ｈＴＮＦ４０Ｆａｂ’（ヒトＴＮＦαを認識する）を、１０Ｌファーメンターで増殖したＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０で、発現させた。Ｆａｂ’フラグメントは、架橋に使用し得る、そのヒンジ部中に存在する単一のシステイン残基を有している。細胞抽出物は、実施例１記載のようにして調製した。細胞抽出物は、伝導度３．５ｍＳ／ｃｍに稀釈し、ｐＨ４．５に調節し、そして５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で平衡化したＳｔｒｅａｍｌｉｎｅTMＳＰ（ファルマシア）のカラムに適用した。平衡化バッファーで洗滌後、Ｆａｂ’を５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、中２００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した。溶出物質のｐＨを、２Ｍトリスで７．５に調節し、ＰＢＳで平衡化したｐｒｏｔｅｉｎＧ・Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用した。ＰＢＳで洗滌後、Ｆａｂ’を０．１Ｍグリシン塩酸、ｐＨ２．７、で溶出し、直ちにｐＨを６に再調節した。精製したＦａｂ’を２ｍＭ・ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６、に透析濾過した。
【００８５】
ｈＴＮＦ４０ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の調製
Ｆａｂ’のヒンジチオールを、実施例１記載のように、β−メルカプトエチルアミンで還元によって活性化した。試料を、２ｍＭのＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．０、中に脱塩した。Ｆａｂ’分子当りのチオール基の数は、実施例１に記載されたようにして測定した。Ｆａｂ’を、中間体４から調製したＰＥＧ化クロスリンカー（４０ｋＤａ・ＰＥＧビスマレイミド、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）と、Ｆａｂ’：リンカーの比２．２：１で、室温にて、架橋した。
【００８６】
目的のＤＦＭ−ＰＥＧを、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で（未反応のＦａｂ’を除くため）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・Ｓ−２００ＨＲを用いてゲル濾過クロマトグラフィにより、次いで、Ｆａｂ’−ＰＥＧからＤＦＭ−ＰＥＧを分離するためにＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰを用いた陽イオン交換クロマトグラフィにより、精製した。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰクロマトグラフィは、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５、で平衡化したカラムを用いて行った。試料を適用し、平衡化バッファーで洗滌した後、結合した物質を塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより溶出した。精製した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験し、未修飾ＤＦＭよりも遅い移動度を有することが示され、ＰＥＧの結合が成功したことが明らかになった（図８）。
【００８７】
ＢＩＡｃｏｒｅによる抗原結合分析
抗原結合活性を、ＴＮＦ結合に対する親和性を測定する、ＢＩＡｃｏｒｅ測定によって評価した。Ｆａｂ’、ＤＦＭ、ＩｇＧまたはＰＥＧ−ＤＦＭを固定化抗Ｆａｂ’抗体で捕捉し、表面にヒトＴＮＦを通過させた。次いでＴＮＦ結合の動力学を分析した。この分析からの結果は、表５に示される。クロスリンカーとしてのＢＭＨと調製した非修飾ＤＦＭおよびＩｇＧを、結合パラメータを比較するために使用した。Ｋｄ値によって定量された結合親和性は、ＩｇＧおよびＤＦＭ（それぞれ、１．７９Ｘ１０-10Ｍおよび１．０７Ｘ１０-10Ｍ）に類似していた。ＤＦＭの部位特異性ＰＥＧ化は、１．８２Ｘ１０-10Ｍと、ほとんど同一の結合親和性の結果となり、ＰＥＧ修飾後抗体結合機能の喪失がないことを示している。
【００８８】
【表５】
薬物動力学
薬物動力学解析のために、これら試料を、実施例１に記載した方法を用いてラットで研究した。クリアランス率および血中濃度−時間曲線下面積値は、ＳＩＰＨＡＲまたはＷＩＮＮＯＮＬＩＮソフトウエアのいずれかを使用して決定された。
【００９０】
結果（図９）は、非修飾ＤＦＭに比べてＤＦＭ−ＰＥＧ複合体の血中クリアランスが遅いこと（より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期）を明らかにした。このことは、また、薬物動力学パラメータの計算においても反映され、２コンパートメントモデルに適合した。結果は、ＤＦＭに比較してＤＦＭ−ＰＥＧは、著しく長い半減期と増加した血中濃度−時間曲線下面積を明らかにした（表６）。
【００９１】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 非還元（レーン１−５）および還元（レーン６−９）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図２】 ラットにおける、ＤＦＭおよびＩｇＧと比較した、125Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の薬物動力学。
【図３】 抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ランダム）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ ＳＳ−リンカー、部位特異的）、ＤＦＭおよびＩｇＧによる１０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ ＢＢに対するＳＫ−５増殖応答の阻害。
【図４】 抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、ランダム）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）、ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ ＳＳ−リンカー、部位特異的）、ＤＦＭおよびＩｇＧの１マイクログラム／ｍｌによる１０ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ ＢＢに対するＳＫ−５増殖応答の阻害。
【図５】 ラットにおける、ＤＦＭと比較した、125Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ、ＳＳリンカー）およびＤＦＭ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ、ＳＳリンカー）の薬物動力学。
【図６】 非還元（レーン１−７）および還元（レーン８−１３）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図７】 ラットにおける、非修飾ＤＦＭと比較した、種々のタイプの125Ｉ標識抗ＰＤＧＦβＲ ＤＦＭ−ＰＥＧ（部位特異的）の薬物動力学。
【図８】 非還元（レーン２−３）および還元（レーン４−５）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図９】 ラットにおける、ＤＦＭおよびＩｇＧと比較した、125Ｉ標識抗ｈＴＮＦ４０ ＤＦＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ、部位特異的）の薬物動力学。
Claims (13)
- 二つの抗体重鎖および共有結合した少なくとも１つのポリマー分子を含み、各重鎖が、一方の鎖のシステイン残基の硫黄原子が他方の鎖のシステイン残基の硫黄原子に結合した、少なくとも一つの非ジスルフィド分子鎖間架橋によって他に共有結合しており、該システイン残基は各鎖のヒンジ部ドメインの中に配置されている、二価抗体フラグメントで、少なくとも一つの非ジスルフィド分子鎖間架橋が共有結合したポリマー分子を含むことを特徴とする二価抗体フラグメントであって、
該ポリマー分子が、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー、または分枝または非分枝多糖類である、 上記二価抗体フラグメント。 - 各重鎖が、単一の非ジスルフィド架橋によって他に共有結合し、該架橋が共有結合したポリマー分子を含有している請求項１記載の抗体フラグメント。
- 各重鎖が軽鎖と対をなしている、請求項１または請求項２記載の抗体フラグメント。
- 各重鎖が、ヒンジ部ドメインによって末端が置換されたＶH−ＣＨ１鎖である、請求項１ないし請求項３のいずれか一つに記載の抗体フラグメント。
- ポリマーが置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）またはその誘導体である、請求項１記載の抗体フラグメント。
- ポリマーがメトキシ（ポリエチレングリコール）またはその誘導体である、請求項５記載の抗体フラグメント。
- ポリマーが約２５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項６記載の抗体フラグメント。
- 各分子鎖間架橋が、ホモまたはヘテロ二官能性架橋剤の残基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
- 各架橋が、一つまたはそれ以上のヘテロ原子またはヘテロ原子含有基によって中断されていてもよい、置換されていてもよいＣ4-20アルキレン鎖である、請求項８記載の抗体フラグメント。
- 一つまたはそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子に共有結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
- 細胞表面または可溶性抗原に選択的に結合することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
- 抗原がヒト腫瘍壊死因子αまたは血小板由来増殖因子またはそのレセプターである請求項１１記載の抗体フラグメント。
- 一つまたはそれ以上の医薬品として許容される賦形剤、稀釈剤または担体と共に請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体フラグメントを含む医薬組成物。
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