CN104004088B - 双特异性抗体融合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体相融合。

Description

双特异性抗体融合物
本申请是申请日为2008年9月26日、申请号为200880113719.9、发明名称为“双特异性抗体融合物”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及新的双特异性抗体融合蛋白。此类抗体包含针对目的抗原的第一特异性，和对于第二目的抗原的第二特异性，所述第二目的抗原例如为血清载体蛋白，其用于在延长抗体的体内血清半衰期中使用。还提供了用于产生此类分子的方法和包含它们的药物组合物。
抗体的高特异性和亲和力使得它们成为理想的诊断和治疗剂，特别是用于调节蛋白质:蛋白质相互作用。在重组抗体技术领域中的进展已导致产生出抗体片段例如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段及其他抗体片段。这些更小的分子保留了完整抗体的抗原结合活性，并且还可以展示出相比于完整免疫球蛋白分子而言经改善的组织渗透和药物代谢动力学特性。事实上，抗体片段被证明是多用途的治疗剂，如通过产品例如和的近期成功而可见的。尽管此类片段看起来展示出超过完整免疫球蛋白的许多优点，但它们还遭受了增加的从血清中的清除率，因为它们缺乏赋予长的体内寿命的Fc结构域（Medasan等人,1997,J.Immunol.158:2211-2217）。
先前已描述了具有双特异性即与两种不同的抗原相结合的抗体（关于综述，参见Segal等人,1999,Curr.Opin.Immunol.11:558-562；Plückthun&Pack,1997,Immunotechnology,3:83-105；Fischer和Leger,2007,Pathobiology,74,3-14）。在WO02/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203和US2006280734中也描述了双特异性抗体。用于制备基于异双特异性抗体的分子的先前方法一般采用化学交联或者蛋白质改造技术。化学交联遭受了异和同二聚体形成的产率差以及要求进行其后续的色谱法分离。蛋白质改造方法已高度地进行了详细阐述（例如，杵-臼（knobs-into-holes）改造；Ridgway等人,1996,Protein Eng.9(7):617-621）或已使用了具有不合适的稳定性特征的分子（例如，双抗体，scFv）。在某些情况下， 双特异性抗体还可以遭受位阻问题，从而使得两种抗原无法同时与每条抗体臂相结合。
单可变结构域抗体也称为单结构域抗体或dAbs，其相应于抗体的重链可变区（VH）或轻链可变区（VL）。Ward等人,1989,Nature,341,544-546描述了鼠类单结构域抗体。人单结构域抗体和‘骆驼化的（camelised）’人单结构域抗体也已得到描述（Holt等人,2003,Trends in Biotechnology,21,484-490）。还已从骆驼科动物（骆驼和美洲驼）和软骨鱼（须鲨和铰口鲨）中获得了单结构域抗体。这些生物已进化出了安装在Fc-等价恒定结构域构架上的高亲和力单V-样结构域（在骆驼科动物中称为VhH，和在鲨鱼中称为V-NAR），以作为其免疫系统的完整且至关重要的组分（关于综述，参见Holliger&Hudson；2005,NatureBiotechnology,23(9):1126-1136）。
在EP0368684中描述了单结构域抗体-酶融合物。在WO2004/058820中还描述了单结构域-效应子基团融合物，其包含单个可变结构域。在WO2007/024715中描述了双重可变结构域免疫球蛋白。在EP1517921中描述了包含两个具有不同特异性的单结构域抗体的双特异性配体。
用于改善抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2和其他抗体片段的半衰期的手段是已知的。一种方法使所述片段与聚合物分子相缀合。因此，已通过缀合至聚乙二醇（PEG）而改善了Fab’、F(ab’)2片段在动物中的短的循环半衰期（参见例如，WO98/25791、WO99/64460和WO98/37200）。另一种方法通过缀合至与FcRn受体相互作用的试剂来修饰所述抗体片段（参见例如，WO97/34631）。延长半衰期的另外一种方法使用结合血清白蛋白的多肽（参见例如，Smith等人,2001,Bioconjugate Chem.12:750-756；EP0486525；US6267964；WO04/001064；WO02/076489；和WO01/45746）。然而，仍然需要产生具有长的体内半衰期的抗原结合性免疫球蛋白蛋白质，以作为因为与FcRn受体相互作用而具有长的半衰期的那些的备选方案，其中没有通过缀合至PEG来进行化学修饰或者缀合至人血清白蛋白。
各种蛋白质存在于血浆中，并且包括甲状腺素结合蛋白、运甲状腺素蛋白、α1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白，或者它们中的任何的片段。血清载体蛋白在机体内循环，具有以天测量的半衰期，例如对于甲状腺素结合蛋白来说为5天或者对于运甲状腺素蛋白来说为2天（Bartalena&Robbins,1993,Clinics in Lab.Med.13:583-598），或者在碘化的α1-酸性糖蛋白的周转的第二个阶段中为65小时（Bree等人,1986,Clin.Pharmacokin.11:336-342）。来自Gitlin等人（1964,J.Clin.Invest.10:1938-1951）的数据暗示，在孕妇中，α1-酸性糖蛋白的半衰期为3.8天，对于转铁蛋白为12天，和对于纤维蛋白原为2.5天。血清白蛋白是在血管和血管外区室中都丰富的蛋白质，其在人中的半衰期为大约19天（Peters,1985,Adv Protein Chem.37:161-245）。这与为大约21天的IgG1的半衰期相似（Waldeman&Strober,1969,Progr.Allergy,13:1-110）。
本发明提供了经改善的双特异性抗体融合蛋白，其可以重组地产生并且能够同时结合两种抗原。
因此，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体（dAb）。
本发明还提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含至少一个具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体。
本发明的双特异性抗体融合物将能够与两种目的抗原选择性地相结合。
在一个实施方案中，由所述Fab或Fab’片段所结合的目的抗原可以是细胞关联蛋白，例如在细胞例如细菌细胞、酵母细胞、T-细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何在医学上相关的蛋白质，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白质，例如受体和/或其相应的配体。细胞表面蛋白的具体例子包括粘附分子，例如整联蛋白例如β1整联蛋白例如VLA-4， E-选择蛋白，P选择蛋白或L-选择蛋白，CD2，CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD11a，CD11b，CD18，CD19，CD20，CD23，CD25，CD33，CD38，CD40，CD45，CDW52，CD69，CD134（OX40），ICOS，BCMP7，CD137，CD27L，CDCP1，DPCR1，DPCR1，dudulin2，FLJ20584，FLJ40787，HEK2，KIAA0634，KIAA0659，KIAA1246，KIAA1455，LTBP2，LTK，MAL2，MRP2，柄蛋白-样2，NKCC1，PTK7，RAIG1，TCAM1，SC6，BCMP101，BCMP84，BCMP11，DTD，癌胚抗原（CEA），人乳脂球蛋白（HMFG1和2），I类MHC和II类MHC抗原，和VEGF，以及适当时，它们的受体。
可溶性抗原包括白介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素γ，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生长因子例如PDGF-α和PDGF-β，以及适当时，它们的受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒例如流感、EBV、HepA、B和C，生物恐怖主义试剂，放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
在一个实施方案中，本发明的抗体融合蛋白可以用于在功能上改变目的抗原的活性。例如，所述抗体融合蛋白可以直接地或间接地中和、拮抗或激动所述抗原的活性。
在一个实施方案中，由本发明的双特异性抗体融合蛋白中的所述单结构域抗体所结合的第二目的抗原可以是细胞关联蛋白，例如在细胞例如细菌细胞、酵母细胞、T-细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何在医学上相关的蛋白质，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白质，例如受体和/或其相应的配体。细胞表面蛋白的具体例子包括粘附分子，例如整联蛋白例如β1整联蛋白例如VLA-4，E-选择蛋白，P选择蛋白或L-选择蛋白，CD2，CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD11a，CD11b，CD18，CD19，CD20，CD23，CD25，CD33，CD38，CD40，CD45，CDW52，CD69，CD134（OX40），ICOS，BCMP7，CD137，CD27L，CDCP1，DPCR1，DPCR1， dudulin2，FLJ20584，FLJ40787，HEK2，KIAA0634，KIAA0659，KIAA1246，KIAA1455，LTBP2，LTK，MAL2，MRP2，柄蛋白-样2，NKCC1，PTK7，RAIG1，TCAM1，SC6，BCMP101，BCMP84，BCMP11，DTD，癌胚抗原（CEA），人乳脂球蛋白（HMFG1和2），I类MHC和II类MHC抗原，和VEGF，以及适当时，它们的受体。
可溶性抗原包括白介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素γ，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生长因子例如PDGF-α和PDGF-β，以及适当时，它们的受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒例如流感、EBV、HepA、B和C，生物恐怖主义试剂，放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
可以由所述单结构域抗体所结合的其他抗原包括血清载体蛋白、使得能够进行细胞介导的效应子功能募集的多肽以及核素螯合剂蛋白质。
因此，在一个实例中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含具有对于第二种蛋白质的特异性的单结构域抗体，后者提供了募集效应子功能（例如补体途径激活和/或效应细胞募集）的能力。此外，由于与核素螯合剂蛋白质相结合的单结构域抗体，本发明的融合蛋白可以用于螯合放射性核素。此类融合蛋白可在成像或放射性核素靶向方法（以进行治疗）中使用。
因此，在一个实例中，提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于募集多肽的特异性的dAb相融合，所述dAb通过与所述募集多肽相结合而提供了直接地或间接地募集细胞介导的效应子功能的能力。
效应子功能的募集可以是直接的，因为效应子功能与细胞相关联， 所述细胞在其表面上携带有募集分子。当dAb与募集分子的结合引起例如下述因子的释放时，可以发生间接募集：所述因子可以直接地或间接地募集效应子功能，或者可以经由信号传导途径的激活。例子包括TNFα、IL2、IL6、IL8、IL17、IFNγ、组胺、C1q、调理素以及经典和旁路补体激活级联的其他成员，例如C2、C4、C3-转变酶和C5至C9。
如本文所使用的，“募集多肽”包括FcγR例如FcγRI、FcγRII和FcγRIII，补体途径蛋白例如但不限于C1q和C3，CD标志蛋白（分化群（Cluster of Differentiation）标志物）例如但不限于CD68、CD115、CD16、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、CD45、CD19、CD20和CD22。为CD标志蛋白的进一步的募集多肽包括CD1、CD1d、CD2、CD5、CD8、CD9、CD10、CD11、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD43、CD44、CD45、CD46、CD49、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62、D62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD66e、CD68、CD70、CD71、CD72、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD88、CD89、CD90、CD94、CD95、CD98、CD106、CD114、CD116、CD117、CD118、CD120、CD122、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD137、CD138、CD141、CD142、CD143、CD146、CD147、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD162、CD164、CD169、CD184、CD206、CD209、CD257、CD278、CD281、CD282、CD283和CD304，或它们中的任何的片段，所述片段保留了直接地或间接地募集细胞介导的效应子功能的能力。募集多肽还包括具有效应子功能的免疫球蛋白分子，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。
在一个实施方案中，dAb对于其具有特异性的第二种蛋白质是补体途径蛋白，其中C1q是特别优选的。
在优选的实施方案中，dAb对于其具有特异性的第二种蛋白质是 CD标志蛋白，其中CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16和CD35是特别优选的。
因此，还提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体片段，所述片段与至少一个dAb相融合，所述dAb具有对于选自下列的CD分子的特异性：CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16和CD35。
在一个实施方案中，所述单结构域抗体为具有第一特异性的免疫球蛋白部分提供了延长的半衰期。
因此，在一个实施方案中，提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性的单结构域抗体相融合，所述单结构域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1相结合而为具有对于所述目的抗原的特异性的所述抗体片段提供了延长的半衰期。
在一个实施方案中，提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性的单结构域抗体相融合，所述单结构域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1相结合而为具有对于所述目的抗原的特异性的所述抗体片段提供了延长的半衰期。
如本文所使用的，“血清载体蛋白”包括甲状腺素结合蛋白、运甲状腺素蛋白、α1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白，或它们中的任何的片段。
如本文所使用的，“循环免疫球蛋白分子”包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、sIgA、IgM和IgD、或它们中的任何的片段。
CD35/CR1是存在于红细胞上的蛋白质，其具有36天的半衰期（正常范围为28至47天；Lanaro等人,1971,Cancer,28(3):658-661）。
在优选的实施方案中，dAb对于其具有特异性的第二种蛋白质是血清载体蛋白，其中人血清载体蛋白是特别优选的。在最优选的实施 方案中，所述血清载体蛋白是人血清白蛋白。
因此，提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于人血清白蛋白的特异性的单结构域抗体相融合。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与至少一个具有对于人血清白蛋白的特异性的单结构域抗体相融合。
在一个实施方案中，具有对于目的抗原的特异性的所述抗体片段是Fab片段。在另一个实施方案中，具有对于目的抗原的特异性的所述抗体片段是Fab’片段。
因此，在一个最优选的实施方案中，本发明的抗体融合蛋白是翻译融合蛋白，即基因融合物，其各自的序列由表达载体编码。备选地，所述抗体融合蛋白组分通过使用化学手段，即通过化学缀合或化学交联进行融合。此类化学手段是本领域已知的。
在一个实例中，所述抗体片段是Fab’片段，其具有天然的或经修饰的铰链区。当用于在制备本发明的双特异性抗体融合蛋白中使用的抗体片段是Fab’片段时，所述片段一般在重链的C-末端处延长一个或多个氨基酸。因此，本发明的抗体融合物可以包含直接地或经由接头与dAb相翻译融合（或化学融合）的Fab’片段。此外，合适的抗体Fab’片段的例子包括在WO2005003170和WO2005003171中描述的那些。
在另一个实例中，所述抗体片段是Fab片段。因此，本发明的抗体融合物可以包含与接头序列相翻译融合（或化学融合）的Fab片段，而所述接头序列与dAb相翻译融合（或化学融合）。优选地，所述Fab片段是在链间半胱氨酸处终止的Fab片段，如WO2005/003169中所描述的。
在本发明中有用的抗体Fab或Fab’片段可以来自任何物种，但优选地源自单克隆抗体、人抗体，或者是人源化的片段。用于在本发明中使用的抗体片段可以源自免疫球蛋白分子的任何类别（例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA）或亚类，并且可以获自任何物种，包括例如小 鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人。
在一个实施方案中，所述抗体Fab或Fab’片段是单克隆的、完全人的、人源化的或嵌合的抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体Fab或Fab’片段是完全人的或人源化的。
单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法来制备，例如杂交瘤技术（Kohler&Milstein,Nature,1975,256,495-497）、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术（Kozbor等人,Immunology Today,1983,4,72）和EBV-杂交瘤技术（Cole等人,“MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy”,第77-96页,Alan R.Liss,Inc.,1985）。
用于在本发明中使用的抗体还可以使用单淋巴细胞抗体方法来产生，所述单淋巴细胞抗体方法通过克隆且表达从被选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞中产生的免疫球蛋白可变区cDNAs，其中通过例如由Babcook,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93(15),7843-7848；WO92/02551；WO2004/051268；和WO2004/106377所描述的方法来进行。
人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补性决定区（CDRs）和来自人免疫球蛋白分子的构架区（参见例如US5,585,089）。
用于在本发明中使用的抗体还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生，并且包括由下列文献所公开的那些：Brinkman等人,J.Immunol.Methods,1995,182,41-50；Ames等人,J.Immunol.Methods,1995,184,177-186；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.,1994,24,952-958；Persic等人,Gene,1997187,9-18；和Burton等人,Advances in Immunology,1994,57,191-280；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；和WO95/20401；和US5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；和5,969,108。此外，转基因小鼠或其他生物（包括其他 哺乳动物）可以用于产生人源化抗体。
完全人的抗体是这样的那些抗体，在所述抗体中重链和轻链的可变区和恒定区（当存在时）都是人起源的，或者基本上等同于人起源的序列，不必来自相同的抗体。完全人的抗体的例子可以包括例如通过上文所描述的噬菌体展示方法而产生的抗体，和由其中鼠类免疫球蛋白可变区和恒定区基因已被其人对应物替代的小鼠所产生的抗体，例如如在EP0546073B1、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP0438474B1和EP0463151B1中所概括性地描述的。
用于在本发明中使用的抗体Fab或Fab’片段起始材料可以获自任何完整的抗体，尤其是完整的单克隆抗体，其中使用任何合适的酶促切割和/或消化技术，例如通过用胃蛋白酶进行处理。备选地或者另外地，抗体起始材料可以通过使用重组DNA技术来制备，其中牵涉编码抗体可变区和/或恒定区的DNA的操作和再表达。标准分子生物学技术可以用于修饰、添加或删除氨基酸或结构域，如所希望的。对于可变区或恒定区的任何改变仍然包括在本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”的范围内。
所述抗体片段起始材料可以获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人。所述抗体片段的部分可以获自超过一个物种，例如所述抗体片段可以是嵌合的。在一个实例中，恒定区来自一个物种，而可变区来自另一个物种。所述抗体片段起始材料也可以是经修饰的。在另一个实例中，所述抗体片段的可变区通过使用重组DNA改造技术来形成。此类经改造的变化形式包括例如通过对于天然抗体的氨基酸序列进行插入、缺失或改变而从天然抗体可变区形成的那些。这种类型的具体例子包括这样的那些经改造的可变区结构域，其包含来自一种抗体的至少一个CDR和任选地一个或多个构架氨基酸，以及来自第二种抗体的该可变区结构域的其余部分。用于形成和制备这些抗体片段的方法是本领域众所周知的（参见例如，Boss等人，US4,816,397；Cabilly等人，US6,331,415；Shrader等人, WO92/02551；Ward等人,1989,Nature,341,544；Orlandi等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3833；Riechmann等人,1988,Nature,322,323；Bird等人,1988,Science,242,423；Queen等人,US5,585,089；Adair，WO91/09967；Mountain和Adair,1992,Biotechnol.Genet.Eng.Rev,10,1-142；Verma等人,1998,Journal ofImmunological Methods,216,165-181）。
在本发明中，与Fab或Fab’片段相融合的每个单结构域抗体可以直接地或经由接头进行连接。
用于使dAb与Fab或Fab’相连接的合适的接头区的例子包括但不限于，柔性接头序列和刚性接头序列。柔性接头序列包括在下列文献中所描述的那些：Huston等人,1988,PNAS85:5879-5883；Wright&Deonarain,Mol.Immunol.,2007,44(11):2860-2869；Alfthan等人,Prot.Eng.,1995,8(7):725-731；Luo等人,J.Biochem.,1995,118(4):825-831；Tang等人,1996,J.Biol.Chem.271(26):15682-15686；和Turner等人,1997,JIMM205,42-54（关于代表性的例子参见表1）。
表1.柔性接头序列
SEQ ID NO: 序列
1 SGGGGSE
2 DKTHTS
3 GGGGS
45 GGGGSGGGGS
46 GGGGSGGGGSGGGGS
47 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
48 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
4 AAAGSG-GASAS
5 AAAGSG-XGGGS-GASAS
49 AAAGSG-XGGGSXGGGS-GASAS
50 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
51 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
6 AAAGSG-XS-GASAS
7 PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY
8 ATTTGSSPGPT
9 ATTTGS
- GS
10 EPSGPISTINSPPSKESHKSP
11 GTVAAPSVFIFPPSD
12 GGGGIAPSMVGGGGS
13 GGGGKVEGAGGGGGS
14 GGGGSMKSHDGGGGS
15 GGGGNLITIVGGGGS
16 GGGGVVPSLPGGGGS
17 GGEKSIPGGGGS
18 RPLSYRPPFPFGFPSVRP
19 YPRSIYIRRRHPSPSLTT
20 TPSHLSHILPSFGLPTFN
21 RPVSPFTFPRLSNSWLPA
22 SPAAHFPRSIPRPGPIRT
23 APGPSAPSHRSLPSRAFG
24 PRNSIHFLHPLLVAPLGA
25 MPSLSGVLQVRYLSPPDL
26 SPQYPSPLTLTLPPHPSL
27 NPSLNPPSYLHRAPSRIS
28 LPWRTSLLPSLPLRRRP
29 PPLFAKGPVGLLSRSFPP
30 VPPAPVVSLRSAHARPPY
31 LRPTPPRVRSYTCCPTP-
32 PNVAHVLPLLTVPWDNLR
33 CNPLLPLCARSPAVRTFP
刚性接头的例子包括肽序列GAPAPAAPAPA（SEQ ID NO:34）、PPPP（SEQ ID NO:35）和PPP。
在一个实施方案中，将抗体铰链序列或其部分用作接头，例如上部铰链序列。通常，用于在本发明中使用的抗体Fab’片段具有天然的或经修饰的铰链区。将此类铰链区用作关于所述dAb部分的天然接头。所述天然铰链区是通常与抗体分子的CH1结构域相关联的铰链区。经修饰的铰链区是在长度和/或组成方面与天然铰链区不同的任何铰链。此类铰链可以包括来自任何其他物种的铰链区，例如人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊铰链区。其他经修饰的铰链区可以包括源自具有与所述CH1结构域不同的类别或亚类的抗体的完整的铰链区。因此，例如，γ1类别的CH1结构域可以附着至γ4类别的铰链区。备选地，经修饰的铰链区可以包括天然铰链的部分或重复单元（其中在所述重复中的每个单元源自天然铰链区）。在进一步的备选方案中，通过将一个或多个半胱氨酸或其他残基转变成中性残基例如丙氨酸，或者通过将处于合适位置的残基转变成半胱氨酸残基，可以改变天然铰链区。通过此类手段，可以增加或减少铰链区中的半胱氨酸残基的数目。此外，可以控制铰链的其他特征，例如铰链半胱氨酸与轻链链间半胱氨酸的距离、铰链半胱氨酸之间的距离、以及铰链中可能影响铰链的特性（例如柔韧性）的其他氨基酸的组成，例如可以将甘氨酸掺入到铰链中以增加旋转柔韧性，或者可以掺入脯氨酸以减少柔韧性。备选地，可以将带电荷的或疏水性的残基的组合掺入到铰链中以赋予多聚化（multimerisation）特性，关于带电荷的或离子性的尾（例如酸性尾）作为接头的使用，参见例如Richter等人,2001,Prot.Eng.14(10):775-783；和关于亮氨酸拉链序列，参见例如Kostelny等人,1992,J.Immunol.5(1):1547-1553。其他经修饰的铰链区可以是完全合成的，并且可以被设计为具有所希望的特性例如长度、组成和柔韧性。
许多经修饰的铰链区已例如描述在US5,677,425、US6642356、WO9915549、WO2005003170、WO2005003169、WO2005003170、WO9825971 和WO2005003171中，并且这些专利文献通过提及而合并入本文。此类铰链一般紧跟在所述CH1区之后，但也可以掺入至轻链κ或λ片段的恒定区的末端处；关于例子参见表2。
表2.铰链接头序列
SEQ ID NO: 序列
36 DKTHTCAA
37 DKTHTCPPCPA
38 DKTHTCPPCPATCPPCPA
39 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
40 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
41 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
42 DKTHTCCVECPPCPA
43 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
44 DKTHTCPSCPA
用于在本发明中使用的单可变结构域（也称为单结构域抗体或dAbs）可以使用本领域已知的方法来产生，并且包括在WO2005118642；Ward等人,1989,Nature,341,544-546；和Holt等人,2003,Trends in Biotechnology,21,484-490中所公开的那些。在一个实施方案中，用于在本发明中使用的单结构域抗体是重链可变结构域（VH）或轻链结构域（VL）。每个轻链结构域可以是κ或λ亚组的。用于分离VH和VL结构域的方法已在本领域中进行了描述，参见例如EP0368684和Ward等人（同上）。此类结构域可以源自任何合适的物种或抗体起始材料。在一个实施方案中，所述单结构域抗体可以源自啮齿动物、人或其他物种。在一个实施方案中，所述单结构域抗体是人源化的。
在一个实施方案中，所述单结构域抗体源自噬菌体展示文库，其中使用在例如WO2005/118642；Jespers等人,2004,Nature Biotechnology,22,1161-1165；和Holt等人,2003,Trends in Biotechnology,21,484-490中所描述的方法。优选地，此类单结构 域抗体是完全人的，但也可以源自其他物种。将会意识到，所述单结构域抗体的序列在分离后可以进行修饰，以改善单结构域抗体的特征例如可溶性，如Holt等人（同上）中所描述的。
在一个实施方案中，所述dAb是获自scFv噬菌体展示或者获自转基因的HumouseTM或VelocimouseTM或者人源化的啮齿动物的人序列。
在一个实施方案中，所述dAb获自人或人源化的啮齿动物、骆驼科动物或鲨鱼。此类dAb将优选地是人源化的。在一个实例中，所述单结构域抗体是基于骆驼科动物免疫球蛋白的VHH结构域，如EP0656946中所描述的。在一个实例中，用目的抗原对骆驼或美洲驼进行免疫接种，并且在滴度合适时收集血液。可以通过单细胞PCR来克隆编码所述dAb的基因，或者可以通过EBV转化或通过与无限增殖细胞系相融合来使编码所述dAb的B细胞永生化。
如本文上面所描述的，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段直接地或经由接头与至少一个具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体相融合。
因此，在一个实施方案中，所述抗体片段例如Fab或Fab’片段直接地或经由接头在重链或轻链可变区的N-末端处与dAb相融合。备选地，所述抗体Fab或Fab’片段直接地或经由接头在重链或轻链的C-末端处与dAb相融合。在另一个实施方案中，所述抗体Fab或Fab’片段的重链和轻链各自直接地或经由接头在C-末端处与dAb相融合。所述连接可以是化学缀合，但最优选地是翻译融合，即其中各自的序列顺次由表达载体进行编码的基因融合。
通常，所述单结构域抗体的N-末端将直接地或经由接头与所述Fab或Fab’片段的重链或轻链的C-末端相融合，并且当所述单结构域抗体与所述Fab或Fab’的N-末端相融合时，它将经其C-末端（任选地经由接头）进行融合。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，或者由具有对 于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段组成，所述片段在重链或轻链的N-末端处与具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体相融合。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，或者由具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段组成，所述片段在重链或轻链的C-末端处与具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体相融合。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，或者由具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段组成，所述片段在重链或轻链的C-末端处与至少一个具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体相融合。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，或者由具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段组成，所述片段与两个单结构域抗体相融合，其中每个单结构域抗体以线性顺序彼此融合（任选地经由接头），并且所得到的单结构域抗体融合物与所述Fab或Fab’片段的轻链或重链的C-末端相融合。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，或者由具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段组成，所述片段与两个单结构域抗体相融合，其中一个单结构域抗体与所述Fab或Fab’片段的轻链的C-末端相融合，而另一个单结构域抗体与所述Fab或Fab’片段的重链的C-末端相融合，所述单结构域抗体具有对于第二目的抗原的特异性。
在一个实施方案中，当所述Fab或Fab’片段的重链和轻链各自在C-末端处包含单结构域抗体时，这两个单结构域抗体是等同的，即具有相同的对于相同抗原的结合特异性。在一个实例中，它们结合在相 同抗原上的相同表位。例如，所述单结构域抗体可以均为相同的VH dAb、相同的VHH dAb或相同的VL dAb。
优选地，当所述Fab或Fab’片段的重链和轻链各自在C-末端处包含单结构域抗体时，这两个单结构域抗体是协作地结合抗原的互补VH/VL对，即它们是具有相同的结合特异性的互补VH/VL对。通常，它们将是源自相同抗体的VH/VL对。
在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含为互补VH/VL对的两个单结构域抗体时，VH单结构域抗体与重链恒定区（CH1）的C-末端相融合，并且VL单结构域抗体与轻链恒定区（Cκ或Cλ）的C-末端相融合。
在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含为互补VH/VL对的两个单结构域抗体时，VL单结构域抗体与重链恒定区（CH1）的C-末端相融合，并且VH单结构域抗体与轻链恒定区（Cκ或Cλ）的C-末端相融合。
在本发明的双特异性融合蛋白中，所述单结构域抗体与第二种抗原相结合，所述第二种抗原与由所述Fab或Fab’片段组分所结合的那种抗原不同。
在一个实例中，用于在本发明中使用的dAbs展示出对于补体途径蛋白、CD标志蛋白或FcγR的特异性。在这种情况下，所述dAb优选地对于CD分子是特异的。最优选地，所述dAb展示出对于选自下列的CD分子的特异性：CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16和CD35。
在优选的实例中，用于在本发明中使用的dAbs展示出对于血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性，所述血清载体蛋白优选地是人血清载体蛋白例如甲状腺素结合蛋白、运甲状腺素蛋白、α1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原或血清白蛋白。最优选地，所述dAb展示出对于人血清白蛋白的特异性。因此，在一个实例中，用血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1（例如人血清白蛋白）对兔、小鼠、大鼠、骆驼或美洲驼进行免疫接种，并且在滴度合 适时收集血液。可以通过单细胞PCR来克隆编码所述dAb的基因，或者可以通过EBV转化或通过与无限增殖细胞系相融合来使编码所述dAb的B细胞永生化。备选地，所述单结构域抗体可以通过如本文上面所描述的噬菌体展示来获得。
在一个实施方案中，所述单结构域抗体结合人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述单结构域抗体结合人血清白蛋白、鼠类血清白蛋白和大鼠血清白蛋白。
在一个实施方案中，所述结合血清白蛋白的单结构域抗体是在WO2005/118642中提供的dAb（参见例如图1c和1d），或在WO2004/041862中提供的VHH，或在WO2006/122787的例如表III中描述的人源化的纳米抗体（nanobody）。
在一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是重链VH单结构域抗体，其包含下列CDR中的至少一个：具有在图5（e）SEQ ID NO:56或图5（k）SEQ ID NO:62中给出的关于CDR-H1的序列的CDR，具有在图5（f）SEQ ID NO:57或图5（l）SEQID NO:63中给出的关于CDR-H2的序列的CDR，和具有在图5（g）SEQ ID NO:58或图5（m）SEQID NO:64中给出的关于CDR-H3的序列的CDR。
在另一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是重链VH抗体，其中VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少两个选自下列：在SEQ IDNO:56或SEQ ID NO:62中给出的关于CDR-H1的序列，在SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:63中给出的关于CDR-H2的序列，和在SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64中给出的关于CDR-H3的序列。例如，所述单结构域抗体可以包含VH结构域，其中CDR-H1具有在SEQ ID NO:56中给出的序列，并且CDR-H2具有在SEQ ID NO:57中给出的序列。备选地，所述单结构域抗体可以包含VH结构域，其中CDR-H1具有在SEQ ID NO:56中给出的序列，并且CDR-H3具有在SEQ ID NO:58中给出的序列。为了避免疑问，应当理解包括了所有排列。
在另一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是重链VH单结构域抗体，其中所述VH结构域包含有在SEQ ID NO:56中给出的关于CDR-H1的序列，在SEQ ID NO:57中给出的关于CDR-H2的序列，和在SEQ ID NO:58中给出的关于CDR-H3的序列。
在另一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是重链VH单结构域抗体，其中所述VH结构域包含有在SEQ ID NO:62中给出的关于CDR-H1的序列，在SEQ ID NO:63中给出的关于CDR-H2的序列，和在SEQ ID NO:64中给出的关于CDR-H3的序列。
在一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是人源化的重链VH单结构域抗体，dAbH1，其具有在图5（a）（SEQ ID NO:52）中给出的序列。合适的CH1-dAbH1融合物（包含G4S接头）的例子在图6（SEQ ID NO:68）中给出。
在一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是人源化的重链VH单结构域抗体，dAbH2，其具有在图5（c）（SEQ ID NO:54）中给出的序列。合适的CH1-dAbH2融合物（包含G4S接头）的例子在图6（SEQ ID NO:69）中给出。
根据由Kabat等人设计出的系统，对抗体可变结构域中的残基常规地进行编号。这种系统在Kabat等人,1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Health and Human Services,NIH,USA（下文中称为“Kabat等人（同上）”）中进行了阐述。除非另有说明，在本说明书中使用这种编号系统。
Kabat残基名称并不总是与氨基酸残基的线性编号直接地相对应。实际的线性氨基酸序列可能包含比在严格Kabat编号中更少或额外的氨基酸，这相应于结构组分的缩短或向结构组分中的插入，无论是基本可变结构域结构的构架还是互补性决定区（CDR）。通过使抗体序列中的同源性残基与“标准”Kabat编号序列进行比对，关于给定的抗体可以确定残基的正确的Kabat编号。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDRs位于残基31-35（CDR-H1）、残基50-65（CDR-H2）和残基95-102（CDR-H3）处。然而，根据Chothia（Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987)），等价于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，如本文所使用的，“CDR-H1”包括残基26至35，如由Kabat编号系统和Chothia的拓扑环（topological loop）定义的组合所描述的。
根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDRs位于残基24-34（CDR-L1）、残基50-56（CDR-L2）和残基89-97（CDR-L3）处。
在一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是轻链VL单结构域抗体，其包含下列CDR中的至少一个：具有在图5（h）SEQ ID NO:59或图5（n）SEQ ID NO:65中给出的关于CDR-L1的序列的CDR，具有在图5（i）SEQ ID NO:60或图5（o）SEQID NO:66中给出的关于CDR-L2的序列的CDR，和具有在图5（j）SEQ ID NO:61或图5（p）SEQID NO:67中给出的关于CDR-L3的序列的CDR。
在另一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是轻链VL抗体，其中VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的至少两个选自下列：在SEQ IDNO:59或SEQ ID NO:65中给出的关于CDR-L1的序列，在SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:66中给出的关于CDR-L2的序列，和在SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:67中给出的关于CDR-L3的序列。例如，所述结构域抗体可以包含VL结构域，其中CDR-L1具有在SEQ ID NO:59中给出的序列，并且CDR-L2具有在SEQ ID NO:60中给出的序列。备选地，所述结构域抗体可以包含VL结构域，其中CDR-L1具有在SEQ ID NO:59中给出的序列，并且CDR-L3具有在SEQ ID NO:61中给出的序列。为了避免疑问，应当理解包括了所有排列。
在另一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是轻链VL结构域抗体，其中所述VL结构域包含有在 SEQ ID NO:59中给出的关于CDR-L1的序列，在SEQ ID NO:60中给出的关于CDR-L2的序列，和在SEQ ID NO:61中给出的关于CDR-L3的序列。
在另一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是轻链VL结构域抗体，其中所述VL结构域包含有在SEQ ID NO:65中给出的关于CDR-L1的序列，在SEQ ID NO:66中给出的关于CDR-L2的序列，和在SEQ ID NO:67中给出的关于CDR-L3的序列。
在一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是人源化的轻链VL单结构域抗体，dAbL1，其具有在图5（b）（SEQ ID NO:53）中给出的序列。合适的CH1-dAbL1融合物和Ck1-dAbL1融合物（均包含G4S接头）的例子在图6（SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:72）中给出。
在一个实施方案中，用于在本发明中使用的结合人血清白蛋白的单结构域抗体是人源化的轻链VL单结构域抗体，dAbL2，其具有在图5（d）（SEQ ID NO:55）中给出的序列。合适的CH1-dAbL2融合物和Ck1-dAbL2融合物（均包含G4S接头）的例子在图6（SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73）中给出。
在一个实施方案中，当所述Fab或Fab’片段的重链和轻链各自在C-末端处包含单结构域抗体，并且这两个单结构域抗体是协作地结合抗原的互补VH/VL对（如本文上面所描述的）时，VH dAb是dAbH1（SEQ ID NO:52），并且VL dAb是dAbL1（SEQ ID NO:53）。
在一个实施方案中，当所述Fab或Fab’片段的重链和轻链各自在C-末端处包含单结构域抗体，并且这两个单结构域抗体是协作地结合抗原的互补VH/VL对（如本文上面所描述的）时，VH dAb是dAbH2（SEQ ID NO:54），并且VL dAb是dAbL2（SEQ ID NO:55）。
在另一个方面，本发明提供了白蛋白结合抗体或其片段，其包含有在本文上面和图5（e-p）中所提供的CDRs中的一个或多个。所述CDRs可以掺入到任何合适的抗体构架和任何合适的抗体形式之中。此 类抗体包括完整抗体以及其在功能上有活性的片段或衍生物，其可以是但不限于单克隆的、人源化的、完全人的或嵌合的抗体。因此，此类白蛋白结合抗体可以包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于Fab，经修饰的Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，单结构域抗体，scFv，二、三或四价抗体，Bis-scFv，双抗体，三抗体，四抗体和上述中的任何的表位结合片段（参见例如，Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online2(3),209-217）。用于形成和制备这些抗体片段的方法是本领域众所周知的（参见例如，Verma等人,1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181）。多价抗体可以包含多重特异性或者可以是单特异性的（参见例如WO92/22853和WO05/113605）。将会意识到，本发明的这个方面还延伸至这些白蛋白结合抗体的变体。
将会意识到，此类白蛋白结合抗体，特别是单结构域抗体，可以与任何其他抗体或蛋白质或其他分子相缀合，如在任何其他合适的情形下所希望或使用的。在一个实例中，在上文所描述的且在图5（a-d）中所显示的单结构域抗体dAbH1、dAbL1、dAbH2、dAbL2可以掺入到任何合适的抗体形式中，或者在任何合适的情形（例如融合物或缀合物）下用作单结构域抗体。
在一个实施方案中，本发明的这个方面的抗体包含有在图5（e）中给出的关于CDR-H1的序列，在图5（f）中给出的关于CDR-H2的序列，和在图5（g）中给出的关于CDR-H3的序列。
在一个实施方案中，本发明的这个方面的抗体包含有在图5（k）中给出的关于CDR-H1的序列，在图5（l）中给出的关于CDR-H2的序列，和在图5（m）中给出的关于CDR-H3的序列。
在一个实施方案中，本发明的这个方面的抗体包含有在图5（h）中给出的关于CDR-L1的序列，在图5（i）中给出的关于CDR-L2的序列，和在图5（j）中给出的关于CDR-L3的序列。
在一个实施方案中，本发明的这个方面的抗体包含有在图5（n） 中给出的关于CDR-L1的序列，在图5（o）中给出的关于CDR-L2的序列，和在图5（p）中给出的关于CDR-L3的序列。
当本发明的双特异性融合蛋白的单结构域抗体与白蛋白相结合时，所述单结构域抗体对于白蛋白的结合亲和力将足以延长所述Fab或Fab’在体内的半衰期。已报道了，小于或等于2.5μM亲和力的对于白蛋白的亲和力将会延长体内半衰期（Nguyen,A.等人(2006)Protein Engineering,Design&Selection,19(7),291-297）。本发明的单结构域抗体分子优选地具有适合于其目的和它们所与之结合的抗原的结合亲和力。在一个实例中，所述单结构域抗体具有高的结合亲和力，例如pM。在一个实例中，所述单结构域抗体具有为nM或μM的对于抗原的结合亲和力。亲和力可以使用本领域已知的任何合适方法来测量，包括如在本文实施例中所描述的BIAcore，其中使用天然或重组抗原。
优选地，结合白蛋白的本发明的单结构域抗体分子具有大约2μM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体分子具有大约1μM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体分子具有大约500nM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体分子具有大约200nM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的结构域抗体分子具有大约1nM或更好的结合亲和力。将会意识到，使用本领域已知的任何合适方法可以改变由本发明所提供的和本领域中已知的单结构域抗体的亲和力。因此，本发明还涉及本发明的结构域抗体分子的变体，其具有改善的对于白蛋白的亲和力。此类变体可以通过许多亲和力成熟方案来获得，包括使CDRs突变（Yang等人,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995）、链改组（Marks等人,Bio/Technology,10,779-783,1992）、大肠杆菌（E.coli）增变株的使用（Low等人,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996）、DNA改组（Patten等人,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997）、噬菌体展示（Thompson等人,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996）和有性PCR（Crameri等人,Nature,391,288-291,1998）。Vaughan等人（同上）讨论了这些亲和力成熟方法。
本发明还提供了编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的分离的DNA序列。本发明的DNA序列可以包括合成DNA（例如通过化学加工而产生的）、cDNA、基因组DNA或其任何组合。
编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列可以通过本领域技术人员众所周知的方法来获得。例如，如所希望的，可以从确定的DNA序列或者基于相应的氨基酸序列来合成编码所述抗体片段、接头和/或dAbs的部分或全部的DNA序列。
可以使用分子生物学的标准技术来制备编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。可以使用寡核苷酸合成技术来完全或部分地合成所需的DNA序列。在合适时，可以使用位点定向诱变和聚合酶链反应（PCR）技术。
本发明进一步涉及包含一个或多个本发明的DNA序列的克隆或表达载体。因此，提供了包含一个或多个DNA序列的克隆或表达载体，所述DNA序列编码本发明的双特异性抗体融合蛋白。在一个优选的实施方案中，所述克隆或表达载体包含编码整个双特异性抗体融合蛋白的单个DNA序列。因此，所述克隆或表达载体顺次包含DNA编码的转录单元，从而使得产生出翻译融合蛋白。
事实上，本领域技术人员将会理解，本发明的融合蛋白可以在N-末端或C-末端处具有所述dAb，并因此dAb DNA编码的转录单元将会在编码翻译融合物的DNA序列内分别处于开始或最后。因此，翻译融合物可以包含N-末端dAb和C-末端Fab或Fab’。此外，翻译融合物可以包含N-末端Fab或Fab’和C-末端dAb。
将会意识到，所述Fab或Fab’的重链和轻链可以掺入到相同或不同的载体中。在一个实施方案中，一种载体可以包括包含Fab或Fab’重链和C-末端dAb的翻译融合物，而另一种载体可以包括包含Fab或Fab’轻链和C-末端dAb的翻译融合物。
例如，当希望产生在抗体片段的N-末端处具有dAb部分的双特异性抗体融合蛋白时，载体将以顺次顺序包含下列DNA转录单元：编码 dAb部分的DNA转录单元；任选地，编码接头序列的DNA转录单元；和编码抗体片段的DNA转录单元。当希望产生在抗体片段的C-末端处具有dAb部分的双特异性抗体融合蛋白时，载体将以顺次顺序包含下列DNA转录单元：编码抗体片段的DNA转录单元；任选地，编码接头序列的DNA转录单元；和编码dAb部分的DNA转录单元，所述dAb部分具有对于血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1（例如人血清白蛋白）的特异性。因此，本发明的翻译融合物可以以不同的构造，包括例如但不限于，dAb-接头-Fab、Fab-接头-dAb、dAb-Fab、Fab-dAb、Fab’-dAb、dAb-Fab’、dAb-接头-Fab’、Fab’-接头-dAb。当例如使用两种载体时，第一种可以包含与dAb相融合的Fab或Fab’的重链，而第二种可以包含与dAb相融合的Fab或Fab’的轻链。
关于包含在本发明的翻译融合物中的抗体片段的DNA密码可以作为转录单元掺入到载体中，其中以本领域技术人员已知的构造，例如转录单元可以包含关于轻链的密码，随后为重链密码，或者反之亦然；参见，特别是Humphreys等人,2002,Protein Expressionand Purification,26:309-320。
优选地，根据本发明的载体包含合适的前导序列，例如抗体前导序列。此类前导序列是本领域众所周知的。
通过其可以构建出载体的一般方法、转染和转化方法以及培养方法是本领域技术人员众所周知的。在这方面，可参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York，和由Cold Spring HarborPublishing出品的Maniatis Manual。
还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述克隆或表达载体包含一个或多个编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可以用于表达编码所述双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。可以使用细菌例如大肠杆菌和其他微生物系统，或者还可以使用真核生物例如哺乳动物宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括NS0、CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。因此， 在一个实施方案中，在大肠杆菌中表达本发明的融合蛋白。在另一个实施方案中，在哺乳动物细胞中表达本发明的融合蛋白。
本发明还提供了用于产生双特异性抗体融合蛋白的方法，其包括在适合于从编码所述双特异性抗体融合蛋白的DNA序列中表达出蛋白质的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞。本发明进一步提供了用于分离所述双特异性抗体融合蛋白的方法。
在产生之后，当需要时，通过使用本领域已知的任何合适方法，可以纯化出本发明的双特异性抗体融合蛋白。可以使用例如但不限于色谱法技术，例如离子交换、大小排阻、G蛋白或疏水相互作用色谱法。
双特异性抗体融合蛋白的大小可以通过本领域已知的常规方法来证实，例如大小排阻色谱法和非还原性SDS-PAGE。此类技术可以用于证实，所述蛋白质未二聚化和/或不具有部分缺失（例如dAb部分）。如果检测出二聚体，那么可以通过使用如上所描述的常规色谱法技术来从二聚体种类中纯化出单体的双特异性抗体融合蛋白。
本发明的双特异性抗体融合蛋白在疾病或病症的治疗中有用，所述疾病或病症包括炎性疾病和病症、免疫疾病和病症、纤维变性病症和癌症。
术语“炎性疾病或病症”和“免疫疾病或病症”包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、斯蒂尔病、穆-韦病（Muckle Wells disease）、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、SLE（系统性红斑狼疮）、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、多发性硬化、脉管炎、I型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。
术语“纤维变性病症”包括特发性肺纤维化（IPF）、系统性硬化病（或硬皮病）、肾纤维化、糖尿病性肾病、IgA肾病、高血压、终末期肾脏病、腹膜纤维变性（不卧床持续腹膜透析）、肝硬化、年龄相关的黄斑变性（ARMD）、视网膜病变、心脏反应性纤维化（cardiacreactive fibrosis）、瘢痕形成、瘢痕瘤、烧伤、皮肤溃疡、血管成形术、冠状动脉搭桥手术、关节成形术和白内障手术。
术语“癌症”包括起于上皮的、在皮肤中或更通常地在身体器官（例如：乳腺、卵巢、前列腺、肺、肾、胰腺、胃、膀胱或肠）的衬里（lining）中发现的恶性新生长。癌症趋于浸润到相邻组织中并且扩散（转移）至远离的器官，例如：至骨、肝、肺或脑。
因此，根据本发明的进一步方面，提供了药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂相联合的本发明的抗体融合物。还提供了本发明的抗体融合蛋白在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。最优选地，所述疾病或病症是炎性疾病或病症。
根据本发明的药物组合物可以采取适合于口服、颊、肠胃外、皮下、鼻、局部、眼或直肠施用的形式，或者适合于通过吸入或吹入进行施用的形式。
当适当时，例如如果所述抗体融合蛋白的单结构域抗体与白蛋白相结合，那么可以值得做的是，通过使用本领域已知的任何合适方法，用人或重组血清白蛋白对所述双特异性融合蛋白进行预配制。
对于口服施用，所述药物组合物可以采取例如片剂、锭剂或胶囊的形式，其通过常规方法用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂（例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素）；填充剂（例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙）；润滑剂（例如硬脂酸镁、滑石或硅石）；崩解剂（例如马铃薯淀粉或乙醇酸钠）；或润湿剂（例如月桂基硫酸钠）来制备。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包衣。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形式，或者它们可以呈现为用于在使用前用水或其他合适的媒介物进行构建的干燥产物。此类液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂来进行制备，所述添加剂例如为悬浮剂、乳化剂、非水性媒介物或防腐剂。当适当时，所述制剂还可以包含缓冲盐类、矫味剂、着色剂或甜味剂。
用于口服施用的制剂可以适当地进行配制，以产生活性化合物的受控释放。
对于颊施用，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂 的形式。
本发明的双特异性抗体可以被配制成用于肠胃外施用，所述肠胃外施用通过注射，例如通过推注或输注来进行。用于注射的制剂可以呈现为单位剂型，例如在玻璃安瓿或多剂量容器例如玻璃小瓶中。用于注射的组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液的形式，并且可以包含配制试剂（formulatory agent），例如悬浮剂、稳定剂、防腐剂和/或分散剂。备选地，活性成分可以为用于在使用前用合适的媒介物例如无热原的无菌水进行构建的粉末形式。
除了上面所描述的制剂外，本发明的双特异性抗体也可以配制为贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入或者通过肌内注射来进行施用。
对于鼻施用或通过吸入施用，根据本发明的化合物可以方便地以用于加压包装或喷雾器的喷雾剂呈现形式进行递送，其中使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、一氟三氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体或气体混合物。
如果需要，所述组合物可以呈现在包装或分配装置中，所述包装或分配装置可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。所述包装或分配装置可以附有关于施用的说明书。
对于局部施用，根据本发明的化合物可以方便地配制在包含活性组分的合适的软膏中，所述活性组分悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中。具体的载体包括例如矿物油、液体石油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡和水。备选地，根据本发明的化合物可以配制在包含活性组分的合适的洗剂中，所述活性组分悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中。具体的载体包括例如矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇（cetearyl alcohol）、苯甲醇、2-辛基十二烷醇和水。
对于眼施用，根据本发明的化合物可以方便地配制为在等渗的、pH经调整的无菌盐水中的微离子化（microionized）的悬浮液，其中具有或不具有防腐剂例如杀细菌剂或杀真菌剂，例如硝酸苯汞、苯扎氯铵或醋酸氯己定。备选地，对于眼施用，化合物可以配制在软膏例如凡士林中。
对于直肠施用，根据本发明的化合物可以方便地配制为栓剂。这些可以通过将活性组分与合适的非刺激性赋形剂相混合来制备，所述非刺激性赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，并因而将会在直肠中融化从而释放出活性组分。此类材料包括例如可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
对于预防或治疗特定病状所需的本发明化合物的量将依赖于所选择的化合物和待治疗的患者的病状而改变。然而，一般而言，日剂量可以为大约10ng/kg至1000mg/kg，通常100ng/kg至100mg/kg，例如对于口服或颊施用为大约0.01mg/kg至40mg/kg体重，对于肠胃外施用为大约10ng/kg至50mg/kg体重，和对于鼻施用或者通过吸入或吹入施用为大约0.05mg至大约1000mg，例如大约0.5mg至大约1000mg。
本发明的每个实施方案的优选特征比照适用于其他实施方案中的每一个。在本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)通过提及而合并入本文，就如同每一单个出版物被明确和单独地指明通过提及而合并(好像完全阐述似的)一样。
现在，将就下列实施例而言来描述本发明，所述实施例仅是举例说明性的，而无论如何不应当解释为限制了本发明的范围。
附图列表：
图1：Fab-dAbs的图解表示，其中dAb在C-末端处。该图显示了经由接头与轻链或重链的恒定区的C-末端相连接的dAbL或dAbH，其中：轻链可变区或重链可变区；恒定区cκ和CH1 ；结构域抗体片段dAbL和dAbH。
图2：Fab-didAbs的图解表示。该图显示了，dAbL和dAbH与每条链的恒定区的C-末端相连接，从而LC-dAbL或LC-dAbH融合物与HC-dAbL或HC-dAbH相配对，其中：轻链可变区或重链可变区 ；恒定区cκ和CH1；结构域抗体片段，dAbL和dAbH 。
图3：FabA-dAbL3(CK-SG4SE)(1)和FabA-dAbL3(CK-G[APAPA]2)(2)的SDS PAGE分析。
图4：FabA-dAbL3(CK-SG4SE)(1)和FabA-dAbL3(CK-G[APAPA]2)(2)的Western印迹分析。
图4a：FabB-didAbs的SDS PAGE：
泳道M＝SeeBlue标准参照物
泳道1和2＝IgG对照
泳道3＝FabB
泳道4＝FabB-didAb，-dAbL1(CK-G4Sx2)&dAbH1(CH1-G4Sx2)
泳道5＝FabB-didAb，-dAbL2(CK-G4Sx2)&dAbH2(CH1-G4Sx2)。
图5：结构域抗体dAbH1、dAbH2、dAbL1和dAbL2以及源自这些抗体中每一个的CDRs的序列。
图6：FabB-dAb构建体，其包含与结构域抗体相融合的FabB重链或轻链可变结构域。
图：Fab’A重链和轻链序列以及FabA重链序列。
实验：
实施例1：对于人血清白蛋白特异的dAb的产生
使用重组DNA技术来产生由符合读框的DNA编码的转录单元，其编码具有对于人血清白蛋白的特异性的dAb。
当需要时，使用重组DNA技术可以产生由符合读框的DNA编码的转录单元，其编码具有对于募集蛋白的特异性的dAb。
实施例2：抗体片段的产生
为了dAb与轻链C-末端的融合，合成了编码人κ轻链恒定区(具有κ恒定区的Km3同种异型)、肽接头和dAb的DNA，并将其作为SacI-PvuII限制片段克隆到UCB-Celltech内部的(in-house)表达载体pTTOD(Fab)(pTTO-1的衍生物，其描述在Popplewell等人,MethodsMol.Biol.2005；308:17-30中)中，所述表达载体包含编码人γ-1CH1恒定区的DNA。这产生了由下列组成的双顺反子基因 排列：经由接头与dAb相融合的人源化轻链的基因，随后为人源化重链Fab片段的基因，两者都在tac启动子的控制下。还编码了在Gly4Ser接头上游的独特的BspE1位点，或在富含Ala-Pro的接头上游的AscI位点。
为了dAb与重链C-末端的融合，合成了编码人CH1片段（具有γ1同种型）以及随后的接头编码序列和dAb的DNA。将这作为ApaI-EcoRI限制片段亚克隆到UCB-Celltech内部的表达载体pTTOD(Fab)（pTTO-1的衍生物，其描述在Popplewell等人（上文）中）中，所述表达载体包含编码人γ-1CH1恒定区的DNA。这产生由下列组成的双顺反子基因排列：人源化轻链的基因，非编码性基因间序列，随后为经由接头与dAb相融合的重链的基因，这两个基因都在tac启动子的控制下。将该重组表达质粒转化到大肠杆菌菌株W3110中，在其中通过添加IPTG来诱导表达。最初通过在大约0.5的OD（600nm）时添加200uMIPTG来以小规模进行表达实验（5ml培养体积），在诱导后2小时收获细胞，并且在Tris/EDTA中于30℃提取过夜。将经澄清的提取物用于通过Biacore的亲和力分析。选择给出有前途的表达产率和活性的构建体用于发酵。
方法
在下列实施例中，将dAb所与之融合的抗体链命名为CK或LC（对于cκ轻链），和命名为CH1或HC（对于重链恒定结构域CH1）。
用于在大肠杆菌中表达的FabA-dAb融合物质粒的构建
通过使dAbL3或dAbH4与FabA的轻链或重链恒定区的C-末端相融合来构建Fab-dAb融合蛋白。使用柔性接头（SGGGGSE（SEQ ID NO:1））或刚性接头（G(APAPA)2（SEQ ID NO：34））来将dAb与cκ区（SEQ ID NO:75）相连接，而使用接头DKTHTS（SEQ ID NO:2）来将dAb与CHI区（SEQ ID NO:76）相连接。作为片段合成地制备编码恒定区-dAb融 合物的DNA序列，以使得能够亚克隆到内部的pTTOD载体的FabA序列中。
通过下列方式来构建轻链-dAb融合物：将合成的基因的SacI-ApaI片段亚克隆到能够表达FabA的质粒的相应位点中，所述合成的基因编码经由柔性接头（SGGGGSE（SEQ IDNO:1））或刚性接头（G(APAPA)2（SEQ ID NO：34））与dAbL3或dAbH4相融合的C-末端cκ。
通过下列方式来构建重链-dAb融合物：将合成的基因的ApaI-EcoRI片段亚克隆到能够表达FabA的质粒的相应位点中，所述合成的基因编码经由DKTHTS接头与dAbL3或dAbH4相融合的C-末端CHI。
Fab’A源自IL-1β结合抗体，其重链和轻链序列分别提供在图7中所示的SEQ IDNO:74和75中。在其中轻链具有附着的dAb的Fab’A中，将重链的铰链改变为DKTHTS，即使当无dAb与重链（SEQ ID NO:76）相附着时。
FabA包含相同的轻链序列（SEQ ID NO:75）和在链间半胱氨酸处终止的截短的重链序列（SEQ ID NO:77）。
dAbL3和dAbH4分别为结合人血清白蛋白的轻链和重链结构域抗体。
用于在大肠杆菌中表达的FabA-didAb融合物质粒的构建
通过将编码CH1-dAb融合物的ApaI-EcoRI片段亚克隆到现有的Fab-dAb质粒（其中dAb经由柔性接头与轻链相融合）中来构建在轻链和重链上均具有dAbL3或dAbH4的FabA-didAb。
用于在哺乳动物细胞中表达的FabB-dAb融合物质粒的构建
FabB-dAbs、FabB-dAbH1（CH1-G4Sx2）、FabB-dAbH2（CH1-G4Sx2）、FabB-dAbL1（CH1-G4Sx2）、FabB-dAbL2（CH1-G4Sx2）都通过PCR进行装配，然后克隆到哺乳动物表达载体中从而在HCMV-MIE启动子和 SV40E polyA序列的控制下。这些与包含FabB轻链的相似载体相配对以用于在哺乳动物细胞中表达（参见下文）。
FabB源自结合细胞表面共刺激分子的抗体。
如实施例3中所描的，获得dAbH1、dAbH2、dAbL1和dAbL2。
用于在哺乳动物细胞中表达的FabB-dAb融合质粒的构建
FabB-dAbs、FabB-dAbH1（CH1-G4Sx2）、FabB-dAbH2（CH1-G4Sx2）、FabB-dAbL1（CK-G4Sx2）、FabB-dAbL2（CK-G4Sx2）都通过PCR进行装配，然后克隆到哺乳动物表达载体中从而在HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列的控制下。
FabB-dAbs和didAbs的哺乳动物表达
根据制造商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简而言之，使2μg重链质粒＋2μg轻链质粒与10μl293fectin＋340μlOptimem介质一起在RT下温育20分钟。然后，将该混合物添加至处于悬浮的5×106个HEK293细胞，并且于37℃在摇动下温育4天。
Biacore
使用CM5传感器芯片和HBS-EP（10mM HEPES(pH7.4),150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%v/v表面活性剂P20）运行缓冲液，通过在Biacore T100上进行的表面等离子共振（SPR）来测定关于Fab-dAb构建体的相互作用的结合亲和力和动力学参数。使用人F(ab’)2-特异性山羊Fab（Jackson ImmunoResearch，109-006-097）或内部产生的抗人CH1单克隆抗体来将Fab-dAb样品捕获至传感器芯片表面。通过标准的胺偶联化学来达到捕获抗体的共价固定。
每个试验循环由下述组成：首先采用1分钟注射来捕获Fab-dAb，随后为由3分钟的抗原注射组成的缔合阶段，在这之后监控解离5分钟。在每个循环后，采用下列方式来使捕获表面再生：2×1分钟的40mM HCl注射，随后为30秒的5mM NaOH。所使用的流速对于捕获来说为10μl/分钟，对于缔合和解离阶段来说为30μl/分钟，和对于再生来说为10μl/分钟。
关于动力学试验，执行抗原滴定法（对于人血清白蛋白通常为62.5nM-2μM，对于IL-1β为1.25-40nM），将空白流动池（flow-cell）用于参照扣除，并且包括了缓冲液空白注射以扣除仪器噪声和偏移。
使用Biacore T100评价软件，通过所得到的传感图（sensorgram）与标准1:1结合模型的同时总体配合（simultaneous global-fitting）来测定动力学参数。
为了测试同时的结合，在被捕获的Fab-dAb上注射分开的5μMHSA或100nM IL-1β，或者5μM HSA和100nM IL-1β的混合溶液的3分钟注射。
从大肠杆菌中纯化Fab-dAb
周质提取
将在周质内包含Fab-dAbs的大肠杆菌粒状沉淀重悬浮在具有100mM Tris/HCl,10mM EDTA pH7.4的原始培养体积中。然后，使这些悬浮液于4℃在250rpm下温育16小时。使重悬浮的粒状沉淀于4℃以10000xg离心1小时。去除上清液，并且进行0.45μm过滤。
G蛋白捕获
通过G蛋白色谱法从经过滤的上清液中捕获Fab-dAbs。简而言之，以20分钟的停留时间将上清液施加至在20mM磷酸盐,150mM NaCl pH7.1中平衡的Gammabind PlusSepharose（GE Healthcare）柱。用20mM磷酸盐,150mM NaCl pH7.1洗涤该柱，并且用0.1M甘氨酸/HCl pH2.8洗脱下结合的材料。收集洗脱峰，并且用1M乙酸钠将pH调整至～pH5。将pH经调整的洗出液浓缩，并且使用10k MWCO膜而渗滤到50mM乙酸钠pH4.5中。
离子交换
用NaCl洗脱梯度，在pH4.5下，通过阳离子交换色谱法来进一步 纯化Fab-dAbs。简而言之，将经渗滤的G蛋白洗出液施加至在50mM乙酸钠pH4.5中平衡的Source15S（GEHealthcare）柱。用50mM乙酸钠pH4.5洗涤该柱，并且用20柱体积的在50mM乙酸钠pH4.5中0至1M NaCl的线性梯度来洗脱下结合的材料。在该梯度自始至终收集第三柱体积级分。通过A280和SDS-PAGE来分析所述级分，并且汇集相关级分。
凝胶过滤
如果需要，通过凝胶过滤来进一步纯化Fab-dAbs。简而言之，将FabA-dAbL3（CK-SG4SE）汇集的离子交换洗脱级分施加至在50mM乙酸钠,125mM NaCl pH5.0中平衡的Superdex200（GE Healthcare）柱，并且用50mM乙酸钠,125mM NaCl pH5.0的等度梯度（isocratic gradient）来进行洗脱。在该梯度自始至终收集1/120柱体积级分。通过A280和SDS-PAGE来分析所述级分，并且汇集相关级分。
对于未经历凝胶过滤的Fab-dAbs，将汇集的离子交换洗脱级分浓缩，并且使用10kMWCO膜而渗滤到50mM乙酸钠,125mM NaCl pH5.0中。
SDS-PAGE
当需要时用水稀释样品，然后向10μl中添加10μL2X样品走样缓冲液。对于非还原的样品，在这一点上添加2μL100mM NEM，而对于还原的样品，添加2μL10X还原剂。使样品涡旋振荡，于85℃温育5分钟，冷却，并且在12500rpm下离心30秒。将准备好的样品加载到4-20%丙烯酰胺Tris/甘氨酸SDS凝胶上，并且在125V下走样100分钟。将凝胶转移到PVDF膜上以用于Western印迹法，或者用考马斯蓝蛋白质染料进行染色。
Western印迹法
在150mA下，在12mM Tris,96mM甘氨酸pH8.3中，将凝胶转移至PVDF膜，共16小时。用在PBS＋0.1%Tween20中的2%MarvelTM （封闭缓冲液）使PVDF膜封闭1小时。
抗-轻链
HRP-兔抗人κ轻链，在封闭缓冲液中的1/5000稀释度，共1小时。
抗-重链
小鼠抗人重链，在封闭缓冲液中的1/7000稀释度，共1小时。随后为HRP-山羊抗小鼠，在封闭缓冲液中的1/2000稀释度，共1小时。
抗-His标签
兔抗His6，在封闭缓冲液中的1/1000稀释度，共1小时。随后为HRP-山羊抗兔IgG，在封闭缓冲液中的1/1000稀释度，共1小时。
所有印迹用100ml PBS＋0.1%Tween20洗涤6次，每次洗涤10分钟。印迹用下列方式进行显现：用ECL试剂1分钟，随后暴露于Amersham Hyperfilm；或者用金属增强的DAB试剂20-30分钟，随后为水。
高温反相HPLC
样品（2μg）于80℃在2.1mm C8Poroshell柱上进行分析，其中使用2ml/分钟的流速和18-38%B的梯度，经过4分钟。
A=0.1%TFA，在H2O中
B=0.065%TFA，在80:20IPA:MeOH中
通过在214nm处的吸收来进行检测。
ELISA
使用夹心ELISA来测量Fab-dAb的产率。简而言之，用抗-CH1抗体来捕获Fab-dAb，随后用抗-κ-HRP来揭示。
实施例3：
产生抗白蛋白抗体
用重组的chromapure人血清白蛋白（购自Jackson）对1/2垂耳 兔进行免疫接种。兔以皮下方式接受100ug HSA蛋白的3次免疫接种，第一次免疫接种在完全弗氏佐剂中，而后续的免疫接种在不完全弗氏佐剂中。使用WO04/051268中描述的方法来分离出结合人、小鼠和大鼠血清白蛋白的抗体1和2。分离出抗体1和2的重链可变结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的基因，并进行测序，在经由反转录PCR进行克隆后。
将所嫁接的轻链序列亚克隆到兔轻链表达载体pVRbcK中，所述表达载体包含编码兔C-κ恒定区的DNA。将所嫁接的重链序列亚克隆到兔重链表达载体pVRbHFab中，所述表达载体包含编码兔Fab’重链恒定区的DNA。将质粒共转染到CHO细胞中，并且就白蛋白结合和亲和力来筛选所产生的抗体（表1）。根据制造商的说明书（InVitrogen，目录号11668），使用LipofectamineTM2000操作程序来进行CHO细胞的转染。
产生人源化的结构域抗体dAbL1、dAbH1、dAbL2和dAbH2
通过使用人V-区接纳体构架和供体残基（在构架区中）来设计人源化的VL和VH区。对于抗体1和2中的每一种，设计一个所嫁接的VL区（L1（SEQ ID NO:53）和L2（SEQ ID NO:55））和一个VH区（H1（SEQ ID NO:52）和H2（SEQ ID NO:54）），并且通过寡核苷酸装配和PCR诱变来构建基因。所嫁接的结构域抗体及其CDRs显示在图5中。
表1：抗白蛋白抗体的亲和力
实施例4：在哺乳动物细胞中表达的FabB-dAbs的分析
如在“方法”中所描述的，产生FabB-dAb构建体，并且在BIAcore中直接测试包含FabB-dAbs的来自经转染的HEK293细胞的上清液。
进行动力学分析以评估HSA与FabB-dAb构建体的相互作用。这些构建体由与FabB的CH1的C-末端相融合的dAbL1、dAbH2或dAbL3组成（参见图6）。FabB-dAbL1对于HSA（KD=170nM）具有比FabB-dAbL3（KD=392nM）更高的亲和力。FabB-dAbH2显示出具有最差的针对HSA的亲和力（KD=1074nM），参见表2。
表2
关于HSA与融合至dAbL1、dAbH2或dAbL3的FabBs的结合而测定的亲和力和动力学参数。所显示的数据为平均值±SEM。（对于FabB-dAbL1和FabB-dAbH2，n=4。对于FabB-dAbL3，n=2）。
FabB-dAb蛋白质的SDS-PAGE和Western印迹法证实了，所产生的FabB-dAbs具有预期的大小。
实施例5：在哺乳动物细胞中表达的FabB-didAbs的分析
如在“方法”中所描述的，产生FabB-didAb构建体，并且在BIAcore中直接测试包含didAbs的来自经转染的HEK293细胞的上清液。
使用其中将单dAbs与Fab的重链和轻链C-末端两者相融合的didAb构建体来进行进一步的分析。与单独的单dAb相比较而言，其中didAb源自天然重链和轻链可变结构域配对的构建体显示出亲和力 的显著改善（表2和3）。由两个等同的dAbL1s组成的didAb融合物未显示出超过对于单个dAbL1所看到的那种的在亲和力方面的改善（数据未显示）。
表3
关于HSA与融合至dAbL1&dAbH1或dAbL2&dAbH2的FabBs的结合而测定的亲和力和动力学参数。
FabB-didAb蛋白质的SDS-PAGE证实了，所述FabB-didAbs良好地表达并且具有预期的大小（参见图4a）。注意：该SDS PAGE凝胶为由细胞所表达的总蛋白质。
实施例6：经纯化的FabA-dAbs的分析
如在“方法”中所描述的，构建出用于在大肠杆菌中表达Fab-dAbs，Fab’A-dAbL3（CK-SG4SE）Fab’A-dAbL3（CK-G[APAPA]2）的质粒。如在“方法”中所描述的，将Fab-dAbs表达到大肠杆菌的周质中，并且纯化至均质。通过高温反相HPLC、SDS-PAGE和Western印迹法来评估Fab-dAbs的纯度。还通过Biacore就抗原结合来对Fab-dAbs进行评估。
高温反相HPLC
如在“方法”中所描述的来施行的高温反相HPLC给出了在 FabA-dAbL3（CK-SG4SE）和FabA-dAbL3（CK-G[APAPA]2）中所包含的所有种类的定量分析。所存在的每种种类的百分比显示在表4中。
表4：在Fab-dAb批次中存在的种类的定量
种类 Fab’A-dAbL3（CK-SG4SE） Fab’A-dAbL3（CK-G[APAPA]2）
1 0.6% 1.8%
2 0.6% 0.0%
3 1.0% 0.3%
4 0.9% 0.8%
Fab-dAb 85.5% 92.9%
Di Fab-dAb 11.5% 4.2%
SDS-PAGE
如在“方法”中所描述的，在非还原和还原条件下准备Fab-dAb样品，并且在凝胶上走样。对凝胶进行考马斯染色。Fab’A-dAbL3（CK-SG4SE）和Fab’A-dAbL3（CK-G[APAPA]2）这两种Fab-dAb样品的条带图谱与通过高温反相HPLC所观察到的图谱良好地相符合（图3）。
Western印迹
如在“方法”中所描述的，对Fab-dAb样品实施非还原SDS-PAGE，随后为用抗-轻链和抗-重链抗体进行的Western印迹分析。这证实了，dAb在Fab的轻链上，并且重链在两种样品中均是未修饰的（图4）。还证明了，通过经考马斯染色的非还原SDS PAGE而检测出的所有条带都是Fab-dAb相关产物。
Biacore
将如在“方法”中所描述的通过SPR的动力学分析用于评估人血清白蛋白与Fab’A-dAbL3（CK-SG4SE）和Fab’A-dAbL3（CK-G[APAPA]2）的结合。表5中的结果证明，这两种构建体均能够以大约1μM的相似的亲和力（KD）结合人血清白蛋白。
表5
进一步的动力学分析证明，所有融合构建体保留了原始FabA针对IL-1β的相互作用特征（表6），其中在动力学和亲和力参数方面仅可见很小的差异。
表6
通过将每种构建体捕获至传感器芯片表面来评估每种构建体同时与人血清白蛋白和IL-1β抗原两者相结合的潜力，然后施行分开的3分钟的5μM人血清白蛋白或100nM IL-1β注射，或者5μM人血清白蛋白和100nM IL-1β两者的混合溶液注射。对于每种Fab-dAb构建体，对于组合的HSA/IL-1β溶液所看到的应答与独立注射的应答之和几乎等同，参见表7。这显示，所述Fab-dAbs能够同时与IL-1β和人血清白蛋白两者相结合，并且IL-1β或人血清白蛋白的结合不抑制另一个的相互作用。原始FabA仅与IL-1β结合，并且有着可忽略的与人血清白蛋白的结合。
表7
上表显示了在分开注射HSA或IL-1β，或者注射预混合的HSA和IL-1β后，对于每种构建体所看到的结合应答（RU）。在每种情况下，终浓度对于HSA来说为5μM，和对于IL-1β来说为100nM。独个的HSA和IL-1β应答之和显示在括号中。
实施例7：FabA didAbs
FabA-didAbs在大肠杆菌中的表达
在大肠杆菌中表达以C-末端HIS6标签终止的FabA-dAbs和FabA-didAb融合物。在周质提取后，经由C-末端His6标签来纯化dAb融合蛋白。通过用抗-CH1和抗-cκ抗体来进行的非还原凝胶的Western印迹法来分析Fab表达。将FabA-dAb和FabA-didAb表达为全长蛋白质，并且显示出与所述两种抗体检测试剂反应。
在大肠杆菌中表达的FabA-didAbs的分析
进行进一步的分析以表征HSA与已向其融合了一个或多个dAbs的FabA构建体的结合。对于其中dAbL3或dAbH4与FabA的轻链或重链相融合的各种构建体进行结合试验（关于构建体的细节和结合数据的概括参见表8）。尽管看到仅在轻链或重链上携带dAbH4的构建体 以相当差的亲和力（分别≈9μM和3μM）结合HSA，但对于携带dAbL3（作为单一融合物（在轻链或重链上）或者与在相对链上的第二个dAb（dAbL3或dAbH4）搭档）的构建体观察到较高亲和力结合。
表8
关于HSA与在轻链（LC）或重链（HC）或两者上携带dAbL3或dAbH4的FabAs（如所示的）的结合而测定的亲和力和动力学参数。未检测到HSA与原始FabA的结合（nb）。关于HSA与具有（在HC上的dAbH4）或（在LC上的dAbH4）的FabA的结合的相互作用动力学太快而无法测定，因此由稳态结合来测定亲和力（KD）。

Claims (17)

1.双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对于目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab’片段，所述片段与两个具有对于第二目的抗原的特异性的单结构域抗体相融合，所述第二目的抗原选自血清载体蛋白，其中一个单结构域抗体为与所述Fab或Fab’片段的轻链的C-末端相融合的VL结构域，而另一个单结构域抗体为与所述Fab或Fab’片段的重链的C-末端相融合的VH结构域；其中所述血清载体蛋白是人血清白蛋白；并且其中所述VH结构域包含有在SEQID NO:56或SEQ ID NO:62中给出的关于CDR-H1的序列，在SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:63中给出的关于CDR-H2的序列，和在SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64中给出的关于CDR-H3的序列，且所述VL结构域包含有在SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:65中给出的关于CDR-L1的序列，在SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:66中给出的关于CDR-L2的序列，和在SEQ ID NO:61或SEQ IDNO:67中给出的关于CDR-L3的序列。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述VH结构域包含有在SEQ ID NO:56中给出的关于CDR-H1的序列，在SEQ ID NO:57中给出的关于CDR-H2的序列，和在SEQ ID NO:58中给出的关于CDR-H3的序列，且所述VL结构域包含有在SEQ ID NO:59中给出的关于CDR-L1的序列，在SEQ ID NO:60中给出的关于CDR-L2的序列，和在SEQ ID NO:61中给出的关于CDR-L3的序列。
3.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述VH结构域包含有在SEQ ID NO:62中给出的关于CDR-H1的序列，在SEQ ID NO:63中给出的关于CDR-H2的序列，和在SEQ ID NO:64中给出的关于CDR-H3的序列，且所述VL结构域包含有在SEQ ID NO:65中给出的关于CDR-L1的序列，在SEQ ID NO:66中给出的关于CDR-L2的序列，和在SEQ ID NO:67中给出的关于CDR-L3的序列。
4.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述VH结构域包含有在SEQID NO:52或SEQ ID NO:54中给出的序列。
5.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述VL结构域包含有在SEQ ID NO:53或SEQ IDNO:55中给出的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中一个单结构域抗体是VH结构域，而另一个单结构域抗体是VL结构域，并且所述VH和VL结构域是协作地结合所选择的抗原的互补VH/VL对。
7.根据权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中每个单结构域抗体是完全人的或人源化的。
8.根据权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述Fab或Fab’是完全人的或人源化的。
9.根据权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中与所述抗体Fab或Fab’片段相融合的每个单结构域抗体是经由独立地选自下列的接头进行融合的：氨基酸序列GS、PPP、SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
10.根据权利要求9的融合蛋白，其中所述接头序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:45。
11.根据权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述单结构域抗体经由具有SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:45中给出的序列的接头与所述Fab或Fab’片段的重链的C-末端相连接。
12.根据权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述单结构域抗体经由具有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:45中给出的序列的接头与所述Fab或Fab’片段的轻链的C-末端相连接。
13.根据权利要求6的融合蛋白，其中所述VH结构域经由具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:45中给出的序列的接头与所述Fab或Fab’片段的重链的C-末端相连接，并且所述VL结构域经由具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:45中给出的序列的接头与所述Fab或Fab’片段的轻链的C-末端相连接。
14.根据权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中每个单结构域抗体具有对于血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性，所述单结构域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1结合而为具有对于所述目的抗原的特异性的所述抗体Fab或Fab’片段提供了延长的半衰期。
15.表达载体，其包含权利要求1-14中任一项之中所定义的双特异性抗体融合蛋白的密码。
16.宿主细胞，其包含权利要求15中所定义的载体。
17.权利要求1-14中任一项之中所定义的双特异性抗体融合蛋白在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
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