CN101952312A - 多特异性表位结合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多特异性表位结合蛋白、其制备方法及其在预防、控制、治疗或诊断急性或慢性疾病中的应用。

Description

多特异性表位结合蛋白及其应用
1.技术领域
本发明涉及多特异性表位结合蛋白、其制备方法及其在预防、控制、治疗或诊断急性或慢性疾病中的应用。
2.发明背景
可证明能够与一种或多种抗原结合的抗体片段，如Fab、scFv、双抗体、三抗体和四抗体适于多种临床应用。这些类型的表位结合蛋白保留了对抗原的结合特异性，但缺少刺激针对所结合抗原的免疫应答的功能，即它们缺少效应功能。
对增加单独抗体分子结合的价态或抗原决定簇数目所进行的努力导致开发了双特异性抗体(BsAb)(例如参见Jimenez等，Molecular Cacner Therapeutics2005：4(3)427-434，Lu等.J.of Immun.Methods 1999：230，159-171和美国专利公开号20070014794和20050100543)。BsAb是基于免疫球蛋白(Ig)的分子，它与相同或不同抗原的两个不同表位结合。例如，抗体可对肿瘤细胞抗原和效应细胞如活化T细胞或功能试剂如细胞毒素具有特异性。双特异性T细胞接合物(Engager)或BiTETM分子是一种BsAb类型，显示可运用于临床应用(例如参见美国专利号7,112,324)。
对于增加超过两种不同抗原特异性的努力产生了三特异性抗体样结构，它由通过铰链区结构域侧接的三个不同的scFv结构域组成，可通过二硫键连接使所得蛋白质环化(参见美国专利号20050175606)。然而，因为依赖于单个二硫键进行环化，该抗体样结构的稳定性仍旧是一个问题。
阻碍开发用作治疗剂的多表位结合抗体如BsAb的一个主要障碍是难以产生足够数量和质量的抗体用于临床研究。具体说，传统的方法包括将两种不同杂交瘤融合以产生表达两套重链和轻链的细胞的杂交的杂交瘤法，以及化学偶联法(Carter等，(1995)J.Hematotherapy 4：463-70)不能满足需要。
例如，在杂交的杂交瘤中共表达两套不同的IgG轻链和重链可产生多至10种轻链和重链对，这些对中仅有一对形成功能性双特异性异源二聚体(Suresh等(1986)Methods Enzymol.121：210-28)。从诸如杂交的杂交瘤产生的同源二聚体和非关联Ig轻链和重链的错配异源二聚体这些非功能性物质中纯化抗体不仅麻烦而且效率低下。
两种IgG或其片段的化学交联同样是不充分的，并可导致抗体活性的丧失(Zhu等，(1994)Cancer Lett.86：127-34)。与杂交的杂交瘤方法类似，从诸如化学偶联得到的多聚聚集体等非功能性物质中纯化抗体常常是困难的，且产率通常较低(Cao等，(1998)Bioconj.Chem.9：635-44)。
开发了多种重组方法来提高多表位结合抗体的生产效率。例如，已开发以抗体片段(Carter等(1995)；Pluckthun等(1997)Immunotechology 3：83-105；Todorovska等(2001)J.Immunol.Methods 248：47-66)和全长IgG的形式(Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15)有效产生BsAb的方法。例如，通过所谓“旋钮入孔”(knobs-into-holes)工程改造使Ig CH3结构域有效异源二聚化(Ridgway等1996Protein Eng.9：617-21；Merchant等1998Nat.Biotech.16：677-81)以及将不同特异性的单链Fv(scFv)与全长IgG分子的N或C末端融合(Zhuang等Protein Eng.200013：361-7；Coloma和Morrison Nat.Biotechnol.199715：159-63)，从而产生同源全长IgG样BsAb。利用或不利用弹性接头将两种单链Fv(scFv)或Fab片段遗传融合(Mallender等J.Biol.Chem.1994269：199-206；Mack等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.199592：7021-5；Zapata等Protein Eng.19958.1057-62)，通过二聚化设备如亮氨酸拉链(Kostelny等，J.Immunol.1992148：1547-53；de Kruif等J.Biol.Chem.1996271：7630-4)和IgCλ/CH1结构域(Muller等FEBS Lett.422：259-64)；通过双抗体(Holliger等(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA.199890：6444-8；Zhu等Bio/Technology(纽约)199614：192-6)、Fab-scFv融合(Schoonjans等J.Immunol.2000165：7050-7)和小抗体形式(Pack等Biochemistry 199231：1579-84；Pack等Bio/Technology 199311：1271-7)，构建BsAb。.在大多数这些例子中，这些重组方法产生二价双特异性抗体分子，这些分子对其每一靶抗原而言是单价的。
另一些抗体，如多特异性表位结合蛋白提供了许多优于传统靶向表位的优势，例如，但不限于，对免疫沉默结构域的接近、扩展的靶点库、新的结合特异性，以及与药物、放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒偶联。因为具有这些显著优势，本领域需要构建并有效产生功能性多价和多特异性表位结合蛋白，所述蛋白能够以高亲和力与至少三种或多种表位结合，并保留引起抗体效应功能的能力。
不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明的现有技术。
3.发明内容
本发明提供了能够与多个表位结合并包含抗体恒定结构域Fc区的新的多特异性表位结合蛋白。如本文所用术语“Fc区”指含有CH3、CH2和抗体恒定结构域铰链区的至少一部分的多肽。Fc区可任选包括一些抗体类型中出现的CH4结构域。如本文所用Fc区可包含抗体恒定结构域的整个绞链区。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含抗体的Fc区和CH1区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含抗体恒定结构域的Fc区、CH1区和Cκ/λ区。在一个实施方式中，本文所述的本发明的多特异性表位结合蛋白和/或多肽链在天然情况下不存在或不是天然序列(组成和取向)Ig分子。此外，在一个实施方式中，如本文所述多特异性表位结合蛋白并非在体外通过将一对抗体或其抗原结合片段化学交联产生。
本发明的多特异性表位结合蛋白包含一、二、三、四或多条多肽链。在具体实施方式中，本发明的表位结合蛋白包含2-4条多肽链。本发明多特异性表位结合蛋白的每一条链可包含1、2、3、4、5、6、7、8或多个表位结合域。表位结合域可为scFv、单链双抗体、抗体可变区(如，重链和/或轻链可变区)、肽模拟物或其它本领域所知表位结合域。
可将多肽链内包含的Fc区和表位结合域以多种不同取向连接在一起(本文中所用“连接”可指直接相邻，或通过居间序列或结构间接连接，例如与表位结合域连接的Fc区可与表位结合域直接相邻，或者通过居间序列与表位结合域连接)。在一个实施方式中，一条或多条链的表位结合域与Fc区的C末端连接。在另一些实施方式中，一条或多条链的表位结合域与Fc区的N末端连接。在另一些实施方式中，一条或多条链的表位结合域与Fc区的N末端和C末端同时连接。
本发明的多特异性表位结合蛋白可为二聚体、三聚体、四聚体或更高级的多聚体，并且可以是同源聚体或异源聚体，即它们可包含多条相同或不同的多肽链。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可包含两条多肽链的同源二聚体或异源二聚体。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可包含三条多肽链的同源三聚体或异源三聚体。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可包含四条多肽链的同源四聚体或异源四聚体。本发明的多特异性表位结合蛋白的多肽链可通过Fc区组件，即CH3、CH2、铰链区(或其部分)和/或CH1区进行多聚化(即组装)。或者或此外，本发明的多特异性表位结合蛋白的多肽链可通过与出现于组成多肽链的其它结构域相互作用进行多聚化(即组装)。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白能够同时结合多种表位(例如，体内或体外)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白的表位结合域能够同时结合至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种表位(例如，体内或体外)。在另一实施方式中，每一表位结合域对相同表位具有特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含对不同表位具有特异性的一个或多个表位结合域。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白中的每一结合域对相同或不同表位具有特异性。在一个实施方式中，与分离结合域相比，本发明的多特异性表位结合蛋白中每一结合域对抗原具有不同(即更高或更低)的亲和力。
众所周知免疫系统通过抗体的效应功能抑制、减少或消除具体目标。抗体依赖性细胞介导的毒性作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)是传统抗体Fc区调节的两种效应功能。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白保留了通过Fc区有效刺激效应功能的能力。在一些情况下，不需要效应功能，例如，阻断配体和受体的相互作用就足以得到期望的结果。因此，在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可不引起针对靶点的效应功能。
本发明还提供产生本发明中多特异性表位结合蛋白的方法。在一个实施方式中，可从单个载体或多个载体中表达形成本发明多特异性表位结合蛋白的多肽链。载体内多肽链结合域的编码区的排列可不同。例如，Fc区(如，CH3、CH2、绞链区(或其部分)和/或CH1区)编码区的取向可为多特异性表位结合多肽链内所含任何表位结合域的编码区的5′或3′侧。同样，任何表位结合域编码区的取向可为Fc区编码区的5′和/或3′侧。在一些实施方式中，表位结合域的编码区位于Fc区编码区的5′和3′侧。在某些实施方式中，CH1结构域可位于Fc区编码区的5′侧。
可在多个不同表达系统中产生本发明的多特异性表位结合蛋白。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白由哺乳动物细胞产生并分泌。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白由人细胞产生并分泌。在另一具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白由植物细胞产生并分离。
本发明还提供使用本发明中多特异性表位结合蛋白的方法。例如，许多细胞类型表达多种常见表面抗原，这是区别特定细胞类型的专有抗原组合。在一个实施方式中，使用本发明的蛋白质，可靶向特定的细胞亚组而不与其它无关细胞群交叉反应。同样，亚基的交联导致许多细胞表面受体的活化或失活。在另一实施方式中，本发明的蛋白质可通过与细胞表面受体交联刺激或抑制靶细胞的反应。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于阻断抗原与多种细胞表面受体的相互作用。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于加强抗原与多种细胞表面受体的相互作用。在另一实施方式中，可利用含有对相同抗原具有特异性的多个结合域的本发明多特异性表位结合蛋白使细胞表面受体的同源二聚体交联。
本发明还提供了靶向传统抗体难以靶向的表位的方法。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于首先靶向相邻抗原，结合后，另一结合域可与另一隐藏表位，例如直到第一个靶点结合后才可接近的表位结合。
本发明还提供了使用多特异性表位结合蛋白将不同细胞类型聚集(即使其更接近)的方法。在一个实施方式中，本发明的蛋白质可通过一个结合域与靶细胞结合，通过另一结合域征集另一细胞。在一个具体实施方式中，第一种细胞可以是癌细胞，第二种细胞是免疫效应细胞，如NK细胞。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于增强两种不同细胞，如抗原递呈细胞和T细胞的相互作用，可能增强免疫应答。
本发明还包括将本发明的多特异性表位结合蛋白单独使用或与其它疗法联用，以预防、控制、诊断、治疗或改善与疾病、失调或感染，包括但不限于癌症、炎性疾病和自身免疫病相关的一种或多种症状。本发明还包括将与某部分(如治疗剂或药物)偶联或融合的本发明的多特异性表位结合蛋白单独使用或与其它疗法联用，以预防、控制、治疗或改善与疾病、失调或感染，包括但不限于癌症、炎性疾病和自身免疫病相关的一种或多种症状。
本发明还提供将多特异性表位结合蛋白用作诊断试剂的方法。所述多结合特异性可用于需要同时有效捕获不同抗原的试剂盒或试剂。
4.附图简要说明
图1A.所示为多特异性表位结合蛋白表达载体的例子，包含启动子，编码三个scFv、铰链-CH2-CH3(Fc区)的多核苷酸序列和聚A尾巴。显示了不同取向的铰链-CH2-CH3。相同颜色或阴影的区域代表构建物内相同或重复的表位结合域。同时显示在多特异性表位结合蛋白内包含重复(2个)scFv的实施方式(小图e)。此外，显示了多特异性表位结合蛋白内包含相同(3个)scFv的实施方式(小图f)。
图1B.显示图1A中构建物组装的多特异性表位结合蛋白(小图a)。表位结合蛋白是两条多肽链的同源二聚体，每条链包含三个scFv和铰链-CH2-CH3(Fc区)。
图2A.显示多特异性表位结合蛋白表达载体的例子，包含启动子，编码四个scFv、铰链-CH2-CH3(Fc区)的多核苷酸序列和聚A尾巴。显示了不同取向的铰链-CH2-CH3(Fc区)。相同颜色或阴影的区域代表构建物内相同或重复的表位结合域。还显示了多特异性表位结合蛋白内包含重复的scFv的实施方式(小图e)。此外，还显示了包含四个相同scFv的实施方式(小图f)。
图2B.显示图2A中构建物组装的多特异性表位结合蛋白的代表性示意图(小图a)。该表位结合蛋白是两条多肽链的同源二聚体，每条链包含四个scFv和铰链-CH2-CH3(Fc区)。
图2C.显示编码两条不同多肽链的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链包括启动子、编码侧接CH1结构域的两个抗体重链可变区(VH1，VH2)的多核苷酸序列以及聚A尾巴。轻链包括启动子、编码侧接Cκ/λ区的两个抗体轻链可变区(VL1，VL2)的多核苷酸序列以及聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域代表构建物内相同表位结合特异性。
图2D.显示从与图2C所示构建物相似的构建物组装的多特异性表位结合蛋白“P6”例子的示意图。该多特异性表位结合蛋白是两条多肽链的异源二聚体。重链包含侧接CH1结构域的两个抗体可变区(VH1，VH2)。轻链包含侧接Cκ/λ结构域的两个抗体可变区(VL1，VL2)。可变区VH1和VL1源自C5a特异性抗体1B8。可变区VH2和VL1源自C5a特异性抗体15。抗体1B8和15的表位不同。
图3A.显示多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图，包含启动子和编码两条不同多肽链的多核苷酸序列。重链包含启动子，编码VH结构域，包含铰链、CH2和CH3区(Fc区)的Fc区，CH1区，两个scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链包含启动子，编码VL结构域、Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域代表构建物内相同或重复的表位结合域。还显示了多特异性表位结合蛋白内包含重复的scFv的实施方式(小图c)。
图3B.显示由图3A中构建物组装的多特异性表位结合蛋白(小图a、b)。表位结合蛋白是四条多肽链，两条重链和两条轻链的多聚体。每一重链包含VH结构域，铰链、CH2和CH3(Fc区)，CH1和两个scFv，每一轻链包含VL结构域和Cκ/λ区。
图3C.显示如实施例所述用于产生多特异性表位结合蛋白“P1”的表达载体的示意图。重链载体包含启动子，编码VH结构域、包含铰链、CH2和CH3区的Fc区、CH1区、两个scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。VH结构域对EphA2具有特异性，同时scFv1代表“EA”，是对EphA家族RTK具有特异性的scFv，scFv2代表“EB”，是对EphB家族RTK具有特异性的scFv。轻链载体包含启动子，编码VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链上出现的VL结构域编码对EphA2具有特异性的VL结构域。
图3D.显示由图3C中构建物组装的多特异性表位结合蛋白的示意图。蛋白“P1”包含四条链，两条重链和两条轻链。每一重链包含对EphA2具有特异性的VH结构域，铰链-CH2-CH3(Fc区)，对EphA家族RTK具有特异性的scFv以及对EphB家族RTK具有特异性的scFv。每一轻链包含对EphA2具有特异性的VL结构域以及Cκ/λ结构域。
图3E.显示如实施例所述用于产生多特异性表位结合蛋白“P2”的表达载体的图示。重链载体包含启动子，编码VH结构域，铰链、CH2和CH3(Fc区)，CH1区，单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。VH结构域对EphA2具有特异性，同时单链双抗体代表对EphA家族RTK具有特异性的scFvs“EA”，以及对EphB家族RTK具有特异性的“EB”scFv。轻链载体包含启动子，编码VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链上出现的VL结构域编码对EphA2具有特异性的VL结构域。
图3F.显示图3E中构建物组装的多特异性表位结合蛋白的示意图。蛋白“P2”包含两条重链和两条轻链，包含对EphA2具有特异性的VH结构域，铰链、CH2、CH3(Fc区)和单链双抗体的每一重链代表对EphA家族RTK具有特异性的scFvs“EA”和对EphB家族RTK具有特异性的“EB”scFv。每一轻链包含对EphA2具有特异性的VL结构域以及Cκ/λ。
图4A.显示含有编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链包含启动子，编码两个VH结构域，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区，两个scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体包含启动子，编码两个VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域代表构建物内相同或重复的表位结合域。还显示了多特异性表位结合蛋白内包含重复的scFv的实施方式(小图c)。
图4B.显示图4A中构建物组装的多特异性表位结合蛋白的例子的示意图(小图a和b)。表位结合蛋白是四条多肽链的多聚体，其中两条重链各自包含两个VH结构域，含有CH1、铰链、CH2和CH3(Fc区)的Fc区和两个scFv，并且两条轻链各自包含两个VL结构域和Cκ/λ区。
图4C.显示包含编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体包含启动子，编码VH结构域，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体包含启动子，编码scFV、VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4D.显示图4C中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子的示意图。表位结合蛋白是四条多肽链的多聚体，其中两条重链各自包含VH1结构域，含有CH1、铰链、CH2和CH3(Fc区)的Fc区，并且两条轻链各自包含scFV、VL结构域和Cκ/λ区。
图4E.显示包含编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体包含启动子，编码scFV结构域、VH结构域，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体包含启动子，编码VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4F.显示图4E中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子的示意图。表位结合蛋白是四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含scFV结构域、VH1结构域，含有CH1、铰链、CH2和CH3的Fc区，并且两条轻链各自包含VL结构域和Cκ/λ区。
图4G.显示包含编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体包含启动子，编码scFV结构域、VH结构域，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体包含启动子，编码scFV结构域、VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4H.显示图4G中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子的示意图。表位结合蛋白是四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含scFV结构域、VH1结构域，含有CH1、铰链、CH2和CH3的Fc区，并且两条轻链各自包含scFv结构域、VL结构域和Cκ/λ区。多特异性表位结合蛋白“P3”由结合C5a(1B8)的抗体，也结合C5a表位的scFv#1(15)以及结合EphA家族RTK的scFv#2(EA)组成。
图4I.显示包含编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体包含启动子，编码scFV结构域、VH结构域，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区，另外两个scFV的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体包含启动子，编码scFV结构域、VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4J.显示图4I中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子的示意图。表位结合蛋白是四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含scFV结构域、VH1结构域，含有CH1、铰链、CH2和CH3的Fc区和另外两个scFV，并且两条轻链各自包含scFv结构域、VL结构域和Cκ/λ区。
图4K.显示包含编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体包含启动子，编码scFV结构域、VH结构域，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区、另外的scFV的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体包含启动子，编码scFV结构域、VL结构域、Cκ/λ的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4L.显示图4K中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子的示意图。表位结合蛋白是四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含scFV结构域、VH1结构域，含有CH1、铰链、CH2和CH3的Fc区和另外的scFV，并且两条轻链各自包含scFV结构域、VL结构域和Cκ/λ区。
图4M.显示包含编码四条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体(a)包含启动子，编码第一个VH结构域(VH2)、第一个CH1结构域、第二个VH结构域(VH1)，包含CH1(第2个)、铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链1载体(b)包含启动子，编码第一个VL结构域(VL2)、第一个Cκ/λ区、第二个VL结构域(VL1)、第二个Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链2载体(c)包含启动子，编码VL结构域(VL2)、Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链3载体(d)包含启动子，编码VL结构域(VL1)、Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。考虑到载体(a)构建物编码的重链多肽可与轻链1载体(b)编码的多肽或者轻链2和3的组合(c+d)相连形成图4N所示的功能性多特异性表位结合蛋白。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4N.显示图4M中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子(双Fab结构域IgG形式1(DFD-1))的示意图。表位结合蛋白可为四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含第一VH结构域(VH2)、第一CH1结构域、第二VH结构域(VH1)，包含CH1(第2个)、铰链、CH2、CH3的Fc区，两条轻链各自包含第一VL结构域(VL2)、第一Cκ/λ区、第二VL结构域(VL1)和第二Cκ/λ区。或者，表位结合蛋白可为六条多肽链，即两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链的多聚体。两条重链各自包含第一VH结构域(VH2)、第一CH1结构域、第二VH结构域(VH1)、第二CH1结构域和包含铰链、CH2和CH3的Fc区。两条第一轻链各自包含VL结构域(VL2)和Cκ/λ(参见图4N，小图c)。两条第二轻链各自包含VL结构域(VL1)和Cκ/λ区(参见图4N，小图d)。
图4O.显示包含编码四条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体(a)包含启动子，编码VL结构域(VL2)、Cκ/λ区、VH结构域(VH1)，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链1载体(b)包含启动子，编码VH结构域(VH2)、CH1、第二VL结构域(VL1)、Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链2载体(c)包含启动子，编码VH结构域(VH2)、CH1区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链3载体(d)包含启动子，编码VL结构域(VL1)、Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。考虑到载体(a)构建物编码的重链多肽可与轻链1载体(b)编码的多肽或者轻链2和3的组合(c+d)相连形成图4P所示的功能性多特异性表位结合蛋白。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4P.显示图4O中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子(双Fab结构域IgG形式1(DFD-2))的示意图。表位结合蛋白可为四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含VL结构域(VL2)、Cκ/λ区、VH结构域(VH1)，包含CH1、铰链、CH2、CH3的Fc区，两条轻链各自包含VH结构域(VH2)、CH1、VL结构域(VL1)和Cκ/λ区。或者，表位结合蛋白可为六条多肽链，即两条重链，两条第一轻链和两条第二轻链的多聚体。两条重链各自包含VL结构域(VL2)，Cκ/λ区，VH结构域(VH1)，含有CH1、铰链、CH2和CH3的Fc区。两条第一轻链各自包含VH结构域(VH2)和CH1(参见图4O，小图c)。两条第二轻链各自包含VL结构域(VL1)和Cκ/λ区(参见图4O，小图d)。
图4Q.显示包含编码四条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体(a)包含启动子，编码第一VL结构域(VL2)、第一Cκ/λ区、第二VL结构域(VL1)、第二Cκ/λ区，包含铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体(b，轻链1)包含启动子，编码第一VH结构域(VH2)、第一CH1、第二VH结构域(VH1)、第二CH1的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体(c，轻链2)包含启动子，编码VH结构域(VH2)、CH1区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体(d，轻链3)包含启动子，编码VH结构域(VH1)、CH1区的多核苷酸序列和聚A尾巴。考虑到载体(a)构建物编码的重链多肽可与轻链1载体(b)编码的多肽或者轻链2和3载体的组合(c+d)相连形成图4R所示的功能性多特异性表位结合蛋白。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4R.显示图4Q中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子(双Fab结构域IgG形式1(DFD-3))的示意图。表位结合蛋白可为四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含第一VL结构域(VL2)、第一Cκ/λ区、第二VL结构域(VL1)、第二Cκ/λ区，以及包含铰链、CH2、CH3的Fc区，两条轻链各自包含第一VH结构域(VH2)、第一CH1区、第二VH结构域(VH1)和第二CH1区。或者，提供的多特异性表位结合蛋白可为六条多肽链，即两条重链，两条第一轻链和两条第二轻链的多聚体。两条重链各自包含第一VL结构域(VL2)，第一Cκ/λ区，第二VL结构域(VL1)，第二Cκ/λ区，以及含有铰链、CH2和CH3的Fc区。两条第一轻链各自包含VH结构域(VH2)和CH1(参见图4Q，小图c)。两条第二轻链各自包含VH结构域(VH1)和CH1(参见图4Q，小图d)。
图4S.显示包含编码四条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体(a)包含启动子，编码VL结构域(VL2)、Cκ/λ区、VH结构域(VH1)，包含CH1、铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体(b，轻链1)包含启动子，编码VH结构域(VH2)、CH1、VL结构域(VL1)、Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体(c，轻链2)包含启动子，编码VH结构域(VH2)、CH1区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体(d，轻链3)包含启动子，编码VL结构域(VL1)、Cκ/λ区的多核苷酸序列和聚A尾巴。考虑到载体a构建物编码的重链多肽可与轻链1多肽(b)或者轻链2和3的组合(c+d)相连形成图4T所示的功能性多特异性表位结合蛋白。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4T.显示图4S中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子(双Fab结构域IgG形式1(DFD-4))的示意图。表位结合蛋白可为四条多肽链的多聚体，两条重链各自包含VL结构域(VL2)、Cκ/λ区、VH结构域(VH1)，包含CH1、铰链、CH2、CH3的Fc区，两条轻链各自包含VH结构域(VH2)、CH1、VL结构域(VL1)和Cκ/λ区。或者，提供的多特异性表位结合蛋白可为六条多肽链，即两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链的多聚体。两条重链各自包含VL结构域(VL2)，Cκ/λ区，VH结构域(VH1)，含有CH1、铰链、CH2和CH3的Fc区。两条第一轻链各自包含VH结构域(VH2)和CH1(参见图4S，小图c)。两条第二轻链各自包含VL结构域(VL1)和Cκ/λ(参见图4S，小图d)。
图4U.显示包含编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的反向抗体表达载体例子的示意图。重链样链(heavy-like chain)或第一载体(a)包含启动子，编码VL结构域(VL1)、Cκ/λ区，包含铰链、CH2和CH3区的Fc区的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链样链(light-like chain)或第二载体(b)包含启动子，编码VH结构域(VH1)、CH1区的多核苷酸序列和聚A尾巴。相同颜色或阴影的区域表示具有相同结合特异性的结构域。
图4V.显示图4U所示构建物组装的反向抗体例子的示意图。反向抗体是四条多肽链的多聚体，两条重链样链各自包含第一VL结构域(VL1)，Cκ/λ区和含有铰链、CH2、CH3的Fc区，两条轻链样链各自包含第一VH结构域(VH1)和CH1。
图4W.显示构建图4U和4V所示反向抗体类型的例子的示意图。简单说，使用亲本抗-EphA2抗体12G3H11，利用基于PCR的方法帮助构建该抗体。首先，使用引物从重链中扩增VH、CH1和部分绞链区。第二，使用另一组引物扩增VL、CL和部分绞链区，以及CH3、CH2和绞链区的重叠部分。第三，使用重叠PCR片段以及VL区N末端和CH3区C末端的引物构建全长反向重链。随后的克隆得到用于产生如图4U和4V所示“反向抗体”的载体。
图5A.显示包含两条不同多肽链的多特异性表位结合蛋白表达盒的示意图。重链包含启动子，两个scFV结构域，包含CH1、铰链、CH2和CH3的Fc区和聚A尾巴。轻链包含启动子，两个scFv结构域，Cκ/λ区和聚A尾巴。还显示了多特异性表位结合蛋白内包含重复的scFv的实施方式。
图5B.显示图5A中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子的示意图。表位结合蛋白是四条多肽链，即两条重链和两条轻链的多聚体。每条重链包含两个scFv结构域和包含CH1、铰链、CH2和CH3结构域的Fc区，并且每条轻链包含两个scFv结构域以及Cκ/λ区。
图5C.显示含有编码两条不同多肽链的多核苷酸序列的多特异性表位结合蛋白表达载体例子的示意图。重链载体包含启动子，编码scFv结构域、VH结构域、CH1结构域和另外的scFv结构域的多核苷酸序列和聚A尾巴。轻链载体包含启动子，编码scFV结构域、VL结构域、Cκ/λ、另外的scFv结构域的多核苷酸序列和聚A尾巴。
图5D.显示图5C中构建物组装的多特异性表位结合蛋白例子的示意图。表位结合蛋白是两条多肽链，即一条重链和一条轻链的二聚体。重链包含scFv结构域，含有CH1和另外的scFv结构域的Fc区，并且轻链包含scFv结构域、Cκ/λ区和另外的scFv结构域。
图6.显示scFv中VH和VL结构域的相对排列以及本发明多肽链中存在的双抗体形式的示意图。显示每一形式的接头长度。对于scFv形式(小图1)，每一scFv单位的VH和VL区之间的接头长度较长(＞5个氨基酸)，利于scFv的形成。同样每一scFv之间的接头长度也利于scFv单位的正确折叠。单链双抗体的接头长度(小图2-7)代表利于将VH和VL区“对折”以形成单链双抗体结构所需的长度。
图7.显示PAGE凝胶实验的结果，其中将多种多特异性表位结合蛋白置于(A)非变性或(B)变性条件下。泳道1和5代表以1微克/孔上样的scFv-Fc区蛋白(3F2-522)。泳道2和6代表以4微克/孔上样的scFv-Fc区蛋白(3F2-522)。泳道3和7代表以1微克/孔上样的scFv-Fc区蛋白(522-Fc)。泳道4和8代表以4微克/孔上样的scFv-Fc区蛋白(522-Fc)。泳道M表示分子量标准品(SeeBlue2TM)。
图8.表示ELISA形式的共结合实验的结果。该结果表明多表位结合蛋白保留了每一分离的功能性表位结合域的结合特异性。(A)中用αvβ3整联蛋白包被ELISA板并与522-Fc区和3F2522-Fc区一起孵育。以生物素化EphA2-Fc的结合检测与板结合的蛋白质。(B)中通过ELISA板上结合的EphA2或αvβ3整联蛋白捕获3F2522-Fc区蛋白，并显示通过光密度测量的双特异性结合。
图9.显示了本发明表位结合蛋白集合的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的结果。简单说，将本发明中每一蛋白的纯化样品上样于PAGE凝胶并电泳，然后用考马斯蓝染色。本文显示本发明蛋白质如下：泳道1-522-Fc，泳道2-3F2-522-Fc.，泳道3-P1，泳道4-3F2-522-Fc区，泳道5-12G3H11-5-8和泳道6-3F2-522-Fc区。
图10.显示了多特异性表位结合蛋白P2在大小排阻色谱柱中的洗脱概况。曲线表示每一柱组分的相对蛋白质浓度(X轴)。结果显示本发明P2多表位结合蛋白以单一实体洗脱。
图11.显示了多特异性表位结合蛋白P1在阳离子交换色谱柱中的洗脱概况。曲线表示每一柱组分的相对蛋白质浓度(X轴)。
图12.显示PAGE分析的结果(A和B)，以及对图11所示阳离子交换色谱的汇集组分的双特异性结合分析(C)结果。实施例6描述了汇集组分。在(A)中，样品上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶并电泳，用考马斯蓝染色。(B)中，将等量样品上样并在变性条件下运行，用考马斯蓝染色。(C)中，测试等量样品对EphA2和其它EphA家族RTK(EA)的双结合特异性。每一样品显示了对EphA2和其它EphA家族RTK(EA)的结合。
图13.在不同表位结合蛋白上进行的结合实验的结果。特别显示的是抗体12G3H11和多特异性表位结合蛋白P1和P2对EphA2的特异性。正如所料，EA、EB1和EB2表位结合蛋白对EphA2无特异性。
图14.在不同表位结合蛋白上进行的结合实验的结果。特别显示的是表位结合蛋白EA和多特异性表位结合蛋白P1和P2对EphA家族RTK的特异性。抗体12G3H11和表位结合蛋白EB1和EB2对EphA家族RTK无特异性。
图15.在不同表位结合蛋白上进行的结合实验的结果。特别显示的是表位结合蛋白EB1和EB2以及多特异性表位结合蛋白P1和P2对EphB家族RTK的特异性。抗体12G3H11和表位结合蛋白EA对EphB家族RTK无特异性。
图16.在不同表位结合蛋白上进行的双特异性结合实验的结果。(A)中，通过板结合的EphA2捕获多特异性表位结合蛋白P1和P2并用生物素化的EphA家族RTK进行检测。这证明多特异性表位结合蛋白P1和P2能够同时结合EphA2和EphA家族RTK。抗体12G3H11和单特异性表位结合蛋白EA不能同时结合两个表位。(B)中，通过板结合的EphA2捕获多特异性表位结合蛋白P1和P2并用生物素化的EphB家族RTK进行检测。这证明多特异性表位结合蛋白P1和P2能够同时结合EphA2和EphB家族RTK。单特异性表位结合蛋白EA和EB1不能同时结合两个表位。
图17.显示对不同表位结合蛋白进行的双特异性结合实验的结果。(A)中，通过板结合的EphA家族RTK捕获多特异性表位结合蛋白P1和P2并用生物素化的EphA2进行检测。这证明多特异性表位结合蛋白P1和P2能够同时结合EphA2和Eph A家族RTK。抗体12G3H11和单特异性表位结合蛋白EB1不能同时结合两个表位。(B)中，通过板结合的EphA家族RTK捕获多特异性表位结合蛋白P1和P2并用生物素化的EphB家族RTK进行检测。这证明多特异性表位结合蛋白P1和P2能够同时结合EphA2和Eph B家族RTK。抗体12G3H11和单特异性表位结合蛋白EB1不能同时结合两个表位。
图18.显示在不同表位结合蛋白上进行的双特异性结合实验的结果。(A)中，通过板结合的EphB家族RTK捕获多特异性表位结合蛋白P1和P2并用生物素化的EphA2进行检测。这证明多特异性表位结合蛋白P1和P2能够同时结合EphA2和Eph B家族RTK。抗体12G3H11和单特异性表位结合蛋白EB1不能同时结合两个表位。(B)中，通过板结合的EphB家族RTK捕获多特异性表位结合蛋白P1和P2并用生物素化的EphA家族RTK进行检测。这证明多特异性表位结合蛋白P1和P2能够同时结合EphA家族RTK和Eph B家族RTK。抗体12G3H11和单特异性表位结合蛋白EA不能同时结合两个表位。
图19.显示本发明蛋白质与活细胞上表达表位的结合特异性的分析结果。MiaPaCa2细胞与蛋白质EA、EB2、12G3H11和人IgG孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测本发明蛋白质的结合。用FACS分析本发明蛋白质的结合。结果表明MiaPaCa2细胞具有EA、EB2和12G3H11的特异性目标表位。
图20.显示蛋白质与活细胞上表达表位的结合特异性的分析结果。MiaPaCa2细胞与蛋白质P1、P2和人IgG孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合。用FACS分析蛋白质结合的程度。结果表明MiaPaCa2细胞具有P1和P2的特异性目标表位。
图21.显示表位结合蛋白与活细胞上表达表位的结合特异性分析结果。MiaPaCa2细胞与EA、EB1、EB2、P1、P2、12G3H11、对照Ab和人IgG孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合。用FACS分析蛋白质结合的程度。结果表明MiaPaCa2细胞具有12G3H11、EA、EB1、EB2、P1和P2的特异性目标表位。
图22.显示某些表位结合蛋白与活细胞上表达表位的结合特异性的分析结果。MiaPaCa2细胞与蛋白质P1、P2、EB2、EA、12G3H11和抗人Fc孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合。用FACS分析结合的程度。结果表明MiaPaCa2细胞具有P1、P2、EA、EB2和12G3H11表位的特异性目标表位。
图23.显示某些表位结合蛋白与活细胞上表达表位结合竞争性抑制的分析结果。在过量可溶性EphA2-Fc存在下，MiaPaCa2细胞与蛋白质P1、P2、EB2、EA、12G3H11和抗人Fc孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合。用FACS分析蛋白质结合的程度。结果标明可溶性EphA2-Fc蛋白能与MiaPaCa2细胞上的表位竞争结合12G3H11但不竞争结合P1、P2、EB2和EA，它们中的每一个均保持结合。
图24.显示某些表位结合蛋白与活细胞上表达表位结合的竞争性抑制的分析结果。在过量可溶性EphA家族RTK的存在下，MiaPaCa2细胞与本发明蛋白质P1、P2、EB2、EA、12G3H11和抗人Fc孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合。用FACS分析蛋白质结合的程度。结果标明可溶性EphA家族RTK可与MiaPaCa2细胞上的表位竞争结合EA但不竞争结合12G3H11、P1、P2和EB2，它们中的每一个均保持结合。
图25.显示某些表位结合蛋白与活细胞上表达表位结合的竞争性抑制的分析结果。在过量可溶性EphB家族RTK的存在下，MiaPaCa2细胞与本发明蛋白质P1、P2、EB2、EA、12G3H11和抗人Fc孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合。用FACS分析蛋白质结合的程度。结果表明可溶性EphB家族RTK可与MiaPaCa2细胞上的表位竞争结合EB2但不竞争结合12G3H11、P1、P2和EA，它们中的每一个均保持结合。
图26.这里显示某些表位结合蛋白与活细胞上表达表位结合的竞争性抑制的分析结果。在过量可溶性EphA2-Fc和Eph B家族RTK存在下，MiaPaCa2细胞与蛋白质P1、P2、EB2、EA、12G3H11和抗人Fc孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合并用FACS进行分析。结果显示可溶性EphA2-Fc和Eph B家族RTK蛋白的组合可与MiaPaCa2细胞上的表位竞争与EA和12G3H完全结合以及与P1和P2仅部分结合，同时仅EB2保持结合。
图27.显示对活细胞上表达表位具有特异性的某些表位结合蛋白结合的竞争性抑制的分析结果。在过量可溶性EphA家族RTK和Eph B家族RTK存在下，MiaPaCa2细胞与蛋白质P1、P2、EB2、EA、12G3H11和抗人Fc孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合并用FACS进行分析。结果显示可溶性EphA家族RTK和Eph B家族RTK蛋白的组合能与MiaPaCa2细胞上的表位竞争与EA和EB2完全结合，而P1、P2和12G3H11保持结合。
图28.这里显示对活细胞上表达表位具有特异性的某些表位结合蛋白结合的竞争性抑制的分析结果。在过量可溶性EphA2-Fc、EphA家族RTK和Eph B家族RTK存在下，MiaPaCa2细胞与本发明蛋白质P1、P2、EB2、EA、12G3H11和抗人Fc孵育。用FITC偶联的抗人Fc检测残余蛋白质结合并用FACS进行分析。结果显示可溶性EphA2-Fc、EphA家族RTK和Eph B家族RTK蛋白的组合能与MiaPaCa2细胞上的表位竞争结合P1、P2、EB2、EA和12G3H11。
图29.在此显示激活实验的结果，其中检测某些表位结合蛋白刺激活细胞靶受体磷酸化的能力。然后将靶受体免疫沉淀并用Western印迹分析磷酸盐含量。如图所示，用蛋白质P1和P2处理的MiaPaCa细胞激活并磷酸化EphA2。EphA2特异性抗体12G3H11作为阳性对照包含于研究中。EA、EB1、EB2、对照Ab和培养基不刺激细胞中EphA2的活化。
图30.在此显示激活实验的结果，其中检测某些表位结合蛋白刺激活细胞靶受体磷酸化的能力。然后将靶受体免疫沉淀并用Western印迹分析磷酸盐含量。如图30所示，用本发明蛋白处理MiaPaCa细胞，P1和P2活化并磷酸化Eph A家族RTK。EphA家族特异性抗体EA作为阳性对照包含于研究中。12G3H11、EB1、EB2、对照Ab和培养基不刺激细胞中EphA家族RTK的活化。
图31.在此显示激活实验的结果，其中检测某些表位结合蛋白刺激活细胞靶受体磷酸化的能力。然后将靶受体免疫沉淀并用Western印迹分析磷酸盐含量。如图31所示，用本发明蛋白P1和P2处理的MiaPaCa细胞活化并磷酸化Eph B家族RTK。EphB家族特异性抗体EB2作为阳性对照包含于研究中。12G3H11、EA、EB2、对照Ab和培养基不刺激细胞中EphB家族RTK的活化。
图32.在此显示记录如图4G所示三特异性表位结合蛋白的表达的PAGE凝胶。在图中，非还原(泳道1和2)和变性凝胶(泳道3和4)记录了在这些条件下三特异性表位结合蛋白的相对分子量。泳道2中，三特异性表位结合蛋白显示预测分子量约为240kDa，这比(a)所代表的传统抗体在非变性条件下的PAGE凝胶电泳的预测分子量大。泳道4中，三特异性表位结合蛋白显示预测分子量，重链约75kDa，轻链约50kDa。这些值高于在类似条件下进行电泳的包含重链(b)和轻链(c)的传统抗体显示的预测分子量。
图33.这里显示多特异性表位结合蛋白“P3”的大小排阻色谱(SEC)的结果。图4H描述的构建物包含三个不同表位结合区。表达表位结合蛋白并用SEC分析。描记点代表用于确定P3蛋白分子量的一组确定的分子量组分。实线代表P3洗脱概况。峰1代表在约240kDa(单体)的估测分子量处约70％的蛋白质。峰2和3代表更高级结构(如二聚体)或聚集体。
图34.这里显示在不同形式表位结合蛋白上进行的蛋白酶敏感性实验的结果。具体说，表达并纯化蛋白质(亲本抗体和本文列举的各种形式的表位结合蛋白)，不与或与胰酶(20ng胰蛋白酶/1μg抗体/表位结合蛋白)，胰凝乳蛋白酶(20ng胰凝乳蛋白酶/1μg抗体/表位结合蛋白)或人血清(1μg血清/1μg抗体/表位结合蛋白)在37℃孵育(A)1小时或(B)20小时。与蛋白酶的孵育一旦结束，在还原PAGE凝胶上电泳样品，并用考马斯亮蓝染色确定是否发生蛋白水解。如图显示，37℃孵育1小时不会引起各种亲本抗体或表位结合蛋白的蛋白水解降解。延长孵育时间(37℃12小时)未观察到可探测到的表位结合蛋白水解。
图35.这里显示在不同形式表位结合蛋白上进行的蛋白酶敏感性实验的结果。具体说，表达并纯化蛋白质(亲本抗体和本文列举的各种形式的表位结合蛋白)，不与(奇数)或与(偶数)组织蛋白酶B(20ng蛋白酶/1μg抗体/表位结合蛋白)在37℃孵育(A)1小时或(B)20小时。与蛋白酶的孵育一旦结束，在还原PAGE凝胶上电泳样品，并用考马斯亮蓝染色确定是否发生蛋白水解。如图所示，37℃孵育1小时不会引起各种亲本抗体或表位结合蛋白的蛋白水解降解。延长孵育时间(37℃20小时)后，泳道8和9(蛋白P2)以及泳道14和15(蛋白P4)中的表位结合蛋白发生明显蛋白水解(见虚线圈)。
图36.在此显示的是BIAcore实验的结果，显示多特异性表位结合蛋白同时结合于三个不同的抗原。上方曲线代表图4D代表的多特异性表位结合蛋白“P1”上的三个不同表位结合域的结合活性。将可溶性EB、EA和EphA2抗原加入固定的P1并测量相对结合。对应三种抗原的箭头所标记的三种不同变化表明与固定P1的结合。卵清蛋白(下方曲线)作为阴性对照。未发现可溶性EB、EA和EphA2对固定卵清蛋白的特异性结合。
图37.在此显示多特异性表位结合蛋白P1内化分析研究的结果。图像代表受体介导的P1蛋白、12G3H11抗体和对照抗体(R347)内化的时效实验。将PC3细胞与5μg/ml P1蛋白和抗体孵育0、10、20、30和60分钟后进行通透，使用AlexaFluor488(绿色荧光)山羊-γ-人IgG抗体检测多特异性表位结合蛋白和抗体。用DAPI对细胞核进行染色。如对应实施例所述通过共聚焦激光扫描显微镜分析图像。
图38.在此显示对P1蛋白在PC-3细胞中引起EB家族RTK和EphA2降解的能力的研究结果。简单说，将3×105个PC-3细胞(前列腺腺癌细胞)铺于6孔板并贴壁过夜。如图所示，用67nM P1蛋白或对照抗体(抗-EphA2，抗-EB1，阴性对照抗体(R347)或未处理的)处理细胞。将P1蛋白和对照抗体与PC-3细胞孵育4小时以检测EB降解(A)，孵育24小时以检测EphA2降解(B)。用抗-EphA2、抗-EB1和抗-GAPDH特异性抗体探测Western印迹。图中显示EB家族RTK、EphA2和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的位置。分子量以KDa表示。
图39.在此显示在给予P1蛋白和对照抗体的PC-3荷瘤裸小鼠中EB家族RTK和EphA2的体内降解时程的结果。简单说，将5×106个PC-3细胞(前列腺腺癌细胞)皮下种植于裸小鼠右胁处。肿瘤生长至约100mm3时，在腹膜内给予P1蛋白、亲本抗-EphA2或抗-EB1抗体，剂量为67nmol/kg体重。在给药后0、1、4、8、24、48、72、120和144小时，在每个时间点从每剂量组收集三只小鼠的肿瘤。用Western印迹分析肿瘤裂解物中EB蛋白表达(A)和EphA2(C)。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为表达对照。将每一肿瘤裂解物上样于三块不同凝胶中的一块，每块凝胶上有来自每一时间点的一个样品。此图仅显示代表性凝胶。用密度分析对三块凝胶的蛋白质条带进行定量，并根据0小时时间点的蛋白质条带进行标准化。三张印迹中每一张均使用一个PBS处理(0小时)的对照肿瘤作为对照。用GraphPad
Figure GPA00001010429400211
软件将标准化密度值绘制成相对EB(B)或EphA2(D)表达的平均值。
图40.在此显示的是在PC-3荷瘤裸小鼠中对P1蛋白和对照抗体进行的药代动力学分析。简单说，将3×105个PC-3前列腺腺癌细胞皮下种植于裸小鼠右胁处。肿瘤生长至约100mm3时，给予P1蛋白或亲本抗-EphA2或抗-EB1抗体，剂量为67nmol/kg体重。在给药后1、4、8、24、48、72、120和144小时，在每个时间点从每剂量组通过尾静脉收集三只小鼠的血液并分离血清。另一组给予PBS的3只小鼠在给药后(0小时)立即收集血清。使用EphA2和EB1结合ELISA分析血清样品中是否存在P1蛋白(绿色和红色曲线，分别代表抗-EphA2和抗-EphB4的结合)、亲本抗-EphA2(黑色曲线)或抗-EB1(蓝色曲线)对照抗体。
5.术语
如本文所用术语“抗体”指，例如，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、二硫连接Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab’)片段和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括如，对本发明抗体的抗-Id抗体)和上述任何的表位-结合片段。具体说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原结合位点的分子，这些片段可与或可不与另一免疫球蛋白结构域，包括但不限于：Fc区或其片段融合。免疫球蛋白分子可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或小类。
天然抗体通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，它们由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。各轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键连接数不同。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥键。各重链的一端具有可变区(VH)，后接若干恒定区。各轻链的一端具有可变区(VL)，另一端具有恒定区，轻链的恒定区与重链的第一恒定区对应排列，轻链可变区与重链可变区对应排列。术语“可变区”也可用于描述重链或轻链的可变结构域。相信某些特定氨基酸残基会形成轻链和重链可变域之间的界面。这类抗体可衍生自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、犬、猫、小鼠等。
术语“可变”指以下事实：不同抗体之间可变域的某些部分的序列广泛不同，这些序列负责产生各种具体抗体与其特定抗原的结合特异性。然而，可变性并不是均匀地分布在抗体的可变域上。在轻链和重链可变域中称为互补决定区(CDR)的区段比较集中。可变区中高度保守的部分称为构架区(FW)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FW区，主要采取β-片层构型，通过三个CDR连接，形成环连接β-片层结构，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。各链中的CDR被FW区聚集在一起，紧密相邻，与另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(序列of蛋白质s of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务部(Public HealthService)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD)(1991))。恒定区通常不直接参与抗原结合，但可能影响抗原结合亲和力，并可能具有各种效应功能，如抗体参与ADCC、CDC和/或凋亡。
本文所用术语“高变区”指与抗原结合有关的抗体的氨基酸残基。高变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列(序列of蛋白质s ofImmunological Interest)，第5版，公共卫生服务部(Public Health Service)，马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes of Health，Bethesda，MD)(1991))和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987))。“构架”或“FW”残基是侧接于CDR的那些可变区残基。嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、单链双抗体、疫苗抗体、线性抗体和双特异性抗体中均存在FW残基。
本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了少数出现可能的天然产生突变外，群体包含的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有针对某一抗原性位点的高度特异性。而且，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每一单克隆抗体针对抗原的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体的优势还在于可通过杂交瘤细胞合成，这些杂交瘤细胞不被其他产生免疫球蛋白的细胞污染。本领域受训技术人员了解其他生产方法，例如，单克隆抗体可由编码单克隆抗体重链和轻链基因稳定或瞬时转染的细胞产生。
定语单克隆体表明抗体的特征在于获自基本均一的抗体群，而不解释为需要通过任何特定方法对抗体进行工程改造。本文所用术语单克隆摂指起源于克隆细胞群的抗体，所述细胞包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而非工程改造抗体的方法。例如，本发明所用单克隆抗体可通过Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法产生，或通过任何重组DNA方法产生(参见例如，美国专利号4,816,567)，包括使用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述技术从噬菌体抗体文库中分离产生。可使用这些方法产生单克隆的哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、单链双抗体、疫苗抗体和线性抗体。
术语“嵌合”抗体包括重链和/或轻链至少一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或子类的抗体的相应序列相同或同源，而该链至少另一部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或子类的抗体的相应序列相同或同源的抗体，以及这种抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括含有来自非人灵长动物的可变区抗原结合序列(例如，旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或猕猴)和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)“灵长动物化”抗体。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含起源于非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗体。多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受抗体)，其中天然的CDR残基被来自非人物种如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的对应CDR的残基替换(供体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的FW区残基被相应的非人残基所替换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体的重链或轻链主要包含所有至少一个或多个可变结构域，其中所有或几乎所有CDR对应非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或几乎所有FW是人免疫球蛋白序列的FW。在某些实施方式中，人源化抗体包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定区。更多的细节参见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
“人抗体”可为来源于人的抗体，或者获自经“工程改造”对抗原刺激反应产生特异性人抗体的转基因有机体的抗体，，并可通过本领域任何已知方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入源于内源性重链和轻链基因座被靶向破坏的胚胎干细胞系的有机体细胞株中。转基因生物体可合成人抗原特异性的人抗体，并且可使用该生物体产生人抗体-分泌性杂交瘤。人抗体也可为重链和轻链由起源于一种或多种人DNA来源的核苷酸序列编码的抗体。也可通过本领域所知的遗传学或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术或体外活化的B细胞来构建完全人抗体。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用摂和“ADCC”指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)能识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。在一个实施方式中，这类细胞是人细胞。虽然不希望受任何特定作用机理的限制，但介导ADCC的这些细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。介导ADCC的原始细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)小结了造血细胞上的FcR表达情况。为了评估分子的ADCC活性，可进行体外ADCC实验，如美国专利5,500,362或5,821,337所述。可用于这类测得的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或此外，可在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)所述的动物模型中进行评价。
“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”指某分子启动补体活化和在补体存在下裂解靶点的能力。通过补体系统第一组分(C1q)与复合关联抗原的分子(如抗体)结合，启动补体激活途径。为了评估补体激活，可进行CDC测定，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202：163(1996)所述。
效应细胞摂是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。该细胞至少表达FcγRI、FCγRII、FcγRIII和/或FcγRIV并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。
“表位”是本领域熟知的术语，指能特异性结合抗体的任何化学部分。“抗原”是含有表位的部分或分子，同样也能与抗体特异性结合。
“严谨杂交条件”指42℃在含有50％福尔马林、5x SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x登哈特(Denhardt′s)溶液、10％硫酸葡聚糖和20？g/ml变性剪切鲑鱼精DNA的溶液中孵育过夜，然后用0.1x SSC在约65℃冲洗滤器。可通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸(如Kutmeier等，BioTechniques17：242(1994)所述)，简言之，该方法包括合成含有编码该抗体的序列的某部分的重叠寡核苷酸，使这些寡核苷酸退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
6.具体实施方式
本发明提供了包含抗体恒定结构域Fc区的新颖多特异性表位结合蛋白。具体说，Fc区可包含来自抗体恒定结构域的CH3、CH2、绞链区(或其部分)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含抗体恒定结构域的Fc区和CH1区。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白还包含Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或更多个CH1和/或Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个CH1和/或Cκ/λ区。在另一实施方式中，Fc区、CH1区或Cκ/λ区来源于本领域已知任何抗体亚型。在其它实施方式中，Fc区是来源于本领域已知多个抗体亚型的嵌合体。
在候选实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白在不存在Fc区的情况下可包含CH1或Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白在不存在Fc区的情况下，可包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或更多个CH1和/或Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白在不存在Fc区的情况下，可包含所有或部分绞链区。
已知Fc区的变体(如氨基酸取代、加入和/或缺失)增强或削弱效应功能(参见Presta等，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490；美国专利5,624,821，5,885,573和PCT公开号WO 00/42072、WO 99/58572和WO 04/029207)。因此，在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白的氨基酸序列可包含变异Fc区。在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白的变异Fc区诱导与天然Fc相似水平的效应功能。在另一实施方式中，变异Fc区诱导比天然Fc更高的效应功能。在另一实施方式中，变异Fc区诱导比天然Fc更低的效应功能。在另一实施方式中，变异Fc区诱导比天然Fc更高的ADCC。在另一实施方式中，变异Fc区诱导比天然Fc更低的ADCC。在另一实施方式中，变异Fc区诱导比天然Fc更高的CDC。在另一实施方式中，变异Fc区诱导比天然Fc更低的CDC。变异Fc区的具体实施方式详述于下文。
本领域已知可对Fc区糖基化进行修饰以提高或降低效应功能(参见例如，Umana等，1999，Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies等，2001，Biotechnol Bioeng74：288-294；Shields等，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)美国专利号6,602,684；美国序列号10/277,370；美国序列号10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM技术(纽约州普林斯顿百合花集团)(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM糖基化筛选技术(瑞士苏黎世个来卡生物技术公司)(GLYCART biotechnologyAG，Zurich，Switzerland)。因此，在一个实施方式中，本发明的多特异性多肽的Fc区的氨基酸残基糖基化改变。在另一实施方式中，氨基酸残基糖基化改变导致效应功能降低。在另一实施方式中，氨基酸残基糖基化改变引起导致效应功能提高。在一个具体实施方式中，Fc区的岩藻糖基化水平降低。在另一实施方式中，Fc区是非岩藻糖基化的(参见例如，美国专利申请公开号2005/0226867)。
最近的研究表明在IgG分子的寡糖中加入唾液酸能增强其抗炎活性并改变其细胞毒性(Keneko等，Science 313，670-673(2006)，Scallon等，Mol.Immuno.2007年3月；44(7)：1524-34)。因此，可通过选择最适于目标应用的糖形对抗体治疗的功效进行优化。插入抗体两个CH2结构域间的两条寡糖链参与Fc与其受体的结合。上述研究表明唾液酸化升高的IgG分子具有抗炎特性，而唾液酸化降低的IgG分子则免疫刺激活性提高。因此，可“定制”抗体疗法使其具有适合特定应用的唾液酸化概况。名为“治疗活性增强的方法和组合物”(Methods And Compositions With Enhanced Therapeutic Activity)的WO2007/005786以及名为“抗炎活性增强、细胞毒性降低的多肽及相关方法”(Polypeptides With Enhanced Anti-Inflammatory And Decreased CytotoxicProperties And Related Methods)的WO2007/117505展示了调节抗体唾液酸化状态的方法，均全文纳入本文作参考。
在一个实施方式中，本发明的多特异性多肽的Fc区与未改变的参比Fc区相比唾液酸化状态改变。在一个实施方式中，本发明的多特异性多肽的Fc区与未改变的参比Fc区相比唾液酸化状态提高。在一些实施方式中，与未改变的参比Fc区相比，本发明的多特异性多肽的Fc区的唾液酸化水平提高约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％或约150％或更多。在一些实施方式中，与未改变的参比Fc区相比，本发明的多特异性多肽的Fc区的唾液酸化水平提高至约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或更多倍。
在另一个实施方式中，本发明的多特异性多肽的Fc区与未改变的参比Fc区相比唾液酸化状态降低。在一些实施方式中，与未改变的参比Fc区相比，本发明的多特异性多肽的Fc区的唾液酸化水平降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％或约150％或更多。在一些实施方式中，与未改变的参比Fc区相比，本发明的多特异性多肽的Fc区的唾液酸化水平降低至约1/2、约1/3、约1/4、约1/5、约1/10、约1/20、约1/50倍或更少。
本领域也了解可修饰Fc区以延长蛋白质的半衰期。半衰期延长时可减少病人的药物用量，并减少给药频率。因此，本发明的半衰期延长的多特异性表位结合蛋白可通过修饰鉴定为参与Fc和FcRn受体相互作用的氨基酸残基产生(参见例如，PCT公开号97/34631和02/060919，每一均整体纳入本文作参考)。此外，利用本领域广泛使用技术将本发明多特异性表位结合蛋白与PEG或清蛋白偶联可延长其半衰期。在一些实施方式中，与未改变的参比Fc区相比，本发明的多特异性多肽的Fc区的半衰期延长约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％或更多。在一些实施方式中，与未改变的参比Fc区相比，本发明的多特异性多肽的Fc区的半衰期延长至约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或更多倍。
A.多肽链取向
本发明的多特异性表位结合蛋白包含一个、两个、三个、四个或多个多肽链。本发明的多特异性表位结合蛋白可包含2-4条多肽链(下文中可称作“本发明的多肽链”)。本发明的多特异性表位结合蛋白的每一多肽链可包含至少1、至少2、至少3、至少4、或多于4个表位结合域(本文也称作“EBD”)，还可包含一个或多个下列区域：Fc区、CH1区、Cκ/λ区。本发明的多肽链包含一个或多个表位结合域，表位结合域可为scFv、单链双抗体、抗体可变区或另一类型的表位结合域。可将表位结合域连接于一个或多个下列区域的N末端和/或C末端：Fc区、CH1区、Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明的多肽链可包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个Fc、CH1或Cκ/λ区。
在一个实施方式中，本发明的多肽链包含Fc区。当在下列章节描述本发明的多肽链时，应当理解的是，术语“Fc区”包括含有铰链区或其部分、CH2区和CH3区的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽链还可包含来自抗体恒定区的CH1区。在某些实施方式中，CH1区与Fc区的N末端和/或C末端相连接。
A.1.表位结合域取向
表位结合域(也称为“EBD”)包括例如，抗体可变区、抗体片段、scFv、单链双抗体或其它本领域所知结合域。表位结合域也包含双特异性单链双抗体或设计为结合两个不同表位的单链双抗体。还包括抗体样分子或抗体模拟物，例如但不限于可与表位特异性结合的小抗体、大抗体(maxybodies)和“A”结构域寡聚体(也称为高亲合性多聚体(avimer))(参见例如，美国专利申请公开号2005/0164301、2005/0048512和2004/017576，各自均纳入本文作参考)、基于Fn3的蛋白质支架(参见例如，美国专利申请公开号2003/0170753，将其纳入本文作参考)、锚蛋白重复(也称为DAR销杆(DARpins))、VASP多肽、鸟胰腺多肽(aPP)、四连接素(基于CTLD3)、亲和蛋白(Affililin)(基于γB-晶体蛋白/泛素)、绳结蛋白(Knottins)、SH3结构域、PDZ结构域、淀粉酶抑肽(Tendamistat)、新抑癌蛋白、蛋白A结构域、脂笼蛋白、转铁蛋白和库尼茨(kunitz)结构域。在一个实施方式中，2007年10月31日提交的名为“蛋白质支架(ProteinsScaffolds)”的美国临时专利申请号60/984,206(将其全文纳入本文作参考)，列举了可用于构建本发明多特异性表位结合蛋白的表位结合域。
在一个实施方式中，本发明多肽链的一个、两个、三个或多个表位结合域与Fc区的C末端连接。在另一些实施方式中，一个、两个、三个或多个表位结合域与Fc区的N末端连接。在另一些实施方式中，一个、两个、三个或多个表位结合域与Fc区的N末端和C末端连接。
在一些实施方式中，本发明的多肽链可包含下式所示的取向(N末端-C末端)：EBDn-抗体可变结构域n-Xn-Fc区n-EBDn，其中X是CH1或Cκ/λ且n是0-10的整数，并且在每一结构元件中可不同。
A.2.包含C-末端表位结合域的多肽链
在一个实施方式中，表位结合域(如抗体可变区、scFv、单链双抗体)与本发明多肽链Fc区的C末端连接。在另一实施方式中，多个表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)与Fc区的C末端连接。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与Fc区C末端连接的多个表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与Fc区C末端连接的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含多个与Fc区C末端连接的表位结合域，其中所述结构域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体或本领域已知其它表位结合域。
在某些实施方式中，本发明的多肽链包含与Fc区C末端连接的一种以上类型的表位结合域。例如，但不限于，本发明的包含两个表位结合域的多肽链可包含与Fc区C末端连接的scFv和单链双抗体，或scFv和抗体可变区，或scFv和本领域已知其它表位结合域，或单链双抗体和抗体可变区，或单链双抗体和其它本领域已知表位结合域，或抗体可变区和本领域已知其它表位结合域。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是scFv。在一个实施方式中，一个scFv连接于本发明多肽链Fc区的C末端(参见如图1B)。在另一实施方式中，多个scFv连接于Fc区的C-末端(参见如图2B、3B、4B)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区C末端的多个scFv。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区C末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8或多个scFv。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是单链双抗体。在一个实施方式中，单链双抗体连接于本发明多肽链Fc区的C末端(参见如图3F)。在另一实施方式中，多个单链双抗体连接于Fc区的C末端。在另一实施方式中，本发明多肽链包含连接于Fc区C末端的多个单链双抗体。在另一实施方式中，本发明多肽链包含连接于Fc区C末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8或多个单链双抗体。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是抗体可变区。在一个实施方式中，抗体可变区连接于本发明多肽链Fc区的C末端。在另一实施方式中，多个抗体可变区连接于Fc区的C末端。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区C末端的多个抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区C末端的至少1、2、3、4、5、7、8或多个抗体可变区。
A.3.包含N-末端表位结合域的多肽链
在另一实施方式中，表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)与本发明多肽链Fc区的N末端连接。在另一实施方式中，多个表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)与Fc区的N末端连接。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与Fc区N末端连接的多个表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与Fc区N末端连接的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含多个表位结合域，其中所述结构域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和本领域已知其它表位结合域。
在某些实施方式中，本发明的多肽链包含与Fc区N末端连接的一种以上类型的表位结合域。例如，但不限于，本发明的包含两个表位结合域的多肽链可包含与Fc区N末端连接的scFv和单链双抗体，或scFv和抗体可变区，或scFv和本领域已知其它表位结合域，或单链双抗体和抗体可变区，或单链双抗体和其它本领域已知表位结合域，或抗体可变区和本领域已知其它表位结合域。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是scFv。在一个实施方式中，scFv连接于本发明多肽链Fc区的N末端。在另一实施方式中，多个scFv连接于Fc区的N末端。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端的多个scFv。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8或多个scFv。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是单链双抗体。在一个实施方式中，单链双抗体连接于本发明多肽链Fc区的N末端。在另一实施方式中，多个单链双抗体连接于Fc区的N末端。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端的多个单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8或多个单链双抗体。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是抗体可变区。在一个实施方式中，抗体可变区连接于本发明多肽链Fc区的N末端。在另一实施方式中，多个抗体可变区连接于Fc区的N末端(参见如图4D和5B)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端的多个抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端的至少1、2、3、4、5、7、8或多个抗体可变区。
A.4.包含N-末端和C-末端表位结合域的多肽链
在另一实施方式中，本领域所知表位结合域(如，抗体可变区、scFv、单链双抗体)与本发明多肽链Fc区的N末端和C末端连接。在另一实施方式中，本领域抑制的多个表位结合域与Fc区的N末端和C末端同时连接。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端和C末端的多个本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端和C末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8或多个本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含多个表位结合域，其中所述结构域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和本领域已知其它表位结合域。
在某些实施方式中，本发明的多肽链包含与Fc区N末端和C末端连接的一种以上类型的表位结合域。例如，但不限于，本发明的包含两个表位结合域的多肽链可包含与Fc区N末端和C末端连接的scFv和单链双抗体，或scFv和抗体可变区，或scFv和本领域已知其它表位结合域，或单链双抗体和抗体可变区，或单链双抗体和其它本领域已知表位结合域，或抗体可变区和本领域已知其它表位结合域。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是scFv。在一个实施方式中，scFv连接于本发明的表位结合多肽链Fc区的N末端和C末端。在另一实施方式中，多个scFv连接于Fc区的N末端和C末端(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区的N末端和C末端的多个scFv。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区N末端和C末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个scFv。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是单链双抗体。在一个实施方式中，单链双抗体连接于本发明表位结合多肽链Fc区的N末端和C末端(参见例如，图3F)。在另一实施方式中，多个单链双抗体连接于Fc区的N末端和C末端。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区的N末端和C末端的多个单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区的N末端和C末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个单链双抗体。
在一个具体实施方式中，一个或多个表位结合域是抗体可变区。在一个实施方式中，抗体可变区连接于本发明表位结合多肽链Fc区的N末端和C末端(参见例如，图3F)。在另一实施方式中，多个抗体可变区连接于Fc区的N末端和C末端。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区的N末端和C末端的多个抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含连接于Fc区的N末端和C末端的至少1、2、3、4、5、7、8或更多个抗体可变区。
A.5.多肽链取向的具体实施方式
在一个实施方式中，本发明的多肽链包含3个连接于Fc区的scFv。在一个具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-scFv-Fc区-scFv(参见图1B)或反之亦然(scFv-Fc区-scFv-scFv，参见图1A小图b)。在另一个具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：Fc区-scFv-scFv-scFv(参见图1A小图c)或反之亦然(scFv-scFv-scFv-Fc区)。在另一实施方式中，本发明多肽链包含4个连接于Fc区的scFv。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv(参见图2B)或反之亦然。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-Fc区-scFv-scFv-scFv(参见图2A小图b)。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-scFv-scFv-Fc区-scFv(参见图2A小图d)或反之亦然(参见图2A小图c)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含scFv、抗体可变区和Fc区。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-抗体可变区-Fc区(参见图4E小图a，图4G小图a)。
在另一实施方式中，本发明的多肽链包含scFv、抗体可变区和Cκ/λ区。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-抗体可变区-Cκ/λ区(参见图4D小图b，图4G小图b)。
在另一实施方式中，本发明的多肽链包含scFv、抗体可变区、Fc区和scFv。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-抗体可变区-Fc区-scFv。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含scFv、抗体可变区、Fc区和两个scFv。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-抗体可变区-Fc区-scFv-scFv(参见图4I小图a)。
在另一实施方式中，本发明的多肽链包含scFv、抗体可变区、Fc区和scFv。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-抗体可变区-Fc区-scFv。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含scFv、抗体可变区、Fc区和scFv。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：scFv-抗体可变区-Fc区-scFv(参见图4K小图a)。
在另一实施方式中，本发明的多肽链包含抗体可变区、Fc区和两个scFv。在另一具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：抗体可变区-Fc区-scFv-scFv(参见图3B)或反之亦然。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含两个抗体可变区和两个scFv。在一个具体实施方式中，本发明的多肽链从N末端到C末端排列如下：抗体可变区-抗体可变区-Fc区-scFv-scFv(参见图4B)或反之亦然。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含两条本发明的多肽链。
在一些实施方式中，本发明的多肽链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个抗体可变结构域和一个或多个CH1、Cκ/λ或Fc区。在一些实施方式中，本发明的多肽链包含两个抗体可变区和一个或多个CH1、Cκ/λ、或Fc区。在一些实施方式中，本发明的多肽链包含的抗体可变区是抗体重链可变区或结构域(VH)和/或抗体轻链可变区或结构域(VL)。在一些实施方式中，本发明的多肽链包含抗体可变结构域类型，例如但不限于VH和VL抗体可变区的混合物。
在一个具体实施方式中，本发明的多肽链包含两个抗体可变结构域和2个Cκ/λ区(参见例如，图4N)。在另一个具体实施方式中，本发明的多肽链包含两个抗体可变结构域和2个CH1结构域(参见例如，图4N)。在一个具体实施方式中，本发明的多肽链包含两个抗体可变结构域、CH1和Cκ/λ区(参见例如，图4P和4T)。
在另一实施方式中，本发明的多肽链包含抗体重链，其进一步包含轻链可变结构域(VL)、Cκ/λ和Fc区(参见例如，图4V)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含抗体轻链，其进一步包含重链可变结构域(VH)和Cκ/λ(参见例如，图4V)。
在一些实施方式中，本发明的多肽链不包含相同的抗体可变结构域。在其它实施方式中，本发明的多肽链不包含具有相同表位结合特异性的抗体可变区。在一些实施方式中，本发明的多肽链不包含串联的抗体可变重链结构域(VH)。在一些实施方式中，本发明的多肽链不包含串联的抗体可变轻链结构域(VL)。
2001年3月20日提交的PCT公开号WO 01/77342描述了包含与IgG1分子重链连接的Fab结构域的单特异性多价抗体。在一些实施方式中，本发明蛋白质不包含与PCT公开号WO 01/77342图4所示IgG1分子重链相连的Fab结构域。在一些实施方式中，本发明的多肽链不显示于PCT公开号WO 01/77342图4之中。
在另一实施方式中，本发明多肽链不包含Fc区。在一个实施方式中，本发明的多肽链包含Cκ/λ区。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含CH1结构域。在一个实施方式中，本发明的多肽链包含与Cκ/λ区和/或CH1区连接的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与Cκ/λ区和/或CH1区的N末端和/或C末端连接的抗体可变区。在一个具体实施方式中，本发明的多肽链包含两个与Cκ/λ区连接的抗体可变区，从N末端到C末端排列如下：VL1-Cκ/λ-VL2(参见图2D)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区和两个scFv，从N末端到C末端排列如下：scFv-VL1-Cκ/λ-scFv(参见图5D)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含两个与CH1区连接的抗体可变区，从N末端到C末端排列如下：VH1-CH1-VH2(参见图2D)。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与CH1区连接的抗体可变区和两个scFv，从N末端到C末端排列如下：scFv-VH1-CH1-scFv(即缺少Fc结构域，参见图5D)。
A.6.接头长度和单链双抗体形式
已知接头长度可极大影响scFv可变区的折叠和相互作用。事实上，若使用较短的接头(5-10个氨基酸之间)，则能防止链内折叠，并且需要链间折叠使两个可变区一起形成功能性表位结合位点。所得结构一般称为单链双抗体，具有多种取向，如图6所示那些。关于更多的接头取向和大小的例子，参见Hollinger等，1993Proc Natl Acad Sci.U.S.A.90：6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，将其每一文献全文纳入本文作参考。
也应当理解的是，本发明多肽链的结构域和/或区域可被不同长度的接头分隔。在一些实施方式中，接头区可将表位结合域与表位结合域、Cκ/λ、CH1、铰链、CH2、CH3或整个Fc区分隔开。此类接头区可包含一些随机分类的氨基酸或一些有限制的氨基酸集合。此类接头区可以是弹性或者刚性的。
在一些情况下，根据数个Fab分子的晶体结构分析选择接头序列。在Fab或抗体的分子结构中，可变结构域和CH1/Cκ/λ恒定结构域间存在天然的弹性连接。这种天然连接包含约10-12个氨基酸残基，其中V结构域的C末端贡献4-6个残基，Cκ/λ/CH1结构域的N末端贡献4-6个残基。Cκ/λ或CH1结构域的N末端残基，尤其是头5-6个氨基酸残基，采取了没有强二级结构的环状构象，因此可作为两个可变结构域间的弹性接头。Cκ/λ或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是Ig序列的一部分，因此能够最大程度减少接头或连接可能引起的任何免疫原性。接头序列可包含任何长度的Cκ/λ/CH1结构域的任何序列，而不是Cκ/λ/CH1结构域的所有残基；例如Cκ/λ/CH1结构域的最初5-12个氨基酸残基；并且重链接头可来自任何同种型，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ的CH1。接头序列也可来自于其它蛋白质，如Ig-样蛋白质(如TCR、FcR、KIR)；来源于绞链区的序列；以及来自其它蛋白质的其它天然序列。
在本发明的一个实施方式中，本发明的多肽链在其表位结合域、Cκ/λ结构域、CH1结构域、绞链区、CH2结构域、CH3结构域或Fc区中一个或多个区域之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个氨基酸残基的接头区。接头区可包含任何天然产生的氨基酸。在一些实施方式中，接头区中包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一实施方式中，接头区取向包含若干组甘氨酸重复(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x，其中X是等于或大于1的正整数。
A.7.二硫键的形成和位置
本领域理解抗体在Cκ/λ和CH1间包含链间二硫键。在一些实施方式中，本发明的多肽链包含至少一个利于链间二硫键形成的半胱氨酸残基。本发明多肽链的VL、VH、CH1、铰链、CH2或CH3区中存在至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方式中，本发明的多肽链不包含利于链间二硫键形成的半胱氨酸残基。在其它实施方式中，可工程改造本发明的多肽链，移除至少一个能形成链间二硫键的半胱氨酸残基。
在一些实施方式中，本发明的多肽链包含所有或至少一部分抗体绞链区。可将绞链区或其部分直接与表位结合域、CH1、Cκ/λ、CH2或CH3连接。在另一实施方式中，可通过不同长度的接头区将绞链区或其部分与表位结合域、CH1、Cκ/λ、CH2或CH3连接。
在一些实施方式中，本发明的多肽链包含1、2、3、4、5、6或更多个绞链区或其部分。在其它实施方式中，本发明的多肽链包含相同的绞链区或其部分。在其它实施方式中，绞链区或其部分是不同的。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含来自人IgG1分子的绞链区或其部分。在另外的实施方式中，可工程改造绞链区或其部分，将天然产生的半胱氨酸残基移除，引入非天然产生的半胱氨酸残基，或用天然产生的残基代替非天然产生的半胱氨酸残基。在一些实施方式中，本发明多肽链包含至少一个含有下列氨基酸序列的绞链区或其部分：EPKSC(SEQ ID No：1)。在其它实施方式中，本发明多肽链包含至少一个含有下列氨基酸序列的绞链区或其部分：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ IDNo：2)。在一些实施方式中，工程改造至少一个绞链区或其部分，将至少一个天然产生的半胱氨酸残基取代为另一氨基酸残基。在一些实施方式中，用丝氨酸替换至少一个天然产生的半胱氨酸残基。在一个具体的实施方式中，本发明多肽链包含至少一个含有下列氨基酸序列的绞链区或其部分：EPKSS(Seq IDNo：3)。
在其它实施方式中，本发明的多肽链可包含用于定点偶联的非天然产生的半胱氨酸残基。2008年1月18日提交的美国临时专利申请系列号61/022,073，名为“用于定点偶联的半胱氨酸工程改造抗体(Engineered Antibodies forSite-Specific Conjugation)”以及2005年9月22日提交的美国专利申请公开号20070092940列出此类方案、组合物和方法，将其全文纳入本文用作所有目的。
A.8.二聚化/多聚化结构域
本发明的多特异性表位结合蛋白的组装依赖于多肽链上出现的允许多聚化的结构域。例如，常规抗体使用Fc的CH2和CH3区之间的相互作用形成同源二聚化分子。在同一分子内，抗体使用来自重链和轻链亚基的CH1和Cκ/λ区形成异源二聚体。也可能使用天然产生蛋白质的多聚化结构域使本发明多肽链形成多特异性表位结合蛋白。在一些实施方式中，本发明的多肽链包含选自下组的蛋白质二聚化/多聚化结构域：CH1、CH2、CH3、Cκ/λ、亮氨酸拉链结构域(bZIP)、螺旋-环-螺旋基序、EF手、磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域、Src同源结构域(SH2、SH3)，或其它本领域已知结构域。在其它实施方式中，本发明的多肽链包含2006年12月5日提交的美国专利公开号20070140966中出现的多聚化结构域，将其全文纳入本文作参考。
B.编码本发明多肽链的载体
本发明的多特异性表位结合蛋白可包含2-4条多肽链。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可包含5、6、7、8或更多条多肽链。本发明多特异性表位结合蛋白的每一条多肽链可包含1、2、3、4、5、6、7、8或多个表位结合域。多肽链包含的表位结合域可为scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域所知表位结合域。可将许多不同取向的Fc区和表位结合域连接在一起(参见例如，章节A和图1-5)。本发明还提供用于产生和/或表达本发明的多肽链和多特异性表位结合蛋白的多核苷酸载体。在一个实施方式中，用于产生多肽链的载体编码与Fc区C末端连接的表位结合域。在另一实施方式中，用于产生多肽链的载体编码与Fc区N末端连接的表位结合域。在另一实施方式中，用于产生多肽链的载体编码与Fc区N末端和C末端连接的表位结合域。
在一个实施方式中，由含有启动子、编码本发明多肽链的多核苷酸序列和聚A尾巴的载体表达本发明的多特异性表位结合多肽链。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码含有Fc区的表位结合多肽链的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码含有Fc区的表位结合多肽链的多核苷酸序列和聚A尾巴，其中Fc区连接于1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域的N末端。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码含有Fc区的表位结合多肽链的多核苷酸序列和聚A尾巴，其中Fc区连接于1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域的C末端。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端连接的表位结合域的多核苷酸序列。
在其它实施方式中，本发明载体还包含编码本发明多特异性结合多肽链的多核苷酸序列，其中本发明多特异性表位结合多肽链包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或更多个CH1和/或Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个CH1和/或Cκ/λ区。在另一实施方式中，Fc区、CH1区或Cκ/λ区来源于本领域已知任何抗体亚型。在其它实施方式中，Fc区是来源于本领域已知多个抗体亚型的嵌合体。
在另选实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白在不存在Fc区的情况下可包含CH1或Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白在不存在Fc区的情况下，可包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或更多个CH1和/或Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白在不存在Fc区的情况下，可包含所有或一部分抗体绞链区。
B.1.编码具有C末端表位结合域的多肽链的载体
在一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图1A(小图a、b、c))。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的多个scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图2A(小图a、b、c))。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区C末端连接的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图3E(小图a))。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的多个单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区C末端连接的单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的多个抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区C末端连接的抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区C末端的多个本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区C末端连接的本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，载体包含启动子，编码多个与Fc区C末端连接的表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴，其中所述结合域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和本领域所知的另一表位结合域。
B.2.编码具有N末端表位结合域的多肽链的载体
在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图1A(小图a、b、d、e和f))。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的多个scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图2A(小图a、d、e和f))。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端连接的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的多个单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端连接的单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的抗体可变区(如重链和/或轻链可变区)的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图3A(小图a和c))。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的多个抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端连接的抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端的多个本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端连接的本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，载体包含启动子，编码多个与Fc区N末端连接的表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴，其中所述结合域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和本领域已知的另一表位结合域。
B.3.编码具有N末端和C末端表位结合域的多肽链的载体
本发明还涵盖包含启动子和一个或多个同时连接于Fc区N末端和C末端的表位结合域以及聚A尾巴的表达载体。在一个实施方式中，表达载体包含：(a)启动子；(b)编码至少一个连接于N末端的表位结合域和至少一个连接于C末端的表位结合域的多核苷酸序列，以及(c)聚A尾巴，其中每一表位结合域选自抗体可变区、scFv、单链双抗体或其它本领域所知的表位结合域。在另一实施方式中，将相同类型的表位结合域(如scFv)与Fc区的N末端和C末端连接。在另一实施方式中，不同类型的表位结合域与Fc区的N末端和C末端连接。例如，但不限于，可将一个或多个scFv连接于N末端，将一个或多个单链双抗体连接于C末端，或将一个或多个scFv以及一个或多个单链双抗体连接于N末端和C末端。
在一个具体的实施方式中，表达载体包含启动子，编码至少一个连接于Fc区N末端和C末端的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图1A(小图a和b)，图2A(小图a和b))。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端和C末端的多个scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见例如图2A(小图a))。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端连接的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码至少一个连接于Fc区N末端和C末端的单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端和C末端的多个单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端连接的单链双抗体的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码至少一个连接于Fc区N末端和C末端的抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端和C末端的多个抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端连接的抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在另一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端和C末端的本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个实施方式中，载体包含启动子，编码连接于Fc区N末端和C末端的多个本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端连接的本领域已知表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，载体包含启动子，编码多个与Fc区N末端和C末端连接的表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴，其中所述结合域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和另一本领域所知的表位结合域。
B.4.编码本发明多肽链的载体的具体实施方式
在一个实施方式中，本发明载体包含启动子，编码三个连接于Fc区的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。在一个实施方式中，本发明载体包含启动子，编码三个连接于Fc区的scFv、从N末端至C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv的多核苷酸序列以及聚A尾巴(参见图1A(小图a))。在另一实施方式中，本发明载体包含启动子，编码四个连接于Fc区的scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，本发明载体包含启动子，编码四个连接于Fc区的scFv、从N末端至C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图2A(小图a))。在另一实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于Fc区的抗体可变区和两个scFv的多核苷酸序列以及聚A尾巴。在另一具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于抗体可变区、两个scFv和Fc区，排列为：抗体可变区-Fc区-scFv-scFv的多核苷酸序列以及聚A尾巴(参见图3A(小图a和c))。在另一实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于Fc区的两个抗体可变区和两个scFv的多核苷酸序列以及聚A尾巴。在一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于Fc区的两个抗体可变区和两个scFv、从N末端至C末端排列为：抗体可变区-抗体可变区-Fc区-scFv-scFv的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4A(小图a和c))。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于Fc区的抗体可变区和两个scFv、从N末端至C末端排列为：scFv-抗体可变区-Fc区-scFv的多核苷酸序列以及聚A尾巴(参见图4K(小图a))。
在另一实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于Cκ/λ区的两个抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。在一个具体的实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于Cκ/λ区的两个抗体轻链可变结构域、从N末端至C末端取向如下：VL1-Cκ/λ-VL2，的多核苷酸序列以及聚A尾巴(参见图2C小图A).在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于Cκ/λ区的抗体可变区和两个scFv，从N末端至C末端取向如下：scFv-VL1-Cκ/λ-scFv的多核苷酸序列以及聚A尾巴(参见图5C(小图b))。
在另一实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于CH1区的两个抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于CH1区的两个抗体重链可变结构域、从N末端至C末端排列为：VH1-CH1-VH2的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图2C小图b)。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码连接于CH1区的抗体可变区和两个scFv、从N末端至C末端排列为：scFv-VH1-CH1-scFv的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图5C小图a)。
在另一实施方式中，本发明载体包含启动子，编码侧接CH1区、Cκ/λ或Fc区的两个抗体可变区的多核苷酸序列。在一些实施方式中，抗体可变结构域是重链可变结构域和/或轻链可变结构域。在一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码两个抗体重链抗体可变结构域、两个CH1结构域和Fc区，从N末端至C末端排列为：VH2-第一CH1-VH1-第二CH1-Fc区的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4M小图A)。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码两个抗体轻链可变结构域(VL)和两个Cκ/λ区，从N末端至C末端排列为：VL2-第一Cκ/λ-VL1-第二Cκ/λ的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4M小图B)。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码VL结构域、Cκ/λ、VH结构域、CH1结构域和Fc区，从N末端至C末端排列为：VL-Cκ/λ-VH-CH1-Fc区的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4O小图A)。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码VH结构域、CH1结构域、VL结构域和Cκ/λ结构域，从N末端至C末端排列为：VH-CH1-VL-Cκ/λ的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4O小图b)。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码两个抗体轻链可变结构域、两个Cκ/λ区和Fc区，从N末端至C末端排列为：VL-Cκ/λ-VL-Cκ/λ-Fc区的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4Q小图A)。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码两个抗体重链可变结构域和2个CH1结构域，从N末端至C末端排列为：VH2-CH1-VH1-CH1的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4Q小图b)。在另一个具体实施方式中，本发明载体编码抗体轻链可变结构域、Cκ/λ、抗体重链、CH1和Fc区，从N末端至C末端排列为：VL-Cκ/λ-VH-CH1-Fc区的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4S小图A)。在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码抗体重链可变结构域、CH1、抗体轻链可变结构域和Cκ/λ，从N末端至C末端排列为：VH-CH1-VL-Cκ/λ的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4S小图b)。
在其它具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码抗体轻链可变结构域和Cκ/λ，从N末端到C末端排列为：VL-Cκ/λ的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4M，小图c和d；图4O，小图d；以及图4S，小图d)。在另一具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码抗体重链可变结构域和CH1，从N末端到C末端排列为：VH-CH1的多核苷酸序列，以及聚A尾巴(参见图4O，小图c；图4Q，小图c；以及图4S，小图c和图4U，小图b)。
在另一个具体实施方式中，本发明载体包含启动子，编码抗体轻链可变结构域、Cκ/λ和Fc区，从N末端至C末端排列为：VL-Cκ/λ-Fc区的多核苷酸序列以及聚A尾巴(参见图4U小图a)。
在一些实施方式中，本发明载体不是2001年3月20日提交的PCT公开号WO 01/77342图5中展现的那些载体。
C.多特异性表位结合蛋白-两条链
下文描述的是含有两条多肽链的本发明多特异性表位结合蛋白的组装和取向。
在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含本发明的第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域连接的Fc区。本发明的多肽链包含的表位结合域可为scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域所知表位结合域。可将Fc区和表位结合域以多种不同取向连接在一起(参见前述章节A)。在一个实施方式中，表位结合域与Fc区的C末端连接。在另一个实施方式中，表位结合域与Fc区的N末端连接。在另一个实施方式中，表位结合域与Fc区的N末端和C末端连接。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含本发明的第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域连接的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个Fc区。在一个实施方式中，表位结合域与至少一个Fc区的C末端连接。在另一个实施方式中，表位结合域与至少一个Fc区的N末端连接。在另一个实施方式中，表位结合域与至少一个Fc区的N末端和C末端连接。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白不包含Fc区。在本发明的此类蛋白质中，表位结合域与CH1结构域和/或Cκ/λ结构域的N末端、C末端或N和C末端连接。应当理解的是在下文中术语Fc区可被CH1结构域和/或Cκ/λ替换以涵盖本发明中不包含Fc区的蛋白质。在另一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含本发明的第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域连接的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个CH1和/或Cκ/λFc区。在一个实施方式中，表位结合域与至少一个CH1和/或Cκ/λ区的C末端连接。在其它实施方式中，表位结合域与至少一个CH1和/或Cκ/λ区的N末端连接。在其它实施方式中，表位结合域与至少一个CH1和/或Cκ/λ区的N末端和C末端连接。
C.1.具有与Fc区C末端连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含Fc区。在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区C末端连接的scFv(参见例如图1B)。在另一实施方式中，第一条和/或第二条多肽链包含多个与Fc区C末端连接的scFv(参见例如图2B)。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白包含的第一条和/或第二条链具有与Fc区C末端连接的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个scFv。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区C末端连接的单链双抗体(参见例如图3F)。在另一实施方式中，第一条和/或第二条多肽链包含多个与Fc区C末端连接的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白包含的第一条和/或第二条链具有与Fc区C末端连接的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个单链双抗体。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Fc区C末端连接的抗体可变区。在另一实施方式中，第一条和/或第二条多肽链包含与Fc区C末端连接的多个抗体可变区。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区C末端相连接的抗体可变区的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Fc区C末端连接的本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含多个与Fc区C末端相连接的本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有与Fc区C末端连接的至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个本领域已知表位结合域的第一和/或第二条链，其中所述结构域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和本领域已知的其它表位结合域。
C.2.具有与Fc区N末端相连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含Fc区。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端连接的scFv(参见如图1A(小图b))。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端相连接的多个scFv(参见例如图1A(小图a和c))。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端相连接的scFv的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端连接的单链双抗体。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端相连接的多个单链双抗体。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端相连接的单链双抗体的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端连接的抗体可变区(参见例如图3B)。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端相连接的多个抗体可变区(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端相连接的抗体可变区的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端相连接的本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含多个与Fc区N末端相连接的本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端相连接的本领域已知表位结合域的第一和/或第二条链，其中所述结构域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和其它本领域已知的表位结合域。
C.3.具有与Fc区N末端或C末端相连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含Fc区。在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端或C末端相连接的scFv。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端或C末端相连接的多个scFv。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端或C末端相连接的scFv的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端或C末端相连接的单链双抗体。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端或C末端相连接的多个单链双抗体。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端或C末端相连接的单链双抗体的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端或C末端相连接的抗体可变区。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端或C末端相连接的多个抗体可变区。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端或C末端相连接的抗体可变区的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端或C末端相连接的本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含多个与Fc区N末端或C末端相连接的本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端或C末端相连接的本领域已知表位结合域的第一和/或第二条链，其中所述结构域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和其它本领域已知的表位结合域。
C.4.具有与Fc区N末端和C末端相连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含Fc区。在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端和C末端相连接的scFv(参见如图1B)。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端和C末端相连接的多个scFv(参见如图2B)。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端相连接的scFv的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端和C末端相连接的单链双抗体。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含多个与Fc区N末端和C末端相连接的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端相连接的单链双抗体的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端和C末端相连接的抗体可变区。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含与Fc区N末端和C末端相连接的多个抗体可变区。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端相连接的抗体可变区的第一和/或第二条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条链包含与Fc区N末端和C末端相连接的本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含多个与Fc区N末端和C末端相连接的本领域已知表位结合域。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与Fc区N末端和C末端相连接的本领域已知表位结合域的第一和/或第二条链，其中所述结构域选自：抗体可变区、scFv、单链双抗体和其它本领域已知的表位结合域。
多特异性表位结合蛋白的组装
在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，每条链包含Fc区。在另一实施方式中，第一和/或第二条多肽链包含任何表位结合域，包括scFv、单链双抗体、抗体可变区和任何本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含通过Fc区二聚化的第一和第二条多肽链。在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和第二条多肽链氨基酸序列不同。在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和第二条多肽链氨基酸序列相同。在另一实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白是异源二聚体。在另一实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白是同源二聚体。
具体实施方式-两条链
在一个实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含Fc区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Fc区连接的三个scFv。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条多肽链包含三个与Fc区相连的scFv，从N末端至C末端排列为scFv-scFv-Fc区-scFv(参见图1B)或反之亦然。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含四个与Fc区连接的scFv。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一和第二条多肽链，其中第一和/或第二条多肽链包含与Fc区连接的四个scFv，从N末端至C末端排列为scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv(参见图2B)或反之亦然(C末端至N末端scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv)。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含Cκ/λ区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含两个与Cκ/λ区连接的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含两个与Cκ/λ区连接的抗体可变区，从N末端到C末端排列为：VL1-Cκ/λ-VL2(参见图2D)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区和两个scFv。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区和两个scFv，从N末端到C末端排列为：scFv-VL1-Cκ/λ-scFv(参见图5C)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和/或第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含两个与CH1连接的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和/或第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含两个与CH1连接的抗体可变区，从N末端到C末端排列为：VH1-CH1-VH2(参见图2D)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与CH1区连接的抗体可变区和两个scFv。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一条和第二条多肽链，其中第一条和/或第二条多肽链包含与CH1区连接的抗体可变区和两个scFv，从N末端到C末端排列为：scFv-VH1-CH1-scFv(参见图5C)。
D.多特异性表位结合蛋白-4条链
本发明提供了含有四条多肽链的多特异性表位结合蛋白，分别命名为第一链、第二链、第三链和第四链(下文中总称为“本发明的多肽链”，参见例如，图3B、3D、3F、4B和5B)。如本文所示，当为本发明的四条链多特异性表位结合蛋白时，四条链中的两条包含上述章节所述的Fc区；然而，四条中的两条不包含Fc区。因此，四条链中的两条可包含章节A所述的本发明多肽，而两条可为下文所公开的多肽。
D.1.Cκ/λ区
本发明的多特异性表位结合蛋白还可包括来自抗体恒定区的Cκ/λ区。蛋白质内Cκ/λ区的取向可不同。在一个实施方式中，本发明的多肽链包含任何取向的Cκ/λ区和其它组件(例如scFv、单链双抗体、抗体可变区等)。
在一个实施方式中，本发明的多肽链包含抗体的Cκ/λ区。在一个实施方式中，本发明的多肽链包含与表位结合域融合的Cκ/λ区。在一个实施方式中，Cκ/λ区与scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合蛋白融合。在另一实施方式中，本发明的多肽链包含与Cκ/λ区N末端连接的表位结合域。在另一实施方式中，多个表位结合域与Cκ/λ区N末端连接。在又一实施方式中，本发明的多肽链包含与Cκ/λ区N末端连接的多个scFv、单链双抗体、抗体可变区和/或其它本领域已知的表位结合域。
a.含Cκ/λ区多肽链的编码载体
本发明也提供用于产生或表达含Cκ/λ结构域的本发明多肽链(如上所述)的多核苷酸载体。在一个实施方式中，本发明的多肽链表达自含有启动子、编码含Cκ/λ的表位结合多肽链的多核苷酸序列和聚A尾巴的载体。在一个实施方式中，表达载体包含启动子，编码含有与Cκ/λ区连接的表位结合域的表位结合多肽链的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码与Cκ/λ区连接的scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知的表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码与Cκ/λ区N末端连接的scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知的表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。在另一实施方式中，表达载体包含启动子，编码与Cκ/λ区N末端连接的多个scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知的表位结合域的多核苷酸序列和聚A尾巴。
在一个具体实施方式中，本发明表达载体包含启动子，编码与Cκ/λ区N末端连接的抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见如图3A(小图b和d)。在一个具体实施方式中，本发明的表达载体包含启动子，编码与Cκ/λ结构域N末端连接的两个抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见如图4A(小图b和d)。在一个具体实施方式中，本发明的表达载体包含启动子，编码与Cκ/λ区N末端连接的两个scFv的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见如图5A(小图a)。
在另一具体实施方式中，本发明的表达载体包含启动子，编码与Cκ/λ区N末端连接的scFv和抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见如图4C(小图b)。在另一具体实施方式中，本发明的表达载体包含启动子，编码与CH1区N末端连接的抗体可变区的多核苷酸序列和聚A尾巴(参见如图4C(小图a)。
D.2.多特异性表位结合蛋白-4条链
下文描述包含四条多肽链的本发明多特异性表位结合蛋白的组装和取向。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一、和/或第二、和/或第三、和/或第四条多肽链，其中第一、和/或第二、和/或第三、和/或第四条多肽链包含与1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合域相连接的CH1和Fc区(也统称作“CH1/Fc区”)或Cκ/λ区。本发明的蛋白质包含的表位结合域可为scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域所知的表位结合域。
在一个实施方式中，可以多种不同取向将CH1/Fc区或Cκ/λ区和表位结合域连接起来。在一个实施方式中，可将表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区的C末端相连接。在另一实施方式中，可将表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区的N末端相连接。在另一实施方式中，可将表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区的N末端或C末端相连接。在另一实施方式中，可将表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区的N末端和C末端相连接。
在其它实施方式中，包含四条链的多特异性表位结合蛋白Fc区不与CH1结构域连接。在其它实施方式中，包含四条链的多特异性表位结合蛋白Fc区不与Cλ/κ区连接。
D.3.反向抗体
在其它实施方式中，本发明提供包含“抗体样”链的反向抗体(下文中称作(“反向抗体”或“本发明反向抗体蛋白”)。本发明的反向抗体包含至少四条链，其中至少两条链为“重链样”链且至少两条链为“轻链样”链。应当理解，形成本发明反向抗体的多肽链在本文中有时称作“本发明的反向抗体多肽链”并且属于本发明的多肽链类型。
在一些实施方式中，本发明的重链样多肽链可包含至少一个抗体轻链可变区和至少一个Cκ/λ区。在其它实施方式中，本发明的重链样链包含至少一个或多个与Cκ/λ结构域串连的抗体轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本发明的重链样多肽链可包含至少一个或多个Fc区。在一些实施方式中，本发明的重链样多肽链包含全部或部分绞链区。在其它实施方式中，本发明的重链样多肽链还可包括本文所述其它表位结合域。
在一些实施方式中，本发明的轻链样多肽链可包含至少一个抗体重链可变区和至少一个CH1结构域。在一些实施方式中，本发明的轻链样链还至少包含另外一个与CH1结构域串连的抗体重链可变区，或至少包含另外一个与Cκ/λ区串连的抗体轻链可变结构域。在一些实施方式中，本发明的轻链样多肽链可包含全部或部分绞链区。在其它实施方式中，本发明的轻链样多肽链还可包括本文所述其它表位结合域。
反向抗体由抗体重链样链和轻链样链形成，上述链结合后使重链样链的抗体可变结构域与轻链样链的抗体可变结构域接近从而形成功能性表位结合位点。例如，来自抗体重链样链的VL结构域与来自抗体轻链样链的VH结构域形成功能性的结合位点(参见例如，图4U)。在一些实施方式中，通过二硫键将轻链样链连接于反向抗体的重链样链。在其它实施方式中，来自一条链的抗体可变区与另一条链形成链间二硫键。在另一实施方式中，来自轻链样链的抗体可变区与重链样链形成链间二硫键。在另一实施方式中，来自重链样链的抗体可变区与轻链样链形成链间二硫键。
D.4.具有与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端相连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的scFv(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的多个scFv(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的scFv。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的多个单链双抗体(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的单链双抗体。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的抗体可变结构域。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的抗体可变区。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的本领域已知的表位结合蛋白。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端连接的本领域所知表位结合域的第一、第二、第三或第四条链，其中所述表位结合域选自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知的表位结合域。
D.5.具有与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端相连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的scFv(参见如图5B)。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的多个scFv(参见如图5B)。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的scFv。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的单链双抗体。在另一实施方式中，多个单链双抗体与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的单链双抗体。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的抗体可变结构域。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的抗体可变区。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的本领域已知的表位结合蛋白。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三和第四条链，这些链具有多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端连接的本领域所知表位结合域的第一、第二、第三或第四条链，其中表位结合域选自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知的表位结合域。
D.6.具有与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端相连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中一条链还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的scFv(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的多个scFv(参见如图5B)。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的scFv的第一、第二、第三和第四条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的单链双抗体。在另一实施方式中，多个单链双抗体与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的多个单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的单链双抗体的第一、第二、第三和第四条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的抗体可变结构域(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的抗体可变区的第一、第二、第三和第四条链(参见如图4B)。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的抗体可变区的第一、第二、第三和第四条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的本领域已知的表位结合蛋白。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的本领域已知的表位结合域的第一、第二、第三或第四条链。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端或C末端连接的表位结合域的第一、第二、第三或第四条链，其中所述结构域选自抗体可变区、scFv、单链双抗体、其它本领域已知的表位结合域。
D.7.具有与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端相连接的表位结合域的多特异性表位结合蛋白
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的scFv。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的多个scFv。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的scFv的第一、第二、第三和第四条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的多个单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的单链双抗体的第一、第二、第三和第四条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的抗体可变结构域。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有多个与CH1/Fc区和Cκ/λ区N末端和C末端连接的抗体可变区的第一、第二、第三和第四条链。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白至少包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的抗体可变区的第一、第二、第三和第四条链。
在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，其中第一、第二、第三和第四条多肽链至少还包含与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的本领域已知的表位结合蛋白。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白包含具有多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的本领域已知的表位结合域的第一、第二、第三和第四条链。在另一实施方式中，本发明的表位结合蛋白包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端和C末端连接的本领域所知表位结合域的第一、第二、第三或第四条链，其中所述结构域选自scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域。
D.8.四链多特异性表位结合蛋白的组装
在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含四条链，每一条链包含CH1/Fc区或Cκ/λ区。在另一实施方式中，每一条多肽链包含任何表位结合域，包括scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知任何表位结合域。在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含含有CH1/Fc区或Cκ/λ区形成的二聚体的四条链。在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白包含两条或多条不同的多肽链。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可包含两条或多条多肽链的多聚体。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含由CH1/Fc区或Cκ/λ区二聚化形成的两条相同链。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含四条链，两条由Fc区二聚化而成，两条由CH1和Cκ/λ区二聚化而成。
D.9.四链多特异性表位结合蛋白的具体实施方式
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条多肽链，所述第一条链含有与CH1/Fc区连接的抗体可变区和两个scFv，所述第二条链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，所述第一条链包含与CH1/Fc区连接的抗体可变区和两个scFv，从N末端至C末端为：抗体可变区-CH1/Fc区-scFv-scFv，所述第二条链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区(参见图3B)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条多肽链，所述第一条链含有与CH1/Fc区连接的抗体可变区和单链双抗体，所述第二条链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，所述第一条链包含与CH1/Fc区连接的抗体可变区和单链双抗体，从N末端至C末端为：抗体可变区-CH1/Fc区-单链双抗体，所述第二条链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区(参见图3F)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条多肽链，所述第一条链含有与CH1/Fc区连接的两个抗体可变区和两个scFv，所述第二条链包含与Cκ/λ区连接的两个抗体可变区。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，所述第一条链包含与CH1/Fc区连接的两个抗体可变区和两个scFv，从N末端至C末端为：抗体可变区-抗体可变区-CH1/Fc区-scFv-scFv，所述第二条链包含两个抗体可变区和Cκ/λ区，从N末端到C末端为：抗体可变区-抗体-可变区-Cκ/λ(参见图4B)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条多肽链，所述第一条链含有与CH1区连接的两个scFv，所述第二条链包含与Cκ/λ连接的两个scFv。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一、第二、第三和第四条多肽链，所述第一条链包含与CH1区连接的两个scFv，从N末端至C末端为：scFv-scFv-CH1，所述第二条链包含两个与Cκ/λ区连接的scFv，从N末端至C末端为：scFv-scFv-Cκ/λ(参见图5B)。
在一个具体的实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条多肽链，所述第一条链含有与CH1/Fc区连接的两个抗体可变区，所述第二条链包含与Cκ/λ区连接的两个抗体可变区。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条多肽链，所述第一条链包含与Cκ/λ区连接的scFv和抗体可变区，从N末端至C末端取向为：scFv-抗体可变区-Cκ/λ，所述第二条链包含与CH1/Fc区连接的抗体可变区，从N末端至C末端取向为：抗体可变区-CH1/Fc区(参见图4D)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条链，所述第一条链包含与CH1区连接的scFv和抗体可变区，从N末端至C末端取向为：scFv-抗体可变区-CH1区，所述第二条链包含与Cκ/λ区连接的抗体可变区，从N末端至C末端取向为：抗体可变区-Cκ/λ区(参见图4F)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条链，所述第一条链包含与Cκ/λ区连接的scFv和抗体可变区，从下列N末端至C末端取向为：scFv-抗体可变区-Cκ/λ，所述第二条链包含与CH1/Fc区连接的三个scFv和抗体可变区，从N末端至C末端取向为：scFv-抗体可变区-CH1/Fc区-scFv-scFv(参见图4J)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条链，所述第一条链包含与Cκ/λ区连接的scFv和抗体可变区，从N末端至C末端取向为：scFv-抗体可变区-Cκ/λ，所述第二条链包含与CH1/Fc区连接的两个scFv和抗体可变区，从N末端至C末端取向为：scFv-抗体可变区-CH1/Fc区-scFv(参见图4K)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条链，所述第一条链包含两个抗体轻链可变区和两个Cκ/λ区，从N末端至C末端取向为：抗体可变区(VL2)-第一Cκ/λ-抗体可变区(VL1)-第二Cκ/λ，所述第二条链包含两个抗体重链可变区、两个CH1和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体可变区(VH2)-第一CH1-抗体可变区(VH1)-第二CH1-Fc区(参见图4N)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条链，所述第一条链包含抗体重链可变区、CH1、抗体轻链可变区和Cκ/λ，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区(VH2)-CH1-抗体轻链可变区(VL1)-Cκ/λ，所述第二条链包含抗体轻链可变区、Cκ/λ、抗体重链可变区、CH1和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL2)-Cκ/λ-抗体重链可变区(VH1)-CH1-Fc区(参见图4P)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条链，所述第一条链包含两个抗体重链可变区和两个CH1结构域，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区(VH2)-CH1-抗体可变区(VH1)-CH1，所述第二条链包含两个抗体轻链可变区、两个Cκ/λ区和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL2)-Cκ/λ-抗体轻链可变区(VL1)-Cκ/λ-Fc区(参见图4R)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三或第四条链，所述第一条链包含抗体重链可变区、CH1、抗体轻链可变区和Cκ/λ，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区(VH2)-CH1-抗体轻链可变区(VL1)-Cκ/λ，并且第二条链包含抗体轻链可变区、Cκ/λ、抗体重链可变区、CH1和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL2)-Cκ/λ-抗体重链可变区(VH1)-CH1-Fc区(参见图4T)。
在其它实施方式中，本发明也包括至少包含第一、第二、第三或第四条多肽链的反向抗体，所述第一条链包含抗体重链可变区和CH1结构域，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区-CH1，并且第二条链包含抗体轻链可变区、Cκ/λ和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区-Cκ/λ-Fc区(参见图4V)。
在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合多肽包括本申请任何附图中的结构形式。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包括本申请任何附图中的结构形式。在一些实施方式中，本发明的载体包括本申请任何附图中的形式。
D.10.六链多特异性表位结合蛋白的组装
下文描述含六条多肽链的本发明的多特异性表位结合蛋白的组装和取向。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六条多肽链，其中第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五和/或第六条多肽链包含与1、2、3、4、5、6、7、8或更多表位结合域连接的CH1和Fc区(本文也统称作“CH1/Fc区”)，或Cκ/λ区。本发明的蛋白质包含的表位结合域可为scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的其它表位结合域。
在一个实施方式中，可以许多不同取向将CH1/Fc区或Cκ/λ区和表位结合域连接在一起。在一个实施方式中，表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区C末端相连接。在另一实施方式中，表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区N末端相连接。在另一实施方式中，表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区的N末端或C末端相连接。在另一实施方式中，表位结合域与CH1/Fc区或Cκ/λ区的N末端和C末端相连接。
在其它实施方式中，包含四条链的多特异性表位结合蛋白的Fc区不与CH1结构域相连。在其它实施方式中，包含六条链的多特异性表位结合蛋白的Fc区不与Cκ/λ区相连。
D.11.六链多特异性表位结合蛋白的具体实施方式
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三、第四、第五或第六条链，所述第一条链包含抗体轻链可变区和Cκ/λ区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL2)-Cκ/λ，所述第二条链包含抗体轻链可变区和Cκ/λ，从N末端至C末端的取向为：抗体轻链可变区(VL1)-Cκ/λ，所述第三条链包含两个抗体重链可变区、两个CH1和Fc区，从N末端至C末端的取向为：抗体可变区(VH2)-第一CH1-抗体可变区(VH1)-第二CH1-Fc区(参见图4M和N)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三、第四、第五、或第六条链，所述第一条链包含抗体重链可变区和CH1，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区(VH2)-CH1，所述第二条链包含抗体轻链可变区和Cκ/λ，从N末端至C末端的取向为：抗体轻链可变区(VL1)-Cκ/λ，所述第三条链包含抗体轻链可变区、Cκ/λ、抗体重链可变区、CH1和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL2)-Cκ/λ-抗体重链可变区(VH1)-CH1-Fc区(参见图4O和P)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三、第四、第五或第六条链，所述第一条链包含抗体可变重链区和CH1，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区(VH2)-CH1，所述第二条链包含抗体重链可变区和CH1，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区(VH1)-CH1，所述第三条链包含两个抗体轻链可变区、两个Cκ/λ区和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL2)-Cκ/λ-抗体轻链可变区(VL1)-Cκ/λ-Fc区(参见图4Q和R)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白至少包含第一、第二、第三、第四、第五或第六条链，所述第一条链包含抗体重链可变区和CH1，从N末端至C末端取向为：抗体重链可变区(VH2)-CH1，所述第二条链包含抗体轻链可变区和Cκ/λ，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL1)-Cκ/λ，所述第三条链包含抗体轻链可变区、Cκ/λ、抗体重链可变区、CH1和Fc区，从N末端至C末端取向为：抗体轻链可变区(VL2)-Cκ/λ-抗体重链可变区(VH1)-CH1-Fc区(参见图4S和T)。
2001年3月20日提交的PCT公开号WO 01/77342描述了包含与IgG1分子连接的Fab结构域的单特异性多价抗体。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白不包含与IgG1分子连接的Fab结构域。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白不包含N末端与Fc区连接的Fab。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个或多个与IgG1分子连接的Fab结构域。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白不包含与IgG1分子连接的相同Fab。在其它实施方式中，多特异性表位不包含与IgG1分子连接的Fab，其中所述Fab包含与所述IgG1分子相同的抗体可变区。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个与IgG1分子连接的Fab，其中所述Fab和IgG1不具有相同的结合特异性。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个C末端与IgG1分子Fc区连接的Fab。在一些实施方式中，本发明的蛋白质不是2001年3月20日提交的PCT公开号WO 01/77342的图4中的蛋白质。
E.多特异性表位结合蛋白组装体的具体实施方式
在一些实施方式中，本发明的蛋白质包含至少一个来自下列抗体的表位结合域，或与来自下列抗体的表位结合域竞争结合的表位结合域：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿巴西普(abatacept)(也称作)、阿昔单抗(也称为
Figure GPA00001010429400632
c7E3Fab)、阿达木单抗(也称为
Figure GPA00001010429400633
)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿来组单抗(也称为
Figure GPA00001010429400641
MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿纳莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿尼莫单抗(anetumumab)、安如珠单抗(anrukizumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿利珠单抗(atlizumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、巴平珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(也称为
Figure GPA00001010429400642
)、巴妥昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)(也称为
Figure GPA00001010429400643
)、贝利木单(belimumab)(也称为LYMPHO-STAT-
Figure GPA00001010429400644
)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝斯理单抗(besilesomab)、贝伐单抗(也称为
Figure GPA00001010429400645
)、比西单抗溴烯比妥(biciromab brallobarbital)、比伐单抗美登素(bivatuzumab mertansine)、坎帕斯(campath)、卡纳努单抗(canakinumab)(也称为ACZ885)、坎妥珠单抗美登素(cantuzumab mertansine)、卡罗单抗(capromab)(也称为
Figure GPA00001010429400646
)、卡图玛索单抗(catumaxomab)(也称为
Figure GPA00001010429400647
)、西利珠单抗(cedelizumab)(也称为
Figure GPA00001010429400648
)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(也称为艾比特斯)、克立昔单抗、达塞珠单抗(dacetuzumab)、达昔单抗(dacliximab)、达珠单抗(也称为)、德诺苏单抗(denosumab)(也称为AMG 162)、地莫单抗(detumomab)、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、多利珠单抗(dorlixizumab)、杜土木单抗(duntumumab)、杜立木单抗(durimulumab)、德木鲁单抗(durmulumab)、爱罗昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(也称为)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(也称为Mab17-1A，
Figure GPA000010104294006412
)、依法利珠单抗(efalizumab)(也称为
Figure GPA000010104294006413
)、依芬古单抗(efungumab)(也称为
Figure GPA000010104294006414
)、艾思莫单抗(elsilimomab)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依法利珠单抗(efalizumab)、依匹莫单抗(epitumomab)、依帕珠单抗、厄利珠单抗(erlizumab)、艾土马单抗(ertumaxomab)(也称为
Figure GPA000010104294006415
)、依那西普(也称为
Figure GPA000010104294006416
)、伊塔木单抗(etaracizumab)(也称为伊塔珠单抗(etaratuzumab)，维他辛
Figure GPA000010104294006417
ABEGRINTM)、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗锝(fanolesomab)(也称为)、法拉莫单抗(faralimomab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)(也称为
Figure GPA000010104294006419
)、加利昔单抗、甘特如单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)(也称为ABX-
Figure GPA000010104294006420
)、吉姆单抗奥佐米星(也称为
Figure GPA00001010429400651
)、戈利木单抗(也称为CNTO 148)、高米昔单抗(gomiliximab)、伊巴丽珠单抗(ibalizumab)(也称为TNX-355)、替伊莫单抗(也称为)、伊戈伏单抗(igovomab)、英西单抗(imciromab)、英夫利昔单抗(也称为)、伊诺莫单抗(inolimomab)、因诺珠单抗(inotuzumab)、奥佐米星、伊皮木单抗(ipilimumab)(也称为MDX-010，MDX-101)、伊拉土木单抗(iratumumab)、凯利昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗、来马索单抗(lemalesomab)、乐利珠单抗(lebrilizumab)、乐德木单抗(lerdelimumab)、来沙木单抗(lexatumumab)(也称作HGS-ETR2、ETR2-ST01)、莱西木单抗(lexitumumab)、利韦单抗(libivirumab)、林妥珠单抗、卢卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗，马巴木单抗(mapatumumab)(也称为HGS-ETR1，TRM-1)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(也称为EMD72000)、美泊利单抗(也称为)、美替木单抗(metelimumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维珠单抗(也称为NUMAXTM)、莫罗单抗(也称为OKT3)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)、纳普莫单抗(naptumomab estafenatox)、那他珠单抗(也称为
Figure GPA00001010429400655
)、奈巴库单抗(nebacumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(也称为THERACIM
Figure GPA00001010429400656
THERA-CIM-
Figure GPA00001010429400657
)、诺非单抗(nofetumomab merpentan)(也称为
Figure GPA00001010429400658
)、奥克利珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥伐木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(也称为)、奥戈伏单抗(也称为
Figure GPA000010104294006510
)、奥利昔珠单抗(otelixizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕丽珠单抗(也称为)、帕木单抗(也称为ABX-EGF，
Figure GPA000010104294006512
)、帕考珠单抗(pascolizumab)、喷托莫单抗(pemtumomab)(也称为
Figure GPA000010104294006513
)、培妥珠单抗(也称为2C4，
Figure GPA000010104294006514
)、培克珠单抗、平妥单抗(pintumomab)、普立昔单抗(priliximab)、普林木单抗(pritumumab)、雷珠单抗(也称为)、拉西库单抗(raxibacumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(也称为利妥昔)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、司韦单抗(sevirumab)、西罗珠单抗、西利珠单抗(也称为MEDI-507)、森图珠单抗(sontuzumab)、司他莫鲁(stamulumab)(也称为MYO-029)、硫索单抗(sulesomab)(也称为
Figure GPA00001010429400661
)、他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、塔道珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、泰普利莫单抗(taplitumomabpaptox)、太妃珠单抗(tefibazumab)(也称为)、阿替莫单抗(telimomabaritox)、替奈昔单抗(teneliximab)、泰利珠单抗(teplizumab)、替昔木单抗(ticilimumab)、托珠单抗(也称为
Figure GPA00001010429400663
)、托利珠单抗(toralizumab)、托西莫单抗、曲妥珠单抗(也称为贺赛汀
Figure GPA00001010429400664
)、托眉力木单抗(tremelimumab)(也称为CP-675,206)、托库珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌斯克努单抗(ustekinumab)(也称为CNTO 1275)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维西珠单抗(也称为
Figure GPA00001010429400665
)、伏罗昔单抗(volociximab)(也称为M200)、伏妥莫单抗(votumumab)(也称为
Figure GPA00001010429400666
)、扎卢木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(也称为HuMAX-CD4)、齐拉木单抗(ziralimumab)或阿佐莫单抗(zolimomabaritox)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个表位结合域，包括2005年2月11日提交的美国专利申请公开号20050215767、2004年11月26日提交的美国专利申请公开号20080014141(各自全文纳入本文作参考)公开的表位结合蛋白。
在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个与上文所列抗体结合相同抗原的表位结合域。
在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个与选自下组的抗原特异性结合的表位结合域：PDGFRα、PDGFRβ、PDGF、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C.VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FGF、FGF2、HGF、KDR、flt-1、FLK-1、Ang-2、Ang-1、PLGF、CEA、CXCL13、Baff、IL-21、CCL21、TNF-α、CXCL12、SDF-1、bFGF、MAC-1、IL23p19、FPR、IGFBP4、CXCR3、TLR4、CXCR2、EphA2、EphA4、EphrinB2、EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)、HER4(ErbB4或tyro2)、SC1、LRP5、LRP6、RAGE、Nav1.7、GLP1、RSV、RSV F蛋白、流感HA蛋白、流感NA蛋白、HMGB1、CD16、CD19、CD20、CD21、CD28、CD32、CD32b、CD64、CD79、CD22、ICAM-1、FGFR1、FGFR2、HDGF、EphB4、GITR、β-淀粉样蛋白、hMPV、PIV-1、PIV-2、OX40L、IGFBP3、cMet、PD-1、PLGF、肾溶素(Neprolysin)、CTD、IL-18、IL-6、CXCL-13、IL-1R1、IL-15、IL-4R、IgE、PAI-1、NGF、EphA2、CEA、uPARt、DLL-4、αvβ6、α5β1、I型和II型干扰素受体、CD19、ICOS、IL-17、因子II、Hsp90、IGF、CD19、GM-CSFR、PIV-3、CMV、IL-13、IL-9和EBV。
在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个与TNF超家族成员(受体或配体)特异性结合的表位结合域。各种分子包括但不限于：肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(″TNF-β″)、淋巴毒素-α(“LT-α”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、4-1BB配体、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也成作TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、骨保护素(OPG)、APRIL、RANK配体(也称作TRANCE)、TALL-1(也称作BlyS、BAFF或THANK)、DR4、DR5(也称为Apo-2、TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER)、DR6、DcR1、DcR2、DcR3(也称为TR6或M68)、CAR1、HVEM(也称为ATAR或TR2)、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、TNFL1、CD30、LTBr、4-1BB受体和TR9。
在另一实施方式中，本发明的结合蛋白能结合选自下组的一种或多种靶点：5T4、ABL、ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、Aggrecan、AGR2、AICDA、AIFI、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、芳香酶、ATX、AX1、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、B7-H1、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCR、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、BIyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDF1O)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(网蛋白)、BRCA1、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCLI1(嗜酸性粒细胞趋化蛋白)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、离去蛋白-2(exodus-2)、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化蛋白-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化蛋白-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CD1C、CD20、CD200、CD-22、CD24、CD28、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD137、CDH1(E-钙粘着蛋白)、CDH1O、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wapl/Cipl)、CDKN1B(p27Kipl)、CDKN1C、CDKN2A(pl6INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、壳多糖酶、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(密蛋白-7)、CLN3、CLU(簇蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COL18A1、COL1A1、COL4A3、COL6A1、CR2、畸胎癌生长因子(Cripto)、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTL8、CTNNB1(b-联蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYD1)、CX3CR 1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL1O(IP-IO)、CXCLI1(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、CYSLTR1、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、ENO1、ENO2、ENO3、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRIN-A3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRIN-B3、EPHB4、EPG、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、雌激素受体、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、法尼基转移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF1O、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FIL1(E)、FBL1(Z)、FLJ 12584、FLJ25530、FLRT1(纤连蛋白)、FLT1、FLT-3、FOS、FOSL1(FRA-I)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR1O)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC1O(C1O)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、Hedgehog、HGF、HIF1A、HIP1、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、DL-I、IL1O、IL1ORA、IL1ORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、IL-1RA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、1L16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、ILIA、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、DL1F9、IL1HY1、IL1R1、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2、IL1RN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、IL4R、IL6ST(糖蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAKI、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(α6整联蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(β4整联蛋白)、JAG1、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KITLG、KLF5(GCBoxBP)、KLF6、KLK1O、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦激素)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR 16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MCP-1、MDK、MIB1、肝素结合细胞因子、MIF、MISRII、MJP-2、MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫因(metallothionectin)-UI)、mTOR、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经粘蛋白、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、NOX5、NPPB、NROB1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZ1、OPRD1、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、peg-天冬酰胺酶、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸粘蛋白、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDC1、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配体、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI1O(ZNF144)、Ron、ROBO2、RXR、S100A2、SCGB1D2(嗜脂蛋白
Figure GPA00001010429400701
SCGB2A1(乳腺球蛋白2)、SCGB2A2(乳腺球蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(马斯平(maspin))、SERPINE1(PAI-I)、SERPINF1、SHIP-1、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STAB1、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP1O、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR1O、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFI1A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF1O(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶IIa)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、酪氨酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多能聚糖、VHLC5、VLA-4、Wnt-1、XCL1(淋巴细胞趋化蛋白)、XCL2(SCM-Ib)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、YY1和ZFPM2。
F.本发明的多特异性表位结合蛋白的结合特征
b.结合特异性
本发明提供了含有多个结合位点的表位结合蛋白。本发明的蛋白质包含含有多个表位结合位点的2-4条多肽链。多个表位结合位点包含来自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合域的结合域。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有相同结合特异性的scFv(参见如图1A小图f)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有不同结合特异性的scFv(参见如图1A小图a)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv，所述scFv与该蛋白内的其它scFv具有相同的结合特异性(参见如图1A小图e)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有相同结合特异性的scFv。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有不同结合特异性的scFv。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv，所述scFv对该蛋白内其它scFv所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个scFv，所述scFv对该蛋白内另一scFv所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有相同结合特异性的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有不同结合特异性的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含单链双抗体，所述单链双抗体可与该蛋白内其它单链双抗体具有相同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有相同结合特异性的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有不同结合特异性的单链双抗体。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含单链双抗体，所述单链双抗体对该蛋白内其它单链双抗体所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个单链双抗体，所述单链双抗体对该蛋白内另一单链双抗体所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有相同结合特异性的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有不同结合特异性的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含抗体可变区，所述抗体可变区可与该蛋白内其它抗体可变区具有相同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有相同结合特异性的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有不同结合特异性的抗体可变区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含抗体可变区，所述抗体可变区对该蛋白内其它抗体可变区所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个抗体可变区，所述抗体可变区对该蛋白内另一抗体可变区所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有相同结合特异性的本领域已知表位结合区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有不同结合特异性的本领域已知表位结合区。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含本领域已知表位结合区，所述表位结合区可与该蛋白内本领域所知其它表位结合区具有相同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含本领域所知的表位结合区，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合区具有相同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含本领域已知表位结合区，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合区具有不同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含本领域已知的表位结合区，所述表位结合区对该蛋白质内本领域所知的其它表位结合区所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位结合区，所述表位结合区对该蛋白内本领域已知的另一表位结合区所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含选自下组的一种以上类型的表位结合域：scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有相同结合特异性的不同表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含具有不同结合特异性的不同表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域，它们对该蛋白内其它scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域具有相同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有相同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个具有不同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域，它们对该蛋白内其它scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域，它们对该蛋白内另外的scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域所针对的相同抗原的另一表位具有特异性。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含能够同时与表位结合的scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含能够同时与表位结合、但具有不同的结合特异性的scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域，。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含能够同时与表位结合的scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域，它们可对该蛋白内的其它scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域具有相同或不同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位被同时结合。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含能够依次与表位结合的scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含能够同时与表位结合、但具有不同结合特异性的scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含能够依次与表位结合的scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知的表位结合域，它们可与该蛋白内其它scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域具有相同或不同的结合特异性。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含scFv、单链双抗体、抗体可变区或本领域已知表位结合域，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个表位被依次结合。为了达到不同的表位结合域依次结合抗原的目的，一种方法是调节表位结合域对特定抗原的亲和和/或解离常数。可通过已知本领域所接受的技术调节亲和和/或解离常数值。这些亲和/解离常数经调节的结构域可显示以下章节列出的数值。
F.1.多特异性表位结合蛋白的亲和力
本发明的表位结合蛋白对其一种或多种关联抗原可具有高结合亲和力。例如，本文所述的表位结合蛋白的结合速率常数或k结合速率(表位结合蛋白(EBP)+抗原-＞EBP-Ag)可以为至少2X105M-1s-1、至少5X105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5X106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5X107M-1s-1或至少108M-1s-1。
在另一实施方式中，表位结合蛋白的k解离速率(EBP-Ag-＞EBP+Ag)小于5x10-1s-1、小于10-1s-1、小于5x10-2s-1、小于10-2s-1、小于5x10-3s-1、小于10-3s-1、小于5x10-4s-1或小于10-4s-1.。在另一实施方式中，本发明表位结合蛋白的k解离小于5x10-5s-1、小于10-5s-1、小于5x10-6s-1、小于10-6s-1、小于5x10-7s-1、小于10-7s-1、小于5x10-8s-1、小于10-8s-1、小于5x10-9s-1、小于10-9s-1或小于10-10s-1。
在另一实施方式中，表位结合蛋白的亲和常数或Ka(k结合/k解离)可以是至少102M-1、至少5X102M-1、至少103M-1、至少5X103M-1、至少104M-1、至少5X104M-1、至少105M-1、至少5X105M-1、至少106M-1、至少5X106M-1、至少107M-1、至少5X107M-1、至少108M-1、至少5X108M-1、至少109M-1、至少5X109M-1、至少1010M-1、至少5X1010M-1、至少1011M-1、至少5X1011M-1、至少1012M-1、至少5X1012M-1、至少1013M-1、至少5X1013M-1、至少1014M-1、至少5X1014M-1、至少1015M-1或至少5X1015M-1。在又一实施方式中，表位结合蛋白的解离常数或Kd(k解离/k结合)可能小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M、小于5x10-10M、小于10-10M、小于5x10-11M、小于10-11M、小于5x10-12M、小于10-12M、小于5x10-13M、小于10-13M、小于5x10-14M、小于10-14M、小于5x10-15M或小于10-15M。
通过本文所述方法或本领域熟练技术人员所知方法(如BIAcore实验、ELISA)(瑞典乌普萨拉Biacore国际公司)(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)进行评价，本文所述方法使用的表位结合蛋白的解离常数(Kd)可能小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM。在一个具体实施方式中，利用本文所述方法或本领域熟练技术人员所知方法(如BIAcore实验、ELISA)评价，本文所述方法使用的表位结合蛋白的解离常数(Kd)可以是25-3400pM、25-3000pM、25-2500pM、25-2000pM、25-1500pM、25-1000pM、25-750pM、25-500pM、25-250pM、25-100pM、25-75pM、25-50pM。在另一实施方式中，利用本文所述方法或本领域熟练技术人员所知方法(如BIAcore实验、ELISA)评价，本文所述方法使用的表位结合蛋白的解离常数(Kd)为500pM、100pM、75pM或50pM。
F.2.多特异性表位结合蛋白的相对结合亲和力
应当理解，本发明提供携带多个表位结合域的蛋白质，它以类似于分离态所示功能的方式保留蛋白质内的功能(即与独立表达或分离的结构域相比，作为多特异性表位结合蛋白一部分的表位结合域显示相似的特性)。例如，对表位Y特异性的分离scFv显示特异性功能概况，包括结合亲和力、激动或拮抗功能。应当理解的是与分离的scFv相比，作为本发明多特异性表位结合蛋白内结合域表达的相同scFv应具有相似的结合亲和力和/或激动或拮抗特性。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含来自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合域的表位结合域，其结合亲和力低于来自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合域的相同的分离(不含多特异性蛋白的其它组分)表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含来自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合域的表位结合域，其结合亲和力高于来自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合域的相同的分离(不含多特异性蛋白的其它组分)表位结合域。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含来自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合域的表位结合域，其结合亲和力与来自scFv、单链双抗体、抗体可变区或其它本领域已知表位结合域的相同的分离(不含多特异性蛋白的其它组分)表位结合域基本相同。
可通过本领域多种技术对结合亲和力进行常规测定，如ELISA、BiaCoreTM、KinExATM、细胞表面受体结合、结合实验的竞争性抑制。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白的结合亲和力可通过实施例10中所示技术测定。在另一实施方式中，通过实施例10中所示技术测定，与功能性分离结合域相比，多特异性表位结合蛋白对特定表位的结合亲和力较低。在另一实施方式中，通过实施例10中所示技术测定，与功能性分离结合域相比，多特异性表位结合蛋白对特定表位的结合亲和力较高。在另一实施方式中，通过实施例10中所示技术测定，多特异性表位结合蛋白对特定表位的结合亲和力与功能性分离结合域相似。
在一个实施方式中，通过本领域已知任何实验测量，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力低99％、低95％、低90％、低80％、低70％、低60％、低50％、低40％、低30％、低20％或低10％。在另一实施方式中，通过实施例10所示技术测定，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力低99％、低95％、低90％、低80％、低70％、低60％、低50％、低40％、低30％、低20％或低10％。
在另一实施方式中，通过本领域已知任何实验测量，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力高99％、高95％、高90％、高80％、高70％、高60％、高50％、高40％、高30％、高20％或高10％。在另一实施方式中，通过实施例10所示技术测定，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力高99％、高95％、高90％、高80％、高70％、高60％、高50％、高40％、高30％、高20％或高10％。
可通过本领域多种技术对结合亲和力进行常规测定，如ELISA、BiaCoreTM、KinExATM、细胞表面受体结合、结合实验的竞争性抑制。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白的表位结合域的结合亲和力可通过实施例13-20中所示技术进行测定。在另一实施方式中，通过实施例13-20所示技术测定，与分离的相同功能性表位结合域相比，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力较低。在另一实施方式中，通过实施例13-20所示技术测定，与分离的相同功能性表位结合域相比，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力较高。在另一实施方式中，通过实施例13-20所示技术测定，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力与分离的相同功能性表位结合域相似。
在另一实施方式中，通过本领域已知任何实验测量，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力低99％、低95％、低90％、低80％、低70％、低60％、低50％、低40％、低30％、低20％或低10％。在另一实施方式中，通过实施例13-20所示技术测定，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力低99％、低95％、低90％、低80％、低70％、低60％、低50％、低40％、低30％、低20％或低10％。
在另一实施方式中，通过本领域已知任何实验测量，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力高99％、高95％、高90％、高80％、高70％、高60％、高50％、高40％、高30％、高20％或高10％。在另一实施方式中，通过实施例13-20所示技术测定，多特异性表位结合蛋白的表位结合域对特定表位的结合亲和力比分离的相同功能性表位结合域的亲和力高99％、高95％、高90％、高80％、高70％、高60％、高50％、高40％、高30％、高20％或高10％。
在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含三个scFv，其中最靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，第二靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，第三靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力。
在另一具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含四个scFv，其中最靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，第二靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，第三靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，第四靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力。
在另一具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合多肽链包含与抗体链相连的两个scFv，其中所述抗体与表位结合的结合亲和力以分离的相同功能性抗体相似，最靠近N末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，第二靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力。
在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含两条多肽链，其中第一条链包含两个scFv，最靠近N末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，第二靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，并且第二条链包含两个scFv，其中最靠近N末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力，其中第二靠近N-末端的scFv与分离的相同功能性scFv相比具有较低的表位结合亲和力。
在另一具体的实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含由两个抗体可变区形成的两个表位结合位点，其中第一个抗原可变区与表位结合的亲和力小于分离的相同功能性抗原可变区，并且第二个抗原可变区与表位结合的亲和力小于分离的相同功能性抗原可变区。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合并抑制细胞表面的不同受体(例如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合并抑制至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种不同的细胞表面受体(例如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合并活化细胞表面的不同受体(例如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合并活化至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种不同的细胞表面受体(例如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合细胞表面的不同受体，并活化或抑制所述受体(例如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合并活化或抑制至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种不同的细胞表面受体(例如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白能够同时结合细胞表面的不同受体(例如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合和中和不同的可溶性配体(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合和/或中和至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种不同的可溶性配体(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可同时选择性结合不同的可溶性配体(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。
在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合和抑制不同的靶蛋白(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合和抑制至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种不同靶蛋白(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合和活化不同靶蛋白。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合和活化至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种靶不同蛋白(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合不同靶蛋白，并活化或抑制所述靶蛋白(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可选择性结合并活化或抑制至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种不同靶蛋白(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可以同时选择性结合不同的靶蛋白(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)。
G.本发明多特异性表位结合蛋白的应用及制剂
本发明还提供使用本发明多特异性表位结合蛋白的方法。本发明还包括将本发明的多特异性表位结合蛋白单独使用或与其它疗法联用，以预防、诊断、控制、治疗或改善与疾病、疾病失调或紊乱，包括但不限于癌症、炎性疾病和自身免疫病相关的一种或多种症状。本发明还包括将与某部分(如治疗剂或药物)偶联或融合的本发明多特异性表位结合蛋白单独使用或与其它疗法联用，以预防、控制、治疗或改善与疾病、失调或感染，包括但不限于癌症、炎性疾病和自身免疫病相关的一种或多种症状。
许多细胞类型表达多种常见的细胞表面抗原，这是区别特定细胞亚组的专有抗原组合。使用本发明的多特异性表位结合蛋白，可靶向特定的细胞亚组而不与其它无关细胞群交叉反应。此外，本发明的多特异性表位结合蛋白可能包含一种至多种(2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)与非靶细胞群上出现的细胞表面抗原结合的表位结合域，然而，表位结合域集合的组合亲合力提供与靶细胞群的有效水平的结合(即治疗有效水平的结合)。换言之，数种表位结合域参与促进对特定细胞类型的靶向，而无法通过独立分离结构域(例如，从该多特异性蛋白分离的结构域)的结合达到该目的，也无法通过暴露于相同细胞的一种或多种但非全部(即子集)表位结合域(对照肽)但不作为多特异性蛋白质的一部分而达到该目的。可想象的是，可调节每一表位结合域的相对亲合力贡献以便仅靶向感兴趣的特定细胞群。可通过本领域接受的技术进行此类亲和力的改变，如亲和成熟、定点诱变和其它本领域所知方法。同时考虑到也可通过改变在多特异性表位结合蛋白中所述表位结合域的相对取向，使每一表位结合域的相对亲合力贡献发生改变。
因此，在一个实施方式中，本文提供了使用本发明的多特异性表位结合蛋白鉴定、消耗、调节(如活化、抑制)细胞群(如哺乳动物(如人)体内和/或体外)的方法。在一个特定实施方式中，当给予哺乳动物(如人)时本发明的多特异性表位结合蛋白不显著结合正常组织(如非癌组织或非疾病组织，即非靶组织)。避免对非靶组织的显著结合可避免或最大程度降低对一种或多种非靶细胞群的消耗、调节(活化、抑制)。在一些实施方式中，与“对照表位结合蛋白”相比本发明的多特异性表位结合蛋白在体外或给予哺乳动物(如人)时对靶细胞群的亲合力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍，所述“对照表位结合蛋白”包含一种或多种但非全部(即子集)分离自所述多特异性表位结合蛋白的表位结合域。在一些实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白所显示的亲合力比所述“对照表位结合蛋白”增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少150％。
在一些实施方式中，与包含一种或多种但非全部(即子集)分离自所述多特异性表位结合蛋白的表位结合域的对照表位结合蛋白相比，本发明的多特异性表位结合蛋白对特定抗原的亲合力增加。在一些实施方式中，与所述对照表位结合蛋白相比，本发明特异性表位结合蛋白的亲合力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍，至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、或至少25倍。在一些实施方式中，本发明多特异性表位结合蛋白的亲合力比所述对照表位结合蛋白增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少150％。
在其它实施方式中，与对照表位结合蛋白(例如但不限于抗体、其它多特异性表位结合蛋白、scFv或单链双抗体)相比，在体外或给予哺乳动物(如人)时，包含X个表位结合域的本发明多特异性表位结合蛋白(其中X为1-20的正整数)对特定抗原的亲合力增加，其中所述对照表位结合蛋白包含X-Y(其中X和Y是1-20的任何正整数，并且X大于Y)个表位结合域，其中对照表位结合域蛋白中至少一个表位结合域对本发明蛋白质中出现的表位结合域所针对的相同表位具有特异性。换言之，与对照表位结合蛋白相比，本发明提供对特定靶点亲合力增加的多特异性表位结合蛋白，其中所述对照表位结合蛋白具有更多或更少的表位结合域，至少一个表位结合域对本发明蛋白质所针对的相同抗原具有特异性。
此类多特异性表位结合蛋白的亲合力改变能降低此类治疗性蛋白在动物中的毒性(例如，章节E“多特异性表位结合组装体的具体实施方式”中所列任何抗体的组合)。应当理解，本发明的蛋白质可展现“定制”的亲合力和/或亲和力以降低体内毒性。同样，本发明还提供与对照表位结合蛋白相比在动物中毒性较低的本发明多特异性表位结合蛋白。应当理解，本发明还提供通过本文所述方法降低本发明蛋白质毒性的方法。
应当理解，可通过简单可行的体外方法评价亲合力的改变，如功能性实验(包括但不限于细胞因子表达/释放/结合、基因表达、形态学改变、趋化性、钙流等)、用对照表位结合域蛋白和BIAcore或KinExa测定结合。在一些实施方式中，对照表位结合蛋白可包含来自本发明蛋白质的表位结合域的子集。在其它实施方式中，对照表位结合蛋白可包含至少一个或多个来自本发明多特异性表位结合蛋白的分离表位结合域。例如，对于有8个表位结合域的本发明的蛋白质，对照表位结合蛋白可包含1、2、3、4、5、6、7个表位结合域，其中至少一个表位结合域对本发明蛋白质和对照蛋白质识别的抗原具有特异性。在其它实施方式中，对照表位结合蛋白包含对分离表位结合域和本发明蛋白质均能识别的抗原具有特异性的分离表位结合域。
在一个实施方式中，使用本发明的多特异性表位结合蛋白以具体鉴定、消耗、活化、抑制或靶向通过多种细胞表面抗原的表达限定的中和细胞。在另一实施方式中，本发明关注使用本发明蛋白质纯化表达该蛋白质内多种表位结合位点识别的多种抗原的细胞。同样，本发明的方法包括调节多特异性表位结合蛋白内的每一单独表位结合域的相对亲合力贡献。
在一些实施方式中，用于鉴定、消耗、活化、抑制或靶向中和细胞的本发明方法不显著消耗、活化或抑制非靶细胞群。在此类实施方式中，给予本发明蛋白质不显示大于治疗本身所实现益处的消极后果。此类消极后果可包括但不限于：与非靶组织结合、毒性增加、病理性消耗细胞、感染的风险增加等。通过实施使用本发明多特异性表位结合蛋白的疗法也可尽量减少传统表位结合域(包括但不限于抗体、scFv、单链双抗体等)疗法中出现消极后果。
同样，应当理解在肿瘤进展过程中，癌细胞差异表达细胞表面分子。例如，肿瘤细胞在良性状态下可表达某细胞表面抗原，一旦转移则下调该特定细胞表面抗原。应当理解的是该过程可能在多种不同的肿瘤类型中发生。同样，可以想象将本发明多特异性表位结合蛋白设计为包含可靶向多个不同癌症进展阶段的此类肿瘤细胞的表位结合域。换言之，本发明多特异性表位结合蛋白可用于靶向某肿瘤细胞类型，而无关乎其进展阶段。本发明的多特异性表位结合蛋白可包含可结合肿瘤不同进展阶段所表达的特定肿瘤细胞表面抗原的多个表位结合域。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含对于可同时或不同时呈现的肿瘤细胞表面抗原具有特异性的表位结合域。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个肿瘤细胞表面抗原特异性表位结合域，其中所述抗原可不同时呈现于肿瘤细胞表面。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个肿瘤表面抗原特异性表位结合域，其中至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8个肿瘤细胞表面抗原由所述蛋白质接合，引发诸如效应功能、内化、中和等反应。
在其它实施方式中，本发明提供将多种细胞表面抗原表达所限定的细胞类型消耗、杀伤、中和和/或掩蔽的方法。此类细胞类型包括但不限于T细胞(如细胞毒性、记忆和NK细胞)、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、干细胞(如癌症干细胞)和巨噬细胞。
以有效产生所需疗效并减少副作用的量使用本发明的多特异性表位结合蛋白。细胞因子风暴是可能致死的免疫反应，包括由(例如)免疫系统与病原体抗争时引起的细胞因子和免疫细胞之间的正反馈环。细胞因子风暴(高细胞因子血症)是健康有力的免疫系统的全身表现，导致多于150种炎症介导因子(细胞因子、氧自由基和凝血因子)的释放。经历细胞因子风暴的病人血清中促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、白介素-1和白介素-6)和抗炎细胞因子(如白介素10和白介素1受体拮抗剂)均升高。细胞因子风暴可发生于数种感染性和非感染性疾病中，包括移植物抗宿主病(GVHD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症、禽流感、天花、中风、变态反应(超敏)、心脏停搏、中毒性休克综合征和全身性炎症反应综合征(SIRS)。传统的小分子或生物治疗也可诱导细胞因子风暴。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白通过抑制/拮抗/中和和/或消耗释放的细胞因子，可用于预防、控制、抑制和/或改善细胞因子风暴。此类多特异性表位结合蛋白可包含至少一个对细胞因子风暴中出现的细胞因子具有特异性的表位结合域。此类蛋白可代表治疗病人中多种细胞因子升高的单药疗法。在其它实施方式中，此类蛋白及其制剂可以预防性方式给药以预防或抑制细胞因子风暴。在其它实施方式中，将此类蛋白及其制剂给予需要的病人，如正在经历细胞因子风暴的病人。在其它实施方式中，可将本发明的多特异性表位结合蛋白与基于OX40的疗法(OX40-Ig，Ox40配体)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂(ARB)、皮质类固醇、NSAIDS和/或自由基清除剂(抗氧化剂)联合给予需要的病人。在其它实施方式中，与给予本发明蛋白前或不给予本发明蛋白相比，本发明的多特异性表位结合蛋白可将哺乳动物(如人、或非人灵长类)中的细胞因子风暴抑制、拮抗、抑制和/或中和至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。
在其它实施方式中，多特异性表位结合蛋白可用于靶向特定抗原的降解产物。已了解β-淀粉样蛋白水解为各种片段，这些片段被认为是引起疾病进展的致病物质。本发明的多特异性表位结合蛋白可用于减少降解产物的各种片段，如β-淀粉样蛋白片段。本发明的蛋白质可通过使每一片段接触至少一种特异性表位结合域而移除各种片段。在另外一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白还可包含至少一个EBD，该EBD仅对修饰后暴露的表位，例如切割产物具有特异性。本发明的蛋白质可用于抑制阻抑、抑制、拮抗或中和此类隐蔽表位。
同样，亚基交联的结果是使许多细胞表面受体活化或失活。本发明的蛋白质可通过使细胞表面受体交联而刺激或抑制靶细胞中的反应。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于阻断抗原与多个细胞表面受体的相互作用。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于增强抗原与多个细胞表面受体的相互作用。在另一实施例中，可利用含对相同抗原具有特异性的结合域的本发明多特异性表位结合蛋白使细胞表面受体的同源二聚体交联。在另一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于使亚基或异源多聚受体(例如，但不限于异源二聚受体)交联。在其它实施方式中，本发明的蛋白质通过与至少两种不同抗原结合，可拮抗、抑制或阻抑异源多聚体的形成。在其它实施方式中，本发明的蛋白质通过使蛋白质内出现的多个表位结合域与多聚受体的不同蛋白质组件相互作用，可用于靶向、激动、拮抗、阻抑和/或刺激多聚受体。
在另一实施方式中，本发明的蛋白质可用于将配体或配体类似物递送至特定细胞表面受体。在一些实施方式中，本发明的蛋白质可用于增加受体上出现的配体的化学计量。这种情况下，本发明的多特异性表位结合蛋白通过多个与特定配体结合的表位结合域可能递呈一种以上配体同种型。在其它实施方式中，本发明的蛋白质通过多个表位结合域与配体的相互作用，可协调一种或多种配体与受体适当地连接。
本发明也提供靶向传统抗体难以靶向的表位的方法。例如，在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于首先靶向相邻抗原，结合后另一结合域可连接隐蔽抗原。
本发明还提供使用多个表位结合域靶向不出现于细胞表面的表位的方法。应当理解，本发明的蛋白质可用于将表位结合域递送至细胞内部。使用至少一种对细胞表面抗原具有特异性的表位结合域，可直接(通过将结合抗原内化)或间接(通过本发明蛋白质上出现透膜序列结构(即细胞内抗体))靶向本发明的蛋白质。此种情况下，可能使用本发明的蛋白质靶向胞内靶点。
本发明还提供了结合、拮抗、阻抑和/或中和循环可溶性抗原(如，哺乳动物(如人)体内和/或体外)的方法。此类抗原包括各种细胞因子、炎症介导物、激素、清蛋白、维生素、甘油三酯、小分子药物等。可以想象的是本发明的蛋白质可包含对多种不同可溶性配体具有特异性的表位结合域。在一些实施方式中，本发明的蛋白质可用于结合、中和和/或阻抑多种给予病人的药物的方法，以控制特定相互作用或影响。在一些实施方式中，本发明的蛋白质可延长或缩短循环可溶性抗原的半衰期。在其它实施方式中，本发明的蛋白质对循环可溶性抗原的半衰期没有影响。
本发明的蛋白质也可用于清除个体循环中的不良物质。例如，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于结合并靶向清除选自下组的物质：病原体、细胞因子、炎症介导物、激素、清蛋白、维生素、甘油三酯和小分子药物等。
本发明还提供使用本发明的蛋白质降低与一种或多种抗体或抗体片段(或任何肽)的治疗相关的治疗诱导毒性的方法。例如，当同时给予两种多肽时产生毒性(或当它们在体内相互作用时给予)，可工程改造本发明多特异性蛋白质内单独蛋白的结合特性，从而避免与此类相互作用有关的毒性。在一些实施方式中，使用本发明方法降低毒性包括用本发明蛋白质靶向单独疗法的相同抗原。在一些实施方式中，本发明蛋白质包含与单独疗法相同的表位结合域。在其它实施方式中，本发明蛋白质包含指向与单独疗法相同的表位和/或抗原的表位结合域。在一些实施方式中，与基于一种或多种抗体和/或抗体片段的疗法相关的毒性相比，本发明方法使与基于一种或多种抗体和/或抗体片段的疗法相关的毒性(例如，章节E“多特异性表位结合组装体的具体实施方式”中所列任何抗体的组合)降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。
本发明还提供了使用多特异性表位结合蛋白汇集不同细胞类型的方法。在一个实施方式中，本发明的蛋白质可通过一个结合域与靶细胞结合，通过另一结合域征集另一种细胞。在另一实施方式中，第一种细胞可以是癌细胞，第二种细胞是免疫效应细胞，如NK细胞。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于增强两种不同细胞，如抗原递呈细胞和T细胞的相互作用，可能加强免疫应答。
本发明还提供了使用多特异性表位结合蛋白改善、治疗或预防癌症或其症状的方法。在一个实施方式中，本发明的方法可用于治疗头、颈、眼、口、喉、食道、胸、皮肤、骨、肺、结肠、直肠、结直肠、胃、脾、肾、骨骼肌、皮下组织、转移性黑素瘤、子宫内膜、前列腺、乳腺、卵巢、睾丸、甲状腺、血液、淋巴结、肾、肝、胰腺、脑或中枢神经系统的癌症。本发明方法可预防、控制、治疗或改善的癌症的例子包括但不限于：头、颈、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、乳腺、卵巢、肾、肝、胰腺和脑的癌症。其它癌症包括但不限于：白血病包括但不限于急性白血病，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病如成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病性白血病和骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于冒烟型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病，重链病，骨癌和结缔组织肉瘤，包括但不限于骨肉瘤、骨髓瘤骨病、多发性骨髓瘤、胆脂瘤诱导的骨肉瘤、佩吉特骨病、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、脉管肉瘤(血管肉瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于，胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非胶质细胞肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和原发性脑淋巴瘤；乳腺癌包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液性乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特病(包括青少年佩吉特病)及炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤及肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺癌和未分化甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于，胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素、活性肠肽瘤、生长抑素分泌瘤、类癌瘤或胰岛细胞瘤；垂体肿瘤例如但不限于欣氏症、泌乳素分泌瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌例如但不仅限于，如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外阴癌如鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤以及佩吉特病；子宫颈癌例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌例如但不仅限于卵巢表皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质肿瘤；食道癌例如不仅限于鳞状细胞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌例如但不限于腺癌、蕈伞型癌(息肉)、溃疡、表面扩散、弥漫扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和肉瘤、结肠癌、直肠癌；肝癌，例如但不限于如肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌如胆管癌如但不限于乳头状，结节状和播散的；肺癌，如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(上皮细胞癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，例如但不限于生发瘤、精原细胞瘤、未分化、经典(典型)、精母细胞性、非精细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌等，例如但不仅限于腺癌、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，例如但不仅限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌包括但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状；皮肤癌包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、表面扩散性黑素瘤、结节性黑色素瘤，恶性黑色素瘤痣、肢端多雀斑黑色素瘤；肾脏包括但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤癌症、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；肾母细胞瘤；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨源性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、表皮肉瘤、囊腺癌、支气管源性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(关于此类失调的综述，参见Fishman等，1985，《医学》(Medicine)，第二版，费城JB林可公司(J.B.Lippincott Co.，Philadelphia)，以及Murphy等，1997，《知情决定：癌症诊断、治疗和康复全书》(Informed Decisions：The Complete Book of Cancer Diagnosis，Treatment，and Recovery)，维金皮金，皮金图书美国公司，美国(Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，inc.，United States ofAmerica)。还考虑到，也可利用本发明方法和组合物治疗凋亡异常引起的癌症。这类癌症可包括但不限于：滤泡淋巴瘤，p53突变的癌症，激素依赖性的乳腺肿瘤、前列腺肿瘤和卵巢肿瘤，以及癌前病变，如家族性腺瘤性息肉病和骨髓发育异常综合征。本发明还提供了使用多特异性表位结合蛋白消耗某细胞群的方法。在一个实施方式中，本发明的方法用于消耗下列细胞类型：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞、癌症干细胞和肿瘤细胞。
本发明还提供使用多特异性表位结合蛋白失活、抑制或消耗细胞因子的方法。在一个实施方式中，本发明的方法用于失活、抑制或消耗至少一种下列细胞因子：TGF-β、TNF-α、C5a、fMLP、白三烯A4和B4，前列腺素D、E和F、血栓烷A2、干扰素α(包括亚型1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17和21)、干扰素β、干扰素ω、干扰素γ、白介素IL-1-33、CCL1-28、CXCL1-17和CX3CL1。
本发明还提供使用多特异性表位结合蛋白作为合成受体的方法。可将至少一种或多种表位结合域工程改造以结合各种分子，例如但不限于药物分子、成像试剂或其它用作这类分子的受体的分子。例如，对细胞群(例如但不限于癌细胞)具有特异性的多特异性表位结合蛋白可结合细胞表面抗原，并为小分子药物提供了特异性靶向细胞群的平台。该方法可引起靶位点药物浓度的升高。由于降低了药物的全身剂量，本方法还可以降低对于正常组织的毒性。本方法允许改变药物/药剂的药效学概况和治疗窗口。在一些实施方式中，可在给予多特异性表位结合蛋白之前、同时或之后给予药剂。
本发明还提供使用本发明的蛋白质降低接触选自下组的一种或多种物质在哺乳动物(如人或非人灵长类)中引发的毒性的方法：相思豆毒蛋白、马钱子碱、毒芹素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺菌毒素、内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇(falcarinol)、α毒素、格尔德霉素、白树毒素、百脉根苷、蓖麻毒蛋白、番木鳖硷、蛇毒毒素和河豚毒素。
在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可利用本文所述的一种或多种应用以完成所需任务。例如，本发明的多特异性表位结合蛋白可阻断受体二聚化并同时中和关联抗原。例如，本发明的多特异性表位结合蛋白可包含至少一个针对IFNAR1受体的表位，从而阻断其活性所需的二聚化，同时使用至少一个其它表位结合域结合并中和与IFNAR1结合的可溶性干扰素α亚型。同样，本发明蛋白质提供了通过给予针对不同相互作用特性的多个表位结合域从而进行多种任务的方法。
本发明也提供了使用多特异性表位结合蛋白作为体内(如当给予哺乳动物，例如人时)或体外(例如用于病人来源的样品)诊断试剂的方法。多种结合特异性可用于需要同时有效捕获不同抗原的试剂盒或试剂。同样，在一些实施方式中，本发明提供了使用本发明蛋白质从溶液中检测和/或纯化至少一种可溶性化合物的方法。在一些实施方式中，此类溶液可为体液、细胞培养基、发酵培养液、生物样品、自来水。体液包括例如血液、汗液、淋巴、尿液、泪液、胆汁、唾液、血清、羊水，耳垢(耳蜡)、考珀液、精液、乳糜、钟液(chime)、脑脊液、粪便、粪便水、胰液、滑膜液、房水、组织间液、乳汁、黏液、胸膜液、脓、皮脂和呕吐物。
本发明蛋白质及包含它的组合物可用作多种目的，例如，用作治疗多种慢性或急性疾病和失调的治疗剂，这些疾病和失调包括但不限于：自身免疫病和/或炎性疾病，包括舍格伦综合征、类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病性和其它视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、老年黄斑变性、新生血管青光眼、血管瘤、甲状腺增生(包括格拉夫斯病)、角膜和其它组织移植和慢性炎症、败血症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩病、再灌注损伤、败血症、内毒素休克、囊性纤维化病、心内膜炎、牛皮癣、关节炎(如，牛皮癣性关节炎)、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、脊髓损伤和同种异体移植排斥。自身免疫病和/或炎性疾病的其他例子包括但不仅限于，斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、舍格伦综合征综合征、牛皮癣、动脉硬化、糖尿病性和其他视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼、血管瘤、甲状腺增生(包括格拉夫斯病)、角膜和其他组织移植、慢性炎症、败血症、类风湿关节炎、腹膜炎、克罗恩病、再灌注损伤、败血症、内毒素休克、囊肿性纤维化、心内膜炎、牛皮癣、关节炎(如牛皮癣性关节炎)、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、脊髓损伤和同种异体移植物排斥反应、自身免疫性血小板减少症、贝切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施二氏综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格拉夫斯病、格林巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、青少年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔氏症、混合型结缔组织病、多发性硬化症、I型或免疫介导糖尿病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺现象、赖特尔综合征、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮、红斑狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如皮炎疱疹样血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。炎性疾病的例子包括但不限于：哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性疾病、感染性休克、肺纤维化、未分化脊椎关节病变、未分化关节病、关节炎、骨溶解炎症和慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。本发明的组合物和方法可与一种或多种用于预防、控制或治疗上述疾病的常规疗法一起使用。
在一个实施方式中，本发明包含能够治疗慢性炎症的组合物。在一个实施方式中，本发明组合物可用于靶向免疫细胞以便破坏和使其失活。在一个实施方式中，该组合物可用于靶向活化T细胞、休眠T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或巨噬细胞。在另一实施方式中，本发明包含能够降低免疫细胞功能的组合物。在另一实施方式中，组合物能够消除免疫细胞的功能。
T细胞在细胞介导的免疫中扮有核心角色，是一类细胞的集合，包括辅助、细胞毒性、记忆和NK T细胞。辅助T细胞一旦被活化，就迅速分裂并分泌调节免疫应答的细胞因子。在一个实施方式中，本发明包含能够抑制辅助T细胞分裂和/或增殖的组合物。在一些实施方式中，与未处理的活化辅助T细胞相比，本发明的组合物能够将辅助T细胞的分裂和/或增殖降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在另一实施方式中，与未处理的活化辅助T细胞相比，本发明的组合物能够将辅助T细胞的分裂和/或增殖降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。在另一实施方式中，本发明的组合物可以抑制或减少活化辅助T细胞产生和/或分泌的细胞因子。在一些实施方式中，与未处理的活化辅助T细胞相比，本发明的组合物能够将辅助T细胞产生和/或分泌细胞因子抑制和/或降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在另一实施方式中，与未处理的活化辅助T细胞相比，本发明的组合物能够将辅助T细胞产生和/或分泌的细胞因子抑制和/或降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
细胞毒性T细胞能够诱导如肿瘤细胞或病毒或其它病原体感染的细胞的细胞死亡。一旦被活化后，细胞毒性T细胞在IL-2细胞因子的帮助下进行克隆扩增。同样，一旦被活化，细胞毒性T细胞释放细胞毒素、穿孔蛋白和颗粒溶素帮助破坏靶细胞。在一个实施方式中，本发明包含能够抑制细胞毒性T细胞分裂和/或增殖的组合物。在一些实施方式中，与未处理的活化细胞毒性T细胞相比，本发明的组合物能够将细胞毒性T细胞的分裂和/或增殖降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在另一实施方式中，与为处理的活化细胞毒性T细胞相比，本发明的组合物能够将细胞毒性T细胞的分裂和/或增殖降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。在另一实施方式中，本发明的组合物可以抑制或减少活化辅助T细胞产生和/或分泌的细胞毒素。在一些实施方式中，与未处理的活化细胞毒性T细胞相比，本发明的组合物能够将细胞毒性T细胞产生和/或分泌细胞毒素抑制和/或降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在另一实施方式中，与未处理的活化细胞毒性T细胞相比，本发明的组合物能够将活化T细胞的产生和/或分泌细胞毒素抑制和/或降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。在另一实施方式中，细胞毒素选自穿孔蛋白或颗粒溶素。在另一实施方式中，减少穿孔蛋白的产生和/或分泌。在另一实施方式中，减少颗粒溶素的产生和/或分泌。在另一实施方式中，减少穿孔蛋白和/或颗粒溶素的产生和/或分泌。
记忆T细胞代表一类可以识别外来入侵物，如在先前感染或疫苗接种中遭遇的细菌和病毒的T细胞。在第二次遭遇入侵物时，记忆T细胞可以增殖以产生比首次遭遇时更快更强的免疫应答。记忆T细胞产生并分泌刺激免疫应答的细胞因子。在一些实施方式中，与未处理的活化细胞记忆T细胞相比，本发明的组合物能够将记忆T细胞的分裂和/或增殖降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在另一实施方式中，与未处理的活化记忆T细胞相比，本发明的组合物能够将记忆T细胞的分裂和/或增殖降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。在另一实施方式中，本发明的组合物可以抑制或减少活化记忆T细胞产生和/或分泌的细胞因子。在一些实施方式中，与未处理的活化记忆T细胞相比，本发明的组合物能够将记忆T细胞产生和/或分泌的细胞因子抑制和/或减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在另一实施方式中，与未处理的活化记忆T细胞相比，本发明的组合物能够将记忆T细胞产生和/或分泌的细胞因子抑制和/或减少至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。在一些实施方式中，本发明的组合物减少IL-2、干扰素γ和/或IL-4的产生。
自然杀伤细胞(也称为NK细胞)是一类细胞毒性淋巴细胞，在肿瘤细胞和病毒感染细胞的定向破坏中起作用。NK细胞释放含有触发靶细胞凋亡的穿孔蛋白和粒酶的小的胞质颗粒，从而对靶细胞进行杀伤。在一些实施方式中，本发明的组合物抑制或减少NK细胞释放的穿孔蛋白和/或粒酶。在一些实施方式中，与未处理的活化NK细胞相比，本发明的组合物能够将NK细胞释放穿孔蛋白和/或粒酶抑制和/或减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在另一实施方式中，与未处理的活化NK细胞相比，本发明的组合物能够将NK细胞释放的穿孔蛋白和/或粒酶抑制和/或减少至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
B细胞在体液免疫应答中扮有角色的淋巴细胞。B细胞的主要功能是产生针对可溶性抗原的抗体。每一个B细胞具有结合一种特定抗原的一种独特受体。一旦B细胞与关联抗原连接并从辅助T细胞中接收其它信号，就变成产生抗体的细胞。在一些实施方式中，本发明的组合物能抑制或减少B细胞的活化。在一些实施方式中，与未处理的B细胞相比，本发明的组合物可以将B细胞的活化抑制或减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，本发明的组合物可以抑制或减少B细胞的活化。在一些实施方式中，与未处理的B细胞相比，本发明的组合物能够将B细胞活化水平抑制或降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
在另一实施方式中，本发明的组合物能够抑制或减少B细胞产生和/或分泌的抗体。在一些实施方式中，与未处理的B细胞相比，本发明的组合物能够将B细胞产生和/或分泌的抗体抑制或减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，与未处理的B细胞相比，本发明的组合物能够将B细胞产生和/或分泌的抗体抑制或减少至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
嗜酸性粒细胞是参与对抗寄生虫感染的白细胞。同样，嗜酸性粒细胞参与变态反应和哮喘相关机制。嗜酸性粒细胞对细胞因子如IL-3、IL-5和GM-CSF产生应答。嗜酸性粒细胞在激活后产生并分泌多种免疫系统介导物，如活性氧物质(如但不限于超氧化物)、脂质介导物(如但不限于白三烯(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)、前列腺素(PGE2、血栓烷A2))、酶(如弹性蛋白酶)、生长因子(如但不限于TGFβ、VEGF和PDGF)和细胞因子(包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13和TNF-α)。在一些实施方式中，本发明的组合物能够抑制或减少活化嗜酸性粒细胞产生和/或分泌的免疫系统介导物。在一些实施方式中，与未处理的嗜酸性粒细胞相比，本发明的组合物能够将嗜酸性粒细胞产生和/或分泌的免疫系统介导物抑制和/或减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，与未处理的活化嗜酸性粒细胞相比，本发明的组合物能够将活化嗜酸性粒细胞产生和/或分泌的免疫系统介导物抑制和/或减少至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
嗜碱性粒细胞是白细胞，它代表组胺和IL-4的重要来源。一旦被活化，大胞质颗粒含有组胺、肝素、软骨素、弹性蛋白酶、溶血磷脂酶和多种白三烯(如但不限于LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)和多种细胞因子(包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13和TNF-α)。在一些实施方式中，本发明的组合物能抑制或减少活化嗜碱性粒细胞产生和/或释放的胞质颗粒。在一些实施方式中，与未处理的活化嗜碱性粒细胞相比，本发明的组合物能够将嗜碱性粒细胞产生和/或分泌的胞质颗粒抑制和/或减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，与未处理的活化嗜碱性粒细胞相比，本发明的组合物能够将活化嗜碱性粒细胞产生和/或分泌的胞质颗粒抑制和/或减少至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
嗜中性粒细胞在免疫应答，尤其是对细菌感染的应答的急性期被活化。嗜中性粒细胞对多种不同趋化因子具有高度反应性，这些趋化因子包括但不限于：fMLP、C5a、LTB4、IL-8和干扰素γ，它们触发中性粒细胞向炎症位点的征集。一旦到达感染位点，嗜中性粒细胞快速寻找细菌和其它病原体并将其破坏。对靶病原体的破坏作用通过吞噬作用和/或产生活性氧完成。嗜中性粒细胞在所谓脱颗粒过程中还释放出许多蛋白质(如但不限于乳铁蛋白、导管素(cathelicidin)、髓过氧化物酶、防御素、丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、明胶酶)。在一些实施方式中，本发明的组合物可抑制或降低活化嗜中性粒细胞对趋化因子的应答。在一些实施方式中，与未处理的活化嗜中性粒细胞相比，本发明的组合物能够将活化嗜中性粒细胞对趋化因子的应答抑制和/或降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，与未处理的活化嗜中性粒细胞相比，本发明的组合物能够将活化嗜中性粒细胞对趋化因子的应答抑制和/或降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
在一些实施方式中，本发明的组合物可抑制或减少活化嗜中性粒细胞的脱颗粒。在一些实施方式中，与未处理的活化嗜中性粒细胞相比，本发明的组合物能够将活化嗜中性粒细胞的脱颗粒抑制和/或降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，与未处理的活化嗜中性粒细胞相比，本发明的组合物能够将活化嗜中性粒细胞脱颗粒抑制和/或降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
肥大细胞在炎症过程中扮有重要角色。肥大细胞活化时迅速释放特征颗粒和各种激素介导物。直接损伤、与IgE受体交联或补体蛋白的激活可刺激肥大细胞脱颗粒。肥大细胞颗粒包含免疫系统调节物，如但不限于组胺、肝素、丝氨酸蛋白酶、前列腺素、白三烯和其它细胞因子。在一个实施方式中，本发明的组合物能够抑制或降低肥大细胞脱颗粒。在一些实施方式中，与未处理的活化肥大细胞相比，本发明的组合物能够将活化肥大细胞的脱颗粒抑制或降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，与未处理的肥大细胞相比，本发明的组合物能够将肥大细胞脱颗粒抑制或降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
巨噬细胞是组织内来源于循环血液单核细胞的细胞。其作用是吞噬细胞碎片和病原体，并刺激其它淋巴细胞其它免疫细胞对病原体产生应答。巨噬细胞也根据其位置进行命名。例如，肝脏内的巨噬细胞称为库普弗细胞，而骨内的巨噬细胞则是破骨细胞。其它确定的巨噬细胞类群包括尘细胞(肺泡)、组织细胞(结缔组织)、小胶质细胞(神经组织)和窦内皮细胞(脾脏)。巨噬细胞对低氧环境产生应答，并被认为会促进慢性炎症。在一些实施方式中，本发明的组合物能抑制或减少巨噬细胞的吞噬活性。在一些实施方式中，与未处理的巨噬细胞相比，本发明的组合物能够将巨噬细胞的吞噬活性抑制和/或降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％或更多。在一些实施方式中，与未处理的巨噬细胞相比，本发明的组合物能够将巨噬细胞的吞噬能力抑制或降低至至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/50或更少。
在另一实施方式中，本发明包括能够抑制或降低血管新生的组合物。在另一实施方式中，血管新生与肿瘤生长、类风湿性关节炎、SLE、舍格伦综合征等相关。
本发明还提供使用表位结合蛋白使多种感染物如病毒、真菌、真核微生物和细菌失活的方法。在一些实施方式中，本发明的表位结合蛋白可用于使RSV、hMPV、PIV或流感病毒失活。在其它实施方式中，本发明的表位结合蛋白可用于使真菌病原体，例如但不限于耐格里原虫(Naegleria)、曲霉(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、组织胞浆菌(Histoplasma)、假丝酵母(Candida)或癣菌(Tinea)失活。在其它实施方式中，本发明的表位结合蛋白可用于使真核微生物，例如但不限于贾第鞭毛虫(Giardia)、弓形虫(Toxoplasma)、疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)和阿米巴虫(Entamoeba)失活。在其它实施方式中，本发明的表位结合蛋白可用于使细菌，例如但不限于葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、梭菌(Clostridium)、疏螺旋体(Borrelia)、弧菌(Vibro)和奈瑟球菌(Neiserria)失活。
本发明蛋白质和包含它的组合物可用于多种目的，例如，用作治疗多种慢性和急性疾病和失调的治疗剂，所述疾病和师表包括但不限于：感染性疾病，包括病毒、细菌和真菌疾病。病毒病原体的例子包括但不限于：腺病毒科(如哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属)、疱疹病毒科(如单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5和单纯疱疹病毒6)、光滑病毒科(如光滑病毒属、肠细菌噬菌体(phase)MS2、异轻小噬菌体属)、痘病毒科(如脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软疣痘病毒属和昆虫痘病毒亚科)、乳多空病毒科(如多瘤病毒属和乳头瘤病毒属)、副粘病毒科(如副粘病毒属、副流感病毒1、麻疹病毒病毒属(如麻疹病毒)、腮腺炎病毒属(如腮腺炎病毒)、肺病毒亚科(如肺病毒属、人呼吸道合胞病毒)和肺炎后病毒属(如禽肺病毒和人肺炎后病毒))、小核糖核酸病毒科(如肠道病毒属、鼻病毒属、肝病毒属(如人甲肝病毒)、心病毒属和口蹄疫病毒属)、呼肠孤病毒科(如正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、质型多角体病毒属、斐济病毒属、植物呼肠病毒属和水稻病毒属)、逆转录病毒科(如哺乳动物B型逆转录病毒属、哺乳动物C型逆转录病毒属、禽C型逆转录病毒属、D型逆转录病毒类群、BLV-HTLV逆转录病毒属、慢病毒属(如人体免疫缺陷病毒1和人体免疫缺陷病毒2)、泡沫病毒属)、黄病毒科(如丙型肝炎病毒)、肝DNA病毒科(如乙型肝炎病毒属)、披膜病毒科(例如α病毒属(如辛德毕斯病毒属)和风疹病毒属(如风疹病毒))、弹状病毒科(如水疱病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属、质型弹状病毒属和核型弹状病毒属)、沙粒病毒科(如沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒和拉沙病毒)和冠状病毒科(如冠状病毒属和环状病毒属)。细菌病原体的例子包括但不限于：水螺菌科(Aquaspirillum)、固氮螺菌科(Azospirillum)、固氮菌科(Azotobacteraceae)、类杆菌科(Bacteroidaceae)、巴尔通体(Bartonella)、蛭弧菌科(Bdellovibrio)、弯曲杆菌(Campylobacter)、衣原体(Chlamydia)(如、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))、梭状芽胞杆菌(clostridium)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(如柠檬酸菌(Citrobacter)、爱德华菌(Edwardsiella)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、欧文菌(Erwinia)、大肠杆菌(Escherichia coli)、哈夫尼菌(Hafnia)、克雷伯杆菌(Klebsiella)、摩根菌(Morganella)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、普罗威登斯菌(Proyidencia)、沙门菌(Salmonella)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和弗氏志贺菌(Shigella flexneri))、加特纳菌科(Gardinella)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、螺杆菌科(Helicobacter)、军团菌科(Legionallaceae)、李斯特菌(Listeria)、甲基球菌科(Methylococcaceae)、分枝杆菌(mycobacteria)(如结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、奈瑟球菌科(Neisseriaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillum)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)、肺炎球菌(Pneumococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、螺菌科(Spirillum)、螺状菌科(Spirosomaceae)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和致热葡萄球菌(Staphylococcuspyrogenes))、链球菌属(Streptococcus)(如肠炎链球菌(Streptococcusenteritidis)、粪链球菌(Streptococc fasciae)和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae))、蝙蝠弧菌螺杆菌科(Vampirovibr Helicobacter)和蝙蝠弧菌科(Vampirovibrio)。真菌病原体的例子包括但不限于：犁头霉(Absidia)(如伞状犁头霉(Absidia corymbifera)和分支犁头霉(Absidia ramosa))、曲霉(Aspergillus)(如、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)和土曲霉(Aspergillus terreus))、蛙粪霉(Basidiobolus ranarum)、皮炎芽生菌、念珠菌(Candida)(如白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克尔念珠菌(Candida kerr)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、假热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida quillermondii)、皱褶念珠菌(Candida rugosa)、星状念珠菌(Candida stellatoidea)和热带念珠菌(Candida tropicalis))、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、耳霉(Conidiobolus)、新形隐球菌(Cryptococcusneoforms)、小克银汉霉(Cunninghamella)、皮肤癣菌、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、渺小毛霉菌(Mucorpusillus)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、波氏假性阿利什利菌(Pseudallescheria boydii)、西伯鼻孢子菌(Rhinosporidiumseeberi)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、根霉(Rhizopus)(如无根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)和小孢根霉(Rhizopusmicrosporus))、酵母菌(Saccharomyces)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、接合菌、以及诸如接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)、半知菌纲(Deuteromycetes)和卵菌纲(Oomycetes)等真菌纲。
在另一实施方式中，本发明提供用于预防、控制、治疗或改善癌症、自身免疫病、炎性疾病或感染性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括将一剂预防或治疗有效量的一种或多种本发明表位结合蛋白与手术联合给予、单独给予、或与标准或实验性化疗、激素疗法、生物疗法/免疫疗法和/或放疗联合给予需要的对象。根据这些实施方式，用于预防、控制、治疗或改善癌症、自身免疫病、炎性疾病或感染性疾病或其一种或多种症状的本发明表位结合蛋白可与或不与某部分(如治疗剂或药物)偶联或融合。
本发明提供用于预防、控制、治疗或改善癌症、自身免疫病、炎性疾病或感染性疾病或其一种或多种症状的方法，所述方法包括联合给予需要的对象一种或多种本发明表位结合蛋白和一种或多种非癌症治疗剂(也称为非癌症疗法)。此类药剂的例子包括但不限于：止吐剂、抗真菌剂、抗细菌剂如抗生素、抗炎剂和抗病毒剂。止吐剂的非限定性例子包括美托哌丙嗪和甲氧氯普胺。抗真菌剂的非限定性例子包括唑类药物、咪唑、三唑、多烯、两性霉素和嘧啶(ryrimidine)。抗细菌剂的非限定性例子包括更生霉素、博莱霉素、红霉素、青霉素、光神霉素、头孢菌素、亚胺培南、氨曲南、去甲万古霉素、环丝氨酸、杆菌肽、氯霉素、克林霉素、四环素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、甲氧苄啶、诺氟沙星、利福平、多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素、酮康唑、异烟肼、甲硝唑和喷他脒。抗病毒剂的非限定性例子包括核苷类似物(如齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷和利巴韦林)、膦甲酸、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦，干扰素(“IFN”)-α、β或γ以及AZT。抗炎剂的非限定性例子包括非类固醇消炎药(“NSAID”)、类固醇消炎药、β-激动剂、抗胆碱能药剂和甲基黄嘌呤。
在另一实施方式中，本发明包含能够抑制癌细胞表型的组合物。在一个实施方式中，癌细胞的表型是细胞生长、细胞贴附、细胞贴附丧失、受体(如Eph)表达降低、受体(如Eph)表达升高、转移潜能、细胞周期抑制、受体酪氨酸激酶活化/抑制或其它现象。
在一个实施方式中，本发明包括能治疗慢性炎症的组合物。在一个实施方式中，本发明组合物可用于靶向免疫细胞以便破坏或使其失活。在一个实施方式中，该组合物可用于靶向活化T细胞、休眠T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞或树突细胞。在另一实施方式中，本发明包含能够降低免疫细胞功能的组合物。在另一实施方式中，该组合物能够消除免疫细胞的功能。
本发明还提供将表位结合蛋白用作诊断试剂的方法。本发明的蛋白质可用于需要同时有效捕获不同抗原的试剂盒或试剂。
H.本发明多特异性表位结合蛋白编码多核苷酸的产生
本发明还提供了含有编码本发明多特异性表位结合蛋白及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还提供了含有编码本发明多肽链及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还包括在如本文所定义的严谨或低严谨性杂交条件下，与本发明表位结合蛋白和/或多肽链的编码多核苷酸杂交的多核苷酸。
编码表位结合蛋白的多核苷酸可由合适来源的核酸产生。例如，如果无法获得含有特定表位结合蛋白的编码核酸的克隆，但已知表位结合蛋白分子的序列，则可通过化学合成或PCR扩增或克隆技术获得该蛋白的编码核酸，所述PCR扩增是使用与该序列3′和5′端杂交的合成引物由合适来源(如cDNA文库，或由表达该表位结合蛋白的任何组织或细胞，例如经选择表达本发明蛋白质的杂交瘤产生的cDNA文库或分离的核酸，优选聚A+RNA)进行，所述克隆技术使用特定基因序列的特异性寡核苷酸探针以识别(如)来自编码该蛋白的cDNA文库的cDNA克隆。然后，可利用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
一旦确定表位结合蛋白的核苷酸序列和对应氨基酸序列，可使用本领域所知任何操纵核苷酸序列的方法，如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如，Sambrook等，1990，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)，第二版，纽约冷泉港市冷泉港实验室，和Ausubel等编，1998，《新编分子生物学实验方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，NY)中所述方法)对表位结合蛋白的核苷酸序列进行操作，以产生具有不同氨基酸序列的表位结合蛋白，例如创建氨基酸取代、缺失或插入。
在一个具体实施方式中，用本领域已知方法，例如与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸进行比较以确定序列超变区，从而检查本发明表位结合蛋白的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列以鉴定互补决定区(CDR)的序列。使用常见重组DNA技术，可将一个或多个CDR插入构架区中，如插入人构架区中以将非人抗体人源化。构架区可以是天然产生的或共有的构架区，优选人构架区(参见例如，Chothia等，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)中所列人构架区)。优选由架构区和CDR组合产生的多核苷酸编码本发明表位结合蛋白。
优选地，可以在构架区中产生一个或多个氨基酸取代，优选地，该氨基酸取代能提高表位结合蛋白与其抗原的结合。本发明包括对多核苷酸的其它改变，这些改变在本领域技术人员能力范围以内。
I.多特异性表位结合蛋白偶联物和衍生物
本发明的蛋白质包括修饰的衍生物(如将任何类型的分子与该蛋白质共价连接)。例如，但不限于，衍生物包括通过例如，糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/封端机团衍生化、蛋白酶水解切割、与细胞配体或其它蛋白连接等修饰的本发明多特异性表位结合蛋白。通过已知技术可进行多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
本发明的表位结合蛋白或其片段可与标记序列融合，如与肽融合以利于纯化。在某些实施方式中，标记氨基酸序列是六-组氨酸肽，例如pQE载体(凯杰公司(QIAGEN，Inc.)，伊顿大街(Eton Avenue)9259号，查茨沃斯(Chatsworth)，CA，91311)提供的标签等，其中许多标记可购得。如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824所述，六-组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化方法。用于纯化的其它肽标签包括但不限于：血凝素“HA”标签，它对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell 37：767)以及“flag”标签。
本发明还涵盖与诊断或治疗剂偶联的多特异性表位结合蛋白。可将该蛋白用于诊断目的，例如，作为临床测试步骤的一部分监测肿瘤的发展或进展，从而(如)确定给定治疗方案的效果。将抗体与可检测物质偶联可利于探测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子成像术检测的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。将可检测物质与抗体(或其片段)直接偶联或缀合，或使用本领域已知技术通过中间体(如本领域所知的接头)偶联或缀合。参见例如，美国专利号4,741,900中的金属离子，可根据本发明将其与抗体偶联用于诊断。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括：伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子是发光胺；生物发光材料的例子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；除125I、131I、111In或99Tc外，合适的放射性物质的例子包括但不限于利用各种正电子发射成像术检测的正电子发射金属、非放射性顺磁金属离子、以及可与本发明蛋白质偶联的特定放射性同位素放射性标记或偶联的分子。
此外，本发明的多特异性表位结合蛋白可与治疗性部分，例如细胞毒素，如细胞稳定剂或细胞杀伤剂、治疗剂或放射性金属例子，如α-发射体，如213Bi偶联。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何物质。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素和它们的类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢剂(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(如双氯乙基甲胺、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(如道诺霉素和多柔比星)、抗生素(如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗-有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。更详细的治疗剂列表可参见PCT公开WO 03/075957。
本发明的偶联物可用于修饰给定的生物学反应，治疗剂或药物部分不限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活因子、凋亡剂如TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际公开号WO 97/33899)、AIM II(参见国际公开号WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等，Int.Immunol.，6：1567-1574(1994))、VEGI(参见国际公开号WO 99/23105)、CD40配体、血栓剂或抗血管新生剂，如血管抑素或内皮抑素；或生物反应修饰剂，例如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
J.多特异性表位结合蛋白的载体分子
本发明的多特异性表位结合蛋白可用于将载荷递送至细胞。例如，可在多特异性表位结合蛋白上装载货物，如但不限于细胞毒药物，以努力将药物递送至特定的细胞群。已为单克隆抗体开发此类技术，需要对抗体进行共价修饰以便与药物偶联，通常在非配对半胱氨酸上进行这种修饰。这些化学修饰麻烦、低效并常常使抗体不稳定。同样，对于单个抗体偶联的药物分子数也控制有限，造成了生产的变异性。可工程改造本发明的多特异性表位结合蛋白，以有效和可预测的方式将货物递送至细胞。可设想多特异性表位结合蛋白可包含货物或装载物特异性的表位结合域，合适递送至细胞。此前对这类表位结合域已有描述，例如针对紫杉醇的抗体(Leu等1993.Cancer Research Mar 15；53(6)：1388-91)和多柔比星的抗体(Morelli等，1996 Cacer Research May 1；56(9)；2082-5)。这些多特异性表位结合蛋白载体分子可装载至少一种与表位结合域结合的货物，并将其给予病人。
在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可用于将货物分子递送至细胞。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含至少一个递送至细胞的货物分子的特异性表位结合域。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含多个同一递送货物分子的特异性表位结合域。在其它实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白包含多个不同递送货物分子的特异性表位结合域。
在一些实施方式中，递送的货物分子是细胞毒药物、抗代谢剂、毒素、肽、DNA分子、RNA分子、小分子、放射性同位素、荧光团、酶、酶抑制剂、前药或线粒体毒剂。在其它实施方式中，在递送至细胞前，货物特异性表位结合域可掩蔽货物分子的活性位点/区。在其它实施方式中，一旦内化，货物特异性表位结合域可逆地释放货物分子。
在一些实施方式中，货物特异性表位结合域与货物分子的结合是pH依赖性的。在一些实施方式中，货物特异性表位结合域在生理pH下，如血液pH下与货物分子结合，但在溶酶体pH(约pH6.0)下不结合货物分子。
在一些实施方式中，至少一个表位结合域可对用于偶联各种靶点的接头部分具有特异性。在这种情况下，使用者可根据所选货物“定制”接头部分，并使用接头特异性表位结合域递送定制货物至细胞。在2005年11月8日授权的美国专利号6,962,702中对此类用于传统抗体的方法已有描述，将其全文纳入本文作参考。
K.表位结合和活性实验
可通过本领域已知任何方法测定本发明的多特异性表位结合蛋白的特异性(即免疫特异性)结合。可使用的免疫实验包括但不限于，使用如下技术的竞争和非竞争实验系统，如western印迹、放射性免疫实验、ELISA(酶联免疫吸附实验)、“夹心”免疫实验、免疫沉淀实验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散实验、凝集实验、补体结合实验、免疫放射实验、荧光免疫实验、蛋白A免疫实验等等。此类实验是常规且为本领域已知的(参见例如，Ausubel等编，1994，《新编分子生物学实验方法》(Current Protocols in MolecularBiology)，第一卷，纽约约翰韦利森出版公司((John Wiley&Sons，NY)))。下面简要描述示范性免疫测定(但不限于此)。
免疫沉淀方案通常包括用补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如乙二胺四乙酸、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40或曲通X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠pH7.2，1％特斯乐(Trasylol))裂解细胞群，将感兴趣的表位结合蛋白加入该细胞裂解物，4℃培育一段时间(如1-4小时)，将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠加入该细胞裂解物，4℃培育约一小时或更长时间，用裂解缓冲液洗珠，并将珠子重悬于SDS/样品缓冲液。可通过，例如Western印迹分析评估感兴趣蛋白质免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员应认识到，可改变参数以提高表位结合蛋白与抗原的结合和降低背景(如，用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解物)。有关免疫沉淀方案的进一步讨论参见例如，Ausubel等编，1994，《新编分子生物实验方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第1卷，纽约约翰韦利森出版公司(JohnWiley&Sons，Inc.，纽约)，10.16.1。
Western印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白质样品的电泳(如，根据抗原的分子量，8％-20％SDS-PAGE)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜，如硝基纤维素、PVDF或尼龙膜上，在封闭缓冲液中封闭膜(如，含3％BSA或脱脂奶粉的PBS)，在洗涤缓冲液中洗膜(如PBS-吐温20)，用封闭缓冲液稀释的第一抗体封闭膜，在洗涤缓冲液中洗膜，用封闭缓冲液稀释的与酶底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如32P或125I)偶联的第二抗体(识别第一抗体)封闭膜，用洗涤缓冲液洗膜并检测抗原的存在。本领域技术人员认识到，可改变参数以提高检测到的信号和降低背景噪声。有关Western印迹方案的进一步讨论参见例如，Ausubel等编，1994，《新编分子生物实验方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第1卷，纽约约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，Inc.，纽约)，10.8.1。
ELISA包括制备抗原，用该抗原包被96孔微量滴定板的孔，将偶联于可检测化合物如酶底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣表位结合蛋白加入孔中，培育一段时间并检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的表位结合蛋白不必与可检测的化合物偶联；取而代之的是可将与可检测化合物偶联的第二抗体(识别感兴趣的蛋白质)加入孔中。此外，不用抗原包被孔，而是用感兴趣的蛋白包被孔。在这种情况下，可加入偶联于可检测化合物的第二抗体，然后向包被孔中加入感兴趣抗原。本领域熟练技术人员应该意识到可对参数进行修改以提高检测信号以及本领域所知的其它对ELISA的改变。关于ELISA的更多讨论，参见例如，Ausubel等编，1994，《新编分子生物实验方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，第1卷，纽约约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，Inc.，纽约)，11.2.1。
表位结合蛋白和抗原的结合亲和力以及其它结合特性可通过本领域所知的多种体外实验进行测定，包括例如，平衡方法(如酶联免疫吸附实验(ELISA；或者放射性免疫实验(RIA))，或动力学方法(如分析)以及其它方法，如间接结合实验、竞争结合实验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱(如凝胶过滤)。这些和其它方法可利用所检测的一种或多种组分上的标记和/或利用各种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。有关结合亲和力和动力学的详细描述可参见Paul，W.E.编，Fundamental Immunology(基础免疫学)，第4版，Lippincott-Raven，费城(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。竞争性结合实验的一个例子是放射性免疫实验，包括在未标记抗原的量递增的条件下，将标记的抗原与感兴趣的表位结合蛋白孵育，并检测与标记抗原结合的表位结合蛋白。可通过Scatchard作图分析的数据确定感兴趣的表位结合蛋白与特定抗原的亲和力和结合解离速率。也可利用放射性免疫实验确定与第二抗体的竞争。这种情况下，在未标记的第二抗体的量递增的条件下，将抗原与标记化合物偶联的感兴趣的表位结合蛋白孵育。
L.变异Fc区
本发明还提供了具有改变的Fc区(本文也成为“变异Fc区”)的多特异性表位结合蛋白。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的多肽链包含变异Fc区(即，如下文所讨论的改变的Fc区)。包含变异Fc区的本发明多肽链在此也称作“Fc变异蛋白”。
在变异Fc区的描述中，应当理解的是本发明多特异性表位结合蛋白的Fc区包括根据Kabat等所述EU索引的编号方案(1991，NIH出版物91-3242，弗吉尼亚州斯普林菲尔德的国家技术信息服务中心(National TechnicalInformation Service，Springfield，VA))。
本发明包括相对于比较分子(如除含有野生型Fc区外其它氨基酸序列相同的蛋白质)对Fc配体(如Fc受体，C1q)的结合特性改变的Fc变异蛋白。结合特性的例子包括但不限于：结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和结合速率(分别是K解离和K结合)、结合亲和力和/或亲合力。通常应理解，具有低KD的结合分子(例如Fc变异蛋白，如抗体)可能比具有高KD的结合分子更优选。然而，在一些情况下，K解离和K结合值可能比KD值更相关。本领域技术人员可确定对给定的表位结合蛋白应用而言，哪种动力学参数最重要。
可通过本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即Fc区与FcγR的特异性结合的各种体外测定法(生化或免疫测定法)确定Fc区与其配体的亲和力和结合特性，这些方法包括但不限于：平衡法(如酶联免疫吸附实验(ELISA)；或放射性免疫实验(RIA))或动力学方法(如
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分析)，以及其它方法，如直接结合实验、竞争性抑制实验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(如凝胶过滤)。这些和其它方法可利用所检测的一种或多种组分上的标记和/或利用各种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。有关结合亲和力和动力学的详细描述可参见Paul，W.E.编，Fundamental Immunology(基础免疫学)，第4版，Lippincott-Raven，费城(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。
在一个实施方式中，相对于比较分子，Fc变异蛋白对一种或多种Fc配体的结合增强。在另一实施方式中，Fc变异蛋白与Fc配体的亲和力是比较分子的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少200倍。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体的结合增强。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合增强。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIB的结合增强。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcRn的结合增强。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与C1q的结合增强。
可通过提高Fc区与FcRn的结合亲和力来延长含有Fc区的蛋白质的血清半衰期。在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的血清半衰期延长。
可测得任何具体Fc变异蛋白通过ADCC介导靶细胞裂解的能力。为了评价ADCC活性，将感兴趣的Fc变异蛋白和免疫效应细胞一起加到靶细胞中，通过抗原抗体复合物可激活该效应细胞，进而导致该靶细胞裂解。通常通过裂解细胞释放的标记(如放射性底物、荧光染料或天然的细胞内蛋白质)来检测细胞裂解。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。体外ADCC实验的具体例子如Wisecarver等，1985 79：277-282；Bruggemann等，1987，J Exp Med 166：1351-1361；Wilkinson等，2001，J ImmunolMethods 258：183-191；Patel等，1995 J Immunol Methods 184：29-38所述。感兴趣的Fc变异蛋白的ADCC活性也可在体内进行评价，如在动物模型中，如Clynes等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656所述。
在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性增强。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白的ADCC活性是比较分子的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平提高且ADCC活性增强。在其它实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性提高、血清半衰期延长。
在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性降低。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白的ADCC活性是比较分子的至多1/2、至多1/3、至多1/5、至多1/10、至多1/50或至多1/100。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平降低且ADCC活性降低。在其它实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性降低、血清半衰期延长。
在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的CDC活性增强。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白的CDC活性是比较分子的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在其它实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的CDC活性提高、血清半衰期延长。在一个实施方式中，相对于比较分子，Fc变异蛋白对一种或多种Fc配体的结合水平降低。在另一实施方式中，Fc变异蛋白与Fc配体的亲和力是比较分子的至多1/2、至多1/3、至多1/5、至多1/7、至多1/10、至多1/20、至多1/30、至多1/40、至多1/50、至多1/60、至多1/70、至多1/80、至多1/90、至多1/100或至多1/200。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体的结合水平降低。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平降低。在一个具体实施方式中，本文所述的Fc变体与Fc受体FcγRIIIA的亲和力是比较分子的至多约1/5，其中所述Fc变体与Fc受体FcγRIIB的亲和力是比较分子亲和力的约2倍以内。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcRn的结合水平降低。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与C1q的结合水平降低。
在一个实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区在一个或多个选自下组的位置上包含非天然产生的氨基酸残基：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的其它和/或另选的位置上包含非天然产生的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217；WO 05/092925和WO06/020114)。
在一个具体实施方式中，本发明提供了Fc变体，其中Fc区包含至少一个非天然产生的氨基酸残基，它们选自234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R.243W、243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W，如Kabat中所述的EU索引进行编号。任选地，Fc区可包含本领域技术人员已知的其它和/或另选的非天然产生的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217)。
在另一实施方式中，本发明提供Fc变体，其中所述Fc区在选自239、330或332的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。
在另一实施方式中，本发明提供Fc变体，其中所述Fc区在选自234、235或331的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在另一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含234F、235F和331S非天然产生的氨基酸残基，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在另一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含234F、235Y和331S非天然产生的氨基酸残基，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。
在其它实施方式中，本发明的Fc变体可与其它已知Fc变体组合，如Ghetie等，1997，Nat Biotech.15：637-40；Duncan等，1988，Nature 332：563-564；Lund等，1991，J.Immunol 147：2657-2662；Lund等，1992，Mol Immunol 29：53-59；Alegre等，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchins等，1995，Proc Natl.Acad Sci USA 92：11980-11984；Jefferis等，1995，Immunol Lett.44：111-117；Lund等，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis等，1996，Immunol Lett 54：101-104；Lund等，1996，J Immunol 157：4963-4969；Armour等，1999，Eur J Immunol29：2613-2624；Idusogie等，2000，J Immunol 164：4178-4184；Reddy等，2000，J Immunol 164：1925-1933；Xu等，2000，Cell Immunol 200：16-26；Idusogie等，2001，J Immunol 166：2571-2575；Shields等，2001，J Biol Chem 276：6591-6604；Jefferis等，2002，Immunol Lett 82：57-65；Presta等，2002，Biochem Soc Trans30：487-490)；美国专利号5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利公开号2004/0002587和PCT公开WO 94/29351；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO 04/099249；WO 04/063351所公开的那些。本发明也包括含有缺失、加入和/或修饰的Fc区。本领域技术人员可以明显看出还可对Fc区进行其它修饰/取代/加入/缺失。
M.本发明的多特异性表位结合蛋白的糖基化
在另一个实施方式中，改变本发明中所用表位结合蛋白的糖基化。例如，可制备无糖基化的表位结合蛋白(即没有糖基化的表位结合蛋白)。可改变糖基化状态，以(例如)提高表位结合蛋白对靶抗原的亲和力。可通过(例如)改变蛋白序列中一个或多个糖基化位点来进行这种糖修饰。这种无糖基化可增加本发明的蛋白质对其抗原的亲和力。这类方法详见美国专利号5,714,350和6,350,861。也可进行一个或多个氨基酸取代，以消除Fc区中存在的糖基化位点(如IgG的天冬酰胺297)。而且，可在缺乏必要的糖基化机器的细菌细胞中产生无糖基化的表位结合蛋白。
也可制备糖基化类型改变的本发明表位结合蛋白，例如海藻糖残基数量减少的低海藻糖基化蛋白或截开型GlcNAc结构增加的蛋白。已证明，这类改变的糖基化模式能提高抗体的ADCC能力。可通过例如在糖基化机器改变的宿主细胞中表达本发明的蛋白质来实现这类糖修饰。本领域已经描述过糖基化机器改变的细胞，它们可用作表达本发明重组蛋白，从而产生糖基化改变的蛋白的宿主细胞。参见例如，Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-1，以及美国专利US 6,946,292；欧洲专利EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342，各篇文献的全文通过引用纳入本文。
已知多样性的存在涉及在抗体IgG分子Fc区结合的复合型N-糖苷-连接的糖链的非还原末端加入半乳糖，以及在还原末端的N-乙酰基葡糖胺上加入岩藻糖[Biochemistry，36，130(1997)]，并且已有报道称在糖链还原末端的N-乙酰基葡糖胺上加入岩藻糖使抗体的ADCC活性大大降低[WO00/61739，J.Biol.Chem.，278，3466(2003)]。因此，为了使功效最大化，需要Fc区岩藻糖基化减少或消除的多特异性表位结合蛋白。
在一个具体实施方式中，与未修饰的特异性表位结合蛋白相比，本发明的多特异性表位结合蛋白岩藻糖基化水平降低。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白的岩藻糖基化水平相当于未修饰多特异性表位结合蛋白水平的至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2.5％或1％。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白是无岩藻糖基化的。在另一实施方式中，岩藻糖基化的本发明多特异性表位结合蛋白包含的岩藻糖基化水平相当于未修饰多特异性表位结合蛋白的5％、2.5％、1％、0.5％、0.1％或0.05％以下。
N.多特异性表位结合蛋白的制备/生产
本发明还提供生产本发明多特异性表位结合蛋白的方法。可从单一载体或从多个载体中表达多特异性表位结合蛋白。载体内结合域的排列可不同。Fc区(或CH1/Fc区)的取向可以是在多特异性表位结合多肽链包含的任何结构域的N-末端或C-末端。在一些实施方式中，表位结合域出现于多肽链内Fc区(或CH1/Fc区)的N-末端和C-末端。
对所需多特异性表位结合蛋白进行工程改造时，可使用本领域所知大规模抗体制备方法以商业规模生产蛋白质。例如，可利用重组表达系统，例如但不限于以下所述的系统来实现这种生产。
N.1.重组表达系统
重组表达本发明的表位结合蛋白需要构建含本发明表位结合蛋白编码多核苷酸的表达载体。一旦获得本发明蛋白质的编码多核苷酸，则使用本领域已知技术通过重组DNA技术产生用于生产表位结合分子的载体。参见例如，美国专利号6,331,415，将其全文纳入本文作参考。因此，本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可在多个不同表达系统中产生本发明的多特异性表位结合蛋白。在一个实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白由哺乳动物细胞产生并分泌。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白由人细胞产生并分泌。在一个具体实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白可在293F、CHO或NS0细胞系中产生。
可利用本领域技术人员熟知的方法构建含有蛋白质编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供含有操作性连接于启动子的表位结合蛋白编码核苷酸序列的可复制载体。
一旦通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中后，就可用常规技术培养转染细胞，以产生表位结合蛋白。因此，本发明包括含有操作性连接于异源启动子的本发明蛋白质编码多核苷酸的宿主细胞。
可利用多种宿主-表达载体系统表达本发明的表位结合蛋白或其部分，如美国专利号5,807,715所述。例如，哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)与某载体如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件联用，是表位结合蛋白的有效表达系统(Foecking等，Gene 45：101(1986)；和Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990))。此外，可选择调节插入序列表达、或以所需的特定方式修饰和加工该基因产物的宿主细胞系。对蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对蛋白质功能至关重要。不同宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，以保证对所表达的本发明蛋白质进行正确修饰和加工。为此，可采用具有能适当地加工初始转录物、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、RY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0、CRL7O3O和HsS78BsT细胞。
在细菌系统中，可根据所表达蛋白质分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选择。例如，准备产生大量这类表位结合蛋白时，为了产生含有本发明表位结合蛋白的药物组合物，可能需要能够介导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO，12：1791(1983))，其中编码序列可单独连接到载体内，与lacZ编码区位于同一读框内，以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster，1989，J.Biol.Chem.，24：5503-5509(1989))；等等。也可采用pGEX载体表达外来多肽与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并可通过以下方法容易地由裂解细胞纯化：吸附和结合于谷胱甘肽琼脂糖亲和基质，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。设计pGEX载体，将凝血酶和/或因子Xa蛋白酶切割位点引入表达的多肽中，以便由GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa califomica)核多面体病病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可将蛋白编码序列单独克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，可将感兴趣的编码序列连接于腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)会产生活的并且能够存活并在感染宿主中表达抗体分子的重组病毒(参见例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811：355-359(1984))。为使插入的抗体编码序列能够有效翻译，可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG启动密码子和相邻序列。另外，该启动密码子通常应该与所需编码序列在同一阅读框内，以保证完整插入物的翻译。这些外源性翻译控制信号和启动密码子可以是各种天然和合成来源。可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等提高表达效率(参见例如Bittner等，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。
可利用稳定表达来长期、高产率地产生重组蛋白。例如，可产生稳定表达蛋白分子的细胞系。可利用适当工程改造的载体转化宿主细胞，所述载体包含表达控制元件(如启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记基因。引入外来DNA后，使细胞在富营养培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记对选择产生抗性，使得将该质粒稳定整合到其染色体中的细胞生长形成细胞灶，进而可克隆并扩增成细胞系。可利用编码本发明表位结合蛋白的质粒将基因/cDNA引入适合培养生产的任何细胞系中。
可采用许多选择系统，包括但不限于可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell 22：8-17(1980))基因。另外，抗代谢剂抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，产生甲氨蝶呤抗性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA，77：357；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527)；gpt，产生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072)；neo，产生氨基糖苷G-418抗性(Wu和Wu，1991，Biotherapy3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science 260：926-932；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIB TECH 11(5)：155-215)；和hygro，产生潮霉素抗性(Santerre等，1984，Gene，30：147)。通常应用重组DNA技术领域公知的方法以选择所需的重组克隆，这些方法参见例如：Ausubel等(编)，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰韦利森公司(John Wiley&Sons)，NY(1993)；Kriegler，《基因转移和表达，实验室手册》(Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，斯托克顿出版社(Stockton Press)，NY(1990)；和Dracopoli等(编)，《新编人类基因组实验指南》(Current Protocols in Human Genetics)的第12和13章，约翰韦利森公司，NY(1994)；Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.，150：1，通过引用将其全文纳入本文。一旦通过重组表达产生本发明表位结合蛋白后，可通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法进行纯化，这些方法包括例如色谱(如离子交换色谱，亲和色谱，特别是对特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和色谱，以及大小柱色谱)、离心、差异溶解度或任何其它蛋白质纯化标准技术。另外，本发明蛋白质或其片段可与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合，以利于纯化。
O.多特异性表位结合蛋白的规模化生产
为了获得大量的本发明多特异性表位结合蛋白，可通过规模化工艺进行生产(下文中称作“本发明规模化工艺”)。在一些实施方式中，多特异性表位结合蛋白可在研究实验室中通过本发明规模化工艺生产，即在分析级生物反应器(例如但不限于5L、10L、15L、30L或50L生物反应器)中放大规模生产本发明蛋白质，同时保持本发明蛋白质的功能活性。例如，在一个实施方式中，经HPSEC或rCGE测定，通过本发明规模化工艺生产的蛋白质的聚集水平较低直至无法检测，即以蛋白质重量计聚集体所占的比例不多于5％、不多于4％、不多于3％、不多于2％、不多于1％或不多于0.5％，和/或片段化水平较低直至无法检测，即完整多特异性表位结合蛋白的峰面积占峰总面积的80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、或99％或更高、或99.5％或更高。在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白可在研究实验室中通过本发明规模化工艺生产，即在生产级生物反应器(例如但不限于75L、100L、150L或500L生物反应器)中放大规模生产本发明的蛋白质。在一些实施方式中，与研究实验室进行的生产工艺相比，本发明规模化工艺的生产效率下降很少或不下降。在其它实施方式中，本发明规模化工艺产生多特异性表位结合蛋白的效率为约10mg/L、约20m/L、约30mg/L、约50mg/L、约75mg/L、约100mg/L、约125mg/L、约150mg/L、约175mg/L、约200mg/L、约250mg/L或约300mg/L或更高。
在其它实施方式中，本发明规模化工艺产生多特异性表位结合蛋白的效率为至少约10mg/L、至少约20mg/L、至少约30mg/L、至少约50mg/L、至少约75mg/L、至少约100mg/L、至少约125mg/L、至少约150mg/L、至少约175mg/L、至少约200mg/L、至少约250mg/L或至少约300mg/L或更高。
在其它实施方式中，本发明规模化工艺产生多特异性表位结合蛋白的效率为约10mg/L-300mg/L、约10mg/L-250mg/L、约10mg/L-200mg/L、约10mg/L-175mg/L、约10mg/L-150mg/L、约10mg/L-100mg/L、约20mg/L-300mg/L、约20mg/L-250mg/L、约20mg/L-200mg/L、约20mg/L-175mg/L、约20mg/L-150mg/L、约20mg/L-125mg/L、约20mg/L-100mg/L、约30mg/L-300mg/L、约30mg/L-250mg/L、约30mg/L-200mg/L、约30mg/L-175mg/L、约30mg/L-150mg/L、约30mg/L-125mg/L、约30mg/L-100mg/L、约50mg/L-300mg/L、约50mg/L-250mg/L、约50mg/L-200mg/L、约50mg/L-175mg/L、约50mg/L-150mg/L、约50mg/L-125mg/L或约50mg/L-100mg/L。
P.多特异性表位结合蛋白的纯化和分离
使用重组技术时，可以在胞内、周质空间产生本发明表位结合蛋白，或者可直接分泌到培养基中。如果在胞内产生蛋白，那么第一个步骤是通过(例如)离心或超滤去除颗粒碎片、宿主细胞或裂解片段。Carter等，Bio/Technology，10：163-167(1992)记载了分离分泌到大肠杆菌(E.coli)周质空间中的抗体的方法。简要说，将细胞糊在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果表位结合蛋白分泌到培养基中，那么通常先采用市售蛋白质浓缩滤器，例如阿米康(Amicon)或MP(Millipore Pellicon)超滤装置浓缩这类表达系统的上清液。任何上述步骤中可包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，还可包含抗生素以防止外来污染物的生长。
可单独利用或与其它纯化步骤联用羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、透析和/或亲和色谱，纯化由细胞制备的表位结合蛋白组合物。蛋白A作为亲和配体的适当性取决于表位结合蛋白中的免疫球蛋白Fc的种类和同种型。可利用蛋白A纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Methods，62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.，5：15671575(1986))。最常见的连接亲和配体的基质是琼脂糖，但也可采用其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质如孔径受控的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可实现较快的流动速率和较短的加工时间。本发明的蛋白质包含CH3结构域时，可使用Bakerbond ABX树脂(新泽西州菲利浦斯勃格的J.T.B.公司(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ))进行纯化。根据待回收抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、肝素色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行琼脂糖色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
初步纯化步骤后，对包含感兴趣表位结合蛋白和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，该色谱使用pH为约2.5-4.5的洗脱缓冲液，在低盐浓度下进行(如约0-0.25M盐)。
通过本领域接受的许多利用感兴趣蛋白质物理特性的技术可完成重组蛋白质分离和纯化，所述物理特性如大小、电荷、疏水性和亲和力等。在一个实施方式中，用本领域已知方法，如大小排阻色谱、离子交换色谱和亲和色谱等对本发明的蛋白质进行分离/纯化。在另一实施方式中，通过蛋白A亲和色谱纯化本发明的蛋白质。在另一实施方式中，通过使用该蛋白内的一种或多种结合特异性的亲和色谱对本发明的蛋白质进行纯化。
应当理解的是，多特异性表位结合蛋白的组成表位结合域基本保持了分离的相同功能性表位结合域所具有的所有功能。在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白的组成表位结合域基本保持了分离的相同功能性表位结合域所具有的一种或多种功能。在一个实施方式中，多特异性表位结合蛋白的表位结合域所显示的功能包括但不限于特异性、亲和力、激动性(参见如图29、30和31)、拮抗性、交联特性，基本与分离的相同表位结构域所显示的功能相同。在另一实施方式中，多特异性表位结合蛋白的组成表位结合域保留了分离的相同功能性表位结合域的一种或多种功能活性的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或至少160％。
开发出合适的结合实验以确认本发明蛋白质的功能性。除了本领域已详细描述的技术如ELISA、
Figure GPA00001010429401201
和KinExATM，本发明还提供确定多特异性表位结合蛋白功能的实验。在一个实施方式中，本发明蛋白质的功能可用实施例部分所述方法进行检测。在另一实施方式中，本发明蛋白质的功能可用实施例10所述方法进行检测。在另一实施方式中，本发明蛋白质的功能可用实施例13-20所述方法进行检测。
开发出合适的实验以确认本发明蛋白质的稳定性。在一个实施方式中，用本领域已知技术表征本发明蛋白质的稳定性。在其它实施方式中，通过聚集和/或片段化率或概况评价本发明蛋白质的稳定性。使用多种技术确定聚集或片段化水平。在一个实施方式中，用下列手段评价聚集和/或片段化概况：分析超速离心(AUC)、大小排阻色谱(SEC)、高效大小排阻色谱(HPSEC)、熔点温度(Tm)，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、光散射(SLS)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、尿素诱导的蛋白质展开技术、固有色氨酸荧光、差示扫描量热法或1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白质结合技术。在另一实施方式中，本发明蛋白质的稳定性通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析进行表征。在另一实施方式中，本发明蛋白质的稳定性通过实施例3和6中所述方法进行表征。在另一实施方式中，本发明蛋白质的稳定性通过大小排阻色谱(SEC)分析进行表征。在另一实施方式中，本发明蛋白质的稳定性通过实施例10中所述方法进行表征。在另一实施方式中，本发明蛋白质的稳定性可用实施例13-20所述方法进行检测。
稳定性的另一种测定是蛋白质对蛋白酶降解所表现出的相对耐受。在一个实施方式中，本发明蛋白质的稳定性通过蛋白酶耐受实验进行表征。在一个实施方式中，蛋白酶耐受实验中所使用的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或谷氨酸蛋白酶。在一个实施方式中，对本发明蛋白质进行蛋白酶耐受实验，其中蛋白酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，组织蛋白酶B、D、L或G，胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、HIV-1蛋白酶、凝乳酶、肾素、疟原虫蛋白酶(plasmepsin)、纤溶酶，羧基肽酶E、胱冬酶1-10或钙蛋白酶。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白显示低水平的蛋白酶降解。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白显示蛋白酶(如，胰蛋白酶(20ng/1μg抗体/表位结合蛋白)或胰凝乳蛋白酶(20ng/1μg抗体/表位结合蛋白))耐受，其中37℃与蛋白酶孵育如1、12或24小时后，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的蛋白质未被消化。在另一实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白显示低水平的蛋白酶降解。在一些实施方式中，本发明的多特异性表位结合蛋白显示蛋白酶耐受，其中基本上如实施例28-29所述，与蛋白酶孵育后至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的蛋白质未被消化。
本发明还提供测试本发明多特异性表位结合蛋白的方法。可用本领域接受的许多技术评价抗体或抗体样分子的结合特异性，如噬菌体展示技术或其它基于ELISA的技术。在一个实施方式中，可通过本领域任何已知技术测试本发明蛋白质的结合特异性。在另一实施方式中，可通过本说明书所示任何技术测试本发明的蛋白质。在另一实施方式中，可通过基于ELISA的实验，如实施例10所述实验测试本发明蛋白质的结合特异性。在另一实施方式中，本发明蛋白质的结合特异性可用实施例13-20所述方法进行测试。
Q.监测多特异性表位结合蛋白制剂的稳定性和聚集的方法
基于蛋白质的理化结构及其生物学活性，可通过多种方法评价蛋白质制剂的稳定性。例如，为了研究蛋白质的变性，可使用如电荷转移吸收、热分析、荧光光谱、圆二色谱、NMR、rCGE(还原毛细管凝胶电泳)和HPSEC(高效大小排阻色谱)等方法。参见例如，Wang等，1988，J.of Parenteral Science&Technology 42(增刊)：S4-S26。
rCGE和HPSEC是最常见和最简单的评价蛋白质聚集体形成、蛋白质降解和蛋白质片段化的方法。因此，可通过这些方法评估本发明液体制剂的稳定性。
例如，可通过HPSEC或rCGE评价本发明液体制剂的稳定性，其中峰面积的百分比代表了非降解的多特异性表位结合蛋白。在一个实施方式中，将约250μg多特异性表位结合蛋白注射到配有TSK SW x1保护柱(6.0mm CX 4.0cm)的TosoH Biosep TSK G3000SWXL柱(7.8mmx30cm)中。用含0.1M硫酸钠和0.05％叠氮化钠的0.1M磷酸二钠溶液等度洗脱多特异性表位结合蛋白，流速0.8-1.0ml/min。用280nm处的UV吸光度检测洗脱的蛋白质。多特异性表位结合蛋白可与参照标准品平行进行检测，结果报告为产物单体峰占除已包含的观察到体积峰外所有其它峰的面积百分比。将早于单体峰洗脱的峰记载为聚集体百分数。
经HPSEC或rCGE测定，本发明的液体制剂的聚集水平较低直至无法检测，即聚集体占蛋白质重量的不多于5％、不多于4％、不多于3％、不多于2％、不多于1％或不多于0.5％，和/或片段化水平较低直至无法检测，即代表完整多特异性表位结合蛋白的峰面积占峰总面积80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、或99％或更高、或99.5％或更高。在SDS-PAGE的情况下，可测量放射性同位素染色或标记的每一条带的密度或放射性，并可获得代表非降解多特异性表位结合蛋白的条带的％密度或％放射性。
本发明的液体制剂中非功能性(如体内和/或体外没有功能)的二聚体或多聚体副产物(例如但不限于不需要的轻链二聚体)水平较低直至无法检测。此类不需要的二聚体或多聚体副产物可通过HPSEC、rCGE或SDS-PAGE进行测量。在一些实施方式中，经HPSEC或rCGE测定，本发明的液体制剂中非功能性二聚体或多聚体副产物水平较低直至无法检测，即副产物占蛋白质重量的不多于5％、不多于4％、不多于3％、不多于2％、不多于1％或不多于0.5％，或代表完整多特异性表位结合蛋白的峰面积占峰总面积的80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、或99％或更高、或99.5％或更高。或者，可使用放射性标记的氨基酸掺入，或多种免疫特异性试剂的Western印迹，通过SDS-PAGE探测不需要的副产物。
也可通过测量制剂中多特异性表位结合蛋白的生物学活性的任何实验评价本发明液体制剂的稳定性。多特异性表位结合蛋白的生物学活性包括但不限于：抗原结合活性、补体激活活性、Fc-受体结合活性、受体/配体中和活性、受体激动或拮抗等。可通过本领域熟练技术人员所知任何方法测量多特异性表位结合蛋白的抗原结合活性，包括但不限于ELISA、放射免疫实验、Western印迹等(参见Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibody：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，1988年第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nded.1988)(全文纳入本文作参考)。可通过本领域技术人员熟知的方法，例如HPSEC测定本发明液体多特异性表位结合蛋白制剂的纯度。通过如下方法评价液体多特异性表位结合蛋白制剂的洁净度“通过标称孔隙度为0.45μm的无菌滤器过滤该液体多特异性表位结合蛋白制剂，用测试液体抗体制剂接种无菌大豆-酪蛋白消化物培养基和液体巯基醋酸盐培养基。使用SterisureTM或SteritestTM方法时，在无菌条件下向各过滤装置中填充约100ml无菌大豆-酪蛋白消化物培养基或液体巯基醋酸盐培养基。使用常规方法时，在无菌条件下将经刺激的过滤物(filter)转移到100ml无菌大豆-酪蛋白消化物培养基或液体巯基醋酸盐培养基中。在合适温度下孵育该培养基，在14天中观察三次，以确认细菌或真菌生长。
本发明的液体制剂也表现出增强的体内稳定性(例如当给予哺乳动物时)。同样，可通过上述方法分析制剂中的成分多特异性表位结合蛋白以评价给予动物后的稳定性。在一些实施方式中，本发明的制剂在体内稳定至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或24小时或更长时间。在其它实施方式中，本发明的制剂在体内稳定至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天或30天或更长时间。在其它实施方式中，给予哺乳动物后，本发明的蛋白质或制剂的半衰期为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或24小时或更长时间。在其它实施方式中，给予哺乳动物后，本发明的蛋白质或制剂的半衰期为至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天或30天或更长时间。
R.药物组合物
在另一方面，本发明提供包含了与药学上可接受载体配制在一起的一种本发明多特异性表位结合蛋白或其组合的组合物，例如但不限于药物组合物。此类组合物可包含一种本发明多特异性表位结合蛋白或例如但不限于两种或多种不同的本发明多特异性表位结合蛋白的组合。例如，本发明的药物组合物可包含与靶抗原不同表位结合或具有补体活性的多特异性表位结合蛋白的组合。
本发明的药物组合物也可以联合治疗的方式进行给药，如与其它试剂联合给药。例如，联合治疗可包括本发明的多特异性表位结合蛋白与至少一种其它疗法的组合，其中所述疗法可为免疫疗法、化疗、放射治疗或药物疗法。
本发明的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些来源于无毒性无机酸，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和亚磷酸等的盐，以及来源于无毒性有机酸，如脂族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属，例如钠、钾、镁、钙等的盐，以及衍生自无毒有机胺，如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺和普鲁卡因等的盐。
本发明的药物组合物也可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
用于本发明药物组合物的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适混合物，植物油如橄榄油，以及可注射有机酯，如油酸乙酯。可通过使用涂覆材料如卵磷脂、如果是分散体则保持所需粒度、以及使用表面活性剂，来维持合适的流动性。
这些组合物还可包含辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌步骤和加入各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇和苯酚山梨酸等确保防止微生物的出现。组合物中也可能需要包含等张剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过加入能延缓吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶以实现可注射药物形式的长期吸收。
在制备和储存条件下，药物组合物通常必须无菌和稳定。可将组合物制成适合高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可通过使用涂覆材料如卵磷脂、如果是分散体则保持所需粒度以及使用表面活性剂，来维持合适的流动性。在许多清凉下，组合物中适合包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。
可将所需量的活性化合物和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后灭菌和微过滤，从而制备无菌注射液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载体中制备分散剂。当制备无菌注射液制备所需的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
在一个实施方式中，本发明组合物是基本不含内毒素和/或相关热原物质的无热原制剂。内毒素包括限定在微生物内并且仅在微生物破坏或死亡时释放的毒素。热原也包括来自细菌和其它微生物外膜的诱导发热的热稳定性物质(糖蛋白)。如果给予人，这些物质均可引起发热、低血压和休克。因为潜在毒性，有利的做法是从静脉内给药溶液中去除哪怕很低含量的内毒素。食品药品管理局(″FDA″)规定，在静脉内给药应用中，每小时给药的上限是5内毒素单位(EU)/剂量/千克体重(The United States Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum(美国药典会议，药典论坛)26(1)：223(2000))。当以数百或数千毫克每千克体重的剂量给予治疗性蛋白质时，最好去除即便是痕量的内毒素。在一个实施方式中，组合物中内毒素和热原水平低于10EU/mg、或低于5EU/mg、或低于1EU/mg、或低于0.1EU/mg、或低于0.01EU/mg、或低于0.001EU/mg。在另一实施方式中，组合物中内毒素和热原水平低于约10EU/mg、或低于约5EU/mg、或低于约1EU/mg、或低于约0.1EU/mg、或低于约0.01EU/mg、或低于约0.001EU/mg。
在一个实施方式中，本发明蛋白质和包含它的组合物可用于治疗癌症或其症状。在一个实施方式中，本发明包含的组合物可用于治疗头、脑、颈、皮肤、喉、肺、骨、乳腺、结肠、肝、胰腺、胃、肠、泌尿道、甲状腺、眼、睾丸、中枢神经系统、前列腺、卵巢、肾、直肠及肾上腺的实体瘤。在另一实施方式中，本发明包含的组合物可用于治疗癌症转移。在另一实施方式中，本发明的组合物可用于治疗非实体瘤，如但不限于骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
在另一实施方式中，本发明包含能够抑制癌细胞表型的组合物。在一个实施方式中，癌细胞的表型是细胞生长、细胞贴附、细胞贴附丧失、受体(如Eph)表达降低、受体(如Eph)表达升高、转移潜能、细胞周期抑制、受体酪氨酸激酶活化/抑制或其它。
在另一实施方式中，包含给予组合物，所述给药是口服、胃肠道外、肌肉内、鼻内、阴道、直肠、舌、舌下、口颊、口颊内、静脉内、经皮、皮下或透皮给药。
在另一实施方式中，本发明还包含与其它疗法，如化疗、激素疗法、生物疗法、免疫疗法或放射疗法联合给予该组合物。
S.剂量/给药
为了制备包含本发明的多特异性表位结合蛋白的药物或无菌组合物，将多特异性表位结合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂混合。可通过与冻干粉末、浆液、水溶液、洗剂或悬浮液形式的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见例如Hardman等(2001)Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，纽约州纽约的MGH公司(McGraw-Hill，New York，N.Y.)；Gennaro(2000)《雷鸣顿：药物科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)；Lippincott，Williams和Wilkins，纽约州纽约；Avis等(编)(1993)《药物剂型：胃肠道外药物》(Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications)；纽约州MD公司(Marcel Dekker，NY)；Lieberman等(编)(1990)《药物剂型：片剂》(Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets)，纽约州MD公司；Lieberman等(编)(1990)《药物剂型：分散体系》(Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems)，纽约州MD公司；Weiner和Kotkoskie(2000)《赋形剂毒性和安全性》(ExcipientToxicity and Safety)，纽约州纽约的MD公司)。
对于治疗剂给药方案的选择基于数种因素，包括血清或组织中实体的周转速率、症状的水平、实体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可接近性。在某些实施方式中，在与可接受水平的副作用相一致的情况下，给药方案将最大治疗量递送给病人。因此，生物递送量部分取决于特定实体和所治疗症状的严重程度。可获得选择抗体、细胞因子和小分子的合适剂量的指导原则(参见例如Wawrzynczak(1996)《抗体治疗》(Antibody Therapy)，英国牛津郡生物科学出版公司(Bios Scientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK)；Kresina(编)(1991)《单克隆抗体，细胞因子和关节炎》(Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis)，纽约MD公司(Marcel Dekker，New York，N.Y.)；Bach(编)(1993)《自身免疫病中的单克隆抗体和多肽治疗》(Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases)，纽约MD公司(Marcel Dekker，New York，N.Y.)；Baert等(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz，等(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
临床医生使用本领域已知或怀疑会影响治疗或预测会影响治疗的参数或因素确定合适的剂量。通常，以稍低于最佳剂量的剂量开始，然后小量递增直至相对任何不良副作用达到所需或最优效果。重要的诊断测量包括如对炎症症状或炎性细胞因子产生水平的测量。
可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，从而在具体患者、组成与给药方式条件下有效实现所需治疗应答且对患者无毒性的活性成分含量。所选剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其脂、盐、酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用特定组合物联用的其他药物、化合物和/或材料，年龄、性别、体重、病症、整体健康状况、所治疗病人的病史以及医学领域所知类似因素。
包含本发明的多特异性表位结合蛋白的组合物可通过连续输注提供，或以如1天、1周或每周1-7次的间隔提供。给药可以静脉内、皮下、局部、口服、鼻内、直肠、肌肉内、脑内或吸入的方式进行。具体的给药方案涉及避免显著不良副作用的最大剂量或给药频率。每周总剂量可以是至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少25mg/kg或至少50mg/kg(参见如Yang等(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。以摩尔/千克体重计，多特异性表位结合蛋白的所需剂量与抗体或多肽类似。以摩尔/千克体重计，多特异性表位结合蛋白治疗所需血清浓度与抗体或多肽类似。该剂量可以是至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg。给予对象的剂量可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多次。
对于本发明的多特异性表位结合蛋白，给予病人的剂量可以是0.0001mg/kg-100mg/kg病人体重。该剂量可以是0.0001mg/kg-20mg/kg、0.0001mg/kg-10mg/kg、0.0001mg/kg-5mg/kg、0.0001-2mg/kg、0.0001-1mg/kg、0.0001mg/kg-0.75mg/kg、0.0001mg/kg-0.5mg/kg、0.0001mg/kg-0.25mg/kg、0.0001-0.15mg/kg、0.0001-0.10mg/kg、0.001-0.5mg/kg、0.01-0.25mg/kg或0.01-0.10mg/kg病人体重。
本发明的多特异性表位结合蛋白的剂量可以用病人体重千克数(kg)乘以所给剂量mg/kg进行计算。本发明的多特异性表位结合蛋白的剂量可以是150μg/kg病人体重或更少、125μg/kg或更少、100μg/kg或更少、95μg/kg或更少、90μg/kg或更少、85μg/kg或更少、80μg/kg或更少、75μg/kg或更少、70μg/kg或更少、65μg/kg或更少、60μg/kg或更少、55μg/kg或更少、50μg/kg或更少、45μg/kg或更少、40μg/kg或更少、35μg/kg或更少、30μg/kg或更少、25μg/kg或更少、20μg/kg或更少、15μg/kg或更少、10μg/kg或更少、5μg/kg或更少、2.5μg/kg或更少、2μg/kg或更少、1.5μg/kg或更少、1μg/kg或更少、0.5μg/kg或更少或0.5μg/kg或更少。
本发明的多特异性表位结合蛋白的单位剂量可以是0.1mg-20mg、0.1mg-15mg、0.1mg-12mg、0.1mg-10mg、0.1mg-8mg、0.1mg-7mg、0.1mg-5mg、0.1-2.5mg、0.25mg-20mg、0.25-15mg、0.25-12mg、0.25-10mg、0.25-8mg、0.25mg-7m g、0.25mg-5mg、0.5mg-2.5mg、1mg-20mg、1mg-15mg、1mg-12mg、1mg-10mg、1mg-8mg、1mg-7mg、1mg-5mg或1mg-2.5mg。
给予本发明多特异性表位结合蛋白剂量在对象中可达到的血清效价为至少0.1μμg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml。或者，给予本发明多特异性表位结合蛋白剂量在对象中可达到的血清效价为至少0.1μμg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml。
可重复给予本发明的多特异性表位结合蛋白的剂量，给药间隔至少为1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
对于特定病人有效量可以是不同的，取决于如所治疗的病症、病人总体健康、给药方法途径和剂量以及副作用严重性(参见如Maynard等(1996)《药物临床试验质量管理规范SOP手册》(A Handbook of SOPs for Good ClinicalPractice)，英佛罗里达州伯克莱屯特法姆出版社(Interpharm Press，Boca Raton，Fla.)；Dent(2001)《药物实验室和临床试验质量管理规范》(Good Laboratory andGood Clinical Practice)，英国伦敦UP公司(Urch Publ.，London，UK)。
给药途径可以是，例如局部或皮肤应用、静脉内注射或输液、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病损内或缓释系统或植入物给药(参见例如Sidman等(1983)Biopolymers 22：547-556；Langer等(1981)J.Biomed.Mater.Res.15：167-277；Langer(1982)Chem.Tech.12：98-105；Epstein等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692；Hwang等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034；美国专利号6,350466和6,316,024)。如果需要，组合物也可含有增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因来减轻注射部位的疼痛。此外，也可采用经肺给药，例如利用吸入器或喷雾器，和用雾化剂配制药物。参见例如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO97/44013、WO 98/31346以及WO 99/66903，将其每一全文纳入本文作参考。在一个实施方式中，使用Alkermes AIRTM经肺药物递送技术(麻省剑桥爱而克默公司)(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)给予本发明的抗体、联合疗法或组合物。
本发明的组合物还可通过使用一种或多种本领域已知方法的一种或多种途径进行给药。本领域熟练技术人员应当理解，给药的途径和/或方式根据所需结果而有所不同。本发明多特异性表位结合蛋白给药所选的途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其它胃肠道外给药途径，例如通过注射或输注。胃肠道外给药代表除肠道和局部给药外的给药形式，通常通过注射，例如但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注给药。或者，本发明的组合物可以通过非胃肠道外途径给药，如通过局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或外用途径给药。
如果本发明的多特异性表位结合蛋白通过控释或者缓释系统给药，可使用泵达到控释或者缓释的目的(参见Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。可使用聚合物材料实现本发明疗法的控释或者缓释(参见如《控释的医学应用》(Medical Applications of ControlledRelease)，Langer和Wise(编)，佛罗里达州博卡拉顿CRC出版社(CRC Pres.，Boca Raton，Fla.)(1974)；《受控的药物生物利用度，药物产品的设计和性能》(Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance)，Smolen和Ball(编)，纽约韦利公司(Wiley，NY)(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还可参见Levy等，1985，Science228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；以及PCT公开号WO 99/20253。缓释制剂中所用聚合物的例子包括但不限于：聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方式中，缓释制剂中所使用的聚合物为惰性、不含可浸提杂质、稳定储存、无菌且可生物降解的物质。可将控释或缓释系统放置于预防或治疗靶点附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见如前述Goodson，《控释的医学应用》(Medical Applications ofControlled Release)，第2卷，115-138(1984))。
Langer(1990，Science 249：1527-1533)讨论了控释系统。任何本领域所知技术可用于生产包含一种或多种本发明多特异性表位结合蛋白的缓释制剂。参见例如美国专利号4,526,938，PCT公开号WO 91/05548，PCT公开号WO96/20698，Ning等，1996，″Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human ColonCancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel″(用缓释凝胶对人结肠癌异种移植瘤进行肿瘤内放射性免疫治疗)Radiotherapy&Oncology 39：179-189，Song等，1995，″Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions″(抗体介导的长期循环乳剂的肺靶向)PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50：372-397，Cleek等，1997，″Biodegradable Polymeric Carriers for abFGF Antibody for Cardiovascular Application″(在心血管应用中用于bFGF抗体的生物可降解聚合物载体)Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854，以及Lam等，1997，″Microencapsulation of Recombinant HumanizedMonoclonal Antibody for Local Delivery″(用于局部递送的重组人源化单克隆抗体的微囊化)Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，将其每一文献全文纳入本文作参考。
如果将本发明多特异性表位结合蛋白进行局部给药，可将其制成油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液剂、乳剂或本领域熟练技术人员所知其它形式。参见例如《雷鸣顿药物科学和药物给药形式导论》(Remington′s Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms)，第19版，宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司(Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995))。对于非喷雾局部给药形式，通常使用含有与局部应用相容、具有动态粘度、在一些情况下粘度大于水的载体或一种或多种赋形剂的粘稠至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、油膏剂、粉末剂、搽剂、软膏剂等，需要的话它们可以是无菌的并与辅料(如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合以影响多种特性，例如渗透压。其它合适的局部剂型包括喷雾气溶胶制剂，其中在一些情况下，将活性成分和固体或液体惰性载体包装在包含加压挥发物(如气体推进剂，如氟利昂)的混合物中或挤压瓶中。需要的话可以在药物组合物中加入保湿剂或增湿剂。本领域熟知此类添加组分的例子。
如果含多特异性表位结合蛋白的组合物进行鼻内给药，可将其制成气雾剂、喷雾剂、雾剂或滴剂的形式。具体说，可以使用合适推进剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)的加压包装或喷雾器中气溶胶喷雾的形式将本发明使用的预防剂或治疗剂进行常规递送。在加压气溶胶的情况下，可通过阀门递送计量用量，以确定剂量单位。可将用于吸入或吹入的胶囊和药囊(由(如)明胶组成)制成含有化合物和合适粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本领域了解与第二种治疗剂如细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或放射线共同给药和治疗的方法(参见例如Hardman等(编)(2001)《固特曼和吉尔曼治疗的药理学基础》(Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第10版增刊(10.sup.th ed.)，纽约麦高黑尔公司(McGraw-Hill，NewYork，N.Y.)；Poole和Peterson(编)(2001)药物治疗高级实践；实践方法》(Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach)，宾夕发尼亚州林普科特、威廉和维尔进公司(Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，Pa.)；Chabner和Longo(编)(2001)《癌症化疗和生物治疗》(Cancer Chemotherapy andBiotherapy)，宾夕发尼亚州林普科特、威廉和维尔进公司(Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减轻至少10％、20％、约30％、40％或至少50％。
与本发明多特异性表位结合蛋白联合给药的其它疗法(如预防剂或治疗剂)可与本发明多特异性表位结合蛋白的给药间隔小于5分钟、小于30分钟、1小时、约1小时、约1-2小时、约2小时-约3小时、约3小时-约4小时、约4小时-约5小时、约5小时-约6小时、约6小时-约7小时、约7小时-约8小时、约8小时-约9小时、约9小时-约10小时、约10小时-约11小时、约11小时-约12小时、约12小时-18小时、18小时-24小时、24小时-36小时、36小时-48小时、48小时-52小时、52小时-60小时、60小时-72小时、72小时-84小时、84小时-96小时、或96小时-120小时。在同一次病人就诊期间可给予两种或多种疗法。
可对本发明的多特异性表位结合蛋白和其它疗法进行周期给药。周期性治疗包括给予第一治疗(如，第一种预防剂或治疗剂)一段时间，然后给予第二治疗(如，第二种预防剂或治疗剂)一段时间，任选地，之后给予第三治疗(如，预防剂或治疗剂)一段时间等等，并重复此种顺次给药即该周期，以降低对一种治疗发生耐受的概率、避免或减轻一种治疗的副作用和/或提高这些治疗的功效。
在某些实施方式中，可将本发明的多特异性表位结合蛋白制剂以保证合适的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了保证本发明的治疗性化合物跨越BBB(需要的话)，可将其制成，如脂质体。关于制备脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811、5,374,548、和5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性转运至特定细胞或器官的部分，从而增强靶向药物递送(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗生素(P.G.Bloeman等，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等，(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本发明提供将含本发明多特异性表位结合蛋白的药物组合物单独给予或与其它疗法联合给予需要对象的方法。本发明联合治疗中的疗法(如预防剂或治疗剂)可同时给予或依次给予对象。本发明联合治疗中的疗法(如预防剂或治疗剂)也可周期性给药。周期性治疗包括给予第一疗法(如，第一种预防剂或治疗剂)一段时间，然后给予第二疗法(如，第二种预防剂或治疗剂)一段时间，并重复此种顺次给药，即该周期，以降低对一种疗法(如药剂)发生耐受的概率、避免或减轻一种疗法(如药剂)的副作用和/或提高这些治疗的功效。
本发明联合治疗中的疗法(如预防剂或治疗剂)可同时给予对象。术语“同时”并不限于在完全相同的时间给予疗法(如预防剂或治疗剂)，而意味着在一定时间间隔内将含本发明多特异性表位结合蛋白的药物组合物依次给予对象，使本发明的多特异性表位结合蛋白能够与其它疗法共同作用以提供优于其它给药方法的受益。例如，可将每一疗法在相同时间或在不同时间点以任何顺序依次给予对象；然而，如果没有在同一时间给药，应将它们在足够接近的时间内给药以提供所需治疗或者预防效果。可将每一疗法以任何合适形式通过任何合适途径分别给予对象。在各种实施方式中，给予对象的疗法(如预防剂或治疗剂)相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时、约1小时、约1小时-约2小时、约2小时-约3小时、约3小时-约4小时、约4小时-约5小时、约5小时-约6小时、约6小时-约7小时、约7小时-约8小时、约8小时-约9小时、约9小时-约10小时、约10小时-约11小时、约11小时-约12小时、24小时、48小时、72小时、或1周。在其它实施方式中，可在同一次病人就诊期间给予两种或多种疗法(如预防剂或治疗剂)。
可在同一药物组合物中给予对象联合疗法的预防剂或治疗剂。或者，可以用单独的药物组合物将联合疗法的预防剂或治疗剂同时给予对象。可将预防剂或治疗剂通过相同或不同给药途径给予对象。
T.药盒
本发明的范围还包括含有本发明组合物(如多特异性表位结合蛋白)及其使用说明的药盒。药盒还可包含至少一种其它试剂或另外一种或多种本发明多特异性表位结合蛋白。药盒通常包含标明药盒内容的指定用途的标签。术语标签包括药盒上或与药盒一起提供的文字或记录材料，或者其它伴随药盒的内容。
等同方案
本领域技术人员应了解或能够确定，只使用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。这类等同形式应包含在所附权利要求书的范围内。
将本说明书中提及的所有发表物、专利和专利申请纳入本说明书作参考，如同专门和单独将各篇发表物、专利或专利申请纳入本文作参考的程度一样。
U.具体实施方式
1.一种包含第一和第二条多肽链的分离的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一和/或第二条链包含至少两个表位结合域(EBD)以及一个或多个Fc区。
2.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含连接于至少一个EBD的N-末端的一个或多个Fc区。
3.如实施方式2所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：一个或多个Fc区-EBD-EBD。
4.如实施方式2所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：EBD-一个或多个Fc区-EBD。
5.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含连接于至少一个EBD的C-末端的一个或多个Fc区。
6.如实施方式5所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区。
7.如实施方式5所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD。
8.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第二条链包含连接于至少一个EBD的N-末端的一个或多个Cκ或Cλ区。
9.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第二条链包含连接于至少一个EBD的C-末端的一个或多个Cκ或Cλ区。
10.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一和/或第二条链包含至少三个EBD。
11.如实施方式10所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一和/或第二条链包含至少四个表位结合域EBD。
12.如实施方式10或11所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，每一Fc区连接于至少三个EBD的N末端。
13.如实施方式12所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD。
14.如实施方式12所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD-EBD。
15.如实施方式10或11所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，每一Fc区连接于至少一个EBD的C末端。
16.如实施方式15所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-EBD-一个或多个Fc区。
17.如实施方式16所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-EBD-EBD-一个或多个Fc区。
18.如实施方式10或11所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，每一Fc区连接于至少一个EBD的N末端和至少一个EBD的C末端。
19.如实施方式18所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：至少一个EBD-一个或多个Fc区-至少一个EBD。
20.如实施方式18所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD。
21.如实施方式18所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD。
22.如实施方式18所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD。
23.如实施方式18所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD。
24.如实施方式18所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD。
25.如实施方式10所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条多肽链包含3个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv，并且其中所述第二条多肽链包含3个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv。
26.如实施方式11所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条多肽链包含4个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv，并且其中所述第二条多肽链包含4个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv。
27.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质包含第一和第二条链；
所述第一条链包含scFv、抗体可变区和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Fc区；和
所述第二条链包含抗体可变区和Cκ/λ区，从N末端到C末端排列为：抗体可变区-Cκ或Cλ。
28.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质包含第一和第二条链；
所述第一条链包含抗体可变区和Fc区，从N末端到C末端排列为：抗体可变区-Fc区；并且
所述第二条链包含scFv、抗体可变区和Cκ/λ区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Cκ或Cλ。
29.如实施方式1所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质包含第一和第二条链；
所述第一条链包含scFv、抗体可变区和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Fc区；并且
所述第二条链包含scFv、抗体可变区和Cκ/λ区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Cκ或Cλ。
30.如实施方式27-29中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少两个EBD与至少一个Fc区的C-末端连接。
31.如实施方式27-30中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质包含抗体重链和抗体轻链。
32.一种包含第一和第二条多肽链的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一和/或第二条链包含至少两个表位结合域(EBD)以及一个或多个CH1结构域。
33.如实施方式32所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质还包含Cκ/λ结构域。
34.如实施方式33所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含连接于CH1结构域的2个scFv，从N末端到C末端排列为：scFv-CH1-scFv，所述第二条链包含连接于Cκ/λ结构域的2个scFv，从N末端到C末端排列为：scFv-Cκ/λ-scFv。
35.如实施方式34所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一和/或第二条链包含全部或部分抗体铰链结构域。
36.如实施方式35所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一和第二条多肽链由二硫键连接。
37.一种至少包含第一和第二条链的多特异性表位结合蛋白，所述第一条链包含两个可变结构域和Cκ或Cλ结构域，所述第二条链包含两个可变结构域、CH1、铰链、CH2和CH3结构域，其中所述第一条链中的所述可变结构域与所述第二条链中的所述可变结构域联合形成至少两个不同的表位结合位点。
38.如实施方式37所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含从N末端到C末端排列的对第一表位和第二表位特异性的可变结构域，所述第二条链包含从N末端到C末端排列的对所述第一和第二表位特异性的可变结构域。
39.一种包含第一和第二条链的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一条链包含至少2个抗体可变区和至少一个CH1和/或Cκ/λ结构域，所述第一条链中的所述可变结构域与所述第二条链中的所述可变结构域联合形成至少两个不同的表位结合位点。
40.如实施方式39所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含抗体重链可变结构域(VH)、CH1结构域、抗体轻链可变结构域(VL)和Cκ/λ结构域。
41.如实施方式40所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VH-CH1-VL-Cκ/λ。
42.如实施方式40所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VL-Cκ/λ-VH1-CH1。
43.如实施方式39所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含2个抗体重链可变结构域(VH)和两个CH1结构域。
44.如实施方式43所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VH-CH1-VH-CH1。
45.如实施方式39所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链包含2个抗体轻链可变结构域(VL)和两个Cκ/λ结构域。
46.如实施方式45所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VL-Cκ/λ-VL-Cκ/λ。
47.如实施方式39-46中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链还包含Fc区。
48.如实施方式39-46中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第二条链不包含Fc区。
49.一种至少包含第一和第二条多肽链的反向抗体蛋白，其中所述第一条链包含至少一个连接于CH1结构域的抗体重链可变区(VH)，所述第二条链包含连接于Cκ/λ结构域的抗体轻链可变区(VL)，所述Cκ/λ结构域还连接于Fc区，其中所述第一条链中的所述可变区与所述第二条链中的所述可变区联合形成表位结合位点。
50.如实施方式49所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述第一条链与第二条链通过二硫键连接。
51.一种包含抗体样轻链和抗体样重链的多特异性表位结合蛋白，其中所述轻链包含两个可变结构域和Cκ或Cλ结构域，并且所述重链包含两个可变结构域、CH1、铰链、CH2和CH3结构域，其中所述轻链中的所述可变结构域与所述重链中的所述可变结构域联合形成至少两个不同的表位结合位点。
52.如实施方式51所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述轻链包含从N末端到C末端排列的对第一表位和第二表位特异性的可变结构域，并且所述重链包含从N末端到C末端排列的对所述第一和第二表位特异性的可变结构域。
53.如实施方式52所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质还包含至少两个连接的EBD。
54.如实施方式53所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的C末端。
55.如实施方式53所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD连接于所述轻链的N末端。
56.如实施方式53所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的N末端。
57.一种包含抗体轻链和抗体重链的多特异性表位结合蛋白，其中所述重链还包含至少2个连接的EBD。
58.如实施方式57所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的C末端。
59.如实施方式57所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的N末端。
60.如实施方式57所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的N末端和C末端。
61.一种包含第一和第二条多肽链的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一和/或第二条链包含至少三个EBD，所述第一条链包含Cκ或Cλ结构域，所述第二条链包含CH1结构域。
62.一种包含图1-5中任一幅出现的结构形式的多特异性表位结合蛋白(或任何本发明蛋白质)。
63.如实施方式1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，每一EBD对相同表位具有特异性。
64.如实施方式1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少两个EBD对不同表位具有特异性。
65.如实施方式63或64所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，每一表位定位于相同抗原。
66.如实施方式65所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，每一表位定位于不同抗原。
67.如实施方式1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，两个或多个EBD对相同表位具有特异性。
68.如实施方式1-67中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，当体外应用或给予哺乳动物时，该蛋白质能同时与至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个表位结合。
69.如实施方式1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD与表位特异性结合的亲和力小于分离的相同功能性EBD。
70.如实施方式69所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述EBD选自下组：最靠近N末端的EBD、第二最靠近N末端的EBD以及第三最靠近N末端的EBD。
71.如实施方式1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD选自下组：scFv、单链双抗体、抗体模拟物和抗体可变结构域。
72.如实施方式71所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述抗体模拟物选自下组：小抗体、大抗体、高亲合性多聚体、基于Fn3的蛋白质支架、锚蛋白重复、VASP多肽、鸟胰腺多肽(aPP)、四连接素、亲和蛋白、绳结蛋白、SH3、PDZ结构域、蛋白A结构域、脂笼蛋白、转铁蛋白和库尼茨结构域。
73.如实施方式1-72中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质特异性结合于不同细胞表面受体并抑制和/或中和所述细胞表面受体。
74.如实施方式73所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述细胞表面受体是相同的受体。
75.如实施方式74所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述细胞表面受体是不同的受体。
76.如实施方式1-75中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质特异性结合于不同可溶性配体并抑制和/或中和所述配体。
77.如实施方式76所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述可溶性配体是相同的配体。
78.如实施方式76所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述可溶性配体是不同的配体。
79.如实施方式1-78中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质特异性结合于不同靶蛋白并抑制和/或中和所述靶蛋白。
80.如实施方式79所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述靶蛋白是相同的。
81.如实施方式79所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述靶蛋白是不同的。
82.如实施方式1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，至少一个EBD保持分离自所述蛋白质的相同EBD的功能活性。
83.如实施方式1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质的功能活性至少与包含分离自所述蛋白的每一EBD的组合物相等。
84.如实施方式1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质的功能活性高于包含分离自所述蛋白的每一EBD的组合物。
85.如实施方式1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质的功能活性比包含分离自所述蛋白的每一EBD的组合物弱50％。
86.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质具有消耗选自下组的细胞群的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
87.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞群增殖的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
88.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞分泌炎性介导物的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
89.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞分泌胞质颗粒的功能活性：T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。
90.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞对活化刺激产生响应的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
91.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质具有通过与一个或多个表位结合活化蛋白质的功能活性。
92.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质具有通过与一个或多个表位结合使蛋白质失活的功能活性。
93.如实施方式1-85中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，当给予哺乳动物或体外应用时，所述蛋白质具有效应功能。
94.如实施方式93所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述效应功能是抗体依赖性细胞毒作用。
95.如实施方式93所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述效应功能是补体依赖性细胞毒作用。
96.一种编码实施方式1-95中任一项所述蛋白质或其表位结合部分(或任何本发明蛋白质)的分离的核酸分子。
97.一种包含实施方式96所述核酸分子的表达载体。
98.一种包含实施方式97所述表达载体的宿主细胞。
99.一种制备实施方式1-95中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)的方法，其中所述方法包括制备所述蛋白质的规模化工艺，其中由所述规模化工艺得到所述蛋白质的生产效率为约10mg/L-300mg/L，并且所述蛋白质保持至少一种功能活性。
100.如实施方式99所述的方法，其特征在于，通过HPSEC测量，以蛋白质重量计，所述工艺产生的所述蛋白质的聚集水平不高于5％。
101.如实施方式99所述的方法，其特征在于，通过rCGE测量，以蛋白质重量计，所述工艺产生的所述蛋白质的聚集水平不高于5％。
102.如实施方式99所述的方法，其特征在于，所述工艺产生的所述蛋白质显示低的片段化水平，通过HPSEC测量，代表完整所述蛋白质的峰占峰总面积的80％或更高。
103.一种包含实施方式1-95中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)的液体制剂，通过HPSEC测量，以蛋白质重量计，所述制剂的聚集水平不高于5％。
104.一种包含实施方式1-95中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)的液体制剂，通过rCGE测量，以蛋白质重量计，所述制剂的聚集水平不高于5％。
105.一种包含实施方式1-95中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)的液体制剂，其中所述制剂显示低的片段化水平，通过HPSEC测量，代表完整所述蛋白质的峰占峰总面积的80％或更高。
106.一种包含治疗有效量的实施方式1-95中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)和药学可接受赋形剂的无菌制剂。
107.一种通过给予需要的病人实施方式106所述的制剂改善、治疗或预防癌症或其症状的方法。
108.如实施方式107所述的方法，其特征在于，所述癌症是头、颈、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、结肠、直肠、结直肠、胃、脾、肾、骨骼肌、皮下组织、转移性黑色素瘤、子宫内膜、前列腺、乳腺、卵巢、睾丸、皮肤、甲状腺、血液、淋巴结、肾、肝、胰腺、脑或中枢神经系统的癌症。
109.一种消耗哺乳动物中细胞群的方法，包括将实施方式106所述制剂与所述细胞接触，其中所述细胞群选自嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞和肿瘤细胞。
110.一种杀伤或靶向病原体的方法，包括将实施方式106所述的制剂与哺乳动物中的病原体接触。
111.一种失活、抑制或消耗细胞因子的方法，包括将实施方式106所述的制剂与哺乳动物中的所述细胞因子接触。
112.如实施方式111所述的方法，其特征在于，所述细胞因子是C5a。
113.一种通过给予需要的病人实施方式106所述的制剂预防、治疗、控制或诊断炎性疾病或自身免疫病的方法。
114.一种通过给予需要的病人实施方式106所述制剂抑制血管新生的方法。
115.如实施方式113或114所述的方法，其特征在于，所述病人罹患癌症、类风湿性关节炎、SLE或舍格伦综合征。
116.如实施方式1-95中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，当给予哺乳动物或体外应用时，所述蛋白质识别和/或消耗通过表达不同细胞表面表位限定的细胞群，所述蛋白质的至少一个表位结合域选择性结合所述不同细胞表面表位。
117.如实施方式116中所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述细胞群选自下组：肿瘤细胞、癌症干细胞、B细胞和T细胞。
118.如实施方式1-95中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质包含对肿瘤细胞呈现的细胞表面抗原具有特异性的表位结合域。
119.如实施方式118所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述细胞表面抗原不同时呈现。
120.如实施方式118或119所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，当给予哺乳动物时所述蛋白质引起抗体效应功能，当至少一个表位结合域发生结合时，靶向肿瘤细胞。
121.如实施方式1-95中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述蛋白质包含对准备在所述蛋白质给予哺乳动物或体外应用时递送至细胞的货物分子具有特异性的至少一个表位结合域。
122.如实施方式121所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述货物分子选自下组：细胞毒药物、抗代谢剂、毒素、肽、DNA分子、RNA分子、小分子、放射性同位素、荧光团、酶、酶抑制剂、前药或线粒体毒剂。
123.如实施方式121或122中所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，当结合于所述细胞时，所述蛋白质内化。
124.如实施方式121-123中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，对货物分子具有特异性的所述表位结合域在pH约7.4时对所述货物分子显示高结合亲和力，在pH约6.0时对所述货物分子显示低结合亲和力。
125.一种鉴定、消耗、活化或抑制靶细胞群的方法，包括当给予哺乳动物或体外应用时，将实施方式1-95中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)与所述靶细胞群接触，其中所述蛋白质不显著消耗、活化或抑制非靶细胞群。
126.如实施方式125所述的方法，其特征在于，与对照表位结合蛋白相比，所述蛋白质与靶细胞群的亲合力提高，其中所述对照表位结合蛋白包含：
在所述多特异性表位结合蛋白中出现的表位结合域子集；或
在所述多特异性表位结合蛋白中出现的至少一个分离的表位结合域。
127.如实施方式126所述的方法，其特征在于，所述子集包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个表位结合域。
128.如实施方式125-127所述的方法，其特征在于，所述靶细胞选自下组：癌细胞、癌症干细胞、T细胞、B细胞、黑色素瘤细胞、淋巴瘤细胞、肿瘤细胞、前B细胞、前T细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。
129.一种使用实施方式1-95或116-124中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)预防、控制、治疗或诊断病人的急性或慢性疾病的方法。
130.一种使用实施方式107-115或125-128中任一项所述方法预防、控制、治疗或诊断病人的急性或慢性疾病的方法。
131.一种在哺乳动物中使用实施方式1-95或116-124中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)降低与接触一种或多种药剂有关的毒性的方法，所述药剂选自下组：相思豆毒蛋白、马钱子碱、毒芹素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺菌毒素、内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇、α毒素、格尔德霉素、白树毒素、百脉根苷、蓖麻毒蛋白、番木鳖硷、蛇毒毒素和河豚毒素。
132.一种使用实施方式1-95或116-124中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)检测和/或纯化溶液中的至少一种可溶性化合物的方法。
133.如实施方式132所述的方法，其特征在于，所述溶液是体液、细胞培养液、发酵培养液、生物样品或饮用水。
134.如实施方式133所述的方法，其特征在于，所述体液选自血液、汗液、淋巴、尿液、泪液、胆汁、唾液、血清、羊水，耳垢(耳蜡)、考珀液、精液、乳糜、钟液、脑脊液、粪便、粪便水、胰液、滑膜液、房水、组织间液、乳汁、黏液、胸膜液、脓、皮脂和呕吐物。
135.一种使用实施方式1-95或116-124中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)降低哺乳动物中细胞因子风暴毒性的方法。
136.一种使用实施方式1-95或116-124中任一项所述蛋白质(或任何本发明蛋白质)降低哺乳动物中治疗诱导毒性的方法，其中所述治疗是生物疗法。
137.如实施方式136所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包含至少一个源自所述生物疗法的表位结合域。
138.如实施方式136所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包含至少一个与所述生物疗法的至少一个组分竞争的表位结合域。
139.如实施方式1-95或116-124中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，当给予哺乳动物时，所述蛋白质的半衰期至少为1天。
140.如实施方式1-95或116-124中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述Fc区直接与至少一个其它结构域连接。
141.如实施方式1-95或116-124中任一项所述的蛋白质(或任何本发明蛋白质)，其特征在于，所述Fc区与至少一个其它结构域间接连接。
此外，通过引用将下列美国临时专利申请号：2007年7月31日提交的60/935,199；2007年12月10日提交的61/012,656和2008年6月20日提交的61/074,330全文纳入本文用作所有目的。
7.实施例
以下实施例只是用来说明本发明，而不以任何方式对本发明构成限制。
实施例1.表达包含融合于Fc区的scFv结构域的蛋白质
目的：为了说明包含连接于Fc区的scFv结构域的表位结合蛋白的高水平表达。
方法：按照生产商推荐方案，使用293FectinTM试剂(英杰目录号51-0031)和FreestyleTM培养基(英杰目录号12338)+10％胎牛血清，以编码3F2-522-Fc区和522-Fc区的载体转染293F细胞。在转染后第三天饲喂(feed)细胞，在第六天收获上清液。通过蛋白A柱纯化抗体，然后用PBS透析。在蛋白质凝胶上评价变性和非变性形式的分子，以确定该蛋白的大小和相对纯度。
结果：图7显示PAGE凝胶实验的结果，其中对各种蛋白质施以(A)非变性或(B)变性条件。泳道1和5代表3F2-522-Fc区(2个连接于Fc区的scFv结构域的例子)，上样量1微克/孔。泳道2和6代表3F2-522-Fc区，上样量4微克/孔。泳道3和7代表scFv-Fc区蛋白522-Fc(一个连接于Fc区的scFv的例子)，上样量1微克/孔。泳道4和8代表522-Fc，上样量4微克/孔。泳道M代表标准分子量标记物(SeeBlue 2TM)。产生、随后纯化这些蛋白质后，得到纯度相当高的预计大小的产物。这些结果证明，可以用上述方法产生蛋白质3F2-522scFv-Fc和522-Fc，并纯化至均一。
实施例2.多种表位结合蛋白对靶抗原有特异性
目的：为了评价某些蛋白质结合靶抗原的能力
方法：为了评价522-Fc区和3F2-522-Fc的结合，使用基于ELISA的实验形式。通常，用50μl 1μg/ml捕获蛋白的PBS溶液(pH7.2)包被EIA/RIA ELISA平板(科司塔目录号3690)，4℃培育过夜。第二天，用Elx405自动平板洗涤机洗涤平板，其程序是5个使用1X PBST(1X PSB，0.1％吐温20)进行的分配/吸出洗涤步骤，被三个二次振荡间隔隔开。在一叠纸巾上拍干该平板，用170μl封闭缓冲液(1X PBST配制的2％BSA w/v)在室温下封闭1小时。在另一块平板中，用封闭缓冲液从5ug/ml开始稀释522-Fc区和3F2-522-Fc，共八个浓度，取50ul加入已封闭孔的ELISA平板中。室温下培育1小时后，再次用Elx405自动平板洗涤机洗涤平板并拍干。向各孔中加入50μl HRP标记的第二抗体，培育1小时。洗涤该平板，旋转180°并再次洗涤。将它们拍干，并向各孔中加入50μl SureBlue TMB过氧化物酶(KPL目录号52-00-03)，发色约3分钟。用50μl 0.2M H2SO4终止该反应，在450nM读出ELISA信号。在(A)中捕获蛋白是αvβ3整联蛋白，而在(B)中捕获蛋白是EphA2或αvβ3整联蛋白。
结果：分析表位结合蛋白522-Fc和3F2-522-Fc结合αvβ3整联蛋白和生物素化EphA2-Fc的能力，结果见图8A。两个不同的3F2-522-Fc蛋白样品表现出同时结合αvβ3整联蛋白(固定在平板上)和可溶性EphA2-Fc的能力。通过生物素化EphA2检测不到522-Fc区蛋白，因为它只对αvβ3整联蛋白有特异性。分析3F2-522-Fc区蛋白对αvβ3整联蛋白和EphA2的双特异性，结果见图8B。使EphA2或αvβ3(固定在平板上)结合浓度递增的可溶性3F2-522-Fc-生物素。洗涤后，通过链霉亲和素偶联试剂检测3F2-522-Fc-生物素的存在。浓度递增时，可溶性3F2-522-Fc特异性结合平板上结合的EphA2和αvβ3整联蛋白。这些结果表明，表位结合蛋白3F2-522-Fc区能够结合EphA2和αvβ3整联蛋白。
实施例3.包含融合于Fc区的scFv结构域的表位结合蛋白的高水平表达。
目的：为了说明包含融合于Fc区的scFv结构域的表位结合蛋白的高水平表达。
方法：通过组合三种表位结合蛋白，即EphA2的特异性抗体(12G3H11)、EphA家族RTK的特异性scFv(EA)和EphB家族RTK的特异性scFv(EB)构建表位结合蛋白P1。得到的结构见图3C和3D。
按照生产商推荐方案，使用293FectinTM试剂(英杰目录号51-0031)和FreestyleTM培养基(英杰目录号12338)+10％胎牛血清，用编码522-Fc区、3F2-522-Fc区、P1和12G3H11的载体转染293F细胞。在转染后第三天饲喂(feed)细胞，在第六天收获上清液。通过蛋白质A柱纯化表位结合蛋白，然后用PBS透析。在蛋白质凝胶上评价变性和非变性形式的分子，以确定该蛋白的大小和相对纯度。
结果：图9显示一组表位结合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果。简要说，加载每种蛋白质的纯化样品，在PAGE凝胶上运行，随后用考马斯蓝染色。出现的蛋白质如下：泳道1-522-Fc区，泳道2-3F2-522-Fc区。泳道3-P1(图3C，D是结构示意图)、泳道4-3F2-522-Fc、泳道5-12G3H11(EphA2的特异性抗体)和泳道6-3F2-522-Fc。产生、随后纯化这些多特异性表位结合多肽后，得到纯度相当高的预计大小的产物。这些结果表明，可利用上述方法制备诸如附图和详述中所述的那些表位结合蛋白并纯化至均一。
实施例4.表位结合蛋白P2的SEC纯化
目的：为了证明经大小排阻色谱处理的蛋白质组合物的均一性
方法：通过组合两种表位结合蛋白，即EphA2的特异性抗体(12G3H11)和含有两组可变区的单链双抗体构建表位结合蛋白P2，其中一组可变区对EphA家族RTK特异(EA)，另一组可变区对EphB家族RTK特异(EB)。得到的结构见图3E和3F。
为了根据其大小纯化P2多表位结合蛋白(图3E，F是结构示意图)，在HiPrep 16/60Sephacryl S-200柱(安玛西亚公司目录号17-1166-01)上运行该蛋白。将所述P2多表位结合蛋白分子浓缩至终体积为1ml，浓度4.3mg/ml。首先，使用Akta Primer蛋白纯化系统，用1X PBS以1毫升/分钟平衡SEC柱1.5小时，以去除柱储存缓冲液。将浓缩的蛋白质注射到2ml环中，然后加到SEC柱上。以1毫升/分钟的速率，用120分钟将PBS缓冲液加到柱上，在整个运行中收集1ml组分。
结果：图10显示从SEC柱上洗脱P2蛋白的洗脱概况。描图代表各柱组分中的相对蛋白质浓度(x轴)。结果证明，P2多表位结合蛋白作为均一的单个实体洗脱。
实施例5.表位结合蛋白的阳离子交换色谱概况
目的：为了建立P1多表位结合蛋白的阳离子交换色谱概况
方法：通过离子交换色谱纯化P1蛋白。pI约9.1的多表位结合蛋白在pH6时净电荷为正。利用强阳离子交换柱(安玛西亚目录号17-5054-01)分离不同的分子物质。用含有20mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液平衡该柱。平衡后，以1毫升/分钟的速率将该蛋白质上样到Hitrap SP FF柱上，用三倍柱体积的平衡缓冲液洗涤该柱。在Akta Prime蛋白纯化系统上，用平衡缓冲液至含20mMNaCl的50mM磷酸盐缓冲液建立100分钟的梯度洗脱。将梯度保持在各个点上，以便更好地对不同峰进行采样。在整个梯度上收集组分。
结果：图11显示从阳离子交换柱洗脱P1蛋白的洗脱概况。描图代表各柱组分中的相对蛋白质浓度(x轴)。
实施例6.纯化的P1蛋白组分的PAGE分析
目的：为了评估实施例5所述的来自阳离子交换柱的含P1组分的纯度和功能。
方法：如实施例5所述制备柱组分。后续分析如下。按照由柱观察到的洗脱峰汇集柱组分(图11)。具体说，如下所述汇集柱组分：组1(5-22)、组2(23-28)、组3(29-34)、组4(35-41)、组5(42-49)、组6(50-54)和组7(55-73)。将来自各组(原始，1-7)的样品上样于非变性(A)和变性(B)PAGE凝胶，在标准条件下运行。此外，在基于ELISA的结合实验(类似于实施例2所述实验)中，检测样品(原始，1-7)结合EphA2和另一EphA家族RTK的能力。含P1蛋白的样品结合于ELISA平板，随后与可溶性EphA2-Fc或EphA家族RTK-Fc一起孵育。如图12C所示，与原始样品相比，所有组分都能特异性结合EphA2和另一EphA家族RTK。组6和组7对其它EphA家族RTK的结合水平降低。这些结果证明，在进行如上述方法章节所述的阳离子交换色谱后，P1蛋白保持了结合特异性。
实施例7.测定表位结合蛋白P1和P2的结合特异性
方法：如实施例2所述进行实验，捕获抗原被指定为另一EphA家族RTK。
结果：图13显示对各种表位结合蛋白进行的结合实验的结果。本文特别说明的是抗体12G3H11以及多特异性表位结合蛋白P1和P2对EphA2的特异性。正如所料，EA、EB1和EB2表位结合蛋白对EphA2没有特异性，因为它们不含EphA2特异性结合基序。这些结果证明，P1和P2蛋白保持对EphA2的结合能力，情况类似于12G3H11基本抗体。
实施例8.测定表位结合蛋白P1和P2的结合特异性
方法：如实施例2所述进行实验，捕获抗原被指定为另一EphA家族RTK。
结果：图14显示对各种表位结合蛋白进行的结合实验的结果。本文特别说明的是多特异性表位结合蛋白P1和P2以及EA对EphA家族RTK的特异性。正如所料，12G3H11、EB1和EB2表位结合蛋白对EphA家族RTK没有特异性，因为它们不含EphA家族RTK的特异性结合基序。这些结果证明，P1和P2蛋白保持对EphA家族RTK的结合能力，情况类似于EA基本结合蛋白。
实施例9.测定表位结合蛋白P1和P2的结合特异性
方法：如实施例2所述进行实验，捕获抗原被指定为EphB家族RTK。
结果：图14显示对各种表位结合蛋白进行的结合实验的结果。本文特别说明的是EB1、EB2以及多特异性表位结合蛋白P1和P2对EphB家族RTK的特异性。正如所料，12G3H11和EA表位结合蛋白对EphB家族RTK没有特异性，因为它们不含EphB家族RTK的特异性结合基序。P2蛋白似乎对EphB家族RTK的亲和力较低，然而它具有特异性。这些结果证明，P1和P2蛋白保持对EphB家族RTK的结合能力，情况类似于EB1和EB2基本结合蛋白。
实施例10.测定表位结合蛋白P1和P2的多结合特异性
方法：为了评价某些表位结合蛋白的多结合特异性，进行改良的ELISA基结合实验。用50μl 1μgml Eph受体或αvβ3整联蛋白的PBS溶液(pH7.2)包被EIA/RIA ELISA平板(科司塔目录号3690)，4℃培育过夜。第二天，用Elx405自动平板洗涤机洗涤平板，其程序是5个使用1X PBST(1X PSB，0.1％吐温20)进行的分配/吸出洗涤步骤，被三个二次振荡间隔隔开。在一叠纸巾上拍干该平板，用170μl封闭缓冲液(1X PBST配制的2％BSA w/v)在室温下封闭1小时。在另一块平板中，用封闭缓冲液从5ug/ml开始稀释抗体，共八个浓度，取50ul加入已封闭孔的ELISA平板中。室温下培育1小时后，再次用Elx405自动平板洗涤机洗涤平板并拍干。向各孔中加入50μl HRP标记的第二抗体，培育1小时。洗涤该平板，旋转180°并再次洗涤。将它们拍干，并向各孔中加入50μlSureBlue TMB过氧化物酶(KPL目录号52-00-03)，发色约3分钟。用50μl 0.2MH2SO4终止该反应，在450nM读出ELISA信号。在内部制备的EphA2、EphA家族RTK、EphB家族RTK或αvβ3整联蛋白上分析结合单个抗原的多特异性和亲本抗体。
为了保证每个结合域都有功能，用双抗原结合进行分析。具体说，用50μl1μg/ml Eph受体或αvβ3整联蛋白的PBS溶液(pH7.2)包被EIA/RIA ELISA平板(科司塔目录号3690)，4℃培育过夜。第二天，用上述Elx405自动平板洗涤机洗涤平板。用170μl封闭缓冲液在室温下封闭该平板1小时。用EZ-连接的磺基-NHS-生物素试剂(皮尔斯(Pierce)目录号21335)，以每个Eph受体分子8个生物素的比例使Eph受体或αvβ3整联蛋白生物素化。用NAP5柱(皮尔斯目录号17-0853-02)去除游离的生物素，用封闭缓冲液将生物素化蛋白质稀释至1μg/ml。再次用Elx405自动平板洗涤机洗涤平板并拍干。向各孔中加入50μl稀释的生物素化Eph受体或αvβ3整联蛋白，37℃培育1小时。如前所述洗涤和干燥平板，加入50μl中性链亲和素-HRP 1∶12500(皮尔斯目录号31002)。37℃培育1小时后，洗涤该平板，旋转180°，再次洗涤。将它们拍干，并向各孔中加入50μl SureBlue TMB过氧化物酶(KPL目录号52-00-03)，发色5-10分钟。用50μl 0.2M H2SO4终止该反应，在450nM读出ELISA信号。包被的Eph受体抗原不同于ELISA后续步骤中所用的生物素化抗原。
结果：在图16(A)中，分析了12G3H11、EA、P1和P2蛋白被ELISA平板通过结合的EphA2捕获并通过生物素化EphA家族RTK蛋白检测的能力。该图证明，只有P1和P2能够既结合平板结合的EphA2，又结合生物素化EphA家族RTK。12G3H11和EA不能既被EphA2捕获，又结合生物素化EphA家族RTK。在图16(B)中，分析了EB2、EA、P1和P2被ELISA平板通过结合的EphA家族RTK捕获并通过生物素化EphB家族RTK蛋白检测的能力。该图证明，只有P1和P2蛋白能够既结合平板结合的EphA家族RTK，又结合生物素化EphB家族RTK。EA和EB2不能既被EphA家族RTK捕获，又结合生物素化EphB家族RTK。
实施例11.测定表位结合蛋白P1和P2的多结合特异性
方法：如实施例10所述进行该实验，其中改变如下：捕获抗原是EphA家族RTK。
结果：在图17(A)中，分析了12G3H11、EB1、P1和P2被ELISA平板通过结合的EphA家族RTK捕获并通过生物素化EphA2蛋白检测的能力。该图证明，只有P1和P2能够既结合平板结合的EphA家族RTK，又结合生物素化EphA2。12G3H11和EB1不能既被EphA家族RTK捕获，又结合生物素化EphA2。在图17(B)中，分析了12G3H11、EB1、P1和P2蛋白被ELISA平板通过结合的EphA家族RTK捕获并通过生物素化EphB家族RTK蛋白检测的能力。该图证明，只有P1和P2蛋白能够即结合平板结合的EphA家族RTK，又结合生物素化EphB家族RTK。12G3H11和EB2不能既被EphA家族RTK捕获，又结合生物素化EphB家族RTK。这些结果进一步支持P1和P2蛋白具有多结合特异性。
实施例12.评价P1和P2蛋白的多特异性
方法：如实施例10所述进行该实验，其中改变如下：捕获抗原是EphB家族RTK。
结果：在图18(A)中，分析了12G3H11、EB1、P1和P2蛋白被ELISA平板通过结合的EphB家族RTK捕获并通过生物素化EphA2蛋白检测的能力。该图证明，只有P1和P2蛋白能够既结合平板结合的EphB家族RTK，又结合生物素化EphA2。12G3H11和EB1不能既被EphB家族RTK捕获，又结合生物素化EphA2。在图18(B)中，分析了EA、12G3H11、P1和P2蛋白被ELISA平板通过结合的EphB家族RTK捕获并通过生物素化EphA家族RTK蛋白检测的能力。该图证明，只有P1和P2蛋白能够既结合平板结合的EphB家族RTK，又结合生物素化EphA家族RTK。12G3H11和EA2不能既被EphB家族RTK捕获，又结合生物素化EphA家族RTK。这些结果进一步支持蛋白P1和P2具有多结合特异性。
实施例13.检测细胞表面上展示的结合表位
目的：为了建立组装某些多特异性表位结合蛋白所用的单特异性结合蛋白的基线测量。
方法：在细胞表面上表达所有三种Eph受体的人胰腺癌细胞系MiaPaCa2上进行结合分析。从铺满的T-175培养瓶中收获MiaPaCa2细胞，用PBS洗涤两次以去除残留的培养基和胰蛋白酶。将200μl PBS中的五十万个细胞放入含有200ng表位结合蛋白的圆底96孔板(费尔肯(Falcon)目录号35-3077)中，4℃培育1小时。用冰冷PBS洗涤细胞两次，与200ul 1∶1000稀释的免疫纯的兔抗人IgG FC荧光素(皮尔斯目录号31535)一起于4℃培育30分钟。培育后，再次用PBS洗涤细胞。将标记的细胞重悬于200ul PBS和10μl 1μg/ml碘化丙锭(卡巴化学公司(Calbiochem)目录号537059)中。用瓜瓦(Guava)FACS分析仪进行分析。
结果：图19显示了单特异性表位结合蛋白与MiaPaCa2细胞结合的FACS分析图。作为阴性对照，将检测试剂，即偶联于荧光素的抗人IgG Fc与细胞一起培育，显示出与细胞低水平结合。12G3H11抗体与MiaPaCa2细胞亲和力高，而EB2和EA单特异性蛋白显示出显著的染色。这些结果证明，MiaPaCa2细胞表达和展示能够与12G3H11、EA和EB2的结合单元接合的抗原。用这些结合单元构建蛋白P1和P2。
实施例14.检测细胞表面上展示的多特异性表位结合蛋白的结合表位。
方法：基本如上述实施例12所述进行该实验。
结果：图20显示了多特异性表位结合蛋白与MiaPaCa2细胞结合的FACS分析图。作为阴性对照，将检测试剂，即偶联于荧光素的抗人IgG Fc与细胞一起培育，显示出与细胞低水平结合。P1和P2多特异性表位结合蛋白对MiaPaCa2细胞具有高亲和力。这些结果证明，MiaPaCa2细胞表达和展示能够与P1和P2的结合单元接合的抗原。这些结果证明，MiaPaCa2细胞展示了与蛋白P1和P2接合的表位。
实施例15.检测细胞表面上展示的表位结合蛋白的结合表位。
目的：为了建立某些表位结合蛋白的相对接合特异性。
方法：基本如上述实施例12所述进行该实验。
结果：图21显示多特异性和单特异性表位结合蛋白的FACS分析图。作为阴性对照，将检测试剂，即偶联于荧光素的抗人IgG Fc与细胞一起培育，显示出与细胞低水平结合。另外，将对照抗体与细胞一起培育，也显示出对MiaPaCa2细胞的亲和力低。P1和P2多特异性表位结合蛋白对MiaPaCa2细胞具有高亲和力。单特异性表位结合蛋白EB2、EA和12G3H11对细胞上展示的表位具有高亲和力。单特异性表位结合蛋白EB1对MiaPaCa2细胞的亲和力较低，但有特异性。这些结果证明，MiaPaCa2细胞展示了可与单和多特异性表位结合蛋白接合的抗原。
实施例16.表位结合蛋白的竞争试验
目的：为了建立某些蛋白质与MiaPaCa2细胞结合的基线结合概况。
方法：基本如实施例12所述进行该结合实验，其中改变如下：为了证实所有结合域均主动参与与细胞表面受体的结合，用游离抗原进行抑制实验，即将表位结合蛋白与50倍摩尔过量的游离抗原预培育1小时，然后与细胞一起培育。然后，如实施例12所述将表位结合蛋白：抗原混合物与MiaPaCa细胞一起培育。将表位结合蛋白与单独或组合的抗原一起预培育，以证明多个结合域的功能性结合。在本实施例中，将表位结合蛋白与载体对照混合，以便为将来的研究建立基线。
结果：图22显示涉及特定蛋白质的结合试验的假竞争抑制的结果。该图代表P2、P1、EB2、EA和12G3H11蛋白与MiaPaCa2细胞表面的特异性结合。这些结果进一步说明，P2、P1、EB2、EA和12G3H11蛋白能够结合活细胞上展示的表位。
实施例17.细胞表面结合的竞争性抑制
目的：为了评价可溶性抗原破坏或与某些表位结合蛋白竞争结合的能力
方法：基本如实施例15所述进行该实验，其中改变如下：将50倍摩尔过量的可溶性抗原EphA2与表位结合蛋白溶液预培育。
结果：图23表示包括表位结合蛋白和可溶性EphA2配体的结合实验的竞争性抑制结果。该图代表与可溶性配体培育并加入到细胞中后，某些蛋白质与MiaPaCa2细胞的残留结合。P2、P1蛋白含有EphA2特异性结合元件，它们仍能结合于该细胞，然而12G3H11的曲线代表该蛋白对EphA2具有单特异性，类似非特异性抗hu-Fc曲线。这表明游离配体EphA2完全饱和了结合细胞表面表位的能力。因此，P1和P2蛋白可能通过另一结合基序产生的特异性保持结合能力。EB2和EA蛋白也保持了结合能力，因为它们不是可溶性EphA2特异性的蛋白。这些结果表明，可溶性EphA2能够抑制单特异性表位结合蛋白12G3H11的结合，但不抑制带有EphA2结合域的多特异性表位结合蛋白P1和P2的结合。P1和P2蛋白可通过另一结合特异性保持与细胞表面表位的结合。本研究中的其它表位仍然可用，因为EA和EB2蛋白保持了在可溶性EphA2存在下结合细胞表面的能力。
实施例18.蛋白质与MiaPaCa2细胞结合的竞争性抑制
目的：为了评价可溶性抗原破坏或竞争表位结合的能力
方法：基本如实施例15所述进行该实验，其中改变如下：将50倍摩尔过量的可溶性抗原EphA家族RTK与各种蛋白质溶液预培育。
结果：图24显示涉及P2、P1、EB2、EA和12G3H11蛋白和可溶性EphA家族RTK配体的结合实验的竞争性抑制结果。该图代表与可溶性配体培育并加入到细胞中后，这些蛋白质与MiaPaCa2细胞的残留结合。P2和P1蛋白含有EphA家族RTK特异性结合元件，它们仍能结合于该细胞，然而EA曲线代表该蛋白对EphA家族RTK具有单特异性，类似非特异性抗hu-Fc曲线。这表明游离配体EphA家族RTK完全饱和了结合细胞表面表位的能力。P1和P2蛋白可能通过另一结合基序产生的特异性保持结合能力。EB2和12G3H11蛋白保持结合能力，因为它们不是可溶性EphA家族RTK的特异性蛋白质。这些结果表明，可溶性EphA家族RTK能够抑制单特异性表位结合蛋白EA的结合，但不抑制带有EphA家族RTK结合域的多特异性表位结合蛋白P1和P2的结合。P1和P2蛋白可通过另一结合特异性保持与细胞表面表位的结合。本研究中的其它表位仍然可用，因为12G3H11和EB2蛋白保持了在可溶性EphA家族RTK存在下结合细胞表面的能力。
实施例19.蛋白质与MiaPaCa2细胞结合的竞争性抑制
目的：为了评价可溶性抗原破坏或竞争结合的能力
方法：基本如实施例15所述进行该实验，其中改变如下：将50倍摩尔过量的可溶性抗原EphB家族RTK与各种蛋白质溶液预培育。
结果：图25表示包括这些蛋白质和可溶性EphB家族RTK配体的结合实验的竞争性抑制结果。该图代表与可溶性配体培育并加入到细胞中后，这些蛋白质与MiaPaCa2细胞的残留结合。P2和P1蛋白含有EphB家族RTK特异性结合元件，它们仍能结合于该细胞，然而EB2曲线代表该蛋白对EphB家族RTK具有单特异性，类似非特异性抗hu-Fc曲线。这表明游离配体EphB家族RTK完全饱和了结合细胞表面表位的能力。P1和P2蛋白可能通过另一结合基序产生的特异性保持结合能力。EA和12G3H11蛋白保持结合能力，因为它们不是可溶性EphB家族RTK的特异性蛋白质。这些结果表明，可溶性EphB家族RTK能够抑制单特异性表位结合蛋白EB2的结合，但不抑制带有EphB家族RTK结合域的多特异性表位结合蛋白P1和P2的结合。P1和P2蛋白可通过另一结合特异性保持与细胞表面表位的结合。本研究中的其它表位仍然可用，因为12G3H11和EA蛋白保持了在可溶性EphB家族RTK存在下结合细胞表面的能力。
实施例20.用两种不同的可溶性抗原竞争性抑制蛋白质与MiaPaCa2细胞的结合
目的：为了评价可溶性抗原破坏或竞争结合的能力
方法：基本如实施例15所述进行该实验，其中改变如下：将50倍摩尔过量的可溶性抗原EphA2和另一EphA家族RTK与某些蛋白质溶液预培育。
结果：图26显示涉及蛋白P2、P1、EB2、EA和12G3H11以及可溶性EphA2和EphA家族RTK配体的结合实验的竞争性抑制结果。该图代表与可溶性配体培育并加入到细胞中后，这些表位结合蛋白与MiaPaCa2细胞的残留结合。P1蛋白含有EphA2和EphB家族RTK特异性结合元件，与分别对EphA2和EphA家族RTK具有特异性的单特异性12G3H11和EA相比仍显示对细胞的残留结合。然而，EB2曲线代表对EphB家族RTK有单特异性的蛋白质，类似实施例15的假对照曲线。这表明游离配体EphA2和EphA家族RTK完全饱和了结合细胞表面表位的能力。P1蛋白可能通过其它结合基序产生的特异性保持结合能力。EB2蛋白也保持结合能力，因为它不是可溶性EphA2或EphA家族RTK的特异性蛋白。
实施例21.用两种不同的可溶性抗原竞争性抑制蛋白质与MiaPaCa2细胞的结合
目的：为了评价可溶性抗原破坏或与细胞表面受体竞争结合的能力
方法：基本如实施例15所述进行该实验，其中改变如下：将50倍摩尔过量的可溶性抗原EphA2和另一EphA家族RTK与某些蛋白质溶液预培育。
结果：图27显示涉及蛋白P2、P1、EB2、EA、12G3H11以及可溶性EphA家族RTK和EphB家族RTK配体的结合实验的竞争性抑制结果。该图代表与可溶性配体培育并加入到细胞中后，这些蛋白质与MiaPaCa2细胞的残留结合。P1和P2蛋白同时含有EphA家族RTK和EphB家族RTK特异性结合元件，与分别对EphA家族RTK和EphB家族RTK有特异性的单特异性EA和EB2相比仍显示对细胞的残留结合。然而，12G3H11曲线代表该蛋白对EphA2有单特异性，类似实施例15的假对照曲线。这表明游离配体EphA家族RTK和EphB家族RTK完全饱和了结合细胞表面表位的能力。P1和P2蛋白可能通过其它结合基序产生的特异性保持结合能力。12G3H11蛋白也保持结合能力，因为它不是可溶性EphA家族RTK或EphB家族RTK的特异性蛋白。
实施例22.三特异性表位结合蛋白的竞争性抑制
目的：为了证明可溶性配体可与细胞表面抗原竞争结合蛋白质。
方法：基本如实施例15所述进行该实验，其中改变如下：将50倍摩尔过量的可溶性抗原EphA2、另一EphA家族RTK和EphB家族RTK与某些蛋白质溶液预培育。
结果：图28显示涉及蛋白P2、P1、EB2、EA和12G3H11以及可溶性EphA2、EphA家族RTK和EphB家族RTK配体的结合实验的竞争性抑制结果。该图代表与可溶性配体培育并加入到细胞中后，这些蛋白质与MiaPaCa2细胞的残留结合。与过量的三种配体预孵育后，所研究的所有蛋白质(P1、P2、EB2、EA和12G3H11)均显示出很少的残留结合或无残留结合。这些结果证明，这些蛋白质结合于MiaPaCa2细胞上表达的特异性表位，且不通过其它机制结合。三特异性蛋白P1和P2通过其中所含的所有表位结合单元进行特异性结合。
实施例23.多特异性表位结合蛋白的功能分析
目的：为了显示表位结合蛋白保留了衍生自亲本抗体和/或分离的相同功能性表位结合域的功能特性。具体说，当应用于靶细胞时，许多亲本抗体用作受体激动剂。
方法：为了评价多特异性表位结合蛋白激动受体的能力，采用如下实验方案。在6孔板中以0.5X106的密度种入MiaPaCa2细胞，并孵育24小时。用PBS冲洗孔两次。为了活化受体，在3ml培养基中加入10μg亲本蛋白质或三特异性表位结合蛋白并在37℃孵育30分钟。除去培养基后用冷PBS小心冲洗细胞两次。加入200ul含1X蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司，目录号P8340)的曲通(triton)裂解缓冲液(波士顿生物制品公司(Boston Bioproducts)目录号BP115)裂解细胞，室温下孵育5分钟。收集裂解物，4℃6000xg离心5分钟去除细胞碎片。用BCA实验(皮尔斯公司(Pierce)目录号23225)对裂解物中的总蛋白浓度进行定量测定。为了分析受体活化，纯化细胞表面受体并按照如下步骤进行分析：用4G10琼脂糖(昂斯特公司(Upstate)，目录号16-199)免疫沉淀EphB家族受体，并用特异性抗-EphB家族抗体检测，第二抗体是山羊抗小鼠IgG(皮尔斯公司，目录号31437)。使用特异性EphA2抗体(1C1)免疫沉淀EphA2。为了免疫沉淀EphA家族RTK，将链霉亲和素M280珠(英杰公司，目录号602-10)与500ug生物素化的抗-EphA家族抗体偶联。按照生产商说明，使用EZ-连接的磺基-NHS-生物素试剂(皮尔斯公司，目录号21335)以1∶4的比例将抗体生物素化。将生物素化抗体和500ul M280珠混合并在室温下孵育1小时，用PBS冲洗以去除没有偶联的抗体。在western印迹检测中使用生物素化4G10(1∶1000)抗磷酸化酪氨酸(昂斯特公司目录号16-204)抗体，并将中性链亲和素-HRP1∶12500(皮尔斯公司，目录号31003)作为第二抗体。
通过将100μg总裂解物蛋白质与20μl 4G10琼脂糖或50μl抗体偶联的M280链霉亲和素珠混合，从处理的细胞裂解物中免疫沉淀Eph受体。将裂解物珠混合物在4℃旋转孵育2小时。然后在2000xg离心该混合物，使珠沉淀，移去上清。为了移去未结合的材料，在冷的裂解缓冲液中冲洗珠两次。从珠中移去洗涤缓冲液，并加入35ul含5％β-巯基乙醇的样品缓冲液(英杰公司目录号NP 0007)，然后100℃加热10分钟。将上清液上样于10％Nupage蛋白质凝胶(英杰公司，目录号NP0301)，并以200V恒压电泳35分钟。用英杰公司转移缓冲液(目录号NP0006-1)在其推荐条件下将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜在封闭缓冲液(含30％鳕鱼明胶、1％吐温20和1％BSA的1X PBS)中孵育1小时。将封闭缓冲液倾析，直接将10ml第一抗体加到膜上。将膜孵育1小时后，用洗涤缓冲液(1x PBS，1％吐温20和1％BSA)洗涤5次。然后在洗涤缓冲液中加入HRP标记的第二试剂，然后在摇床上室温孵育1小时。如前所述洗涤印迹并根据厂商建议浸没于ECL溶液(皮尔斯公司目录号32106)中，然后用Hyperfilm ECL胶片(目录号RPN1674K)曝光。
结果：图29显示了对蛋白12G3H11、EA、EB2、EB1、P1和P2处理的MiaPaCa2细胞进行的EphA2受体活化实验的Western印迹分析。纯化的磷酸化EphA2作为阳性对照(第9泳道)。非特异性抗体(第7泳道)和培养基(第8泳道)作为阴性对照。如图所示，经受体磷酸化测定，用12G3H11(第1泳道)、P1(第5泳道)和P2(第6泳道)处理的MiaPaCa2细胞模拟了受体活化。蛋白EA(第2泳道)、EB2(第3泳道)和EB1(第4泳道)不刺激EphA2。这些结果正如预期，因为EA、EB1和EB2不包含EphA2特异性结合域。预期12G3H11、P1和P2蛋白质保留了激动EphA2的能力，因为它们包含EphA2特异性结合域。这些结果表明蛋白质P1和P2保留了如亲本蛋白部分所述的激动EphA2的能力。
实施例24.各种表位结合蛋白的功能分析。
目的：为了显示表位结合蛋白保留衍生自亲本抗体的功能特性。具体说，当应用于靶细胞时，许多亲本抗体用作受体激动剂。
方法：基本如实施例21所述进行该实验，其中改变如下：靶点是EphA家族RTK。
结果：图30显示在12G3H11、EA、EB1、EB2、P1和P2处理的MiaPaCa2细胞上进行的EphA家族受体活化实验的Western印迹分析。纯化的磷酸化EphA家族RTK作为阳性对照(第9泳道)。非特异性抗体(第7泳道)和培养基(第8泳道)作为阴性对照。如图所示，经受体磷酸化测定，用EA(第2泳道)、P1(第5泳道)和P2(第6泳道)处理的MiaPaCa2细胞模拟了受体活化。蛋白质12G3H11(第1泳道)、EB2(第3泳道)和EB1(第4泳道)不刺激EphA家族RTK。这些结果正如预期，因为12G3H11、EB1和EB2不包含EphA家族RTK的特异性结合域。预期EA、P1和P2蛋白保留激动EphA家族RTK的能力，因为它们包含EphA家族RTK的特异性结合域。这些结果表明蛋白质P1和P2保留如亲本蛋白所述的激动EphA家族RTK的能力。
实施例25.各种表位结合蛋白的功能分析。
目的：为了显示多特异性表位结合蛋白保留衍生自亲本抗体的功能特性。具体说，当应用于靶细胞时，许多亲本抗体用作受体激动剂。
方法：基本如实施例21所述进行该实验，其中改变如下：靶点是EphB家族RTK。
结果：图31显示在12G3H11、EA、EB2、EB1、P1和P2处理的MiaPaCa2细胞上进行的EphB家族受体活化实验的Western印迹分析。纯化的磷酸化EphB家族RTK作为阳性对照(第9泳道)。非特异性抗体(第7泳道)和培养基(第8泳道)作为阴性对照。如图所示，经受体磷酸化测定，用EB(第2泳道)、P1(第5泳道)和P2(第6泳道)处理的MiaPaCa2细胞模拟了受体活化。蛋白质12G3H11(第1泳道)、EA(第2泳道)和EB1(第4泳道)不刺激EphB家族RTK。12G3H11和EA的结果正如预期，因为这些蛋白质不包含EphB家族RTK的特异性结合域。EB1不能激动EphB家族RTK很可能是因为EB1与细胞表面展示的抗原结合不充分造成的(参见实施例14)。预期EB1、P1和P2蛋白保留了激动EphB家族RTK的能力，因为它们包含EphB家族RTK的特异性结合域。这些结果表明蛋白质P1和P2保留了如亲本蛋白所述的激动EphB家族RTK的能力。
实施例26三特异性多特异性表位结合蛋白P3的表达
目的：为了展示包含与抗体重链和轻链融合的scFv结构域的三特异性表位结合蛋白P3的高水平表达。
方法：通过组合三种表位结合蛋白，即C5a的特异性抗体(1B8)、C5a的特异性scFv(15)和EphA家族RTK的特异性scFv(EA)构建表位结合蛋白P3。所得结构如图2D所示。表位结合蛋白P3保留至少与亲本抗体相当的结合特异性和亲和力(数据未显示)。
按照生产商推荐方案，使用293FectinTM试剂(英杰目录号51-0031)和FreestyleTM培养基(英杰目录号12338)+10％胎牛血清，以编码P3的载体转染293F细胞。在转染后第三天饲喂(feed)细胞，在第六天收获上清液。通过蛋白质A柱纯化表位结合蛋白P3，然后用PBS透析。在蛋白质凝胶上评价变性和非变性形式的分子，以确定该蛋白的大小和相对纯度。
结果：图32中是显示如图4G所示三特异性表位结合蛋白的表达的PAGE凝胶。在图中，非还原(泳道1和2)和变性凝胶(泳道3和4)记录了在这些条件下三特异性表位结合蛋白的相对分子量。泳道2中，三特异性表位结合蛋白显示预测分子量约为240kDa，这比(a)所代表的传统抗体在非变性条件下的PAGE凝胶电泳预测分子量大。泳道4中，三特异性表位结合蛋白显示预测分子量，重链约75kDa，轻链约50kDa。这些值高于传统抗体，包括重链(b)和轻链(c)在类似条件下的预测分子量。这些结果表明，可以表达包含与两个scFv融合的抗体的多特异性表位结合蛋白，其中一个scFv与重链N末端融合，另一个scFv与轻链N末端融合，并显示预测分子量和预测结构组成(重链和轻链)。
实施例27多特异性表位结合蛋白P3的大小排阻色谱(SEC)分析
目的：为了证明多特异性表位结合蛋白P3显示正确的表观分子量。
材料和方法：大小排阻色谱是本领域所知的用于确定天然状态下分子(如蛋白质)的表观分子量的方法。在本实施例中，按照实施例26中所述表达并纯化多特异性表位结合蛋白P3。将纯化的P3蛋白在含100mM硫酸钠、100mM磷酸钠pH6.8的缓冲液中上样于SEC柱(TSK-GEL G3000SWXL)。该柱以1毫升/分钟的流速运行。用于确定表观分子量的校正标准品包括：甲状腺球蛋白(670kDa)、牛γ-球蛋白(158kDa)、鸡卵清蛋白(44kDa)、马肌红蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。
结果：图33显示多特异性表位结合蛋白P3的大小排阻色谱(SEC)分析的结果。如图4H所述的构建物包含三个不同的表位结合区。表达表位结合蛋白并用SEC进行分析。虚线表示用于确定P3蛋白分子量的一组确定分子量组分。实线表示P3的洗脱概况。峰1表示约70％的蛋白质预计分子量为约240kDa(单体)。峰2和3表示更高级的结构(如二聚体)或聚集体。这些结果表明，多特异性表位结合蛋白如P3，在天然状态下显示其预测分子量。
实施例28多特异性表位结合蛋白的蛋白酶敏感性
目的：为了确定与亲本抗体相比，多特异性表位结合蛋白的蛋白酶敏感性水平。
材料和方法如上所述表达并纯化抗体和衍生自抗体的多特异性表位结合蛋白。具体说，多特异性表位结合蛋白P4、P5和P6衍生自亲本抗体1B8和15。将衍生自抗体15的scFv与1B8抗体的重链N末端融合，从而构建多特异性表位结合蛋白P4(如图4F所示)。将衍生自抗体15的scFv与1B8抗体的轻链N末端融合，从而构建多特异性表位结合蛋白P5(如图4D所示)。如图所示，将衍生自抗体15的可变区与1B8抗体的Fab片段融合，从而构建多特异性表位结合蛋白P6(如图2D所示)。表位结合蛋白P4、P5和P6保留了至少与亲本抗体水平相当的结合特异性和亲和力(数据未显示)。将各种抗体和多特异性表位结合蛋白与或不与胰蛋白酶(20ng/1μg抗体/表位结合蛋白)、胰凝乳蛋白酶(20ng/1μg抗体/表位结合蛋白)或人血清(1μg血清/1μg抗体/表位结合蛋白)在37℃孵育1小时(图A)或在37℃孵育12小时(图B)。然后用PAGE进行样品分析，与没有用蛋白酶或血清孵育的样品比较，确定片段化概况。
结果：图34显示在不同形式表位结合蛋白上进行的蛋白酶敏感性实验的结果。与蛋白酶的孵育一旦结束，在还原PAGE凝胶上将样品进行电泳，并用考马斯蓝染色以确定是否发生蛋白水解。如图所示，37℃孵育1小时不会引起各种亲本抗体或表位结合蛋白的蛋白水解降解。延长孵育时间(37℃12小时)未观察到可探测到的表位结合蛋白水解。这些结果证明，本文所述多特异性表位结合蛋白显示高水平的蛋白酶耐受，与所观察到的抗体分子的耐受相似。
实施例29多特异性表位结合蛋白的蛋白酶敏感性
目的：为了确定与亲本抗体相比，多特异性表位结合蛋白的蛋白酶敏感性水平。
材料和方法：如上所述表达并纯化抗体和衍生自抗体的多特异性表位结合蛋白。将各种抗体和多特异性表位结合蛋白与或不与组织蛋白酶B(20ng/1μg抗体/表位结合蛋白)在37℃孵育1小时(图A)或在37℃孵育20小时(图B)。然后用PAGE进行样品分析，与没有用蛋白酶或血清孵育的样品比较，确定片段化概况。
结果：图35显示在不同形式表位结合蛋白上进行的蛋白酶(组织蛋白酶B)敏感性实验的结果。具体说，表达并纯化蛋白质(亲本抗体和本文列举的各种形式的表位结合蛋白)，不与(奇数)或与(偶数)组织蛋白酶B(20ng蛋白酶/1μg抗体/表位结合蛋白)在37℃孵育(A)1小时或(B)20小时。与蛋白酶的孵育一旦结束，在还原PAGE凝胶上将样品进行电泳，并用考马斯亮染色以确定是否发生蛋白水解。如图所示，37℃孵育1小时不会引起各种亲本抗体或表位结合蛋白的蛋白水解降解。延长孵育时间(37℃20小时)后，泳道8和9(蛋白P2)以及泳道14和15(蛋白P4)中的表位结合蛋白发生明显蛋白水解(见虚线圈)。这些结果证明，本文所述多特异性表位结合蛋白显示高水平的蛋白酶(组织蛋白酶B)耐受，与所观察到的抗体分子的耐受相似。
实施例30多特异性表位结合蛋白的瞬时表达
                                                        
目的：为了瞬时表达各种多特异性表位结合蛋白形式。
方法：用培养于英杰公司FreestyleTM培养基的HEK293F细胞表达所有构建物。在转染后10天收集培养基，根据厂商方案使用标准蛋白质A亲和色谱(GE健康护理公司，新泽西州皮斯卡塔韦)(GE Healthcare，Piscataway，NJ)纯化所有的抗体形式，缓冲液更换为25mM组氨酸-HCl pH6.0。使用还原和非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和分析大小排阻色谱对构建物的纯度进行分析。用内部开发的蛋白质A结合实验确定总IgG的表达。简单的说，用HPLC系统(安杰伦公司1100毛细管LC系统，加利福尼亚州福斯特城)(Agilent 1100 Capillary LC System，Foster City，CA)将培养基自动上样于蛋白质A柱上。用100mM磷酸钠缓冲液pH6.8洗去未结合的材料，并用0.1％磷酸pH 1.8洗脱抗体。将对应洗脱峰的面积积分，与IgG标准品相比确定总抗体浓度。还使用理论确定的消光系数，读取280nm的吸光度，以确定纯化抗体的浓度。下列表1显示了结果。
表1.多特异性表位结合蛋白的瞬时表达
  结合蛋白质形式   瞬时表达水平
  传统Ab   180mg/L
  图4D   120mg/L
  图4F   140mg/L
  图4H   115mg/L
  图4L   45mg/L
  图3D   120mg/L
这些结果表明，如表1列举的示例性的多特异性表位结合蛋白可以类似于常规抗体的水平进行瞬时表达。
实施例31测定多种多特异性表位结合蛋白的绝对分子量
目的：测定多特异性表位结合蛋白在溶解状态下的各种参数
方法：为了测定溶解分子量和其它分子参数，如水力半径和特性粘度，我们使用配备三种检测系统的分析型大小排阻HPLC同时测量折射率差、差分粘度和光散射。表2显示获自三种检测分析的分子参数。
表2.多特异性表位结合蛋白的生物物理特征
  形式标识  滞留时间(min)   单体状态(％)   理论分子量(KDa)   实验分子量(KDa)   水力半径(Rh)(nm)   特性粘度(η)(ml/g)
  标准Ab   8.5   99   144   151   5.2   6
  图4D   8.0   95   197   204   6.3   7
  图4F   8.0   95   197   202   6.3   8
  图4H   7.7   92   250   265   7.0   8
  图3D   7.7   95   250   262   7.0   8
考虑到两个抗体CH2结构域各自均含有一个N连接的糖部分，占约3.5Kda，表2中所示实验分子量的数值与理论值相一致。如在构建物中加入至少一个表位结合域所预测的，作为通过分子扩散测定的分子有效大小，水力半径(Rh)的计算值从5.2nm开始增大。与蛋白链长度直接相关的特性粘度值(η)也从对照抗体的6ml/g增加到多特异性构建物的7-8ml/g。水力半径和特性粘度值与已报道的完整抗体的值相关。例如，已报道完整IgG的水力半径是5.4nm，特性粘度是6ml/g。综合这些数据表明，实验测定的分子参数与工程改造的多特异性表位结合形式的大小和结构拓扑学相一致，并且与对照抗体良好相关。此外，这些数据表明多特异性表位结合蛋白形式不形成聚集体并具有显著的结构均一性。而且，在4℃储存条件下这些生物物理学特性保持数周不变。
实施例32.差示扫描量热法分析不同多特异性表位结合蛋白形式的热稳定性
在本实施例中，通过差示扫描量热法分析各种多特异性表位结合蛋白的热变性概况。
方法：使用麦克卡(Microcal)VP-DSC超敏感型扫描微量热计(麻省北安普敦麦克卡公司)(Microcal，Northampton，MA)以1℃/min的加热速率进行差示扫描量热法(DSC)实验。在25mM组氨酸-HCl pH6中进行DSC实验。DSC所使用的所有溶液和样品均经0.22微米滤器过滤并在上样于量热计前进行脱气。凝胶过滤色谱分析表明DSC研究所用所有抗体形式中单体＞90％。对于每一组测量，事先获取至少四次缓冲液对基线的运行。然后立即将缓冲液从样品室中移去，并加载约0.5ml浓度为1mg/ml的样品。对于每次测量，用样品缓冲液充满参比室。对于每次样品对缓冲液的实验，减去对应的缓冲液-对-缓冲液基线运行。用浓度和扫描速率将原始数据标准化。用麦克卡(Microcal)提供的OriginTMDSC软件进行数据分析和去卷积。根据Privalov和Potekhin(“温度诱导蛋白变化研究中的扫描微量热法”(Scanning microcalorimetry in studyingtemperature-induced changes in proteins)，Methods Enzymol.(1986)131，4-51)，使用非二态模型进行去卷积分析，使用100个迭代循环获取最佳拟和。简单的说，通过独立或依赖型方案(非二态模型)分析最佳去卷积拟和。独立方案基于多结构域蛋白质的每一结构域独立展开的假设，而不考虑相邻结构域的状态。依赖型方案假定相互作用结构域依次展开的有序过程，因此任何给定结构域的展开取决于其相邻结构域的状态。对DSC去卷积结果的解释基于如下事实：多特异性抗体形式的不同结构域以合作性转变的形式独立地展开，如对免疫球蛋白(Tischenko等(1982)“兔免疫球蛋白G中合作结构的热动力学研究”(Athermodynamic study of cooperative structures in rabbit immunoglobulin G)，Eur JBiochem.，126，517-521)或其它多结构域蛋白(Batey等(2008)，“多结构域蛋白中的单独结构域的折叠路径不受相邻结构域的影响”(The folding pathway of asingle domain in a multiple domain protein is not affected by its neighboringdomain)，J.Mol.Biol.出版中)的描述。通过至少三次平行实验测定每一构建物的变性温度Tm(对应转变峰的最大值)，且变化不超过±2％。变性后重新扫描样品以分析再折叠。下列表3中总结了结果。
表3.过量热容曲线去卷积测定不同多特异性表位结合蛋白中出现的表位结构域的转变温度(Tm)
结果：对照抗体1B8的热分析图显示三次不同的展开转变，变性温度Tm为69℃、75℃和82℃。这三次转变分别对应CH2、Fab和CH3结构域的变性。出现这三个不同的峰表明IgG分子是一个多结构域蛋白，其中至少三个结构域或结构域组在不同条件下发生变性。因此，感兴趣的是分析多特异性表位结合蛋白形式的变性转变，以研究构建物的整体稳定性以及它们潜在的多结构域合作变性。图4D(表3)所示多特异性形式的去卷积分析揭示了4次转变，1次Tm是57℃，1次Tm是69℃，1次Tm是73℃，1次Tm是82℃。Tm为57℃的峰对应连接于轻链N末端的scFv的变性转变(图4D)。通常，scFv的变性温度低于其展开以单次转变事件为特征的任何给定抗体结构域。图4D形式中的与轻链N末端连接的scFv不破坏蛋白质支架的整体稳定性。事实上，图4D形式Fab结构域变性的Tm 73℃与亲本Fab所观察到的Tm 75℃没有显著性差异(数据未显示)。此外，与对照抗体相比，图4D形式中CH2结构域的变性温度(Tm＝69℃)和CH3结构域的变性温度(Tm＝82℃)没有改变。相似地，图4F形式蛋白质中与抗体重链N末端连接的scFv(Tm＝63℃)不破坏蛋白质支架的整体折叠的稳定性。事实上，对于这种形式，去卷积分析显示其Fab结构域变性(Tm＝73℃)与对照抗体Fab结构域变性(Tm＝75℃)非常相似，并且与图4D形式中Fab结构域观察到的变性转变(Tm＝73℃)相同。而且，对于该抗体形式，与对照抗体相比，CH2结构域的变性(Tm＝69℃)和CH3结构域的变性(Tm＝82℃)保持不变(表3)。
图3D形式蛋白质变性的去卷积热分析图显示与CH3结构域C末端相连接的scFv具有独特的变性转变，图3D形式中与重链C末端相连接的第一个scFv的Tm是57℃，图3D形式中与重链C末端相连接的第二个scFv的Tm是65℃。CH3结构域后连接的这些scFv的展开不破坏蛋白质支架的整体展开的稳定性。事实上，这两个构建物的Fab、CH2和CH3结构域与对照抗体具有相似的变性转变(表3)。
图4H形式蛋白质热分析图的去卷积分析揭示了5次转变，Tms为61℃、63℃、69℃、75℃和82℃(表3)。转变Tm为61℃的峰对应与轻链N末端相连接的scFv的变性转变。Tm为63℃的峰对应与重链N末端相连接的scFv的变性转变，而另外三个Tm为69℃、75℃和82℃的峰分别对应Fab、CH2和CH3结构域的变性转变。这些Tm值确认图4H形式与对照抗体的稳定程度相似。
综合这些实验确认了以多结构域展开转变为特征的多特异性表位结合蛋白形式具有强热稳定性。此外，独立DSC展开转变与近期一项显示多结构域蛋白质，如多特异性表位结合蛋白形式中单独结构域的折叠通路的研究相一致，不受其相邻结构域的影响。
实施例33多特异性表位结合蛋白显示与三种不同抗原的同时结合
目的：为证明固定于BIAcore仪器上的多特异性表位结合蛋白与三种不同抗原的同时结合。
方法：通过将三种抗原EB、EA和EPhA2依次注射到P1包被的芯片上，利用BIAcore评价P1(图3D)的三特异性结合能力。当P1表位被第一种抗原(EB)饱和时，注入第二种抗原(EA)，然后注入第三种抗原(EphA2)。卵清蛋白用作阴性结合对照。
结果：如图36所示，P1表位结合蛋白显示同时结合三种名为EB、EA和EphA2的不同抗原的能力(上方曲线)。P1表位结合蛋白的这种结合能力是特异性的，因为用卵清蛋白进行的相似实验未显示特异性结合(下方曲线)。这些结果显示多特异性表位结合蛋白可以同时连接三种不同抗原，它们被表位结合域组件识别。
实施例34多特异性表位结合蛋白的细胞内化
目的：为证明多特异性表位结合蛋白的细胞内化
方法：用共聚焦显微镜(显示)抗体内化-将表达EphA2的PC3细胞以1x106/孔的浓度加入96孔U底板。用PBS洗涤细胞两次，并在冰上用5μg对照(R347)、亲本(12G3H11)或多特异性表位结合蛋白(P1)标记30分钟。用PBS洗涤细胞两次，并在37℃培养基中孵育0、10、20、30和60分钟。然后用3.7％多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS冲洗两次并用含0.5％曲通X-100的PBS在室温下通透5分钟。再用PBS冲洗细胞两次，最后用1μg AlexaFluor-488山羊-抗-γ-人IgG抗体(英杰公司)标记细胞。用冷PBS冲洗两次去除过量的第二抗体。将细胞离心到包被的细胞载片上，用含DAPI的VH(VectasheildHardset)封片剂(维克特实验室公司(Vector Laboratories))将细胞封于盖玻片下。使用莱卡(Leica)SP5(德国慕尼黑)显微镜进行共聚焦激光扫描显微术，在63x放大倍数下分析内化。
结果：为了确认细胞对亲本抗体和多特异性表位结合蛋白的摄取，37℃下将表达三种靶受体(EphA2、EA和EB)的MiaPaca肿瘤细胞系与浓度为5μg/ml的多特异性表位结合蛋白P1、亲本抗体或阴性对照抗体孵育0、10、20、30和60分钟。使用共聚焦激光扫描显微镜通过荧光标记的抗-Fc抗体检测受体介导的内化。阳性内化的典型标志是细胞胞质中的明亮荧光，伴随膜(胞外)荧光降低。如图37B和C所示，多特异性表位结合蛋白P1和亲本抗体(12G3H11)迅速内化(～10分钟)，显示作为受体介导内化典型模式的胞内染色(绿色荧光)。使用293细胞的对照实验没有摄取任何P1或亲本抗体(12G3H11)(数据未显示)。而且，在使用无关抗体(R347，图37A)时，我们没有检测到MiaPaca细胞的内化，并且在不允许内化的4℃条件下未观察到可检测的内化。这些数据确证，与抗-EphA2亲本抗体相似，多特异性表位结合蛋白P1在体外被有效内化。
实施例35多特异性表位结合蛋白P1引起的体外和体内受体降解
目的：为证明多特异性表位结合蛋白可在体内与其靶表位发生功能性相互作用。
方法：体内药代动力学(PK)和药效学(PD)分析：将PC-3前列腺腺癌细胞以每只小鼠5x106细胞的密度植入7周龄裸小鼠(哈兰SD公司(Harlan SpragueDawley))右胁皮下。肿瘤生长至约100mm3时，给予多特异性表位结合蛋白P1或亲本抗-EphA2或抗-EB抗体，剂量67nmol/kg体重。在给药后1、4、8、24、48、72、120和144小时，在每个时间点从每剂量组收集三只小鼠的肿瘤和血清。另一组给予PBS的3只小鼠在给药后(0小时)立即收集肿瘤和血清。处理前将肿瘤和血清存储于-80℃。在快速制备(Fast Prep)24系统(MP生物医学公司(MP Biomedicals))的裂解基质(Lysing Matrix)A试管(MP生物医学公司)中，用含25μg/ml抑肽酶和10μg/ml亮抑肽酶的1％曲通-裂解缓冲液匀浆肿瘤30秒。浆裂解物4℃10,000rpm离心5分钟。收集上清并用BCA蛋白实验(皮尔斯公司(Pierce))分析蛋白质浓度。将来自肿瘤上清的30μg总蛋白上样至10％bis-tris凝胶上，并用western印迹分析EphA2、EB和GAPDH。将肿瘤裂解物上样于三块单独的凝胶，每块凝胶上加载来自每一时间点的一个样品。对Western印迹后的蛋白质条带进行光密度定量分析，并相对来自0小时时间点的单一蛋白质条带进行标准化，三块印迹凝胶中均存在PBS对照。使用EphA2或EB结合ELISA分析血清样品中的P1蛋白或亲本抗-EphA2或抗-EB对照抗体。简单的说，在4℃用含5μg/ml人EphA2或EB的PBS pH7.4包被96孔Maxisorp Elisa板(Nunc)过夜。用4％脱脂奶粉溶液封闭板，冲洗，加载血清样品(1∶1000稀释)并在22℃孵育1小时。对于EB和EphA2结合ELISA，从1mg/ml到10ng/ml进行连续稀释以制作标准曲线。对于EB结合ELISA，将P1蛋白血清样品与P1蛋白标准曲线对比以便定量，将抗-EB对照抗体血清样品与抗-EB对照抗体标准曲线作比较。用于抗-EB对照抗体ELISA的HRP偶联的第二抗体是山羊-抗-小鼠抗体(杰克逊免疫实验室公司(Jackson Immunolabs))，用于P1蛋白特异性ELISA的是山羊-抗-人抗体(杰克逊免疫实验室公司)。对于EphA2结合ELISA，将P1蛋白血清样品与P1蛋白标准曲线对比以便定量，将抗-EphA2对照抗体血清样品与抗-EphA2对照抗体标准曲线作比较。抗-EphA2对照抗体和三特异性抗体EphA2ELISA中所用的HRP偶联的第二抗体均为山羊-抗-人抗体(杰克逊免疫实验室公司)。
结果：进行受体降解实验以确定多特异性表位结合蛋白P1是否能够在体外和体内诱导其靶受体(EphA2、EA和EB)的降解。选择表达EB和EphA2的PC-3细胞是因为在注射入裸小鼠后它们能够增殖为肿瘤。不幸的是，PC-3细胞不表达EA，因此我们无法检测该受体的体外降解。然而，如体外受体磷酸化中所述，MiaPaca细胞系表达EA、EphA2和EB，但我们无法将该细胞用于受体降解实验，因为(1)它们在体内的肿瘤生长速率低且多变，并且(2)亲本抗-EA抗体(因此，多特异性表位结合蛋白P1)不能在MiaPaca细胞或其它表达EA的肿瘤细胞系中诱导EA降解。如图6所示，与单独的抗-EphA2和抗-EB亲本抗体相比，与P1蛋白孵育时，PC3细胞的EB(图38A)和EphA2(图38B)均强烈降解。接下来我们研究在全身给药后，P1蛋白是否能够在体内肿瘤模型系统中诱导靶受体的降解。值得指出的是，为了诱导体内受体的降解，三特异性抗体不仅需要到达肿瘤位点，还要能够穿透进入肿瘤本身。将PC-3细胞接种到裸小鼠中并测定P1蛋白或亲本抗体治疗后EphA2和EB表达水平，从而确证EphA2和EB确实发生体内降解。如图7所示，与亲本抗-EphA2和抗-EB抗体相比，P1蛋白能更有效地引起EB(A，B)和EphA2(C，D)降解。这些结果表明，设计为同时连接三种不同抗原的P1蛋白能够有效促进细胞表面不同受体组合的群聚(优于单独抗体)，从而提高内化和降解的效率，进而导致明显的受体下调，引起显著的抗肿瘤相应。
实施例36多特异性表位结合蛋白的药代动力学分析。
使用PC-3荷瘤小鼠进行多特异性表位结合蛋白P1及其亲本抗体抗-EphA2和抗-EB抗体的药代动力学分析。通过ELISA对具体时间点的P1蛋白和亲本抗体的血浆浓度进行分析。如图40所示，使用EphA2或EB ELISA发现，给药后144小时(6天)后仍可检测到P1蛋白(＞200nM)，并且P1蛋白的血浆浓度水平和单独亲本抗体的水平相当。这些数据表明在体内肿瘤模型中P1蛋白的半衰期与其亲本抗体相似。这些结果也表明P1蛋白在体内高度稳定。
序列表
<110>米迪缪尼有限公司(MedImmune LLC)
 
<120>多特异性表位结合蛋白及其应用
 
<130>AE713PCT
 
<140>PCT/US08/071656
<141>2008-07-30
 
<150>US 60/935,199
<151>2007-07-31
 
<150>US 61/012,656
<151>2007-12-10
 
<150>US 61/074.300
<151>2008-06-20
 
<160>4
 
<170>PatentIn 3.3版
 
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>人工构建物
 
<400>1
 
Glu Pro Lys Ser Cys
1               5
 
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
 
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>人工构建物
 
<400>3
 
Glu Pro Lys Ser Ser
1               5
 
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>4
 
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5

Claims (139)

1.一种包含第一和第二条多肽链的分离的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一和/或第二条链包含至少两个表位结合域(EBD)以及一个或多个Fc区。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含连接于至少一个EBD的N-末端的一个或多个Fc区。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：一个或多个Fc区-EBD-EBD。
4.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：EBD-一个或多个Fc区-EBD。
5.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含连接于至少一个EBD的C-末端的一个或多个Fc区。
6.如权利要求5所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区。
7.如权利要求5所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含结构域和Fc区，从N末端到C末端排列为：EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD。
8.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述第二条链包含连接于至少一个EBD的N-末端的一个或多个Cκ或Cλ区。
9.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述第二条链包含连接于至少一个EBD的C-末端的一个或多个Cκ或Cλ区。
10.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述第一和/或第二条链包含至少三个EBD。
11.如权利要求10所述的蛋白质，其特征在于，所述第一和/或第二条链包含至少四个表位结合域EBD。
12.如权利要求10或11所述的蛋白质，其特征在于，每一Fc区连接于至少三个EBD的N末端。
13.如权利要求12所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD。
14.如权利要求12所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD-EBD。
15.如权利要求10或11所述的蛋白质，其特征在于，每一Fc区连接于至少一个EBD的C末端。
16.如权利要求15所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-EBD-一个或多个Fc区。
17.如权利要求16所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-EBD-EBD-一个或多个Fc区。
18.如权利要求10或11所述的蛋白质，其特征在于，每一Fc区连接于至少一个EBD的N末端和至少一个EBD的C末端。
19.如权利要求18所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：至少一个EBD-一个或多个Fc区-至少一个EBD。
20.如权利要求18所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD。
21.如权利要求18所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD。
22.如权利要求18所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD。
23.如权利要求18所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD。
24.如权利要求18所述的蛋白质，其特征在于，所述结构域和Fc区从N末端到C末端排列为：EBD-一个或多个Fc区-EBD-EBD-EBD。
25.如权利要求10所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条多肽链包含3个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv，并且其中所述第二条多肽链包含3个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv。
26.如权利要求11所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条多肽链包含4个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv，并且其中所述第二条多肽链包含4个scFv和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-scFv-Fc区-scFv-scFv。
27.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含第一和第二条链；
所述第一条链包含scFv、抗体可变区和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Fc区；和
所述第二条链包含抗体可变区和Cκ/λ区，从N末端到C末端排列为：抗体可变区-Cκ或Cλ。
28.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含第一和第二条链；
所述第一条链包含抗体可变区和Fc区，从N末端到C末端排列为：抗体可变区-Fc区；并且
所述第二条链包含scFv、抗体可变区和Cκ/λ区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Cκ或Cλ。
29.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含第一和第二条链；
所述第一条链包含scFv、抗体可变区和Fc区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Fc区；并且
所述第二条链包含scFv、抗体可变区和Cκ/λ区，从N末端到C末端排列为：scFv-抗体可变区-Cκ或Cλ。
30.如权利要求27-29中任一项所述的蛋白质，其特征在于，至少两个EBD与至少一个Fc区的C-末端连接。
31.如权利要求27-30中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含抗体重链和抗体轻链。
32.一种包含第一和第二条多肽链的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一和/或第二条链包含至少两个表位结合域(EBD)以及一个或多个CH1结构域。
33.如权利要求32所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质还包含Cκ/λ结构域。
34.如权利要求33所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含连接于CH1结构域的2个scFv，从N末端到C末端排列为：scFv-CH1-scFv，所述第二条链包含连接于Cκ/λ结构域的2个scFv，从N末端到C末端排列为：scFv-Cκ/λ-scFv。
35.如权利要求34所述的蛋白质，其特征在于，所述第一和/或第二条链包含全部或部分抗体铰链结构域。
36.如权利要求35所述的蛋白质，其特征在于，所述第一和第二条多肽链由二硫键连接。
37.一种至少包含第一和第二条链的多特异性表位结合蛋白，所述第一条链包含两个可变结构域和Cκ或Cλ结构域，所述第二条链包含两个可变结构域、CH1、铰链、CH2和CH3结构域，其中所述第一条链中的所述可变结构域与所述第二条链中的所述可变结构域联合形成至少两个不同的表位结合位点。
38.如权利要求37所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含从N末端到C末端排列的对第一表位和第二表位特异性的可变结构域，所述第二条链包含从N末端到C末端排列的对所述第一和第二表位特异性的可变结构域。
39.一种包含第一和第二条链的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一条链包含至少2个抗体可变区和至少一个CH1和/或Cκ/λ结构域，所述第一条链中的所述可变结构域与所述第二条链中的所述可变结构域联合形成至少两个不同的表位结合位点。
40.如权利要求39所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含抗体重链可变结构域(VH)、CH1结构域、抗体轻链可变结构域(VL)和Cκ/λ结构域。
41.如权利要求40所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VH-CH1-VL-Cκ/λ。
42.如权利要求40所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VL-Cκ/λ-VH1-CH1。
43.如权利要求39所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含2个抗体重链可变结构域(VH)和2个CH1结构域。
44.如权利要求43所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VH-CH1-VH-CH1。
45.如权利要求39所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链包含2个抗体轻链可变结构域(VL)和2个Cκ/λ结构域。
46.如权利要求45所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链从N末端到C末端排列为：VL-Cκ/λ-VL-Cκ/λ。
47.如权利要求39-46中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链还包含Fc区。
48.如权利要求39-46中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述第二条链不包含Fc区。
49.一种至少包含第一和第二条多肽链的反向抗体蛋白，其中所述第一条链包含至少一个连接于CH1结构域的抗体重链可变区(VH)，所述第二条链包含连接于Cκ/λ结构域的抗体轻链可变区(VL)，所述Cκ/λ结构域还连接于Fc区，其中所述第一条链中的所述可变区与所述第二条链中的所述可变区联合形成表位结合位点。
50.如权利要求49所述的蛋白质，其特征在于，所述第一条链与第二条链通过二硫键连接。
51.一种包含抗体样轻链和抗体样重链的多特异性表位结合蛋白，其中所述轻链包含两个可变结构域和Cκ或Cλ结构域，并且所述重链包含两个可变结构域、CH1、铰链、CH2和CH3结构域，其中所述轻链中的所述可变结构域与所述重链中的所述可变结构域联合形成至少两个不同的表位结合位点。
52.如权利要求51所述的蛋白质，其特征在于，所述轻链包含从N末端到C末端排列的对第一表位和第二表位特异性的可变结构域，并且所述重链包含从N末端到C末端排列的对所述第一和第二表位特异性的可变结构域。
53.如权利要求52所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质还包含至少两个连接的EBD。
54.如权利要求53所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的C末端。
55.如权利要求53所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD连接于所述轻链的N末端。
56.如权利要求53所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的N末端。
57.一种包含抗体轻链和抗体重链的多特异性表位结合蛋白，其中所述重链还包含至少2个连接的EBD。
58.如权利要求57所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的C末端。
59.如权利要求57所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的N末端。
60.如权利要求57所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD连接于所述重链的N末端和C末端。
61.一种包含第一和第二条多肽链的多特异性表位结合蛋白，其中所述第一和/或第二条链包含至少三个EBD，所述第一条链包含Cκ或Cλ结构域，所述第二条链包含CH1结构域。
62.一种包含图1-5中任一幅出现的结构形式的多特异性表位结合蛋白。
63.如权利要求1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质，其特征在于，每一EBD对相同表位具有特异性。
64.如权利要求1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质，其特征在于，至少两个EBD对不同表位具有特异性。
65.如权利要求63或64所述的蛋白质，其特征在于，每一表位定位于相同抗原。
66.如权利要求65所述的蛋白质，其特征在于，每一表位定位于不同抗原。
67.如权利要求1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质，其特征在于，两个或多个EBD对相同表位具有特异性。
68.如权利要求1-67中任一项所述的蛋白质，其特征在于，当体外应用或给予哺乳动物时，该蛋白质能同时与至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个表位结合。
69.如权利要求1-24、30-36或53-61中任一项所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD与表位特异性结合的亲和力小于分离的相同功能性EBD。
70.如权利要求69所述的蛋白质，其特征在于，所述EBD选自下组：最靠近N末端的EBD、第二最靠近N末端的EBD以及第三最靠近N末端的EBD。
71.如权利要求1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD选自下组：scFv、单链双抗体、抗体模拟物和抗体可变结构域。
72.如权利要求71所述的蛋白质，其特征在于，所述抗体模拟物选自下组：小抗体、大抗体、高亲合性多聚体、基于Fn3的蛋白质支架、锚蛋白重复、VASP多肽、鸟胰腺多肽(aPP)、四连接素、亲和蛋白、绳结蛋白、SH3、PDZ结构域、蛋白A结构域、脂笼蛋白、转铁蛋白和库尼茨结构域。
73.如权利要求1-72中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质特异性结合于不同细胞表面受体并抑制和/或中和所述细胞表面受体。
74.如权利要求73所述的蛋白质，其特征在于，所述细胞表面受体是相同的受体。
75.如权利要求74所述的蛋白质，其特征在于，所述细胞表面受体是不同的受体。
76.如权利要求1-75中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质特异性结合于不同可溶性配体并抑制和/或中和所述配体。
77.如权利要求76所述的蛋白质，其特征在于，所述可溶性配体是相同的配体。
78.如权利要求76所述的蛋白质，其特征在于，所述可溶性配体是不同的配体。
79.如权利要求1-78中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质特异性结合于不同靶蛋白并抑制和/或中和所述靶蛋白。
80.如权利要求79所述的蛋白质，其特征在于，所述靶蛋白是相同的。
81.如权利要求79所述的蛋白质，其特征在于，所述靶蛋白是不同的。
82.如权利要求1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质，其特征在于，至少一个EBD保持分离自所述蛋白质的相同EBD的功能活性。
83.如权利要求1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的功能活性至少与包含分离自所述蛋白的每一EBD的组合物相等。
84.如权利要求1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的功能活性高于包含分离自所述蛋白的每一EBD的组合物。
85.如权利要求1-24、30-36、53-61、63-67和69-70中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的功能活性比包含分离自所述蛋白的每一EBD的组合物弱50％。
86.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有消耗选自下组的细胞群的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
87.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞群增殖的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
88.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞分泌炎性介导物的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
89.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞分泌胞质颗粒的功能活性：T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。
90.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有抑制或降低选自下组的细胞对活化刺激产生响应的功能活性：T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。
91.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有通过与一个或多个表位结合活化蛋白质的功能活性。
92.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有通过与一个或多个表位结合使蛋白质失活的功能活性。
93.如权利要求1-85中任一项所述的蛋白质，其特征在于，当给予哺乳动物或体外应用时，所述蛋白质具有效应功能。
94.如权利要求93所述的蛋白质，其特征在于，所述效应功能是抗体依赖性细胞毒作用。
95.如权利要求93所述的蛋白质，其特征在于，所述效应功能是补体依赖性细胞毒作用。
96.一种编码权利要求1-95中任一项所述蛋白质或其表位结合部分的分离的核酸分子。
97.一种包含权利要求96所述核酸分子的表达载体。
98.一种包含权利要求97所述表达载体的宿主细胞。
99.一种制备权利要求1-95中任一项所述蛋白质的方法，其中所述方法包括制备所述蛋白质的规模化工艺，其中由所述规模化工艺得到所述蛋白质的生产效率为约10mg/L-300mg/L，并且所述蛋白质保持至少一种功能活性。
100.如权利要求99所述的方法，其特征在于，通过HPSEC测量，以蛋白质重量计，所述工艺产生的所述蛋白质的聚集水平不高于5％。
101.如权利要求99所述的方法，其特征在于，通过rCGE测量，以蛋白质重量计，所述工艺产生的所述蛋白质的聚集水平不高于5％。
102.如权利要求99所述的方法，其特征在于，所述工艺产生的所述蛋白质显示低的片段化水平，通过HPSEC测量，代表完整所述蛋白质的峰占峰总面积的80％或更高。
103.一种包含权利要求1-95中任一项所述蛋白质的液体制剂，通过HPSEC测量，以蛋白质重量计，所述制剂的聚集水平不高于5％。
104.一种包含权利要求1-95中任一项所述蛋白质的液体制剂，通过rCGE测量，以蛋白质重量计，所述制剂的聚集水平不高于5％。
105.一种包含权利要求1-95中任一项所述蛋白质的液体制剂，其中所述制剂显示低的片段化水平，通过HPSEC测量，代表完整所述蛋白质的峰占峰总面积的80％或更高。
106.一种包含治疗有效量的权利要求1-95中任一项所述蛋白质和药学可接受赋形剂的无菌制剂。
107.一种通过给予需要的病人权利要求106所述的制剂改善、治疗或预防癌症或其症状的方法。
108.如权利要求107所述的方法，其特征在于，所述癌症是头、颈、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、结肠、直肠、结直肠、胃、脾、肾、骨骼肌、皮下组织、转移性黑色素瘤、子宫内膜、前列腺、乳腺、卵巢、睾丸、皮肤、甲状腺、血液、淋巴结、肾、肝、胰腺、脑或中枢神经系统的癌症。
109.一种消耗哺乳动物中细胞群的方法，包括将权利要求106所述制剂与所述细胞接触，其中所述细胞群选自嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞和肿瘤细胞。
110.一种杀伤或靶向病原体的方法，包括将权利要求106所述的制剂与哺乳动物中的病原体接触。
111.一种失活、抑制或消耗细胞因子的方法，包括将权利要求106所述的制剂与哺乳动物中的所述细胞因子接触。
112.如权利要求111所述的方法，其特征在于，所述细胞因子是C5a。
113.一种通过给予需要的病人权利要求106所述的制剂预防、治疗、控制或诊断炎性疾病或自身免疫病的方法。
114.一种通过给予需要的病人权利要求106所述制剂抑制血管新生的方法。
115.如权利要求113或114所述的方法，其特征在于，所述病人罹患癌症、类风湿性关节炎、SLE或舍格伦综合征。
116.如权利要求1-95中任一项所述的蛋白质，其特征在于，当给予哺乳动物或体外应用时，所述蛋白质识别和/或消耗通过表达不同细胞表面表位限定的细胞群，所述蛋白质的至少一个表位结合域选择性结合所述不同细胞表面表位。
117.如权利要求116中所述的蛋白质，其特征在于，所述细胞群选自下组：肿瘤细胞、癌症干细胞、B细胞和T细胞。
118.如权利要求1-95中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含对肿瘤细胞呈现的细胞表面抗原具有特异性的表位结合域。
119.如权利要求118所述的蛋白质，其特征在于，所述细胞表面抗原不同时呈现。
120.如权利要求118或119所述的蛋白质，其特征在于，当给予哺乳动物时所述蛋白质引起抗体效应功能，当至少一个表位结合域发生结合时，靶向肿瘤细胞。
121.如权利要求1-95中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含对准备在所述蛋白质给予哺乳动物或体外应用时递送至细胞的货物分子具有特异性的至少一个表位结合域。
122.如权利要求121所述的蛋白质，其特征在于，所述货物分子选自下组：细胞毒药物、抗代谢剂、毒素、肽、DNA分子、RNA分子、小分子、放射性同位素、荧光团、酶、酶抑制剂、前药或线粒体毒剂。
123.如权利要求121或122中所述的蛋白质，其特征在于，当结合于所述细胞时，所述蛋白质内化。
124.如权利要求121-123中任一项所述的蛋白质，其特征在于，对货物分子具有特异性的所述表位结合域在pH约7.4时对所述货物分子显示高结合亲和力，在pH约6.0时对所述货物分子显示低结合亲和力。
125.一种鉴定、消耗、活化或抑制靶细胞群的方法，包括当给予哺乳动物或体外应用时，将权利要求1-95中任一项所述蛋白质与所述靶细胞群接触，其中所述蛋白质不显著消耗、活化或抑制非靶细胞群。
126.如权利要求125所述的方法，其特征在于，与对照表位结合蛋白相比，所述蛋白质与靶细胞群的亲合力提高，其中所述对照表位结合蛋白包含：
在所述多特异性表位结合蛋白中出现的表位结合域子集；或
在所述多特异性表位结合蛋白中出现的至少一个分离的表位结合域。
127.如权利要求126所述的方法，其特征在于，所述子集包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个表位结合域。
128.如权利要求125-127所述的方法，其特征在于，所述靶细胞选自下组：癌细胞、癌症干细胞、T细胞、B细胞、黑色素瘤细胞、淋巴瘤细胞、肿瘤细胞、前B细胞、前T细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。
129.一种使用权利要求1-95或116-124中任一项所述蛋白质预防、控制、治疗或诊断病人的急性或慢性疾病的方法。
130.一种使用权利要求107-115或125-128中任一项所述方法预防、控制、治疗或诊断病人的急性或慢性疾病的方法。
131.一种在哺乳动物中使用权利要求1-95或116-124中任一项所述蛋白质降低与接触一种或多种药剂有关的毒性的方法，所述药剂选自下组：相思豆毒蛋白、马钱子碱、毒芹素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺菌毒素、内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇、α毒素、格尔德霉素、白树毒素、百脉根苷、蓖麻毒蛋白、番木鳖硷、蛇毒毒素和河豚毒素。
132.一种使用权利要求1-95或116-124中任一项所述蛋白质检测和/或纯化溶液中的至少一种可溶性化合物的方法。
133.如权利要求132所述的方法，其特征在于，所述溶液是体液、细胞培养液、发酵培养液、生物样品或饮用水。
134.如权利要求133所述的方法，其特征在于，所述体液选自血液、汗液、淋巴、尿液、泪液、胆汁、唾液、血清、羊水，耳垢(耳蜡)、考珀液、精液、乳糜、钟液、脑脊液、粪便、粪便水、胰液、滑膜液、房水、组织间液、乳汁、黏液、胸膜液、脓、皮脂和呕吐物。
135.一种使用权利要求1-95或116-124中任一项所述蛋白质降低哺乳动物中细胞因子风暴毒性的方法。
136.一种使用权利要求1-95或116-124中任一项所述蛋白质降低哺乳动物中治疗诱导毒性的方法，其中所述治疗是生物疗法。
137.如权利要求136所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包含至少一个源自所述生物疗法的表位结合域。
138.如权利要求136所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包含至少一个与所述生物疗法的至少一个组分竞争的表位结合域。
139.如权利要求1-95或116-124中任一项所述的蛋白质，其特征在于，当给予哺乳动物时，所述蛋白质的半衰期至少为1天。
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