CN104004092B - 单基因编码的双或多价特异性抗hiv免疫粘附素 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素，其由单个基因编码区域产生，不包含常规抗体的CL和CH1结构域，包含由灵活肽段连结而成的两个或多个抗体功能结构域scFv以及人免疫球蛋白Fc区域，且能够同时与两个或多个不同HIV相关抗原表位进行高亲和力的结合。本发明构建了的单一基因编码的具有双或多价特异抗HIV位点的分泌型免疫粘附素具有高效的抗病毒能力及中和广谱性，并使出现中和抗体的耐药病毒株的机率降到最低。
Description
技术领域
本发明涉及抗HIV-1感染的新型生物剂预防和免疫治疗产品的研发，特别涉及用于有效阻断HIV-1感染的广谱高效中和免疫粘附素的基因优化、蛋白表达纯化以及中和效能的改进。
背景技术
艾滋病(HIV/AIDS)是严重威胁人类公共健康的最主要因素之一，至今已经导致了全世界累计3000万人死亡和高达3300万的病毒携带者，迄今还没有有效的治愈艾滋病的方法和疫苗。虽然目前已经有几十种广谱高效的抗HIV-1中和抗体从少数艾滋病感染者中分离出来，但是可以诱导出这种中和抗体的疫苗还一直没有被研发出来，见文献[Kwong PD,Mascola JR:Human antibodies that neutralize HIV-1:identification,structures,and B cell ontogenies.Immunity，2012,37:412-425]以及[Corti D,Lanzavecchia A:Broadlyneutralizing antiviral antibodies.Annu Rev Immunol2013,31:705-742]。
面对艾滋病疫苗研制长期以来的失败结果，我们在重新思考和审视有关艾滋病疫苗的设计、疫苗免疫策略等重大科学问题的同时，对其他新型生物剂预防产品进行研发。免疫粘附素(Immunoadhesin,IA)就是其中一种，它是基于中和抗体、已经获FDA批准的用于预防和治疗的新型生物产品。
近几年来，人免疫粘附素被证明在临床上有应用潜能，是以人源单克隆中和抗体为药剂来中和外来病原体(如HIV)提供了另一种可能的方式。构建免疫粘附素的一个重要优势在于较容易在体外优化中和抗体的中和效力，包括优化提高抗体的表达、释放、半衰期和结合区域亲和力等特性。最近的研究已经证明，即使在很低的浓度条件下，有中和抗体活性的免疫粘附素能够有效保护对于猴子免于SIV的感染，见文献[Hessell AJ,Poignard P,Hunter M,Hangartner L,Tehrani DM,Bleeker WK,Parren PW,Marx PA,BurtonDR:Effective,low-titer antibody protection against low-dose repeated mucosal SHIVchallenge in macaques.Nat Med2009,15:951-954]以及[Johnson PR,Schnepp BC,Zhang J,Connell MJ,Greene SM,Yuste E,Desrosiers RC,Clark KR:Vector-mediated gene transferengenders long-lived neutralizing activity and protection against SIV infection in monkeys.Nat Med2009,15:901-906]。目前，能使人免于HIV的感染的具有中和抗体活性的免疫粘附素类似产品还没有报道；针对scFv-ibalizumab(Hu5A8)，scFv-VRC01，scFv-PG09，scFv-PG16和scFv-PGT128分泌型sIgG-免疫粘附素或者分泌型sIgA-免疫粘附素的研究，也没有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是构建能够由单一基因编码的具有双或多价特异抗HIV位点的分泌型免疫粘附素，其具有高效的抗病毒能力及中和广谱性，并使出现中和抗体的耐药病毒株的机率降到最低。
本发明提供了一种单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素，其由单个基因编码区域产生，不包含常规抗体的CL和CH1结构域，包含由灵活肽段连结而成的两个或多个抗体功能结构域scFv以及人免疫球蛋白Fc区域，且能够同时与两个或多个不同HIV相关抗原表位进行高亲和力的结合。
本发明还提供了上述单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：筛选目标基因，并根据目标基因构建中和抗体单链scFv基因，即VL-(Gly4Ser)3-VH或VH-(Gly4Ser)3-VL；
步骤二：将构建的一种中和抗体单链scFv基因与人hIgG1-Fc基因进行无缝连接，构成IgG免疫粘附素融合基因；
步骤三：通过重叠PCR的方法将另一种中和抗体单链scFv基因与上述IgG免疫粘附素融合基因通过一个(Gly4Ser)4肽段相连接，构建融合基因；
步骤四：将步骤三最后构建得到的融合基因整合进优化后的pVAX-Opt.载体中，构建出单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA；
步骤五：将构建的单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA通过细胞转染和蛋白纯化来得到所需的免疫粘附素。
步骤一中所述目标基因为scFv-Hu5A8基因和scFv-PGT128基因，所述构建的中和抗体单链scFv基因序列如图1的scFv-Hu5A8和scFv-PGT128所示。
步骤二中构建的一种中和抗体单链scFv基因为scFv-Hu5A8基因，与人hIgG1-Fc基因进行无缝连接，构建scFv-Hu5A8-IgG基因，构建方法如下：先用设计好的两对引物分别PCR扩增scFv-Hu5A8基因和hIgG1-Fc基因，引物的构建原则为：scFv-Hu5A8基因的反向引物和hIgG1-Fc基因的正向引物有10个碱基的基因重叠，scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG1-Fc基因的反向引物的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点；然后以两种扩增产物为模板，以scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG1-Fc基因的反向引物为引物再进行PCR扩增，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-IgG。
步骤三中另一种中和抗体单链scFv基因为scFv-PGT128基因，构建方法如下：先用设计好的两对引物分别PCR扩增scFv-PGT128基因和scFv-Hu5A8-IgG基因；引物的构建原则为：scFv-PGT128基因的反向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的正向引物有45个碱基的基因重叠，且scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点，引物设计还要引入一个(Gly4Ser)4肽段，将scFv-PGT128连接到scFv-Hu5A8-IgG的5'端；然后以两种扩增产物为模板，以scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物为引物再进行PCR扩增，得到scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因。
步骤四中是通过BamHI和MssI双酶切连接法，把上述scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因整合进图3A所示的优化后的pVAX载体中，其中融合基因的5'端以BamHI连接，3'端以MssI连接到载体，从而构建出如图3G所示的单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒，即pVAX-SG-Bispecific-IA。
步骤五中细胞转染和蛋白纯化的步骤如下：提前一天将293T细胞以1.5×105个细胞/毫升的密度铺在细胞培养皿中，转染当天用PEI转染试剂与单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA充分混合，DNA与PEI转染试剂的质量比1:3，静置15分钟后将PEI-DNA混合物均匀加入293T细胞中，三天后将细胞上清用rProtein G试剂收集纯化分泌的免疫粘附素。
本发明选择设计了多种针对不同靶位的中和抗体的单链决定域基因，进行基因编排的优化，先构建成单价分泌型IgG免疫粘附素，比较这些免疫粘附素的抗病毒活性及协同作用，选择其中具有较强协同中和作用的两个中和抗体scFv作为构建双或多价特异性免疫粘附素的母版，构建了单一基因编码的具有双或多价特异抗HIV位点的分泌型免疫粘附素，实验证明，这种免疫粘附素具有高效的抗病毒能力及中和广谱性，并使出现中和抗体的耐药病毒株的机率降到最低。
附图说明：
下面结合图表和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为优化后的目标抗体单链基因及人hIgG1-Fc序列。
图2为本发明单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的构建示意图。
图3为本发明单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒的构建示意图。
图4为构建成功的各特异性免疫粘附素的SDS-PAGE检测结果。
图5用ELISA和FACS检测特异性免疫粘附素对CD4和gp120的结合能力的检测结果。
图6为各特异性免疫粘附素对假病毒的中和强度及广谱性的检测结果。
图7为各特异性免疫粘附素对40株HIV-1假病毒的中和结果。
具体实施方式：
下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1
本实施例提供了sIgG及sIgA目标基因的选择、合成、优化及免疫粘附素(IA)的构建和表达，具体过程如下：
步骤一：目标基因的筛选和单链抗体的构建
选择设计了多种针对HIV不同靶位的中和抗体的单链基因(scFv)，具体参考文献(1)Skerra A,Pluckthun A:Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment inEscherichia coli.Science1988,240:1038-1041.和(2)Glockshuber R,Malia M,Pfitzinger I,Pluckthun A:A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments.Biochemistry1990,29:1362-1367。即VL-(Gly4Ser)3-VH(见构建示意图2A)，包括scFv-Hu5A8(针对靶细胞CD4)，scFv-VRC01(针对HIV包膜蛋白CD4结合位点)，scFv-PG9(针对HIV包膜蛋白四级结构V2环)，scFv-PG16(针对HIV包膜蛋白四级结构V2环)和scFv-PGT128(针对HIV包膜蛋白V3环和糖基)，并成功构建出高表达，密码子优化的中和抗体单链基因(Genscript公司合成，针对在人体内蛋白表达进行了密码子优化)，具体氨基酸和DNA序列见图1。
步骤二：构建IgG免疫粘附素的融合基因
通过重叠PCR方法，将上述五种优化后的scFv基因(图1)与人hIgG1-Fc基因(参考GenBank序列AC_000146)进行无缝连接，即将scFv中VH的3'端与hIgG1-Fc中hinge区域的5'端连接，构成IgG免疫粘附素融合基因(见构建示意图2B)。
以构建融合基因scFv-Hu5A8-IgG为例，具体构建方法为：
先用设计好的两对引物(引物均由Tech Dragon Ltd.公司合成)分别PCR扩增两个需要融合的基因，如用引物Hu5A8-1F/Hu5A8-1R(见表1)扩增scFv-Hu5A8(步骤一中构建，由Genscript公司合成)，用引物Hu5A8-2F/2R(见表1)扩增hIgG1-Fc基因(模板序列见图1，由Genscript公司合成)，引物的构建原则为：反向引物1R和正向引物2F有10个碱基的基因重叠，且正向引物1F和反向引物2R的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点。具体PCR反应条件按照高保真DNA聚合酶KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase(KapaBiosystems公司，货号KK2601)说明书进行操作，其中退火65℃15秒，延伸72℃，1分钟/Kb，共20个循环；然后以两种扩增产物(重叠基因部分可自动进行配对)为模板，以Hu5A8-1F和2R为引物再进行PCR扩增(PCR反应条件同上)，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-IgG，且融合基因的5'端和3'端即分别连有BamHI和MssI酶切位点以利于后续的质粒构建。
融合基因scFv-VRC01-IgG、scFv-PG09-IgG、scFv-PG16-IgG、scFv-PGT128-IgG的构建方法同融合基因scFv-Hu5A8-IgG。所有构建融合基因的PCR引物序列见表1(引物2R同时代表Hu5A8-2R、VRC01-2R、PG09-2R、PG16-2R和PGT128-2R，序列均相同)。
表1
| 引物名称 | 引物序列 |
| Hu5A8‐1F | CGGGATCCGACATTGTGATGACTC |
| Hu5A8‐1R | ATTTGGGCTCGGATGAGACTGTCACCAGGG |
| Hu5A8‐2F | AGTCTCATCCGAGCCCAAATCTTGTGACAA |
| VRC01‐1F | CGGGATCCGAGATTGTCCTGACCC |
| VRC01‐1R | ATTTGGGCTCGCTGCTGACAATGACAGGTG |
| VRC01‐2F | TGTCAGCAGCGAGCCCAAATCTTGTGACAA |
| PG09‐1F | CGGGATCCCAGAGCGCCCTGACCC |
| PG09‐1R | ATTTGGGCTCAGAGGAGACTGTGACGGTAG |
| PG09‐2F | AGTCTCCTCTGAGCCCAAATCTTGTGACAA |
| PG16‐1F | CGGGATCCCAGAGCGCCCTGACCC |
| PG16‐1R | ATTTGGGCTCGCTGGAGACAGTGACAGTAG |
| PG16‐2F | TGTCTCCAGCGAGCCCAAATCTTGTGACAA |
| PGT128‐1F | CGGGATCCCAGAGCGCCCTGACCC |
| PGT128‐1R | ATTTGGGCTCGCTGCTGACAGTGACCAGAG |
| PGT128‐2F | TGTCAGCAGCGAGCCCAAATCTTGTGACAA |
| 2R | GGGTTTAAACTCATTTACCCGGAG |
步骤三：构建分泌型免疫粘附素蛋白真核表达质粒
为了增强免疫粘附素的分泌性表达，将高效分泌肽tPA(DNA序列为：ATGGACGCCATGCTGCGCGGACTGTGCTGCGTGCTGCTACTGT
GCGGCGCCGTGTTCGTGAGCCCCAGCCAGGAGATCCACGCCCGATTCAGGAGAGGAGCCAGAGGA，由Tech Dragon Ltd.公司合成)插入哺乳动物表达载体pVAX1(Invitrogen公司，货号V26020)的CMV启动子下游，并在tPA前加入Kozak序列(GCCACCATGG)以进一步增强蛋白的表达，得到优化的pVAX载体，即pVAX-Opt.(见构建示意图3A)。然后通过BamHI和MssI双酶切连接法，把上述IgG免疫粘附素融合基因整合进优化的pVAX载体中(融合基因的5'端以BamHI连接，3'端以MssI连接到载体)，构建成HIV特异性免疫粘附素蛋白真核表达质粒，即pVAX-scFv-Hu5A8-sIgG(见构建示意图3B)、pVAX-scFv-VRC01-sIgG(见构建示意图3C)、pVAX-scFv-PG09-sIgG(见构建示意图3D)、pVAX-scFv-PG16-sIgG(见构建示意图3E)和pVAX-scFv-PGT128-sIgG(见构建示意图3F)。
步骤四：构建单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒
基于后面对构建的五种分泌型免疫粘附素进行协同中和效果的测试，我们优选选择scFv-Hu5A8-IgG和scFv-PGT128-IgG为母体来构建后面的双特异性分泌型免疫粘附素(Bispecific-IA)，包括单基因编码的双特异性免疫粘附素(SG-Bispecific-IA)，以及双基因编码的双特异性免疫粘附素(DG-Bispecific-IA)。
DG-Bispecific-IA作为SG-Bispecific-IA平行对照抗体，是通过共转染表达两个母体免疫粘附素的质粒pVAX-scFv-Hu5A8-sIgG和pVAX-scFv-PGT128-sIgG(均由步骤三构建)得到的异质二聚体免疫粘附素(具体的转染制备过程见步骤五)。
SG-Bispecific-IA的基因是用重叠PCR的方法构建：先用设计好的一对引物PGT128-scFv-BamHI-F/128-scFv-linker-R(引物序列见表2)PCR扩增scFv-PGT128基因(步骤一中构建，由Genscript公司合成)，另一对引物Linker-5A8-scFv-F/scFv-Fc-2R(引物序列见表格2)PCR扩增scFv-Hu5A8-IgG基因(步骤二中构建)，引物构建原则为反向引物128-scFv-linker-R和正向引物Linker-5A8-scFv-F有45个碱基的基因重叠，且scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点，通过引物设计引入一个60碱基长的(Gly4Ser)4肽段(linker)(DNA序列为GGCGGAGGCGGGTCAGGAGGAGGAGGGAGCGGAGGAGGAGGGAGCGGAGGCGGGGGAAGT)，将scFv-PGT128连接到scFv-Hu5A8-IgG的5'端。具体PCR扩增反应条件按照高保真DNA聚合酶KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase(Kapa Biosystems公司，货号KK2601)说明书进行操作，其中退火65℃15秒，延伸72℃1分钟/Kb，共20个循环；然后以两种扩增产物(重叠基因部分可自动进行配对)为模板，以PGT128-scFv-BamHI-F和scFv-Fc-2R为引物再进行PCR扩增(PCR扩增反应条件同上)，得到scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因(5'端和3'端分别连有BamHI和MssI酶切位点)，见示意图2C。同样通过BamHI和MssI双酶切连接法，把上述scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因整合进优化后的pVAX-Opt.载体中(图3A)(融合基因的5'端以BamHI连接，3'端以MssI连接到载体)，构建出单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒，即质粒pVAX-SG-Bispecific-IA(见构建示意图3G)。通过转染表达此单一质粒，预期达到一个抗体分子可以同时袭击两个病毒中和表位的最佳效果，即通过scFv-Hu5A8抗体功能区结合细胞表面的CD4分子来阻止HIV的入胞过程，同时通过scFv-PGT128功能区结合HIV包膜蛋白的V3环和糖基，以进一步阻挡病毒对细胞的感染。
表2
步骤五：制备及功能鉴定单一和双特异性sIgG免疫粘附素
构建好上述所有免疫粘附素基因的表达质粒以后，我们需要通过细胞转染和蛋白纯化来得到所需的抗体，以进行后续的抗体中和能力的鉴定。
首先，分别用构建的目标基因单特异性质粒pVAX-scFv-Hu5A8//PGT128-sIgG(步骤三构建)，单基因双特异性质粒pVAX-SG-Bispecific-IA(步骤四构建)，以及双基因双特异性质粒(质量比为pVAX-scFv-Hu5A8-sIgG：pVAX-scFv-PGT128-sIgG＝1:1)转染人293T细胞(来自美国纽约Aaron Diamond AIDS Research Center)，具体转染步骤为：提前一天将293T细胞以1.5×105个细胞/毫升的密度铺在细胞培养皿中，转染当天用PEI转染试剂(Polysciences公司，货号23966)与所转染的质粒充分混合(质量比为DNA：PEI＝1:3)溶于无血清的DMEM培养基中得到PEI-DNA混合物(即15μg DNA和45μg PEI溶于1ml培养基)，静置15分钟后将PEI-DNA混合物均匀加入293T细胞中(100mm细胞培养皿中加入含15μg DNA的1ml PEI-DNA混合物)，三天后将细胞上清用rProtein G试剂(Invitrogen公司，货号15920010)按照试剂说明书来收集纯化分泌的免疫粘附素(浓度约为200-500μg/ml，具体视细胞转染效率而定)。纯化后的免疫粘附素通过跑SDS-PAGE进行鉴定(见图4)，可看出各免疫粘附素是正确表达的，其中第一条带为单基因编码的双特异性免疫粘附素SG-Bispecific-IA(质粒pVAX-SG-Bispecific-IA表达)，第二条带为双基因编码的双特异性免疫粘附素DG-Bispecific-IA(质粒pVAX-scFv-Hu5A8-sIgG和pVAX-scFv-PGT128-sIgG共表达得到)，第三和第四条带分别为母代免疫粘附素PGT128-IA和Hu5A8-IA(质粒pVAX-scFv-PGT128-sIgG和pVAX-scFv-Hu5A8-sIgG分别表达)，第五条带为对照抗体VRC01的原始IgG蛋白(共转染表达VRC01重链和轻链的质粒得到，表达和纯化步骤与其他免疫粘附素相同，质粒为清华大学艾滋病综合研究中心张林琦教授提供)。此外，单特异性免疫粘附素的蛋白分子量比完整IgG对照抗体(VRC01-IgG)要小，说明构建的免疫粘附素更适用于体内的抗体基因治疗。rProtein G纯化后的免疫粘附素(浓度约为200-500μg/ml)再用PBS溶液(PH7.4，Invitrogen公司，货号10010023)过柱，按照Amicon Ultra Centrifugal Filter Units(Millipore公司，货号UFC805024)的产品说明书来进一步浓缩和纯化(蛋白浓度浓缩为2-3μg/μl)，最后通过BCA试剂盒(Thermo公司，货号23227)蛋白定量后方可进行后续的病毒中和实验。
在进行中和实验之前，我们鉴定了所构建免疫粘附素对特异性表位的结合能力，以确定设计改造后的双特异性免疫粘附素是否具有抗体的基本功能。首先我们分析了各免疫粘附素与CD4分子的结合能力，具体检测步骤为：将表达纯化的SG-Bispecific-IA、DG-Bispecific-IA及其母代Hu5A8-IA、PGT128-IA(均为0.2μg/test)，分别与膜表达CD4分子的3T3.T4细胞(来自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)混合(每个反应约1×106个细胞)，然后用APC荧光标记的抗人IgG-Fc-gamma的二抗(Invitrogen公司，2000倍稀释)给细胞染色，最后用流式细胞仪检测免疫粘附素与细胞的阳性结合率(见图5A，其中横轴为荧光强度，纵轴为相对细胞数)。如图，我们确定了双特异性免疫粘附素SG-Bispecific-IA(红色)和DG-Bispecific-IA(绿色)具有和母代免疫粘附素Hu5A8-IA(蓝色)等同的对CD4的强结合能力(见图5A)，而PGT128-IA(橙色)不识别CD4分子，阴性对照为未加抗体的3T3.T4细胞(黑色)。类似地，我们还利用ELISA分析了各免疫粘附素结合HIV-1gp120蛋白的能力，具体检测步骤为：将HIV-1gp120蛋白(HIV-1IIIB亚型，来自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)包被在Elisa板子上(50ng/孔)，封闭后加入待测的免疫粘附素(100ng/孔)孵育，随后加入HRP标记的抗人IgG的二抗(Sigma公司，100μl/孔，5000倍稀释)，并用对应的底物TMB(四甲基联苯胺底物，Sigma公司，50μl/孔)显色，最后用仪器(Victor3Multilable Reader)读取450nm波段的吸光度值(见图5B，纵轴为吸光度值)，结果如图所示，由此可见双特异性免疫粘附素SG-Bispecific-IA和DG-Bispecific-IA具有和母代PGT128-IA等同的对gp120的强结合能力，而Hu5A8-IA不识别gp120，其中VRC01-IgG为阳性对照抗体，阴性对照为未加HIV特异性抗体的本底对照。以上结果说明构建的SG-Bispecific-IA的结构并不影响其对CD4和gp120的结合效果。
实施例2
本实施例评价了单基因编码的双特异性免疫粘附素对HIV-1假病毒的中和强度和广谱性。
目前，共检测了以上构建的双特异性免疫粘附素(SG-Bispecific-IA和DG-Bispecific-IA)及其母代免疫粘附素(Hu5A8-IA，PGT128-IA)对40例HIV-1假病毒(Env-pseudotyped virus，来自中国医科大学附属第一医院艾滋病免疫学重点实验室尚红教授)在体外TZM-bl细胞系中单轮感染的中和效果，这些HIV-1假病毒覆盖中国主要CRF01AE，CRF07BC，CRF08BC，B’C，B亚型及C亚型，及一些国外B亚型毒株(见图7)。中和试验的具体步骤为：在96孔平底细胞培养板中，用DMEM细胞培养基梯度稀释要测的免疫粘附素或抗体蛋白(100μl/孔，包括细胞空白对照孔和不加抗体的病毒对照孔)，然后加入包装好的HIV-1假病毒(50μl/孔，浓度为200个TCID50，溶于含有25μg/mlDEAE-dextran的DMEM培养基)，在37℃温育1小时后加入1万个细胞/孔的TZM-bl细胞(100μl/孔，细胞来自美国Aaron Diamond AIDS Research Center)。37℃培养48小时后，用Inspire VICTOR3multilabel counter仪器测每孔细胞的Luciferase活性，并计算病毒抑制率和抗体的IC50。在实验室相同实验条件下表达的VRC01-IgG抗体，作为标准抗体以评测和比较构建的免疫粘附素的中和效能。
实验结果表明，只有单基因编码的双特异性免疫粘附素SG-Bispecific-IA可100％中和所有测试的毒株(以IC50计算)；即使以更严格的IC90计算，SG-Bispecific-IA仍然可以中和92％的毒株，而双基因编码的双特异性免疫粘附素DG-Bispecific-IA及其母代免疫粘附素Hu5A8-IA和PGT128-IA只能中和62-70％的毒株，VRC01-IgG对照抗体也只能中和72％的毒株(见图6，图上方的数字表示各抗体对病毒中和广谱性的百分比)。另外，SG-Bispecific-IA还表现出更高的中和强度(见图6，纵轴表示各抗体的IC50或IC90浓度，单位是nM；红色误差线表示Median±IQR)。以基于摩尔质量的几何平均IC50计算，SG-Bispecific-IA的中和强度约是DG-Bispecific-IA和母代PGT128-IA的三倍，是VRC01-IgG对照抗体的十倍；且随着抑制百分率的增加(如以几何平均IC90计算)，SG-Bispecific-IA中和强度的优势更加明显。
综上所述，无论在中和强度还是广谱性上，单基因编码的双特异性免疫粘附素SG-Bispecific-IA都要明显优于双基因编码的双特异性免疫粘附素DG-Bispecific-IA和其母代免疫粘附素Hu5A8-IA和PGT128-IA；这些被SG-Bispecific-IA中和的HIV-1毒株包括4株急性感染分离株(320008,320040,CH106,CH198)，以及一些对广谱中和抗体(如VRC01，PG9，PG16和PGT128)抵抗的变异毒株，这说明本发明构建的单基因编码的双特异性免疫粘附素是有潜力中和覆盖所有HIV-1流行株，将来可以应用到对HIV感染的免疫预防或治疗。
Claims (6)
1.一种单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：筛选目标基因，并根据目标基因构建中和抗体单链scFv基因；
步骤二：将构建的一种中和抗体单链scFv基因与人hIgG1-Fc基因进行无缝连接，构成IgG免疫粘附素融合基因；
步骤三：通过重叠PCR的方法将另一种中和抗体单链scFv基因与上述IgG免疫粘附素融合基因通过一个(Gly4Ser)4肽段相连接，构建融合基因；
步骤四：将步骤三最后构建得到的融合基因整合进优化后的pVAX-Opt.载体中，构建出单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA；
步骤五：将构建的单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA通过细胞转染和蛋白纯化来得到所需的免疫粘附素。
步骤一中所述目标基因为scFv-Hu5A8基因和scFv-PGT128基因，所述构建的中和抗体单链scFv基因序列如图1的scFv-Hu5A8和scFv-PGT128所示。
2.根据权利要求1所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤二中构建的一种中和抗体单链scFv基因为scFv-Hu5A8基因，与人hIgG1-Fc基因进行无缝连接，构建scFv-Hu5A8-IgG基因，构建方法如下：
先用设计好的两对引物分别PCR扩增scFv-Hu5A8基因和hIgG1-Fc基因，引物的构建原则为：scFv-Hu5A8基因的反向引物和hIgG1-Fc基因的正向引物有10个碱基的基因重叠，scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG1-Fc基因的反向引物的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点；然后以两种扩增产物为模板，以scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG1-Fc基因的反向引物为引物再进行PCR扩增，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-IgG。
3.根据权利要求2所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤三中另一种中和抗体单链scFv基因为scFv-PGT128基因，构建方法如下：先用设计好的两对引物分别PCR扩增scFv-PGT128基因和scFv-Hu5A8-IgG基因；引物的构建原则为：scFv-PGT128基因的反向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的正向引物有45个碱基的基因重叠，且scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点，引物设计还要引入一个(Gly4Ser)4肽段，将scFv-PGT128连接到scFv-Hu5A8-IgG的5'端；然后以两种扩增产物为模板，以scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物为引物再进行PCR扩增，得到scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因。
4.根据权利要求3所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤四中是通过BamHI和MssI双酶切连接法，把上述scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因整合进图3A所示的优化后的pVAX载体中，其中融合基因的5'端以BamHI连接，3'端以MssI连接到载体，从而构建出如图3G所示的单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒，即pVAX-SG-Bispecific-IA。
5.根据权利要求4所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤五中细胞转染和蛋白纯化的步骤如下：提前一天将293T细胞以1.5×105个细胞/毫升的密度铺在细胞培养皿中，转染当天用PEI转染试剂与单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA充分混合，DNA与PEI转染试剂的质量比1:3，静置15分钟后将PEI-DNA混合物均匀加入293T细胞中，三天后将细胞上清用rProtein G试剂收集纯化分泌的免疫粘附素。
6.一种单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素，其特征在于，其由权利要求1-5中任一方法制备而成。
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