CN107619820A

CN107619820A - Hiv病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107619820A
Application number: CN201710801919.4A
Authority: CN
Inventors: 况轶群; 吴光耀; 洪琛
Original assignee: Henan university huaihe hospital
Current assignee: Henan university huaihe hospital
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明公开了一种HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，该细胞是HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR‑HC2修饰的T细胞，所述HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR‑HC2由Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4‑1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，scFv的VH和VL之间通过(G4S)×3 Linker连接，不同scFv之间通过(G4S)×5 Linker连接。本发明的双靶点嵌合抗原受体biCAR‑HC2可以同时靶向HIV‑1的靶细胞受体CD4分子和HIV‑1的囊膜蛋白Env。

Description

HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

抗病毒药物的联合使用（combination anti-retroviral therapy, cART）组成的高效抗逆转录病毒疗法（highly active anti-retroviral therapy, HAART）可以有效控制HIV-1感染者或者艾滋病患者体内病毒复制，甚至达到不可检测的水平，从而限制AIDS疾病进程。然而，除了cART药物在长期使用中的毒性和高成本，其最大的局限性在于它不能靶向或清除患者体内静息CD4⁺ T细胞中存在的潜伏HIV-1病毒。这些潜伏感染的细胞是非常稳定的，因此在体内持续，甚至在长期抑制治疗后，通过使用cART药物后反弹，这构成了HIV/AIDS治愈的主要障碍。在治疗后不久，病毒载量在大多数患者中恢复到治疗前水平。HIV-1病毒在宿主体内通过整合机制，在靶细胞中建立稳定的长期潜伏感染。如何彻底清除病人体内的HIV-1病毒，是治愈AIDS病人的关键问题。

研究表明，CD4⁺中心记忆T细胞（central memory T cell，Tcm）细胞占所有潜伏库细胞总数的95%。无法清除储藏库的一个原因，是无法精确定位储藏库细胞，本质是不知道储藏库细胞的生物标志物（biomarker）。之前报道的无论在外周还是淋巴结或肠道上，检查点（checkpoint）分子可能是一种潜在的biomarker引起了科学界很大热情。Chomont小组在PLoS Pathogens报道了检查点分子组合与储藏库细胞的关系，该研究结果非常直观而重要。通过研究七种检查点分子，包括PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, CD160和B24与储藏库细胞的total DNA, 2-LTR, CA-RNA的相关性，研究发现：CD4细胞的PD-1, TIGIT,LAG-3表达与储藏HIV DNA细胞正相关；进一步，这三种分子与不同HIV感染的记忆CD4亚群均呈现正相关。同时表达三种分子的CD4储藏HIV整合DNA的概率较一般CD4高8.2倍；更重要的是，能够被诱导表达的、整合有病毒DNA的储藏库细胞表达至少一种上述三种之一的checkpoint分子。基于上述结果，使用checkpoint blocker如PD-1单抗将可以直接靶向储藏库细胞。

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）修饰的T细胞免疫疗法是当前过继性细胞治疗技术中最新技术之一，实现了从基础免疫学机制研究到临床免疫治疗应用的进步。近年来，应用CAR-T技术治疗肿瘤取得了突破性进展，特别是靶向CD19识别B细胞的CAR-T技术，在治疗急性和慢性白血病方面取得了很好的效果。因此，基因修饰的T细胞，有可能成为清除HIV-1病毒潜伏库的重要途径。研究CAR-T细胞在清除病毒潜伏库中的作用和阐明相关机制，具有重要的基础研究意义和临床应用价值。

自上世纪90年代开始，基因修饰T细胞过继转移（adoptive cell transfer）治疗晚期AIDS病人的研究就已开始。为了实现从患者中完全根除HIV，必须从体内消除所有HIV-1病毒潜伏库，包括潜伏性感染的静息CD4⁺ T细胞。在T细胞免疫治疗领域，CAR-T通过将抗体或配体的病毒或肿瘤抗原结合结构域与CD3ζ或其他受体的激活信号传导结构域直接连接而产生。以前，HIV-1 Env特异性，嵌合的CD4-CD3ζ（第一代）受体表达的修饰T细胞被发现在体外有效地靶向和杀死HIV感染的或HIV-1 Env表达的细胞。然而，在体内，第一代CAR分子随后在I期和II期临床试验中测试没有成功。早在20年前科学家们已尝试将CAR-T 用于HIV感染治疗中，Scholler等对1998-2005年3项临床试验的患者随访发现，表达CD4ζCAR的自体CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞在HIV感染者体内可稳定存活至少11年，显示出CAR-T在HIV感染细胞治疗领域的强大潜力。HIV Env 特异性地表达CD4-CD3ζ嵌合受体的T细胞在体外试验中可有效杀死HIV 感染细胞或表达HIV-1 Env蛋白的细胞，但这种第一代CAR-T在随后的I期和II 期临床试验中并未获得成功。

在最近十几年，随着对有效T细胞功能的信号传导要求的理解以及对共刺激作用的理解，例如通过提供对细胞增殖，细胞因子产生和细胞存活重要的共刺激信号的CD28。，据此，Sahu等设计出了第二代CAR-T。第二代CAR嵌合受体，其包含附着有CD28区的细胞外CD4结构域，随后是CD3ζ的细胞质效应结构域（即CD4-CD28-CD3ζ），将CD28信号增加到第一代CAR中。新设计的第二代CAR-T对HIV潜伏的ACH-2细胞系模型中潜伏感染细胞的影响。结果表明第二代CAR-T可以靶向和杀死对照HIV Env⁺细胞和HIV-感染的H9或原代T细胞。然而，令我们惊讶的是，使用ACH-2靶标，第二代CAR-T不仅清除了在ACH-2细胞总群中产生HIV-1的小部分（5-10%）的细胞，而且几乎消除了整个潜伏感染细胞。这种清除似乎以三个步骤进行：首先第二代CAR-T最初由少量表达HIV的ACH-2细胞刺激以将TNFα释放到共培养上清液中，局部释放的TNFα诱导的相邻ACH-2细胞中潜伏HIV的再激活，最后新表达病毒的ACH-2细胞被相同的第二代CAR-T群体靶向消除。因此，第二代CAR-T不仅可杀死表达HIV-1Env 蛋白的细胞，且在细胞系模型上证实可以激活潜存的HIV-1并将其清除，为寻求有效策略实现AIDS功能性治愈甚至彻底治愈提供了参考。

2015年，Berger研究组发现通过CD4分子的D1D2结构域和7b抗体scFv偶联，同时靶向HIV-1 gp120上的高度保守的CD4诱导的共受体结合位点，可以很好地杀伤表达HIV-1Env的靶细胞。同时可以诱导IFN-γ的产生，并限制假病毒颗粒的产生。通过构建表达HIV-1广谱中和抗体（broadly neutralizing antibody, bNAb）10E8、3BNC117、PG9、PGT126、PGT128、VRC01和 X5等7种不同的scFv介导的CAR分子并转导CD8⁺ T细胞，Ali等人研究证明这些不同中和抗体CAR分子均表现出稳定的抗病毒活性，但是针对不同病毒株抗病毒活性有所不同。这些研究结果表明开发基于广谱中和抗体的新型CAR是用于免疫治疗HIV-1的很好的候选方法。进一步，Liu等人使用广谱中和抗体VCR01单抗的scFv构建了第三代CAR，并转导了CD8⁺ T细胞。该CAR-T细胞可以很好地裂解表达HIV-1 Env的细胞，并可以在细胞模型上抑制停止抗病毒药物使用后病毒的反弹。同时，CAR-T细胞也可以裂解潜伏激活药物激活的来自接受cART治疗病人的CD4⁺ T细胞。这些数据进一步证明，来自广谱中和抗体VRC01scFv的第三代CAR分子修饰的CD8+T细胞是清除HIV-1病毒潜伏库的有力武器。

尽管CAR-T技术在清楚HIV-1病毒库方面显示了强有力的证据。但是，目前还存在很多科学问题亟待解决。首先，第二代CAR分子和第三代CAR分子在清除病毒潜伏库是的效率差异尚不明确。第二代CAR分子包括基于CD28和4-1BB两个不同的共刺激机构域，他们在清除HIV-1病毒库中的差异还不明确。其次，HIV感染者和AIDS病人是一类特殊的病人，长期HIV-1感染造成病人CD4⁺T细胞的丢失，CD8⁺ T缺乏病毒特异性杀伤的CTL反应，从而宿主很难进行免疫系统重建。之前的研究报道有些通过CAR分子修饰PBMCs，有些通过修饰CD8⁺ T细胞。哪种具有更好的效果，目前没有比较结果。其次，CAR修饰的病人来源的CD8⁺ T细胞是否具有和健康人员来源的CD8⁺ T细胞之间的是否有差异，目前也是未解之谜。如果病人来源的CD8⁺ T细胞效果比较差，包括用于免疫系统耗竭的AIDS晚期病人的治疗，这都将面临选择异体来源的CD8⁺ T细胞进行CAR分子修饰。因此，CAR分子修饰的不同来源的CD8⁺ T细胞的杀伤活性比较研究必须解决。同时，有研究表明，删除TCR恒定区（TCR constant region,TRAC）和脱氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase, dCK）改造TCRαβ链的T细胞和对嘌呤核苷酸类似物（purine nucleotide analogues, PNA）化合物代谢的毒性，进行CAR-T改造后能够很好杀伤肿瘤细胞。他们发现表达CD28共刺激信号域的CD19-CAR的同种异体反应性T细胞会经历高度的激活、导致其丧失效应细胞功能和增殖潜力、以及克隆性缺失、从而显着降低了GVHD的发生。同时，存在于整体供体T细胞群体中的其他CAR-T细胞则保持其抗淋巴瘤活性。也就是说，对于具有同种异体反应性的CAR-T细胞来讲，T细胞受体（TCR）和CAR双重加速了T细胞的耗竭。相比之下，第一代和4-1BB共刺激信号域的CAR-T细胞则增加了发生移植物抗宿主病（graft versus host disease, GVHD）的风险。进一步比较不同共刺激分子的第二代CAR分子的安全性也是一个亟待研究的问题。最后，研究表明输入不同CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞比例的CAR-T细胞在肿瘤病人中的杀肿瘤活性显示了很大差异。然而，在HIV感染者和AIDS病人体内，CD4与CD8细胞的比例在AIDS不同疾病时期存在差异，CD4⁺ T和CD8⁺ T是否有协同作用不清楚。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足之处，提供一种HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用。

本发明的目的是以下述方式实现的：

HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，该细胞是HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞，所述HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2由Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，scFv的VH和VL之间通过(G4S)×3 Linker连接，不同scFv之间通过(G4S)×5 Linker连接。

所述HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2的核苷酸序列如序列表SEQID NO. 1所示。

一种上述的T细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：将通过全基因技术合成的Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域按照顺序串联后，连接到载体pCDH上，包装成携带嵌合抗原受体biCAR-HC2编码基因的慢病毒，利用该慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体biCAR-HC2。

一种上述的T细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）T细胞的制备：人T淋巴细胞系Jurkat于RPMI 1640培养基培养，加入10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸链霉素；外周血单核细胞通过Ficoll淋巴细胞分离液分离，细胞在GT-T551培养基中培养，并加入rhIL-2至终浓度为100 IU/mL，按照培养基体积加入5% 自体血清；淋巴细胞的激活扩增：在淋巴细胞培养基中加入MACS GMP TransAct CD3/CD28 Kit (100:1)；37℃，5% CO2条件下培养24 h后准备感染；

（2）嵌合抗原受体pCDH-biCAR-HC2的构建：将通过全基因技术合成的IbalizumabscFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域按照顺序串联后，克隆至pUC57-Amp载体上，通过限制性内切酶Xba I和Not I双酶切pUC57-Amp-biCAR-HC2和pCDH目的载体，回收biCAR-HC2片段和pCDH载体；通过T4 DNAligase连接目的片段和载体，转化Stbl 2感受态细胞；挑取单克隆菌落测序鉴定，鉴定正确的慢病毒表达质粒即为嵌合抗原受体pCDH-biCAR-HC2；

（3）病毒浓缩液的制备：慢病毒表达质粒pCDH-biCAR-HC2与辅助质粒pMD.2G、psPAX按5:2:4的质量比共转染HEK293T细胞，48h后收集病毒上清液，滤膜过滤病毒上清液，再滤液中添加1/4体积的病毒浓缩液Lenti-X concentrator进行混匀，离心后弃上清，沉淀用DMEM培养液溶解，获得病毒浓缩液；

（4）嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰T细胞：将Jurkat细胞与从用病毒转导促进剂Retronectin包被的6孔板中的载体产生细胞中收获的培养上清液混合，离心除去培养物上清液，培养箱中培养过夜；第二天，第二次转导细胞以增加转导效率；除去培养物上清液，培养箱中培养，获得嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞，该嵌合抗原受体biCAR-HC2的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID NO. 2所示。

一种HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，该细胞是采用上述的方法制备的。

上述的HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备用于清除HIV-1病毒潜伏库制剂中的应用。

相对于现有技术，本发明的双靶点嵌合抗原受体biCAR-HC2可以同时靶向HIV-1的靶细胞受体CD4分子和HIV-1的囊膜蛋白Env。在HIV-1病毒潜伏库细胞表面表达CD4分子和低水平表达Env，在病毒潜伏库激活下，Env可以被激活并高表达。通过biCAR-HC2修饰的T细胞，可以识别和结合病毒库细胞，并杀伤该细胞，从而达到清除病毒库的作用。

附图说明

图1是嵌合抗原受体biCAR-HC2的分子结构图和对照分子结构图的对照图。

图2是biCAR-HC2分子和对照分子转导CD8+ T细胞表面表达嵌合抗原受体biCAR-HC2的情况图。

图3是对照分子和biCAR-HC2分子转导CD8+ T细胞表面表达嵌合抗原受体biCAR-HC2时流式细胞仪检测结果，其中a-b为对照组流式细胞仪检测结果，c-d为biCAR-HC2流式细胞仪检测结果，a和c为总体有效分析细胞数，b和d为PE染色阳性细胞数。

图4是转染HEK239T细胞中biCAR-HC2转导后表达情况，其中a-b为普通光源下细胞状态，c-d为荧光下观察表达biCAR-HC2分子载体携带GFP的表达，左边为对照组转导后表达情况，右边为biCAR-HC2转导后表达情况。

图5是HIV-1 Env⁺ GHOST靶细胞对biCAR-T细胞分泌细胞因子IL2的影响。

图6是HIV-1 Env⁺ GHOST靶细胞对biCAR-T细胞分泌细胞因子IFN-γ的影响。

图7是对照组细胞杀伤结果。

图8是biCAR-HC2细胞杀伤结果。

具体实施方式

本发明提供一种HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，它是在T细胞基础上构建而成的一种工程化细胞，是由嵌合抗原受体Ibalizumab scFv-VRC01 scFv-CD8α- 4-1BB- CD3ζ修饰的T细胞。HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2由Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，scFv的V_H和V_L之间通过(G4S)×3 Linker连接，不同scFv之间通过(G4S)×5 Linker连接。蛋白质翻译后再细胞内粗面型内质网切除信号肽后成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后定位于T细胞的细胞膜上。该嵌合抗原受体的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID NO.2所示，其对应的基因编码序列如序列表中SEQID NO.1所示。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明的实施例中所用的试剂如下：

本发明中所用试剂以及购买厂家如下：

DMEM培养基，Gibco公司；

RPMI 1640培养基，Gibco公司；

GT-T551培养基，TaKaRa公司；

胎牛血清，Gibco公司；

Ficoll淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制品有限公司；

T4 DNA ligase、Xba I、Not I，NEB公司；

pMD.2G、psPAX包装质粒，AddGene公司；

pCDH慢病毒载体质粒，System BioSciences公司；

Bstl 2感受态细胞，北京华越洋生物技术有限公司；

MACS GMP TransAct CD3/CD28 Kit，Miltenyi公司；

Lenti X concentrator，TaKaRa公司；

Retronectin，Clontech公司；

TCR ζ chain/CD247兔多克隆抗体，ProteinTech公司；

goat anti-mouse human IgG F(ab)2/PE、mouse anti-human CD8/APC，eBioscience；

IL2和IFN-γ等细胞因子定量ELISA检测试剂盒，RayBiotech公司.

CD4 scFv单链抗体基因来源于Ibalizumab单克隆抗体，HIV-1 Env scFv单链抗体基因来源于HIV-1广谱中和抗体VRC01，scFv的VH和VL之间通过(G4S)×3 Linker连接，不同scFv之间通过(G4S)×5 Linker连接。嵌合抗原受体的各个结构基因在GenBank中的序列号如下：CD8α铰链区和跨膜区基因序列号为AY039664.1，CD28基因序列号为XM_006712862.1，4-1BB（CD137）基因序列号为U03397.1，CD3ζ基因序列号为AF228312.1。质粒载体基因由上海生工生物技术公司全基因合成。

嵌合抗原受体biCAR-HC2包含4-1BB共刺激结构域，对照不包含任何scFv分子，其分子结构设计如图1所示。

在HIV-1治疗后潜伏感染的AIDS病人中，CD4⁺ Tcm细胞是主要的病毒潜伏库（占95%以上），该类细胞会低水平表达HIV-1 Env蛋白。HIV-1广谱中和抗体VRC01是一种高亲和力的靶向HIV-1Env的抗体。结合国内外的进展和目前存在的问题，我们推测：使用靶向CD4分子和HIV-1 Env的scFv抗体分子介导biCAR-T细胞HIV-1病毒潜伏感染细胞，通过不依赖HLA介导的CD8⁺ CTL细胞杀伤活性，可以杀伤同时表达CD4和HIV-1 Env靶细胞，从而达到清除病毒潜伏库的目的（图1）。因此，我们设计了靶向HIV-1 Env和CD4分子的第二代双靶点CAR分子（bi-specific chimeric antigen receptor, biCAR），通过包装病毒后转导Jurkat细胞和分离的正常人CD8⁺ T淋巴细胞（biCAR-T），我们发现这种biCAR分子可以杀伤表达CD4和Env的 GHOST细胞和构建的病毒潜伏模型细胞。该结果揭示了基因修饰的biCAR-T细胞在清除HIV-1病毒潜伏库中的巨大潜力。具体如下：

1. T细胞的制备：人T淋巴细胞系Jurkat于RPMI 1640培养基培养，加入10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸链霉素；外周血单核细胞通过Ficoll淋巴细胞分离液分离，细胞在GT-T551培养基中培养，并加入rhIL-2至终浓度为100 IU/mL，按照培养基体积加入5% 自体血清；淋巴细胞的激活扩增：在淋巴细胞培养基中加入MACS GMP TransAct CD3/CD28 Kit (100:1)；37℃，5% CO₂条件下培养24 h后准备感染；

2. 嵌合抗原受体pCDH-biCAR-HC2的构建：将通过全基因技术合成的IbalizumabscFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的保内信号结构域和CD3ζ的保内信号结构域按照顺序串联后，克隆至pUC57-Amp载体上，通过限制性内切酶Xba I和Not I双酶切pUC57-Amp-biCAR-HC2和pCDH目的载体，回收biCAR-HC2片段和pCDH载体；通过T4 DNAligase连接目的片段和载体，转化Stbl 2感受态细胞；挑取单克隆菌落测序鉴定，鉴定正确的慢病毒表达质粒即为嵌合抗原受体pCDH-biCAR-HC2；

3. 病毒浓缩液的制备：

HEK293T细胞按5×10⁶/dish接种于10 cm培养皿中，37℃，5% CO₂培养箱培养过夜，第二天细胞汇合度将达到80%。将 3 µg pMD.2G、6 µg psPAX和7.5 µg pCDH-biCAR-HC2质粒通过Lipofectamine 2000共转染HEK293T细胞。6 h后更换为含 10% FBS的DMEM新鲜培养液。

细胞培养48 h后，收集培养上清，在4℃，1500 g离心10 min去除细胞碎片。然后用0.45 µm滤膜过病毒上清液。滤膜过病毒上清液按照 3:1的比例加入Lenti-Xconcentrator病毒浓缩液。4℃静置过夜后，4℃，3200 g离心 20 min。弃去上清，用含弃去上清，用DMEM培养液重悬病毒团块。200 µl管分装，-80℃保存备用。

4. 嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰T细胞：将8×10⁶ Jurkat细胞与从用Retronectin（10 mg/ml）包被的6孔板中的载体产生细胞中收获的3 ml培养上清液混合，并在32℃下离心2小时，除去培养物上清液，在37℃，5% CO₂培养箱中培养过夜。第二天，第二次转导细胞以增加转导效率。除去培养物上清液，在37℃，5% CO₂培养箱中培养，获得嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞，该嵌合抗原受体biCAR-HC2的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID NO. 2所示。

5. 嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞的鉴定

5.1 Western blotting检测CD3ζ（CD247）

PBS洗涤5×10⁶转导细胞2遍，细胞加入改良RIPA裂解缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂进行裂解。12000 g， 4℃离心30 min，收集蛋白裂解上清，加入2×Loading Buffer，煮沸10min。蛋白样品通过10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，随后电转移至0.45 µm的NC膜。通过使用小鼠抗人CD247单克隆抗体和ECL化学发光检测试剂盒检测目的蛋白表达，GAPDH作为内参对照，结果如图2所示。通过Western Blot检测证明， biCAR-HC2分子在转导Jurkat T细胞中有高表达。

5.2 FACS检测转导细胞表面嵌合抗原受体的表达

慢病毒感染Jurkat 细胞5 d后，收集各组细胞至15 ml 离心管中，1000 rpm离心5 min后弃液。再加入10 ml预冷的PBS重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000 r/min，离心5 min 后弃液，再加入10 ml 预冷的PBS同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用PBS重悬细胞制成1×10⁶ cells/ml的单细胞悬液。用goat anti-human IgG F(ab)2/PE来标记表达CAR的T细胞，用mouse anti-human CD8/APC来标记CD8⁺的T细胞。用goat IgG/PE和mouseIgG/APC 做同型对照。取2个离心管，分别标记为分析管和同型对照管。分别向其中加入：分析管：细胞悬液1ml，anti human-IgG F(ab)2/PE 2ul，anti human-CD8/APC 2ul。同型对照管：细胞悬液0.3ml，goat IgG/PE2ul，Mouse IgG/APC 2ul。将2管避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的PBS清洗2次，离心弃液。最后加入500 µl PBS（含3.7%多聚甲醛），轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。另取一个上样管，加入0.1 ml 初始细胞悬液，补加0.4 ml PBS，作为阴性对照管。用流式细胞仪进行检测，操作如下：用阴性对照管中的细胞调节阴性对照；用同型对照管中的细胞去除非特异性结合所发出的荧光信号；用分析管中的细胞检测样品中的表达biCAR-T细胞的比例及CD8⁺ T细胞比例。

结果如图3所示，在转导biCAR-HC2的T细胞中，我们通过流式细胞仪检测细胞表达超过60%。

6. Env⁺ GHOST和病人CD4⁺ T细胞靶细胞的构建

将表达HIV-1 NL4-3和JR-FL的Env质粒转染GHOST细胞（CD4⁺CCR5⁺），经过Blasticidin筛选获得稳定表达Env的GHOST细胞株。

7. 靶细胞刺激biCAR-T细胞分泌细胞因子表达

在96孔圆底板中，将biCAR或对照效应物Jurkat细胞（10⁵个细胞）与来自1：1至20：1的梯度（效靶比）的基于GHOST和病人CD4⁺ T的靶细胞共培养。20-24小时后收集上清液。上清通过细胞因子检测试剂盒（联科生物）检测IL2和IFN-γ分泌表达。

嵌合抗原受体biCAR-HC2分子通过克隆进入pCDH-Puro-GFP慢病毒载体质粒，质粒通过共转染HEK293T细胞包装出表达biCAR-HC2的慢病毒颗粒。取慢病毒颗粒上清感染HEK293T细胞，48 h后，通过荧光显微镜观察通过，biCAR-HC2分子在转导的HEK293T细胞内有很高的表达，结果如图4所示。

将HIV-1 NL4-3株和JR-FL株 Env转染表达CD4和CCR5的GHOST细胞，通过biCAR-HC2转导的Jurkat细胞与表达HIV-1 Env的GHOST细胞共培养，检测培养上清细胞因子表达。结果显示，GHOST靶细胞可以刺激biCAR-T细胞分泌IL2和IFN-γ细胞因子，如图5-6所示。

biCAR-HC2转导的Jurkat T细胞与表达HIV-1 NL4-3 Env的GHOST细胞按照不同效靶比共同孵育，通过LDH检测细胞杀伤结果。结果表明， biCAR-HC2分子转导的T细胞可以很好地杀伤表达HIV-1 Env的GHOST细胞，如图7-8所示。

8. 嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞的毒作用分析

接种 100 µl 1 × 10⁴/孔靶细胞加到 96 孔细胞培养板中。按不同的效靶比（E/T值1:1，5:1，10:1，20:1）加入 Jurkat-CAR细胞，补培养液至 200 μl，37ºC，5% CO₂，共培养 24h。共培养 24 小时后，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在只接种靶细胞的培养孔中加入试剂盒提供的 LDH 释放试剂，加入量为原有培养液体积的 10%（20 µl）。加入LDH 释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。12 h 后，将细胞培养板用多孔板离心机 400 g 离心 5 min。分别取各孔的上清液 120 µl，加入到一新的 96 孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入 60 µl LDH 检测工作液。混匀，室温（约25 ºC）避光孵育 30 min（可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动）。然后在 490nm 处测定吸光度。

结果如图7-8所示，biCAR-HC2分子转导的T细胞可以很好地杀伤表达HIV-1 Env的GHOST细胞。

9. 统计学分析

所有原始数据重复和核对后采用Graph Prism 7.0软件进行统计学分析。实验数据Mean ± SD表示，P < 0.05时为差异有统计学意义，结果如图5-6所示。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学淮河医院

<120> HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2048

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgcaggttc agctgcagca gtctggacct gaggttgtga aacctggcgc ctccgtgaag 120

atgagctgta aagccagcgg ctacaccttc accagctacg tgatccactg ggtccgacag 180

aagcctggac agggccttga ttggatcggc tacatcaacc cctacaacga cggcaccgac 240

tacgacgaga agttcaaggg caaagccaca ctgaccagcg acaccagcac aagcaccgcc 300

tacatggaac tgagcagcct gagaagcgag gacaccgccg tgtactactg cgccagagag 360

aaggacaatt acgccaccgg cgcttggttt gcctattggg gacagggcac actggtcacc 420

gtttctagcg gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgatatc 480

gtgatgacac agagccccga cagcctggcc gtgtctcttg gagaacgcgt gaccatgaac 540

tgcaagagca gccagagcct gctgtactcc accaaccaga agaactacct ggcctggtat 600

cagcagaagc ccggccagtc tcctaagctg ctgatctact gggccagcac cagagaaagc 660

ggcgtgcccg atagattttc tggctctggc agcggcaccg atttcaccct gacaatcagc 720

tctgtgcagg ccgaggatgt ggccgtgtat tattgccagc agtactacag ctaccggacc 780

ttcggcggag gcaccaagct ggaaatcaag agaggaggcg gaggatctgg tggcggagga 840

agtggcggag gcggttctgg cggtggtgga tctcaggtgc agctggtgca gtctgggggt 900

cagatgaaga agcctggcga gtcgatgaga atttcttgtc gggcttctgg atatgaattt 960

attgattgta cgctaaattg gattcgtctg gcccccggaa aaaggcctga gtggatggga 1020

tggctgaagc ctcggggggg ggccgtcaac tacgcacgtc cacttcaggg cagagtgacc 1080

atgactcgag acgtttattc cgacacagcc tttttggagc tgcgctcgtt gacagtagac 1140

gacacggccg tctacttttg tactagggga aaaaactgtg attacaattg ggacttcgaa 1200

cactggggcc ggggcacccc ggtcatcgtc tcatcaggtg gcggtggctc gggcggtggt 1260

gggtcgggtg gcggcggatc tgaaattgtg ttgacacagt ctccaggcac cctgtctttg 1320

tctccagggg aaacagccat catctcttgt cggaccagtc agtatggttc cttagcctgg 1380

tatcaacaga ggcccggcca ggcccccagg ctcgtcatct attcgggctc tactcgggcc 1440

gctggcatcc cagacaggtt cagcggcagt cggtgggggc cagactacaa tctcaccatc 1500

agcaacctgg agtcgggaga ttttggtgtt tattattgcc agcagtatga attttttggc 1560

caggggacca aggtccaggt cgacattaaa cgaaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 1620

acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 1680

gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 1740

gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1800

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1860

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1920

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1980

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 2040

cgtggccg 2048

<210> 2

<211> 754

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp

65 70 75 80

Tyr Asp Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala

115 120 125

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

145 150 155 160

Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg

165 170 175

Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn

180 185 190

Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

195 200 205

Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp

210 215 220

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

225 230 235 240

Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

245 250 255

Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gln Met Lys Lys

290 295 300

Pro Gly Glu Ser Met Arg Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Glu Phe

305 310 315 320

Ile Asp Cys Thr Leu Asn Trp Ile Arg Leu Ala Pro Gly Lys Arg Pro

325 330 335

Glu Trp Met Gly Trp Leu Lys Pro Arg Gly Gly Ala Val Asn Tyr Ala

340 345 350

Arg Pro Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Val Tyr Ser Asp

355 360 365

Thr Ala Phe Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Val Asp Asp Thr Ala Val

370 375 380

Tyr Phe Cys Thr Arg Gly Lys Asn Cys Asp Tyr Asn Trp Asp Phe Glu

385 390 395 400

His Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Ile Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

405 410 415

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr

420 425 430

Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Thr Ala Ile Ile

435 440 445

Ser Cys Arg Thr Ser Gln Tyr Gly Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg

450 455 460

Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Ala

465 470 475 480

Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Trp Gly Pro Asp Tyr

485 490 495

Asn Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser Gly Asp Phe Gly Val Tyr Tyr

500 505 510

Cys Gln Gln Tyr Glu Phe Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gln Val Asp

515 520 525

Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

530 535 540

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

545 550 555 560

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

565 570 575

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

580 585 590

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

595 600 605

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

610 615 620

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

625 630 635 640

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

645 650 655

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

660 665 670

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

675 680 685

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

690 695 700

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

705 710 715 720

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

725 730 735

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

740 745 750

Pro Arg

Claims

1.HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：该细胞是HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞，所述HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2由Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，scFv的V_H和V_L之间通过(G4S)×3 Linker连接，不同scFv之间通过(G4S)×5 Linker连接。

2. 如权利要求1所述的HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：所述HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2的核苷酸序列如序列表SEQIDNO. 1所示。

3. 一种如权利要求1所述的T细胞的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：将通过全基因技术合成的Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域按照顺序串联后，连接到载体pCDH上，包装成携带嵌合抗原受体biCAR-HC2编码基因的慢病毒，利用该慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体biCAR-HC2。

4.一种如权利要求3所述的T细胞的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）T细胞的制备：人T淋巴细胞系Jurkat于RPMI 1640培养基培养，加入10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸链霉素；外周血单核细胞通过Ficoll淋巴细胞分离液分离，细胞在GT-T551培养基中培养，并加入rhIL-2至终浓度为100 IU/mL，按照培养基体积加入5% 自体血清；淋巴细胞的激活扩增：在淋巴细胞培养基中加入MACS GMP TransAct CD3/CD28 Kit (100:1)；37℃，5% CO₂条件下培养24 h后准备感染；

5.一种HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：该细胞是采用权利要求3或4所述的方法制备的。

6.权利要求1或5所述的HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备用于清除HIV-1病毒潜伏库制剂中的应用。