CN112979808B

CN112979808B - 一种抗b细胞成熟抗原的抗体及其应用

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Publication number: CN112979808B
Application number: CN202110181213.9A
Authority: CN
Inventors: 余学军; 狄升蒙; 石磊; 郑真真
Original assignee: Huadao Shanghai Biopharma Co ltd
Current assignee: Huadao Shanghai Biopharma Co ltd
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112979808A

Abstract

本发明提供一种抗B细胞成熟抗原的抗体及其应用。所述抗B细胞成熟抗原的抗体为BCMA‑21，其重链可变区包括：SEQ ID NO.1所示的互补决定区1、SEQ ID NO.2所示的互补决定区2和SEQ ID NO.3所示的互补决定区3。本发明利用噬菌体展示纳米抗体库筛选得到的抗体具有特定的CDR区，所得抗体可特异性的结合BCMA抗原，且亲和力较好，其K_a(1/Ms)为7.48E+06，K_d(1/s)为8.50E‑04，K_D(M)为1.14E‑10，将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体和CAR‑T细胞，对BCMA阳性的肿瘤细胞具有明显的杀伤活性。

Description

一种抗B细胞成熟抗原的抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗B细胞成熟抗原的抗体及其应用。

背景技术

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。因此多发性骨髓瘤可以归到B淋巴细胞淋巴瘤的范围。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出现各种细菌性感染。

抗体在骨髓瘤的治疗中显示出一定的潜力，但目前尚没有足够的临床数据来证实。因此，开发能够有效治疗多发性骨髓瘤的新方法意义重大。

MM的免疫治疗的一种候选抗原是B细胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen，BCMA或CD269)。BCMA RNA在MM细胞中普遍检测到，多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面可检测到BCMA蛋白。BCMA是肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族的成员，可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。据报道，在正常细胞中，BCMA主要由浆细胞和一部分成熟B细胞表达，而在大部分B细胞以及其它器官上都不表达。BCMA缺乏的小鼠看上去一切正常，似乎很健康，而且B细胞数量正常，但浆细胞却不能长期存活。在多发性骨髓瘤细胞中，BCMA的表达水平显著高于健康的浆细胞，是一种理想的靶标。

近年来，嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)发展迅速。BCMA是CAR-T细胞治疗MM的靶抗原。嵌合抗原受体是人工合成的功能类似T细胞受体的融合蛋白，主要包括信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号区。在结合靶抗原后，嵌合抗原受体形成聚体、通过胞内信号分子活化T细胞，分泌穿孔素和颗粒酶素B等实现对靶细胞的杀伤。因此，CAR-T细胞识别靶细胞不依赖于MHC(majorhistocompatibility complex，MHC)，从而可避免因肿瘤细胞MHC分子下调而导致的免疫逃逸。

因此，将抗BCMA的嵌合抗原受体基因通过基因工程方法导入T细胞所制备的BCMACAR-T，可使得BCMA CAR-T细胞特异性识别表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞并将其杀死，从而实现其抗肿瘤作用，对靶向BCMA的免疫治疗方法具有较大的临床转化价值。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种抗B细胞成熟抗原的抗体及其应用。所述抗BCMA的单克隆抗体具有高亲和力，能够作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域构建CAR-T细胞，所得CAR-T细胞在肿瘤方面具有较好的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗B细胞成熟抗原(BCMA)的抗体，所述抗体为BCMA-21，其重链可变区包括：SEQ ID NO.1所示的互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO.2所示的互补决定区2(CDR2)和SEQ ID NO.3所示的互补决定区3(CDR3)；

其中，SEQ ID NO.1的序列为GYTDSSNL；

SEQ ID NO.2的序列为FYTGGGRP；

SEQ ID NO.3的序列为AADYLGGAWPFGAYRY。

本发明中，通过瞬时转染方式将包含BCMA蛋白胞外区基因片段的质粒导入到真核细胞Freestyle^TM 293F细胞表达，以该重组蛋白免疫一只未经免疫的双峰驼，构建噬菌体展示抗体库。根据该噬菌体展示抗体库对抗BCMA抗体进行筛选，当抗体的重链可变区的CDR区分别为SEQ ID NO.1～3所示的氨基酸序列时，所得单克隆抗体可特异性的结合BCMA抗原。

作为本发明优选的技术方案，所述抗体的重链可变区包括SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列中任意一条或至少两条的组合。

优选地，所述抗体的重链可变区还包括：SEQ ID NO.4所示的框架区1(FR1)、SEQID NO.5所示的框架区2(FR2)、SEQ ID NO.6所示的框架区3(FR3)和SEQ ID NO.7所示的框架区4(FR4)。

优选地，所述抗体的重链可变区包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

本发明中，利用噬菌体展示技术对BCMA免疫骆驼VHH文库进行筛选，得到了SEQ IDNO.8所示的抗体，其对BCMA的亲和性高，在构建靶向BCMA的嵌合抗原受体方面具有重要的应用前景。

其中，SEQ ID No.4～7的序列如下表1所示：

表1

SEQ ID No.8：

EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTDSSNLMGWFRQAPGKEREGVAVFYTGGGRPVYADSVKGRFTISQDSAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAADYLGGAWPFGAYRYWGQGTQVTVSS

第二方面，本发明提供一种编码如第一方面所述的抗体的核酸分子。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.9：

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCAGCGTGCAGGCCGGCGGCAGCCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTACACCGACAGCAGCAACCTGATGGGCTGGTTCCGGCAGGCCCCAGGCAAGGAGCGGGAGGGCGTGGCCGTGTTCTATACCGGCGGCGGCAGACCAGTGTACGCTGATAGCGTGAAAGGCAGGTTTACAATTTCTCAGGATTCTGCTAAAAACACAGTGTACCTACAGATGAATAGCCTGAAACCAGAAGATACCGCCCTGTATTATTGTGCCGCCGATTATCTGGGAGGAGCCTGGCCTTTTGGAGCCTATAGATATTGGGGACAGGGAACACAGGTGACAGTGAGTAGC。

第三方面，本发明还提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和信号转导结构域；所述抗原结合结构域为第一方面所述的抗体。

优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。

优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区。

优选地，所述跨膜区包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序(CD3ζ)。

优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4-1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、第一方面所述的抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序。

第四方面，本发明还提供一种表达载体，包括第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。

优选地，所述表达载体为含有第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染第四方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

第六方面，本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第四方面所述的表达载体和/或第五方面所述的重组慢病毒。

优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第七方面，本发明同时提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

第八方面，如第一方面所述的抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的嵌合抗原受体、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组慢病毒、第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括多发性骨髓瘤。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明通过瞬时转染方式，以BCMA重组蛋白免疫未经免疫的双峰驼，构建噬菌体展示抗体库，根据该噬菌体展示抗体库对抗BCMA抗体进行筛选，当抗体的重链可变区的CDR区分别为SEQ ID NO.1～3所示的氨基酸序列时，所得单克隆抗体可特异性的结合BCMA抗原，且亲和力较好，通过抗体亲和力的测定可知，其Ka(1/Ms)为7.48E+06，Kd(1/s)为8.50E-04，KD(M)为1.14E-10；

(2)本发明提供的抗BCMA抗体具有较好的亲和力，将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体，并利用该嵌合抗原受体制备T细胞，并且通过实验验证了构建的CAR-T细胞对BCMA阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，且与BCMA阳性细胞共培养后，高效分泌细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ，说明所述抗体、及其构建的嵌合抗原受体以及CAR-T细胞能够提高对肿瘤细胞尤其是多发性骨髓瘤的杀伤能力。

附图说明

图1为实施例3中Biacore检测BCMA抗体的亲和力曲线图。

图2为实施例4中BCMA抗体识别BCMA抗原的FACS检测结果图。

图3为实施例5中HD SIN BCMA(21)-41BBz(ka)慢病毒载体质粒图谱。

图4为实施例5中表达BCMA的嵌合抗原受体结构示意图。

图5为实施例7中T淋巴细胞的嵌合抗原受体表达率的流式检测结果图，其中I图为空白对照，II图为含有BCMA-21的CAR-T细胞。

图6为实施例7中FACS检测T细胞和BCMA CAR-T细胞表型所得到的结果图。

图7A为实施例8中BCMA CAR-T细胞对K562细胞的杀伤效果曲线图。

图7B为实施例8中BCMA CAR-T细胞对RPMI 8226细胞的杀伤效果曲线图。

图7C为实施例8中BCMA CAR-T细胞对U266细胞杀伤效果曲线图。

图8为实施例9中BCMA CAR-T细胞分泌IL-2的柱状图。

图9为实施例9中BCMA CAR-T细胞分泌TNFα的柱状图。

图10为实施例9中BCMA CAR-T细胞分泌IFNγ的柱状图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例用于噬菌体纳米抗体库的构建及淘选，并使用ELISA进行初步筛选。具体步骤如下：

(1)噬菌体纳米抗体库的构建

采用表达胞外区的BCMA-Fc免疫双峰驼，ELISA验证效价后，抽取200mL外周血；分选淋巴细胞，获得外周血单核淋巴细胞沉淀，提取RNA；用

III反转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA，然后利用巢式PCR扩增VHH基因；将VHH基因插入pMECS噬菌体展示载体，电转化TG1感受态细胞后，取适量菌液用于文库鉴定，剩余所有培养物均匀涂布于LB/AMPGLU平板，待菌长出后收集菌苔，加入1/3体积的50％甘油，混匀分装，-80℃保存，即得到库容大于10⁹的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库。

(2)噬菌体纳米抗体库的淘选

在体外对免疫纳米抗体库进行3轮固相筛选，富集具有结合活性的噬菌体克隆；对单克隆噬菌体进行原核诱导表达后，通过ELISA进一步筛选出了可结合BCMA抗原胞外区的噬菌体克隆。具体步骤如下：

首先，将纯化的BCMA-His重组蛋白用PBS缓冲液稀释至4μg/mL，取96孔酶标板，选择3复孔，每孔加入100μL(400ng/孔)，4℃包被过夜，PBS作为阴性对照；弃去包被液，每孔加入150μL 2％浓度脱脂奶粉，室温封闭1h后得到包被BCMA-His重组蛋白的酶标板；

而后，用PBST洗涤4次酶标板，取制备好的噬菌体溶液，用2％脱脂奶粉稀释至5×10¹¹PFU/mL，以100μL/孔的量加入至酶标板中，室温孵育2h；

随后，弃去噬菌体样品，用PBST洗涤10次，再用PBS洗涤5次，每孔加入100μL新鲜配制的0.1M三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1M Tris-HCl(pH为7.4)中和；

取部分洗脱液测定噬菌体滴度，另取400μL洗脱液侵染4mL新鲜培养对数期TG1菌液(OD₆₀₀约0.6)，37℃孵育30min，加入16mL 2×YT/氨苄青霉素/葡萄糖(2×YT/AMP-GLU)培养，37℃、200r/min培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8。

取100μL细菌悬液进行梯度稀释后均匀涂抹于2×YT/AMP-GLU琼脂平板上以便进行文库库容和多样性测定；取100μL细菌悬液即噬菌体展示载体文库接种于2×YT/AMP-GLU培养基中，培养至对数期，加入辅助噬菌体，实施文库救援，获得噬菌体颗粒需测定噬菌体滴度，然后浓缩纯化得到噬菌体粒子用于下一轮筛选；筛选操作重复3次；

剩余菌液经过离心后使用适当体积的2×YT培养液重悬，涂抹于带有筛选抗性的平板上进行过夜培养，使用适量的液体培养液从平板上刮取细菌，加入含1/3体积的50％甘油的2×YT培养液进行重悬后分装，保存于-80℃中。

(3)噬菌体包装

取100μL冻存的上一轮淘选菌液加入到100mL 2×YT/AMP-GLU培养液中37℃振荡(200rpm)培养至对数期(OD₆₀₀值为0.6～0.8)；加入90μL辅助噬菌体M13K07(1.7×10¹³PFU/mL)，37℃静置30min，2800g离心10min收集菌体，用200mL 2×YT/AMP-KAN培养基重悬，37℃振荡(200rpm)培养12h；

4℃、3800g离心30min去除菌体收集上清，加入1/5体积预冷的PEG/NaCl混匀，沉淀噬菌体2h；4℃、3800g离心30min，收集噬菌体，用终体积2mL PBS溶液重悬并转移至15mL离心管中；4℃、12000g离心15min收集上清，加入1/5体积预冷的PEG/NaCl溶液，上下颠倒混匀，冰上静置2h；4℃、10000g离心10min，弃上清，用1mL PBS重悬噬菌体沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解，噬菌体溶液与等体积60％甘油混合后分装至1.5mL EP管中并保存于-80℃。

由于在步骤(2)中采用了BCMA抗原对噬菌体文库进行了3轮淘选，为了避免丢失序列的多样性，初步的ELISA筛选将从第2轮和第3轮的淘选产物中进行，从淘选产物中随机挑选出阳性克隆并进行诱导表达，表达上清即为粗提VHH抗体，通过测序确定单克隆菌株的VHH抗体序列，所得序列记为BCMA-21。

实施例2

本实施例中使用流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated CellSorting，FACS)筛选候选克隆。

按照标准细胞培养方案进行细胞培养，使用胰酶消化细胞制备BCMA阳性及阴性细胞悬液；300g离心5min去除培养液，用Flow Buffer重悬细胞至2×10⁶cell/mL；向V形底96孔板中的每个孔中加入2×10⁵个细胞，300g离心5min后去除上清，添加VHH抗体粗提物重悬细胞，并在4℃孵育1h；

300g离心5min后去除上清，Flow Buffer重悬细胞，使用Flow Buffer稀释APCanti-his抗体至2μg/mL，每孔100μL重悬细胞，4℃孵育1h；Flow Buffer清洗细胞3次后使用200μL Flow Buffer重悬细胞并上流式细胞仪检测。

实施例3

本实施例中对VHH-mIgG2a Fc抗体进行表达和纯化，并进行抗体亲和力的测定。为了进一步对筛选得到的抗体进行鉴定，需要通过哺乳动物细胞表达抗体。因此，首先构建了带有小鼠Fc标签表达VHH的质粒载体，记为C-4pCP.Stuffer-mCg2a-FC，具体步骤如下：

1、使用PCR扩增BCMA VHH B21，其引物为：

HD-F(SEQ ID NO.10)：

CGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCGAGGTGCAGCTGGTGGA；

HD-B8-R(SEQ ID NO.11)：

GCATGGAGGACAGGGCTTGATTGTGGGGCTACTCACTGTCACCTG

其反应体系如表2所示，扩增程序如下表3所示：

表2

表3

2、酶切体系如表4所示，酶切温度为37℃，时间为6h，酶切后的载体用

PCR纯化试剂盒进行纯化，回收得到的DNA溶解于45μL水中，检测DNA的浓度。

表4

试剂	使用量
		C-4pCP.Stuffer-mCg2a-FC	～5μg
10×酶切缓冲液(10×Reaction Buffer)	5μL
		FspA I	2μL
PfI 23II	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至50μL

3、将PCR扩增产物采用同源重组的方式连接入酶切的线性化载体中，体系如表5所示，条件为37℃水浴30min。

表5

试剂	体积(μL)
		Exnase II	1
2×Exnase II buffer	2
		线性化载体(linearized vector)	4
插入片段(Insert fragment)	3

4、取全部同源重组反应体系加入DH5α感受态细胞中，转化DH5α感受态细胞，转化条件如表6所示。

表6

程序	温度	时间
			冰浴	0℃	5min
热击	42℃	1min
			冰浴	0℃	3min
加入500μL LB培养基，220rpm振荡培养	37℃	1.5h
			吸取200μL，涂布于LB/Amp平板	37℃	过夜

5、转化平板挑选单克隆PCR预鉴定，PCR鉴定体系条件如表7所示；条件为95℃预变性3min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min，4℃保存，送测序公司测序鉴定。测序结果符合预期，说明书本实施例中成功构建了带有小鼠Fc标签表达VHH的质粒载体。

表7

试剂	体积(μL)
		pEF1A	1
PSV40	1
		2×Fast Taq Mix	15
ddH<sub>2</sub>O	补齐至3 0μL

在质粒转染前约24h，传代293E细胞，使细胞密度约为0.6×10⁶cells/mL；当细胞密度为(1.0～1.2)×10⁶cells/mL、活率>95％时，以0.15μg scFV-mIgG1/100mL 293E的比例，用PEI法转染293E细胞，其中，质粒DNA和PEI的比例为1:2；

37℃、130rpm、8％CO₂摇床培养5天，3000rpm，30min收集细胞培养物上清，把收集到的包含目的抗体的上清经Millex-GP Filter Unit 0.45μm Sterile过滤后，用MabSelect^TM SuRe^TM离心浓缩，1×PBS洗涤柱体，0.1M Gly-HCL洗脱蛋白，并用1/10体积且pH为8.5的Tris-HCL中和。

蛋白4℃透析过夜后，用NanoDrop 2000测定A₂₈₀的方法定量，SEC-HPLC测定抗体纯度。

另外，本实施例中还将纯化后的BCMA VHH抗体通过Biacore进行亲和力的测定。

Biacore是基于表面等离子共振(surface Plasmon resonance，SPR)开发的生物分析传感技术，可检测跟踪溶液中的分子与固定在芯片表面的分子结合、解离的整个变化过程，以传感图的形式进行记录，并提供动力学和亲和力数据。

测定过程中，将抗体固化到芯片表面，流动相为含有抗原的溶液。测定结果如表8和图1所示。

表8

实施例4

本实施例中对抗BCMA VHH的单链抗体进行流式测定。

将K562(BCMA-)、RPMI 8226(BCMA+)、U266(BCMA+)三株肿瘤细胞与纯化的重组抗BCMA VHH-mIgG2抗体混合，在冰浴下孵育30min，然后用APC标记的羊抗鼠IgG抗体孵育30min，采用流式细胞仪检测。

结果如图2所示，该单链抗体可识别细胞表面的BCMA抗原。

实施例5

本实施例用于制备表达BCMA VHH的嵌合抗原受体的慢病毒载体。

首先，构建携带BCMA VHH嵌合抗原受体的慢病毒载体HD SIN BCMA(21)-41BBz(ka)，载体图谱如图3所示，嵌合抗原受体的示意图如图4所示，包括CD8α信号肽、BCMA VHH、CD8α铰链区、跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序(CD3ζ)。

其中，信号肽的氨基酸序列(SEQ ID No.12)为：

MALPVTALLLPLALLLHAARP

BCMA VHH的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；

CD8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列(SEQ ID No.13)为：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

4-1BB胞内区氨基酸序列(SEQ ID No.14)为：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

CD3ζ氨基酸序列(SEQ ID No.15)为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

具体的制备方法如下：

1、按照表9配制PCR反应体系，扩增BCMA VHH片段，使用引物为：

B21(op)-FR1F-F(E)(SEQ ID NO.16)：

CTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCA

B21(op)-R(SEQ ID NO.17)：

GCGCTGGCGTCGTGGTGCTACTCACTGTCACC

表9

试剂	体积(μL)
		10×buffer	5
2mM dNTP	5
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3
10μM上游引物	1
		10μM下游引物	1
模板DNA(cDNA clone)	1
		无菌去离子水(PCR grade water)	33
KOD-Plus-Neo高保真PCR酶	1

以上试剂来源于TOYOBO Inc.。

配制结束后按照表10所示的PCR程序进行反应。

表10

2、按照表11配制PCR反应体系，在所得扩增产物前加CD8α信号肽，使用引物为：

BamH-CD8αsig-F(SEQ ID NO.18)：

GCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGC

B21(op)-R(SEQ ID NO.17)；

表11

试剂	体积(μL)
		10×buffer	5
2mM dNTP	5
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3
10μM上游引物(BamH-CD8αsig-F)	1
		10μM下游引物	1
模板DNA(VHH片段PCR反应液)	4
		无菌去离子水(PCR grade water)	30
KOD-Plus-Neo高保真PCR酶	1

配制结束后按照表10所示的PCR程序进行PCR反应。

反应结束后，PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，回收500bp左右的片段，紫外吸收法定量。

3、按照表12配制PCR反应体系，配制结束后按照表10所示的PCR程序进行PCR反应。扩增CD8αhinge-TM-41BB-CD3ζ片段，使用引物如下：

CD8αH-F(SEQ ID NO.19)：ACCACGACGCCAGCGCCGCGAC

Vector-R(SEQ ID NO.20)：TCGATAAGCTTGATATCG

表12

PCR结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收780bp左右的片段，紫外吸收法定量。

4、将5μg实验室构建的HD CD19 CAR质粒进行BamHI和EcoRI双酶切，37℃水浴反应2h后，回收载体。

将上述3个片段和用重组酶连接，重组反应体系如表13所示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细胞。

表13

试剂	使用量
		HD CD19 CAR	184.54ng
CD8αsingal BCMA VHH	31.32ng
		CD8αhinge-TM-41BB-CD3ζ	29.72ng
5×CE buffer	2μL
		Exnase<sup>TM</sup> II	1μL
无菌去离子水(PCR grade water)	补足至10μL

从固体培养基上挑选单克隆，过夜培养，进行PCR鉴定，PCR反应物配制如表14所示，PCR程序如表15所示。PCR结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期。

表14

试剂	体积(μL)
		Taq PCR Master Mix	10
10μM F Seq-trEF1a-F	1
		10μM R Vector-R	1
Template DNA菌液	1
		无菌去离子水(PCR grade water)	7

表15

将获得的信号肽-VHH、CD8α铰链区、跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序两个基因片段经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行回收、纯化、定量；

用限制性内切酶BamHI和EcoRI(购自NEB公司)切慢病毒表达载体HD SIN BCMA(21)-41BBz(ka)，按说明书进行操作。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行回收、纯化、定量；

然后，将两条目的片段与载体用重组酶克隆到慢病毒载体中，并进行测序验证，测序结果符合预期。

实施例6

本实施例中对实施例5中制备得到的慢病毒载体HD SIN BCMA(21)-41BBz(ka)进行慢病毒包装、浓缩和滴度检测。

(1)慢病毒包装

以1.6×10⁷细胞数接种293T细胞于15cm培养皿中，37℃，5％CO₂培养过夜准备包装病毒，培养基为含DMEM，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)；将慢病毒载体30μgHD SIN BCMA(21)-41BBz(ka)、12.5μg辅助质粒gag/pol与10μg包膜质粒VSVg溶入2000μL无血清DMEM培养液，混匀；

将157.5μg PEI(1μg/μL)溶解于2000μL的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min；将PEI混合液加入DNA混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min，形成转染复合物；再将转染复合物4mL滴加入含25mL含293T细胞的DMEM培养基中，4～5h小时后，更换新鲜培养基；48h后，收集病毒液上清。

(2)慢病毒浓缩

将病毒上清用0.45μm滤膜过滤后收集到50mL离心管中，加入1/4的PEG-NaCl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃放置过夜；4℃，3500rpm，离心30min；去上清，加入适量的RPMI1640培养基(含质量分数10％的FBS)，溶解重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中，储存在-80℃中；

(3)慢病毒滴度检测

将500μL K562细胞(1×10⁵个细胞)接种细胞于24孔培养板，再将浓缩后的慢病毒分别以1μL、0.2μL和0.04μL的体积添加到细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度5μg/mL，37℃，5％CO₂培养过夜后，更换新鲜培养基；

感染72h后，400g离心5min，弃上清收集细胞，加100μL PBS+2％FBS重悬细胞，加入1μg的hBCMA-EcD-Fc抗体，冰上孵育30min；PBS(含质量分数2％的FBS)缓冲液清洗1次后，加入100μL缓冲液重悬细胞，加入APCanti-human IgG Fc抗体，冰上孵育30min；PBS(含质量分数2％的FBS)缓冲液清洗2次后，加入300μL缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测感染效率；取阳性率为5～20％的细胞样品为宜，计算滴度，滴度计算公式如下：滴度(TU/mL)＝细胞数量(10⁵)×阳性率/病毒体积(mL)。

实施例7

本实施例中使用实施例6中制备得到的慢病毒转导T淋巴细胞。

(1)用PBS将抗人CD3抗体和抗人CD28抗体稀释，终浓度分别为1μg/mL和0.5μg/mL，包被孔板，4℃冰箱静置过夜；弃去孔板中的抗体包被液，1mL PBS洗两次；

(2)用T细胞培养基(X-VIVO+10％FBS+300U/mL IL-2)将人PBMC调整至密度为1×10⁶/mL，接种到CD3和CD28抗体包被的孔板中活化48h；收集活化的T细胞，调整细胞密度为1×10⁶/mL，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)为10加入慢病毒，添加polybrene至终浓度为5μg/mL；于37℃、5％CO₂环境中培养过夜后更换新鲜培养基，每2～3天进行传代；

(3)T细胞感染5天后，取3×10⁵的T细胞，4℃、400g离心5min，弃上清，PBS(含质量分数2％的FBS)缓冲液清洗一次；加100μL缓冲液重悬细胞，加入1μg的hBCMA-EcD-Fc抗体，冰上孵育30min；缓冲液清洗1次后，加入100μL缓冲液重悬细胞，加入APCanti-human IgGFc抗体，冰上孵育30min；缓冲液清洗2次后，加入300μL缓冲液重悬细胞；

采用流式细胞仪检测T淋巴细胞的嵌合抗原受体表达率，结果如图5所示，由图可知(其中I图为空白对照，II图为加入了BCMA-21的实验组)，所述嵌合抗原受体表达率为35.8％。

此外，本实施例中还使用流式细胞仪检测淋巴细胞表型。

(1)T细胞感染5天后，取3×10⁵的T细胞，4℃、400g离心5min，弃上清，PBS(含质量分数2％的FBS)缓冲液清洗一次；

(2)加50μL缓冲液重悬细胞，加入1μL FITC标记的Anti-CD3 Ab、Percp-Cy5.5标记的Anti-CD4 Ab和PE-Cy7标记的Anti-CD8 Ab，冰上孵育30min；缓冲液清洗两次后，加入300μL缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测细胞表型；

结果如图6显示，未转染的T细胞中CD3+CD4+细胞比例为8.44％，CD3+CD8+细胞比例为89.3％；实验组中T淋巴细胞CD3+CD4+细胞比例为19.7％，CD3+CD8+细胞比例为48.0％。

实施例8

本实施例中对CAR-T细胞进行体外毒性实验。

1、靶细胞接种

将K562(BCMA-)、8266(BCMA+)、U266(BCMA+)作为靶细胞，调整靶细胞浓度为1×10⁵/mL，取100μL接种到96孔板；

2、效应细胞接种：

BCMA CAR-T以及对照T细胞为效应细胞，按效靶比0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入CAR-T细胞及对照T细胞；

3、各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。其中各实验组和各对照组如下：

实验组：各靶细胞+CAR-T；

对照组1：靶细胞最大释放LDH；

对照组2：靶细胞自发释放LDH；

对照组3：效应细胞自发释放LDH；

4、检测方法：

效应细胞与靶细胞共培养18h后，采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。

该方法是基于比色法的检测方法，通过检测乳酸脱氢酶(LDH)的含量反映细胞的裂解程度。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过偶联酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。

具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。

5、细胞毒性计算公式为：

结果如图7A所示，构建的CAR-T细胞对BCMA阴性细胞无杀伤作用，如图7B和图7C所示，BCMA阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性。

实施例9

本实施例中检测CAR-T细胞因子的分泌情况。

1、细胞培养上清

将效靶比1:1的细胞培养物400g离心10分钟去除沉淀物，取上清置于-80℃贮存待检。

2、试剂准备

检测前将所有的试剂、样本恢复至室温，如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。按照使用说明配制1×洗液，1×检测缓冲液，检测抗体且在30分钟内使用稀释后的检测抗体。

3、标准品及样品配制

标准品：使用5％1640培养基2倍稀释标准品原液，一共8个稀释梯度，包括零浓度。

样品：使用5％1640培养基按比稀释样品。

4、检测步骤

(1)浸泡酶标板：加入300μL 1×洗液静置浸泡30秒。为了获得理想的实验结果，浸泡是必须的。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。

(2)加标准品：标准品孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品。空白孔加入100μL标准品稀释液(血清/血浆样本)或培养基(细胞培养上清样本)。

(3)加样本：细胞培养上清：样本孔加入100μL细胞培养上清。

(4)加检测抗体：每孔加入50μL稀释的检测抗体(1:100稀释)。保证步骤4、5、6连续加样，不要间断。加样过程在15分钟内完成。

(5)孵育：使用封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育2小时。

(6)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必须彻底移除残留液体。

(7)加酶孵育：每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)。

(8)孵育：使用新的封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育45分钟。

(9)洗涤：重复步骤(6)。

(10)加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，室温孵育5～30分钟。

(11)加终止液：每孔加入100μL终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

(12)检测读数：在30分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和参考波长下的OD值。

校准后的OD值为450nm的测定值减去参考波长下的测定值。

IL-2、TNF-α、IFN-γ因子分泌结果分别如图8、图9和图10所示，构建的CAR-T细胞对BCMA阳性的肿瘤细胞释放细胞因子，而对BCMA阴性细胞无明显细胞因子分泌。

综上所述，本发明中所述抗BCMA抗体通过噬菌体展示纳米抗体库筛选得到，具有较好的抗体亲和力，将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体和CAR-T细胞，所得CAR-T细胞CD3+CD4+细胞比例为19.7％，CD3+CD8+细胞比例为48.0％，通过细胞毒性试验检测可知，其对BCMA阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 华道（上海）生物医药有限公司

<120> 一种抗B细胞成熟抗原的抗体及其应用

<130> 20210127

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 1

Gly Tyr Thr Asp Ser Ser Asn Leu

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 2

Phe Tyr Thr Gly Gly Gly Arg Pro

1 5

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 3

Ala Ala Asp Tyr Leu Gly Gly Ala Trp Pro Phe Gly Ala Tyr Arg Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 5

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 6

Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ser

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Val Phe Tyr Thr Gly Gly Gly Arg Pro Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Tyr Leu Gly Gly Ala Trp Pro Phe Gly Ala Tyr Arg Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc agcgtgcagg ccggcggcag cctgcggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta caccgacagc agcaacctga tgggctggtt ccggcaggcc 120

ccaggcaagg agcgggaggg cgtggccgtg ttctataccg gcggcggcag accagtgtac 180

gctgatagcg tgaaaggcag gtttacaatt tctcaggatt ctgctaaaaa cacagtgtac 240

ctacagatga atagcctgaa accagaagat accgccctgt attattgtgc cgccgattat 300

ctgggaggag cctggccttt tggagcctat agatattggg gacagggaac acaggtgaca 360

gtgagtagc 369

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 10

cgcgattctt aagggtgtcc agtgcgaggt gcagctggtg ga 42

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 11

gcatggagga cagggcttga ttgtggggct actcactgtc acctg 45

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 12

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 13

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 13

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 14

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 14

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 16

ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc aggccggagg tgcagctggt ggagtccggc 60

ggcggca 67

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 17

gcgctggcgt cgtggtgcta ctcactgtca cc 32

<210> 18

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 18

gctgcaggtc gactctagag gatcccgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc 60

tgccgctggc cttgc 75

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 19

accacgacgc cagcgccgcg ac 22

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 20

tcgataagct tgatatcg 18

Claims

1.一种抗B细胞成熟抗原的抗体，其特征在于，所述抗体为纳米抗体，所述抗体为BCMA-21，所述BCMA-21的重链可变区包括：SEQ ID NO.1所示的互补决定区1、SEQ ID NO.2所示的互补决定区2和SEQ ID NO.3所示的互补决定区3；

其中，SEQ ID NO.1的序列为GYTDSSNL；

SEQ ID NO.2的序列为FYTGGGRP；

SEQ ID NO.3的序列为AADYLGGAWPFGAYRY。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述SEQ ID NO.8的序列为：

EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTDSSNLMGWFRQAPGKEREGVAVFYTGGGRPVYADSVKGRFTISQDSAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAADYLGGAWPFGAYRYWGQGTQVTVSS。

3.一种编码如权利要求1-2任一项所述的抗体的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQID NO.9所示的核苷酸序列。

5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域为权利要求1或2所述的抗体。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽包括CD8α信号肽；

所述铰链区包括CD8α铰链区；

所述跨膜区包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合；

所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序；

所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4-1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、权利要求1或2所述的抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序。

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5-7任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因；

所述表达载体为含有权利要求5-7任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体。

10.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染权利要求8或9所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

11.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达权利要求5-7任一项所述的嵌合抗原受体。

12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括权利要求8或9所述的表达载体或权利要求10所述的重组慢病毒。

13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求11-13中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞；

所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

15.如权利要求1-2任一项所述的抗体、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5-7任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求8或9所述的表达载体、权利要求10所述的重组慢病毒、权利要求11-13任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞或权利要求14所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用；

所述肿瘤为多发性骨髓瘤。