CN110964697A - 一种抗肿瘤nk细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。该抗肿瘤NK细胞为嵌合抗原受体编辑的NK细胞，该嵌合抗原受体包括PD‑1的胞外结构域片段、F2A肽片段、CD8a信号肽胞外区、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区、CD8αLinker区、CD28跨膜及胞内协同共刺激区、胞内传递信号的CD3ζ片段。本发明的NK细胞可以在细胞膜上表达靶向HER2的CAR元件，同时，表达分泌型PD‑1蛋白，从而阻断PD‑1与PD‑L1的结合，增加NK细胞杀伤功能；这种抗肿瘤NK细胞用于制备抗肿瘤药物，可靶向肿瘤细胞，还可增强细胞毒作用，免疫原性低，易响应激活，可异体回输，NK细胞肿瘤杀伤得到了显著提高。

Description

一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞治疗药物的技术领域，特别是指一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，细胞治疗已经成为治疗晚期癌症的一种强有力的治疗方法。由于其不仅可以针对肿瘤本身，还可以改善患者的免疫系统，因此被认为是能够攻克癌症最有希望的一个治疗方法。其中嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)，由于在部分血液性肿瘤中取得了显著临床疗效，成为肿瘤过继免疫治疗的典型代表。然而，CAR-T还存在着很多局限性影响临床广泛地应用，比如自体T细胞的体外改造、细胞因子风暴的产生和实体瘤临床治疗效果不佳等。因此，目前亟待寻求新的免疫细胞治疗手段，以提高其对肿瘤特别是实体瘤的杀伤作用，并且方便临床应用，降低毒副作用。
NK细胞，全称natural killer cell，NK，即自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，约占健康人外周血淋巴细胞总数的10％。NK细胞通过杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)及共刺激受体依赖、主要组织相容性复合物(MHC)非依赖方式识别病变细胞，不需提前免疫致敏，可在几十分钟内杀伤恶性细胞，因而被认为是最有效的体内监视和清除病变细胞的免疫细胞亚群。NK细胞的激活依赖于活化和抑制性受体信号的平衡结果。活化的NK细胞通过直接和间接的方式杀伤病变细胞：当NK细胞与靶细胞接触并形成免疫突触时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶，直接作用于靶细胞；同时通过表面的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与靶细胞TRAIL受体结合诱导细胞凋亡。另外，NK细胞通过分泌干扰素等细胞因子调节天然和获得性免疫细胞，从而间接杀伤病变细胞。除了这些优势之外，与CAR-T相比，CAR-NK不易产生细胞因子风暴，安全性更高；可以使用他人或NK细胞株用于CAR-NK生产，方便临床及时用药。此外，由于基因工程修饰的NK细胞还保留自身完整的天然受体，可以通过不同于CAR特异性的机制发挥抗肿瘤作用，因此可以降低CAR靶向抗原丢失所介导的复发或耐药的风险。但是NK细胞在肿瘤杀伤中，与T细胞一样，受到肿瘤细胞表面PD-L1的抑制作用，减弱了免疫细胞的杀伤作用。PD-1是一种抑制性受体，在肿瘤患者NK、T细胞中表达。PD-L1作为PD-1的配体，在恶性细胞表面高表达。PD-1与PD-L1结合，可能导致NK和T细胞凋亡、失活和耗竭，对免疫调节起负调控作用。目前PD-1单抗药物，可通过抑制PD-1与PD-L1结合，使肿瘤细胞易于被免疫系统识别，进一步使肿瘤细胞被杀伤。可溶性的PD-1可以与PD-L1结合，也能抑制PD-1与PD-L1结合，促进肿瘤细胞的免疫杀伤。
现有技术中已经出现了一些利用NK细胞制备的抗肿瘤药物，例如：中国专利CN107974433A于2018年05月01日公开了一种增强型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用，并公开了该抗肿瘤NK细胞为经双重靶向嵌合受体改造的NK细胞，双重靶向嵌合受体由PD-1胞外段、NKG2D全长段以及共刺激分子41BB胞内段组成；这种抗肿瘤NK细胞采用双重靶向嵌合受体对NK细胞进行改造，能够提高NK细胞的抗肿瘤治疗效果，实现对实体瘤的特异性识别和杀伤，并且不会引起机体过激的免疫应答反应。但是，这种抗肿瘤NK细胞由于缺乏胞内信号转导分子，容易造成NK细胞无法响应激活或者激活较弱，而且，这种抗肿瘤NK细胞活化过程中受到肿瘤细胞PD-L1信号抑制的作用，特异性较弱，应答性能不尽人意，应用效果有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用，这种抗肿瘤NK细胞增强了NK细胞的杀伤作用，对肿瘤微环境中T细胞活性也具有增加作用。
在一个方面，本发明的一种抗肿瘤NK细胞，其技术方案是这样实现的：所述抗肿瘤NK细胞为嵌合抗原受体编辑的NK细胞，所述嵌合抗原受体包括PD-1的胞外结构域片段、F2A肽片段、CD8a信号肽胞外区、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区、CD8αLinker区、CD28跨膜及胞内协同共刺激区、胞内传递信号的CD3ζ片段。
本发明中抗体所识别的HER2受体是一个具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，是表皮生长因子受体家族的成员。HER2是公认的治疗靶点，在乳腺、胃、卵巢、结肠、膀胱、肺、子宫颈、头颈部、食道癌等实体肿瘤中均有过表达。HER2在其家族信号网络中的关键作用，导致了用于癌症治疗的抗HER2单克隆抗体的发展，如trastuzumab和pertuzumab。PD-1是一种抑制性受体，在肿瘤患者NK细胞和T细胞中表达。PD-L1作为PD-1的配体，在恶性细胞表面高表达。PD-1与PD-L1结合，可能导致NK细胞和T细胞凋亡、失活和耗竭，对免疫调节起负调控作用。本发明加入了可分泌的PD-1胞外结构域，阻断PD-1/PD-L1通路，增强CAR-NK细胞的抗肿瘤作用。本发明中嵌合抗原受体基因编码的跨膜蛋白主要结构包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区。在该结构中，胞外区由CD8a信号肽以及可以识别结合HER2蛋白的单链抗体组成，选择了CD28跨膜区域作为该结构中的跨膜区域，同时在跨膜区以及单链抗体区域之间加入了一段linker，该区域有利于单链抗体作用与功能发挥；在胞内信号区域中，选择了CD28作为共刺激信号以及CD3ζ区域，增加NK细胞胞内的信号传递。该嵌合抗原受体结构特异性的识别HER2蛋白，同时释放PD-1的胞外段，可以有效的刺激活化NK92细胞，提高NK细胞的抗肿瘤治疗效果，实现了对实体瘤的特异性识别和杀伤。
作为一种优选的实施方案，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明中嵌合抗原受体的主要结构包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区，该嵌合抗原受体具备了二代CAR完整的结构与序列，可以使细胞能正常的靶向肿瘤，然后传递信号至NK细胞并激活NK细胞。
作为一种优选的实施方案，所述PD-1胞外结构域片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。本发明中只选取PD-1的胞外结构域，可以使PD-1无法跨膜与传导胞内负调控信号，从而只作为一个分泌型蛋白，起到识别肿瘤表面PD-L1并阻断的作用。
作为一种优选的实施方案，所述F2A肽片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。该F2A片段由于其翻译过程中核糖体“跳过”作用，可以导致上下游之间肽的断裂，从而更好地切割PD-1，使其成为分泌型的sPD-1蛋白。
作为一种优选的实施方案，所述CD8a信号肽胞外区的氨基酸序列如序列表中SEQID NO:7所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。本发明中在CAR的胞外区选取CD8a信号肽序列，可以引导HER2单链抗体可变区位于膜外。
作为一种优选的实施方案，所述识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。本发明在CAR胞外抗原结合区采用HER2的单链抗体可变区，可以识别乳腺、胃、卵巢、结肠、膀胱、肺、子宫颈、头颈部、食道癌等高表达Her2的实体肿瘤。
作为一种优选的实施方案，所述CD8αLinker区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:11所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。本发明在CAR的跨膜区以及单链抗体区域之间加入了一段linker，该区域有利于单链抗体作用与功能发挥。本发明选择的铰链区长度，可以更好地发挥CAR靶向性识别结合肿瘤抗原的功能。
作为一种优选的实施方案，所述CD28跨膜及胞内协同共刺激区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。本发明选择了CD28跨膜区域作为CAR结构中的跨膜区域，同时在胞内信号区域中，选择了CD28作为共刺激信号；该跨膜及胞内共刺激序列可以帮助CAR结构二聚化以及细胞活化。
作为一种优选的实施方案，所述胞内传递信号的CD3ζ片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:15所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。本发明在胞内信号区采用了CD3ζ片段，该免疫受体酪氨酸活化序列可以在胞外区识别并结合抗原后，在共刺激分子协同下传导信号，激活NK细胞。
在另一个方面，本发明的一种抗肿瘤NK细胞的制备方法，其技术方案是这样实现的：包括以下步骤：
1)合成嵌合抗原受体编码基因
设计特异性引物，分别对PD-1的胞外结构域片段编码基因、F2A肽片段编码基因、CD8a信号肽胞外区编码基因、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区编码基因、CD8αLinker区编码基因、CD28跨膜及胞内协同共刺激区编码基因、胞内传递信号的CD3ζ片段编码基因进行PCR扩增，并将所得扩增产物进行顺序连接，得嵌合抗原受体编码基因；
2)构建重组慢病毒载体
将嵌合抗原受体编码基因克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP上，得重组慢病毒载体；
3)慢病毒的包装
将所得重组慢病毒载体以及辅助载体pSPAX2、辅助载体PMD2G转染感受态细胞，获得慢病毒；
4)慢病毒侵染NK细胞
将所得慢病毒加入NK92细胞进行培养，得到稳定表达嵌合抗原受体的抗肿瘤NK92细胞。
本发明中嵌合抗原受体包含A段和B段，其中，A段＝PD-1的胞外结构域+F2A自我切割肽，B段＝识别结合HER2蛋白的单链抗体可变区+CD28跨膜区域+胞内协同共刺激分子CD28+胞内传递信号的CD3ζ片段。A段和B段以及全长序列都是通过PCR和多步重叠延伸PCR，将多个片段拼接。设计特异性引物，分别对PD-1的胞外结构域片段编码基因、F2A肽片段编码基因、CD8a信号肽胞外区编码基因、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区编码基因、CD8αLinker区编码基因、CD28跨膜及胞内协同共刺激区编码基因、胞内传递信号的CD3ζ片段编码基因进行PCR扩增，并将所得扩增产物进行顺序连接，得到嵌合抗原受体编码基因sPD1-HER2-CAR，分别为HER2-CAR和增强型的sPD1-HER2-CAR；将嵌合抗原受体HER2-CAR和增强型的sPD1-HER2-CAR编码基因克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP上，得重组慢病毒载体；重组慢病毒载体经过包装和侵染，得到稳定表达嵌合抗原受体的抗肿瘤NK92细胞。本发明的抗肿瘤NK细胞制备方法工艺流程短，操作简单，容易实现，易于实现产业化。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，重组慢病毒载体、辅助载体pSPAX2、辅助载体PMD2G按照4:3:1的质量比转染293T细胞。本发明在一种重组慢病毒载体和两种辅助载体的作用下实现了细胞转染，通常情况下，293T细胞5×106铺于10cm培养皿中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5％CO2培养箱中培养，至细胞融合度为60～70％时，使用Lipo3000法进行转染。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)之后还包括慢病毒的浓缩步骤，具体为：收集转染48h和72h的病毒上清，离心，使用0.44μm的滤膜进行过滤，加入PEG8000，上清体积：PEG8000体积＝4:1，混匀，4℃过夜，次日使用高速离心机，在4℃条件下，4000g离心30min进行浓缩，弃去上清，加入预冷的PBS，重悬病毒，分装，-80℃保存，备用。在慢病毒侵染NK-92细胞之前，对慢病毒进行浓缩，提高侵染的效率和效果。
作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，在将所得慢病毒加入NK92细胞进行培养的过程中，还需要加入聚凝胺，侵染12h，去除病毒上清，更换新鲜的培养，继续培养72h。根据慢病毒的滴度(可通过梯度稀释法进行检测)和侵染的细胞量，可获得相应的MOI值；根据MOI值，可获得侵染一定量细胞所加的慢病毒浓缩液的量，从而有利于计量。
作为一种优选的实施方案，所述慢病毒和聚凝胺加入NK92细胞之后，所得聚凝胺的终浓度为8μg/mL。本发明的聚凝胺浓度可以促进病毒侵染NK细胞的效率，同时又不对NK细胞活力造成影响。
在再一个方面，本发明的一种抗肿瘤NK细胞的应用，其技术方案是这样实现的：所述抗肿瘤NK细胞用于制备抗肿瘤药物。本发明的抗肿瘤NK细胞可以用于制备抗肿瘤药物，这种使用了抗肿瘤NK细胞的抗肿瘤药物能够提高抗肿瘤治疗效果，实现了对实体瘤的特异性识别和杀伤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的抗肿瘤NK细胞不仅可以在细胞膜上稳定表达靶向HER2的CAR元件，同时，表达分泌型PD-1蛋白，不仅可以靶向HER2阳性的肿瘤细胞，还可通过阻断PD-1/PD-L1的结合，从而增强NK92细胞的细胞毒作用，能够提高抗肿瘤治疗效果，实现对肿瘤的特异性识别和杀伤；与T细胞相比，本发明的抗肿瘤NK细胞不易造成移植物抗宿主反应，可以进行异体回输。该抗肿瘤NK细胞的制备方法工艺流程短，操作简单，容易实现，易于实现产业化。这种抗肿瘤NK细胞用于制备抗肿瘤药物，可靶向肿瘤细胞，还可增强细胞毒作用，免疫原性低，易响应激活，可异体回输，NK细胞肿瘤杀伤得到了显著提高，所得抗肿瘤药物药效好。
附图说明
图1为嵌合抗原受体的结构示意图；
图2为慢病毒在制备过程中72h时白光表达图；
图3为慢病毒在制备过程中72h时荧光表达图；
图4为病毒滴度检测过程中稀释10倍下的荧光数量图；
图5为病毒滴度检测过程中稀释100倍下的荧光数量图；
图6为病毒滴度检测过程中稀释1000倍下的荧光数量图；
图7为病毒滴度检测过程中稀释10000倍下的荧光数量图；
图8为病毒滴度检测过程中稀释100000倍下的荧光数量图；
图9为病毒滴度检测过程中稀释1000000倍下的荧光数量图；
图10为病毒滴度检测过程中稀释10000000倍下的荧光数量图；
图11为病毒滴度检测过程中稀释100000000倍下的荧光数量图；
图12为病毒滴度检测过程中稀释1000000000倍下的荧光数量图；
图13为sPD1-HER2-CAR病毒转染NK 92过程中侵染72h时在白光下的细胞图；
图14为sPD1-HER2-CAR病毒转染NK 92过程中侵染72h时的荧光表达图；
图15为图13和图14合并之后的总图；
图16为HER2-CAR慢病毒转染NK 92过程中侵染72h时的在白光下的细胞图；
图17为HER2-CAR慢病毒转染NK 92过程中侵染72h时的荧光表达图；
图18为图16和图17合并之后的总图；
图19为Western-blot检测改造后细胞上清中sPD-1的表达；
图20为Western-blot检测肿瘤细胞中HER2的表达；
图21为在A431肿瘤细胞中不同NK细胞的杀伤效率随效钯比的变化趋势图；
图中：—▲—NK92；—■—HER2-NK92；—●—sPD1-HER2-NK92。
具体实施方式
下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种抗肿瘤NK细胞，所述抗肿瘤NK细胞为嵌合抗原受体编辑的NK细胞，所述嵌合抗原受体包括PD-1的胞外结构域片段、F2A肽片段、CD8a信号肽胞外区、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区、CD8αLinker区、CD28跨膜及胞内协同共刺激区、胞内传递信号的CD3ζ片段。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述PD-1胞外结构域片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
更进一步地，所述F2A肽片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。
具体地，所述CD8a信号肽胞外区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
更优选地，所述识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。
更进一步地，所述CD8αLinker区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
更具体地，所述CD28跨膜及胞内协同共刺激区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:13所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。
再次优选地，所述胞内传递信号的CD3ζ片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:15所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。
本发明的一种抗肿瘤NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)合成嵌合抗原受体编码基因
设计特异性引物，分别对PD-1的胞外结构域片段编码基因、F2A肽片段编码基因、CD8a信号肽胞外区编码基因、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区编码基因、CD8αLinker区编码基因、CD28跨膜及胞内协同共刺激区编码基因、胞内传递信号的CD3ζ片段编码基因进行PCR扩增，并将所得扩增产物进行顺序连接，得嵌合抗原受体编码基因；
2)构建重组慢病毒载体
将嵌合抗原受体HER2-CAR和增强型的sPD1-HER2-CAR编码基因克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP上，得重组慢病毒载体；
3)慢病毒的包装
将所得重组慢病毒载体以及辅助载体pSPAX2、辅助载体PMD2G转染感受态细胞，获得慢病毒；
4)慢病毒侵染NK细胞
将所得慢病毒加入NK92细胞进行培养，得到稳定表达嵌合抗原受体的抗肿瘤NK92细胞。
优选地，所述步骤3)中，重组慢病毒载体、辅助载体pSPAX2、辅助载体PMD2G按照4:3:1的质量比转染293T细胞。
进一步地，所述步骤3)之后还包括慢病毒的浓缩步骤，具体为：收集转染48h和72h的病毒上清，离心，使用0.44μm的滤膜进行过滤，加入PEG8000，上清体积：PEG8000体积＝4:1，混匀，4℃过夜，次日使用高速离心机，在4℃条件下，4000g离心30min进行浓缩，弃去上清，加入预冷的PBS，重悬病毒，分装，-80℃保存，备用。
再次优选地，所述步骤4)中，在将所得慢病毒加入NK92细胞进行培养的过程中，还需要加入聚凝胺，侵染12h，去除病毒上清，更换新鲜的培养，继续培养72h。
具体地，所述慢病毒和聚凝胺加入NK92细胞之后，所得聚凝胺的终浓度为8μg/mL。
本发明的一种抗肿瘤NK细胞的应用，所述抗肿瘤NK细胞用于制备抗肿瘤药物。
实施例一
(一)HER2-CAR的构建
根据嵌合抗原受体目的片段的序列，设计PCR所需的引物，合成引物。
首先，使用PCR以pACgp67B-Her2质粒为模板，扩增得到Anti-HER2 ScFv片段；使用重叠延伸PCR将Anti-HER2 ScFv片段与leader片段相连接；使用PCR，以人的cDNA为模板，扩增得到CD28以及CD3ζ区域；使用重叠延伸PCR将CD28片段与CD3ζ相连接；使用重叠延伸PCR将CD28+CD3ζ片段与linker相连接。
接着，以CD8a leader+Anti-HER2 ScFv以及linker+CD28+CD3ζ为模板进行重叠延伸PCR，获得完整的HER2-CAR片段。以人的cDNA为模板，PCR扩增，得到PD-1胞外段。
(二)sPD1-HER2-CAR的构建
在HER2-CAR的构建基础上，使用重叠延伸PCR，在PD-1胞外段后，每次加25bp，获得sPD-1+F2A片段；以sPD-1+F2A和HER2-CAR为模板，使用重叠延伸PCR，获得sPD-1+F2A+HER2-CAR片段，即完整的sPD1-HER2-CAR，完整的嵌合抗原受体的结构模式如图1所示。
(三)构建重组慢病毒载体
将嵌合抗原受体HER2-CAR和增强型的sPD1-HER2-CAR编码基因克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP上，对嵌合抗原受体片段以及慢病毒载体进行双酶切，并使用T4DNA连接酶，将嵌合抗原受体片段和慢病毒载体相连接，最后，将完整的慢病毒质粒进行测序，对其进行测序验证。
测序结果证实序列正确，与预期的各个片段序列均吻合。
(四)慢病毒包装
1、慢病毒包装质粒及目的质粒的提取
将含CAR结构的慢病毒载体、pSPAX2、PMD2G质粒的菌液从-80℃冰箱取出，设20、50、100和200μL的梯度取菌液涂布于含有50μg/mL的氨苄西林抗性的LB固体培养基上，培养过夜。
第二天观察平板是否长出单克隆，并挑取单克隆至5mL的LB液体培养基中扩增，氨苄西林按照50μg/mL的浓度加入，摇床180rpm/min，37℃培养过夜。按照OMEGA公司质粒小提试剂盒说明书提取质粒，使用Epoch2酶标仪对其进行浓度测定，将DNA保存于-20℃，备用。
2、慢病毒包装过程
传代消化获得HEK-293T细胞悬液，293T细胞5×106铺于10cm培养皿中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5％CO2培养箱中培养，至细胞融合度为60-70％时，使用Lipo3000法进行转染。具体实验步骤如下：
1)在1个EP管中加入500μL无血清DMEM培养基、P3000 14μL、三质粒(慢病毒载体质粒、包装质粒pSPAX2、PMD2G)总量为10μg(比例为4：3：1)，混合均匀；
2)另1个EP管中，加入500μL无血清DMEM培养基、Lipo3000 14μL；
3)将两管液体混合，并轻柔吹匀，室温静置15min，均匀加入到培养皿中，空白对照组补加500μL无血清DMEM培养基；
4)培养6h后换液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养；
5)48h后，荧光显微镜下观察荧光表达强度以检测转染效率，如图2和图3所示，图2和图3的放大倍数为4×10，由图2和图3可以看出，图2中白光下293T细胞显示细胞状态良好，图3中293T细胞中荧光表达高，显示病毒包装效率高；收集第一批病毒，之后加入新鲜培养基，继续放入培养箱中培养；
6)72h后收集第二批病毒；
7)收集的病毒上清，3500g，离心10min，去除细胞碎片。
3、病毒浓缩
1)将收集的病毒上清合并，使用0.44μm的滤膜进行过滤，除去病毒上清中的沉淀与大颗粒杂质；
2)慢病毒的浓缩：收集转染48h、72h后的病毒上清，离心后使用0.44μm的滤膜进行过滤，除去病毒上清中的沉淀与大颗粒杂质；按上清体积：PEG8000体积＝4:1，加入PEG8000，混匀后4℃过夜。次日使用高速离心机，在4℃条件下，4000g离心30min进行浓缩，小心弃去上清，加入预冷的PBS，重悬病毒，分装，-80℃保存备用。
4、慢病毒滴度的测定
使用梯度稀释法对所获得的慢病毒浓缩液进行滴度检测，具体的操作步骤如下：
1)取对数生长期的293T细胞，传代消化，每孔1万种96孔板，孔内体积为100μL，置于培养箱中培养过夜；
2)第二天，取若干个EP管，每管中加20μL的培养基，取10μL的病毒浓缩液，依次进行倍比梯度稀释；
3)弃去96孔内的培养基20μL，将含有病毒液体的培养基加入到各个孔内；
4)置于培养箱中，培养24h后，向96孔板内补加100μL含10％胎牛血清的DMEM培养基；
5)继续培养24h后，对96孔板内各个组的细胞进行荧光观察，如图4-图12所示，图4-图12的放大倍数为4×10，选取荧光比例较低的组(15％左右)进行观察和检测。最终的滴度计算按照公式：病毒滴度＝表达荧光的细胞数×MOI值×病毒稀释倍数×103TU/mL。
根据计算公式，所得慢病毒滴度为1×108。
(五)慢病毒转染NK92细胞
取3×105个/孔NK92细胞接种于24孔板中，分别加入HER2-CAR和sPD1-HER2-CAR病毒液，每孔加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺，混匀，置于37℃培养箱中进行培养，10h后离心，去除病毒上清，更换新鲜的培养基，继续培养。侵染48h、72h后，在荧光显微镜下观察荧光的表达以检测侵染效果，如图13-图18所示，图13-图18的放大倍数为4×10，由图13、图14和图15可以看出，细胞成团生长，状态良好；细胞荧光表达效率高。由图16、图17和图18可以看出，细胞成团生长，状态良好；细胞荧光表达效率高。因此，在成功构建了HER2-NK92和sPD1-HER2-NK92细胞之后，荧光显微镜检测稳转NK92细胞的荧光表达。4d后，侵染过的NK92细胞即可用于后续实验。
如图1，本发明的方法所得的抗肿瘤NK细胞中，嵌合抗原受体PD-1的胞外结构域片段、F2A肽片段、CD8a信号肽胞外区、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区、CD8αLinker区、CD28跨膜及胞内协同共刺激区、胞内传递信号的CD3ζ片段。
实施例二
Western-blot检测改造后细胞上清中sPD-1的表达
1)上清样品准备：收取NK92、HER2-NK92以及sPD1-HER2-NK92细胞的培养上清，离心去除细胞碎片；
2)配置8％的下层分离胶和4％的下层浓缩胶；
3)每孔加入loading buffer与上清预混液20μL，使用预染的蛋白marker作为对照，进行电泳检测，将蛋白转移到NC膜上，使用5％的脱脂牛奶室温封闭2h，一抗4℃孵育过夜，使用TBST洗4次，每次5min，二抗室温孵育1h，TBST洗4次，每次5min；
4)显影，根据western blot的结果，分析转染不同的慢病毒以及对照组细胞培养上清中sPD-1的表达水平。
通过Western blot，验证了sPD1-HER2-NK92细胞培养上清中sPD-1的表达，如图19所示；由图19可以看出，NK92以及HER2-NK92蛋白泳道没有显示出sPD-1的表达，sPD1-HER2-NK92蛋白泳道显示出sPD-1的表达。因此，和正常的NK92以及HER2-NK92相比，sPD1-HER2-NK92细胞培养上清中检测到大量的sPD-1的表达。
实施例三
Western blot检测多种肿瘤细胞中HER2蛋白的表达；
1)蛋白样品准备：取对数生长期的MCF-7ADR、NIH-3T3、NIH-3T3-HER2以及A431细胞株，25万/孔铺6孔板，置于培养箱中培养，至融合度为70％左右。弃去培养基，加入预冷的PBS洗两次，每孔加入100-120μL的loading buffer冰上裂解45min，收集样品于沸水中煮15min，-20℃保存备用。
2)配置8％的下层分离胶和4％的下层浓缩胶。
3)每孔加入细胞蛋白样品8-15μL，使用预染的蛋白marker作为对照，进行电泳检测，将蛋白转移到NC膜上，使用5％的脱脂牛奶室温封闭2h，一抗4℃孵育过夜，使用TBST洗4次，每次5min，二抗室温孵育1h，TBST洗4次，每次5min。
4)显影，根据western blot的结果，分别选取HER2阴性和HER2阳性的肿瘤细胞作为后续杀伤实验的靶细胞。
使用Western blot，检测几种肿瘤细胞中HER2蛋白水平表达，如图20所示；由图20可以看出，NIH-3T3细胞蛋白泳道没有显示出HERE2的表达，NIH-3T3-HER2细胞、MCF-7以及A431细胞蛋白泳道显示出HERE2的表达。因此，NIH-3T3细胞中HERE2为阴性，稳定过表达HER2的NIH-3T3-HER2细胞、MCF-7以及A431细胞中HER2为阳性。
实施例四
体外细胞毒性实验
1、细胞准备
取对数生长期的A431细胞，接种于96孔板中，保证每孔5000个细胞，设置3个副孔，置于5％CO2，37℃培养箱中过夜培养。
2、对不同组别的NK92细胞进行计数，然后按照效靶比分别为2.5:1、5:1、10:1加入肿瘤细胞中。同时，设置背景空白对照孔(无细胞的培养液孔)、靶细胞对照孔、效应细胞对照孔、样品最大酶活性对照孔(未加效应细胞处理的用于后续裂解的靶细胞孔)，每孔总体积200μL。
3、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测
本实验采用碧云天公司生产的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(货号C0016)进行检测。效应细胞与靶细胞置于5％CO2，37℃培养箱中共孵育5h。在预定的时间检测点前1h，从细胞培养箱中取出96孔板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打混匀，然后继续放入培养箱中培养。达到共孵育时间后，将96孔板取出，用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相应的孔中，随即进行样品测定。
样品测定步骤如下：(1)各孔分别加入60μL LDH检测工作液；(2)混匀，将96孔板置于100rpm摇床上，室温，避光孵育30min。然后用酶标仪在490nm波长处测定吸光度；(3)所测得的各孔吸光度值均应减去背景空白对照孔的吸光度值；(4)细胞毒性(％)＝(实验组-效应细胞对照孔-靶细胞对照孔)/(样品最大酶活性对照孔-靶细胞对照孔)×100。
对HER2-NK92和sPD1-HER2-NK92细胞进行体外毒性实验。采用乳酸脱氢酶释放法，对A431细胞进行体外杀伤，结果如图21所示。由图21可以看出，NK92细胞在效靶比为2.5:1下，对A431细胞杀伤效率为5.6％；在效靶比为5:1下，对A431细胞杀伤效率为18.3％；在效靶比为10:1下，对A431细胞杀伤效率为27.3％。HER2-NK92细胞在效靶比为2.5:1下，对A431细胞杀伤效率为31.8％；在效靶比为5:1下，对A431细胞杀伤效率为44.3％；在效靶比为10:1下，对A431细胞杀伤效率为59.4％。sPD1-HER2-NK92细胞在效靶比为2.5:1下，对A431细胞杀伤效率为40.3％；在效靶比为5:1下，对A431细胞杀伤效率为58.6％；在效靶比为10:1下，对A431细胞杀伤效率为86.8％。因此，和正常的NK92以及HER2-NK92细胞相比，sPD1-HER2-NK92细胞的杀伤效率最高。
因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的抗肿瘤NK细胞不仅可以在细胞膜上稳定表达靶向HER2的CAR元件，同时，表达分泌型PD-1蛋白，不仅可以靶向HER2阳性的肿瘤细胞，还可通过阻断PD-1/PD-L1的结合，从而增强NK92细胞的细胞毒作用，能够提高抗肿瘤治疗效果，实现对肿瘤的特异性识别和杀伤；与T细胞相比，本发明的抗肿瘤NK细胞不易造成移植物抗宿主反应，可以进行异体回输。该抗肿瘤NK细胞的制备方法工艺流程短，操作简单，容易实现，易于实现产业化。这种抗肿瘤NK细胞用于制备抗肿瘤药物，可靶向肿瘤细胞，还可增强细胞毒作用，免疫原性低，易响应激活，可异体回输，NK细胞肿瘤杀伤得到了显著提高，所得抗肿瘤药物药效好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用
<130> 2019
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Gly Ser Gly Val Lys Gln
165 170 175
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
180 185 190
Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala
195 200 205
Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
210 215 220
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
225 230 235 240
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met
245 250 255
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser
260 265 270
Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val
275 280 285
Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro
290 295 300
Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys
305 310 315 320
Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly
325 330 335
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
355 360 365
Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu
385 390 395 400
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro
405 410 415
Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
420 425 430
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
435 440 445
Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly
450 455 460
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Thr
465 470 475 480
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
485 490 495
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
500 505 510
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu
515 520 525
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
530 535 540
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
545 550 555 560
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
565 570 575
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
580 585 590
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
595 600 605
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
610 615 620
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
625 630 635 640
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
645 650 655
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
660 665 670
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
675 680 685
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
690 695 700
Arg
705
<210> 2
<211> 2115
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt 540
gaccttctca agttggcggg agacgtggag tccaaccctg gacctgcctt accagtgacc 600
gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc cacgccgcca ggccgcaggt gcagctggtg 660
cagtctgggg cagaggtgaa aaagcccggg gagtctctga agatctcctg taagggttct 720
ggatacagct ttaccagcta ctggatcgcc tgggtgcgcc agatgcccgg gaaaggcctg 780
gagtacatgg ggctcatcta tcctggtgac tctgacacca aatacagccc gtccttccaa 840
ggccaggtca ccatctcagt cgacaagtcc gtcagcactg cctacttgca atggagcagt 900
ctgaagccct cggacagcgc cgtgtatttt tgtgcgagac atgacgtggg atattgcagt 960
agttccaact gcgcaaagtg gcctgaatac ttccagcatt ggggccaggg caccctggtc 1020
accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgcag 1080
tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 1140
tgctctggaa gcagctccaa cattgggaat aattatgtat cctggtacca gcagctccca 1200
ggaacagccc ccaaactcct catctatgat cacaccaatc ggcccgcagg ggtccctgac 1260
cgattctctg gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcagtgg gttccggtcc 1320
gaggatgagg ctgattatta ctgtgcctcc tgggactaca ccctctcggg ctgggtgttc 1380
ggcggaggaa ccaagctgac cgtcctaggt gcggccgccg gcggaggagg atctaccacg 1440
acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg 1500
cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc 1560
gcctgtgatt tttgggtgct ggtggtggtt ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 1620
gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1680
gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1740
gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1800
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1860
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1920
cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1980
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 2040
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 2100
ctgccccctc gctaa 2115
<210> 3
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val
165 170
<210> 4
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg 510
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 9
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
100 105 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
145 150 155 160
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
165 170 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
210 215 220
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala
245 250 255
Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser
260
<210> 10
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
caggtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac 240
ttgcaatgga gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac 300
gtgggatatt gcagtagttc caactgcgca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc 360
cagggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc 420
ggtggcggat cgcagtctgt gttgacgcag ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag 480
aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg 540
taccagcagc tcccaggaac agcccccaaa ctcctcatct atgatcacac caatcggccc 600
gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc aagtctggca cctcagcctc cctggccatc 660
agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat tattactgtg cctcctggga ctacaccctc 720
tcgggctggg tgttcggcgg aggaaccaag ctgaccgtcc taggtgcggc cgccggcgga 780
ggaggatct 789
<210> 11
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 12
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 13
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 14
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 16
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 342

Claims (10)

1.一种抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述抗肿瘤NK细胞为嵌合抗原受体编辑的NK细胞；
所述嵌合抗原受体包括PD-1的胞外结构域片段、F2A肽片段、CD8a信号肽胞外区、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区、CD8αLinker区、CD28跨膜及胞内协同共刺激区、胞内传递信号的CD3ζ片段。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：
所述PD-1胞外结构域片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：
所述F2A肽片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：
所述CD8a信号肽胞外区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：
所述识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：
所述CD8αLinker区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
8.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：
所述CD28跨膜及胞内协同共刺激区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示；
优选地，所述胞内传递信号的CD3ζ片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:15所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。
9.一种根据权利要求1-8中任意一项所述的抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成嵌合抗原受体编码基因
设计特异性引物，分别对PD-1的胞外结构域片段编码基因、F2A肽片段编码基因、CD8a信号肽胞外区编码基因、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区编码基因、CD8αLinker区编码基因、CD28跨膜及胞内协同共刺激区编码基因、胞内传递信号的CD3ζ片段编码基因进行PCR扩增，并将所得扩增产物进行顺序连接，得嵌合抗原受体编码基因；
2)构建重组慢病毒载体
将嵌合抗原受体编码基因克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP上，得重组慢病毒载体；
3)慢病毒的包装
将所得重组慢病毒载体以及辅助载体pSPAX2、辅助载体PMD2G转染感受态细胞，获得慢病毒；
4)慢病毒侵染NK细胞
将所得慢病毒加入NK92细胞进行培养，得到稳定表达嵌合抗原受体的抗肿瘤NK92细胞。
10.一种根据权利要求1-8中任意一项所述的抗肿瘤NK细胞的应用，其特征在于：
所述抗肿瘤NK细胞用于制备抗肿瘤药物。
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