CN103965362B

CN103965362B - 一种可使t细胞趋向肿瘤部位的嵌合趋化因子受体

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Publication number: CN103965362B
Application number: CN201310046965.XA
Authority: CN
Inventors: 钱其军; 金华君; 朱洋洋; 丁娜; 王颖; 俞德超; 李林芳; 吴孟超
Original assignee: Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2033-02-06
Also published as: CN103965362A

Abstract

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及一种可使T细胞趋向肿瘤部位的嵌合趋化因子受体。具体地说，该嵌合趋化因子受体由高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段，通过铰链结构与源于高亲和受体的跨膜区和能使T细胞高效迁移的信号域肽段连接构成。膜外肽段接收相应因子信号并传递到胞内，通过能促使T细胞迁移的信号域肽段的胞内区，启动促进T细胞趋化的相关通路，使经过该嵌合趋化因子受体修饰后的T细胞具有向相应因子高浓度方向迁移的特性，并不削弱其正常的肿瘤杀伤活性，从而保证肿瘤过继细胞治疗效应T细胞能高效达到肿瘤病灶部位，发挥治疗作用。

Description

一种可使T细胞趋向肿瘤部位的嵌合趋化因子受体

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及一种可使T细胞趋向肿瘤部位的嵌合趋化因子受体。本发明还涉及所述嵌合趋化因子受体的编码序列和用途。

背景技术

肿瘤过继细胞治疗（adoptive cell therapy,ACT）是将经处理的自体或异体免疫细胞（主要是自体细胞）回输给肿瘤患者，以增强患者免疫功能，达到治疗目的的方法。当前肿瘤ACT进展迅速，在多种类型恶性肿瘤的临床治疗中取得了非常好的疗效（Nature.2011;480:480-9；J Clin Oncol.2011;29:4828-36）。

但过继细胞治疗通常是静脉输液给药，只有一部分细胞能实际到达肿瘤病灶部位，并发挥治疗作用。

肿瘤微环境是由肿瘤细胞及其基质细胞组成的，存在大量由肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子，包括VEGF（血管内皮生长因子）、TGFβ（转化生长因子-β）、EGF（表皮生长因子）、IGF（胰岛素生长因子）、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、HGF（肝细胞生长因子）、PDGF（血小板衍生因）、HIF（缺氧诱导因子）、TF（组织因子），CEA（癌胚抗原）、AFP（甲胎蛋白），具有促进肿瘤细胞生长、侵袭、转移，诱发免疫逃逸与耐受的功能，或者本身是肿瘤进展的生物标志物。

趋化因子受体（Chemokines Receptor）是表达在一些特定的细胞表面的G蛋白耦联的七次跨膜受体，能与细胞外的配体—趋化因子结合。与特异的趋化因子结合后，趋化因子受体引发钙离子内流而产生细胞趋化反应，从而诱导细胞到生物体的特定部位。现已证明，趋化因子/趋化因子受体轴，在嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等向炎性部位的迁移过程中发挥重要功能。

趋化因子受体CXCR3又称G蛋白耦联受体9（GPR9）和CD183，含有7次跨膜α螺旋区（H1～H7），4个细胞外肽段（E1～E4），4个细胞内肽段（C1～C4），主要表达在T细胞、自然杀伤细胞（J Clin Invest.1998;101:746-54）。CXCR3能选择性地与趋化因子（CXCL9,CXCL10和CXCL11）结合（J Biol Chem.2003;278:289-95），引起细胞钙离子的内流，启动肌醇磷脂3-激酶和丝裂原活化蛋白激酶（Blood.2003；102:1959-65）通路，在促进T细胞迁移方面扮演重要角色（Exp Cell Res.2011;317:620-31；J Immunol.2007;179:2223-7；JHepatol.2012;57:1044-51）。有研究报道，增强CXCR3完整分子的表达能使T细胞株（Jurkat细胞）的趋化效应增强10倍左右（Immunology.2007;120:467-85）。但与其它趋化因子受体一样，由于其结构复杂（七次跨膜，含有七段膜内区），目前尚无利用CXCR3某一结构域使T细胞定向趋化的报道。

因而，为保证更多的效应细胞（肿瘤特异性杀伤T细胞）能有效到达肿瘤部位，进一步提高肿瘤ACT的疗效，需解决如何使效应T细胞准确到达肿瘤病灶部位的技术难题。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，建立一种针对肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子（如在各种人类实体瘤中过表达的VEGF）的融合蛋白（本发明中又称为嵌合趋化因子受体，chimeric chemokines receptors,CCR）。具体地说，该嵌合趋化因子受体由特异结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子能力的肽段，通过铰链结构与源于高亲和受体的跨膜区和能使T细胞高效迁移的信号域肽段连接构成。膜外多肽接收相应因子信号并传递到胞内，通过能促进T细胞高效迁移的信号域的胞内肽段，启动促进细胞趋化的相关通路，使经过该嵌合趋化因子受体修饰后的T细胞在保持其原有肿瘤杀伤活性的基础上，具有向相应因子高浓度方向迁移的特性，从而确保肿瘤过继细胞治疗效应T细胞能高效达到肿瘤病灶部位，发挥治疗作用。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的融合蛋白，包括：

高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段、跨膜区肽段以及可使T细胞高效迁移的信号域肽段。

本发明的融合蛋白是一种嵌合趋化因子受体。具体地说，该嵌合趋化因子受体通过具有高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子（VEGF蛋白）能力的多肽来传递T细胞趋化信号，使经过嵌合趋化因子受体修饰后的T细胞向相应细胞因子高浓度的肿瘤部位迁移。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子选自VEGF（血管内皮生长因子）、TGFβ（转化生长因子-β）、EGF（表皮生长因子）、IGF（胰岛素生长因子）、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、HGF（肝细胞生长因子）、PDGF（血小板衍生因子）、HIF（缺氧诱导因子）、TF（组织因子）、CEA（癌胚抗原）和AFP（甲胎蛋白）中的一种或多种。不拘于理论的限制，所述的肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子具有促进肿瘤细胞生长、侵袭或转移，诱发免疫逃逸与耐受的功能，或者本身是肿瘤进展的生物标志物。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段选自与血管内皮生长因子、转化生长因子-β、表皮生长因子、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生因子、缺氧诱导因子、癌胚抗原和甲胎蛋白中的一种或多种高效结合的肽段。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段为肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的天然受体肽段或其单链抗体。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段为包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的肽段。SEQ ID NO：7所示的序列是VEGF受体FLT-1的胞外区第2个免疫球蛋白样结构域肽段。具体地，所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段为单拷贝或多拷贝；具体地，为双拷贝。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述促使T细胞高效迁移的信号域肽段为包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的肽段。SEQ ID NO：11所示的序列是CXCR3-C4结构域肽段。具体地促使T细胞高效迁移的信号域肽段为单拷贝或多拷贝；具体地，为双拷贝。

不拘于理论的限制，多拷贝可以增强对靶标的亲和力，但如果拷贝数太多，可能本领域对融合蛋白空间构象的正确折叠，从而影响其功能；具体地，为2个拷贝。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述跨膜区肽段为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的任意一种。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其还包含信号肽；具体地，所述信号肽包含SEQ ID NO：1所示的序列。

不拘于理论的限制，信号肽可以提高融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终要被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，导致融合蛋白失活。因此，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段、跨膜区、促使T细胞高效迁移的信号域肽段、以及可选的信号肽之间直接连接和/或通过linker连接；优选地，所述linker包含或者为相同或不同的选自SEQ ID NO：3（linker1）和SEQ ID NO：5（linker2）所示的序列。

融合蛋白是通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一基因表达框所得的具有多种功能的蛋白质产物。不拘于理论的限制，在构建融合蛋白时，一个关键的问题是两个甚至多个不同来源蛋白间的接头序列(Linker)，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白（肽段）高级结构的折叠，从而相互干扰，使其中一个甚至多个来源蛋白失去活性；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原，而且随着融合蛋白氨基酸序列的延长，其表达难度会随之增加，其整体折叠可能会出现新的问题。因而，具体涉及到每种蛋白时，由于其各自构象的不同，如何使其融合在一起，而不影响每个部分的功能，需具体分析。遗憾的是，尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步，但是对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限，仍无法通过软件准确模拟融合后蛋白的二级结构。这种现状直接导致了目前对于连接肽序列的设计缺乏可靠的选择标准。

不拘于理论的限制，本发明人通过选择合适的信号肽和linker，增大了融合蛋白的表达量，有利于得到空间构象更佳的融合蛋白，从而提高了融合蛋白的活性。

在本发明的一个实施方案中，构成嵌合趋化因子受体为针对VEGF的嵌合趋化因子受体vCCR，其由信号肽、FLT1-D2区、CD28跨膜区、CXCR3-C4区。

根据本发明任一项所述的融合蛋白，其氨基酸序列包含或者为SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及一种多核苷酸，其编码本发明中任一项所述的融合蛋白。

根据本发明任一项所述的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列或其简并性序列。

本发明的再一方面涉及一种重组载体，其包含本发明任一项所述的多核苷酸；具体地，所述重组载体为重组真核表达载体或重组病毒载体；更具体地，所述重组真核表达载体为重组pLV120gn-vCCR载体；所述重组病毒载体为重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体；进一步具体地，所述重组逆转录病毒载体为重组pLV120-vCCR-IRES-EGFP-neo病毒载体。

本发明的再一方面涉及一种重组细胞，其包含本发明任一项所述的重组载体；具体地，所述重组细胞为重组T细胞；更具体地，所述重组细胞为重组Jurkat E6.1细胞或重组肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）。

本发明的再一方面涉及一种重组T细胞，其本发明中任一项所述的融合蛋白。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体遗传修饰的T细胞；具体地，所述T细胞为JurkatE6.1细胞或肿瘤浸润淋巴细胞；具体地，所述遗传修饰为基因枪法、转染、电转、或病毒转导。

在本发明的一个实施方案中，应用vCCR修饰未经抗原刺激的Jurkat细胞株。

在本发明的一个实施方案中，应用PCR鉴定经vCCR修饰的Jurkat细胞株。

在本发明的一个实施方案中，应用流式细胞术检测经vCCR修饰的Jurkat细胞株表面表达率。

在本发明的一个实施方案中，应用Transwell检测经vCCR修饰的Jurkat细胞株对VEGF的迁移效果。

在本发明的一个实施方案中，体外检测经vCCR修饰后肿瘤浸润淋巴细胞对肝癌SMMC-7721的杀伤能力。

本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含一种或多种本发明中任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体或本发明任一项所述的重组细胞或本发明任一项所述的T细胞；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体或本发明任一项所述的重组细胞或本发明任一项所述的T细胞在制备治疗和/预防和/辅助治疗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一种或多种。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/预防和/辅助治疗肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明任一项所述的融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或本发明任一项所述的重组载体或本发明任一项所述的重组细胞或本发明任一项所述的T细胞的步骤；具体地，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一种或多种。

给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。

在本发明中：

术语“嵌合趋化因子受体”（chimeric chemokines receptors,CCR）是人工改造受体，能够结合胞外相关细胞因子，使免疫细胞向该细胞因子高浓度方向定向迁移。

术语“肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子”是指肿瘤微环境中浓度较高的因子，其由肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生。

术语“VEGF”是指血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，其途径似乎在肿瘤血管生成中发挥了核心作用。VEGF165主要以可溶性胞外形式存在，在各种人类实体肿瘤过表达。不管是在正常还是在病理条件下的血管原生长效应，VEGF都扮演着重要角色。有三种酪氨酸激酶受体与VEGF结合，其中与VEGFR-1的亲和力最高。

术语“FLT1”是指血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growthfactor receptor 1，又称FLT1），其是一种细胞膜受体激酶，主要位于血管内皮细胞上，是与VEGF具有高度亲和力的受体，FLT1参与内皮细胞的生长和血管生成，是血管内皮生长因子(VEGF)促进癌细胞生长发展的传导通路中的一个重要媒介体。血管生成，形成一个新生血管来供应血液，是肿瘤生长和转移的一个特征和基本步骤。

术语“CXCR3”是指趋化因子受体CXCR3，其是G蛋白耦联的七跨膜α螺旋受体结构，选择性的与CXC趋化因子（CXCL9，CXCL10，和CXCL11）结合。CXCR3又称G蛋白耦联受体9(GPR9)和CD183。有两种变异的CXCR3受体。CXCR3-A与CXCL9、CXCL10、CXCL11结合；而CXCR3-B除了与CXCL9、CXCL10、CXCL11结合外还可以与CXCL4结合。

术语“CD28”是最初在PMA刺激所活化的T细胞上发现的，CD28是一种相对分子质量为44kDa的同源二聚体糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，可以表达在95％的CD4+和近50％的CD8+T细胞上。

术语“简并性”是指，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。

术语“T细胞高效迁移的信号域”是指趋化因子受体胞内肽段中，负责在趋化因子受体结合细胞外配体后，活化胞内相关通路，行使促进T细胞定性迁移功能的肽段。

术语“天然受体”是指识别并结合小分子配体的天然肽段，如VEGF的天然受体包括FLT-1，KDR等。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、小鼠、狗、猴、牛、马等。

本发明所述的“高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子”或“高效结合VEGF”是指亲和力常数Kd小于9.9×10^-7mol/L。

发明的有益效果

本发明将具有高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段、跨膜区肽段、具有促使T细胞迁移的趋化因子受体信号域肽段经蛋白linker相连，构成嵌合趋化因子受体。经该趋化因子受体修饰的T细胞，在不削弱其正常的肿瘤杀伤活性的前提下，具有向相应因子高浓度方向迁移的特性，从而能高效到达肿瘤病灶部位，发挥治疗作用，克服了肿瘤过继细胞治疗中，效应细胞无法有效达到肿瘤部位的难题。

在该发明建立的嵌合趋化因子受体基础上，还可以选择性地连接“共刺激信号分子”（Co-stimulating molecule）胞内结构域肽段，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，促进T细胞向肿瘤部位趋化的同时，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。

附图说明

图1：vCCR的结构模式图。SP表示信号肽；FLT1-D2表示FLT1的第2结构域；CD28TM表示或包含CD28跨膜区；L1，L2分别表示Linker1，Linker2;CXCR3-C4表示CXCR3胞内区的C4环区。

图2：vCCR的表达载体结构图（简称pLV120gn-vCCR）。

图3：两个Jurkat细胞阳性克隆（Clone1、Clone2）经PCR鉴定正确结果。各泳道的样品：P，pLV120gn-vCCR质粒（阳性对照）；N，空白对照；J，未修饰的Jurkat细胞（阴性对照）；1，克隆1；2，克隆2；M，DNA Marker。

图4：流式细胞术检测Jurkat细胞阳性克隆（Clone1、Clone2）表面vCCR表达率。A,未修饰的Jurkat细胞；B,vCCR修饰的Jurkat细胞（克隆1）;C,vCCR修饰的Jurkat细胞（克隆2）;

图5：所筛选的Jurkat细胞阳性克隆（Clone1、Clone2）对VEGF的趋化效果。

图6：经vCCR修饰后肿瘤浸润淋巴细胞对肝癌SMMC-7721的杀伤能力。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：vCCR表达框的设计、合成与表达载体的构建

根据构成vCCR各组分的氨基酸序列与编码序列，拼接成整个融合的氨基酸序列与编码DNA表达框，其中构成vCCR的肽段包括：

信号肽的氨基酸残基序列为：

MEFWLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：1)。

信号肽编码序列为：

GAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAA AAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：2)。

Linker1的氨基酸残基序列为:

GGGGGGGGG(SEQ ID NO：3)。

Linker1的编码序列为:

GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT(SEQ ID NO：4)。

Linker2的氨基酸残基序列为：

GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)。

Linker2的编码序列为：

GGTGGCGGAGGCTCCGGAGGTGGAGGCTCT(SEQ ID NO：6)。

FLT1-D2区氨基酸残基序列为:

GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTN YLTHRQT(SEQ ID NO：7)。

FLT1-D2区的编码序列为:

GGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACC(SEQ ID NO：8)。

CD28跨膜区氨基酸残基序列为:

PFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRS(SEQ ID NO：9)。

CD28跨膜区（CD28TM）的编码序列为:

CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGG GTGAGGAGT(SEQ ID NO：10)。

CXCR3-C4氨基酸残基序列为:

GVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRDSSWSETS EASYSGL(SEQ ID NO：11)

CXCR3-C4的编码序列为:

GGGGTCAAGTTCCGGGAGCGGATGTGGATGCTGCTCTTGCGCCTGGGCTGCCCCAACCAGAGAGGGCTCCAGAGGCAGCCATCGTCTTCCCGCCGGGATTCATCCTGGTCTGAGACCTCAG AGGCCTCCTACTCGGGCTTG(SEQ ID NO：12)

vCCR依次由如下部分组成：

信号肽-FLT1D2-Linker1-CD28TM-Linker2-CXCR3C4（见图1），其氨基酸序列如下：

MEFWLSWVFLVAILKGVQCGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSGGGGSGGGGSGVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRDSSWSETSEASYSGL(SEQ ID NO：13)。

vCCR的编码序列为:

ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTGGTGGCGGAGGCTCCGGAGGTGGAGGCTCTGGGGTCAAGTTCCGGGAGCGGATGTGGATGCTGCTCTTGCGCCTGGGCTGCCCCAACCAGAGAGGGCTCCAGAGGCAGCCATCGTCTTCCCGCCGGGATTCATCCTGGTCTGAGACCTCAGAGGCCTCCTACT CGGGCTTGTGATAA(SEQ ID NO：14)。

按vCCR的DNA编码序列(SEQ ID NO：14),委托生工生物工程（上海）有限公司合成其整个表达框，插入pLV120gn载体（Invitrogen）EcoRI-XhoI位点（见图2），转化到E.coli（DH5α），经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。

实施例2：T细胞株的遗传修饰

将实施例1中构建并纯化获得的各重组表达载体的高品质质粒，利用磷酸钙转染法转染至Jurkat（T淋巴细胞株，购自香港大学）。3天后，将转染后的Jurkat细胞转移到具有新霉素的RPMI1640培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。经36天的筛选，分别建立具有新霉素抗性、经vCCR遗传修饰的Jurkat细胞株（Clone1、Clone2）（见图3）。

合成PCR鉴定vCCR表达框的引物：

上游引物5′-TGGCTCTCCTCAAGCGTATT-3′(SEQ ID NO：15)，

下游引物5′-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3′(SEQ ID NO：16)。

预测产物大小为744bp。

按照Biomed细胞基因组DNA快速提取试剂盒(货号：DN0701）说明提取细胞基因组DNA备用。PCR反应条件为：95℃3min；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小与预测相符（见图3）。

实施例3：流式细胞术检测经vCCR遗传修饰的Jurkat细胞株（Clone1、Clone2）的表达率

Jurkat细胞不加抗体按方法处理用于调电压，Jurkat加流式抗体PE用于做对照组，样品组为所筛选Clone1加流式抗体PE、所筛选Clone2加流式抗体PE；细胞计数，调整浓度，取10⁶-10⁷个细胞，1×PBS洗一次；1×PBS洗一次，离心去上清，100μl PBS重悬；加入10μg鼠IgG孵育15分钟；加10μl PE-conjugated anti-FLT1试剂（购自R&D公司），冰上孵育30分钟；每次4ml 1×PBS洗细胞，洗二次；1ml 1×PBS重悬细胞，准备上机检测。

经流式细胞术检测后结果（见图4），所筛选的细胞株Clone1、Clone2均有目的蛋白vCCR的表达，其中Clone1表达率最高：Clone1绿荧光率为99.3%，vCCR表达率为95.3%，Clone2略低；对照细胞Jurkat的FLT1表达率为2.7%，说明vCCR蛋白在所筛选的细胞株Clone1、Clone2中已稳定表达。

实施例4：经vCCR遗传修饰的Jurkat细胞株（Clone1、Clone2）对VEGF的趋化效果

操作按Millipore公司Transwell说明书进行，待测细胞培养生长24小时后用10％血清培养基1640悬浮细胞，计数，调整浓度为5×105cells/ml。在下室（即24孔板底部）加入1.25ml含相应浓度VEGF的10％血清培养基1640，上室加入200μl细胞悬液，将上室置于下室之中，在37℃温箱孵育12h后取出上室，以棉签将残留在上室内表面上的细胞轻轻拭去。上室用PBS洗涤后，迁移上室膜外上的细胞用4%甲醛固定后，再用台盼蓝染色，以PBS清洗，显微镜下（200×）计算迁移细胞数，结果取5个视野细胞计数平均值。

统计结果（见图5），所筛选的细胞株Clone1、Clone2对VEGF均具有很好趋化效果。其中，细胞株Clone1对VEGF的趋化效果显著，当VEGF的浓度为100ng/ml时，趋化效果Clone1是Jurkat细胞的接近4倍。相对于0ng/ml的VEGF浓度，100ng/ml时Clone1对VEGF也有明显趋化效果。

实施例5：肝癌组织来源TIL的分离培养

收集新切除的肝癌标本，立即在无菌条件下进行处理。具体方法如下：去除肝癌标本周围的正常组织和坏死区域，从标本的不同区域取下大小为1-2mm3的小组织块，24孔板的每一孔放置一块。每孔加2mL完全培养基（含10%FBS的GT-T551培养基）和3000IU/mL的IL-2。将24孔板置于37℃，5% CO2培养箱中培养。培养起始后的第5-6天为所有孔进行半量换液。之后，根据肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）生长情况，每隔1-2天进行一次半量换液。一旦孔内TIL长满，且所有贴壁细胞已除去，就将各个长满孔内的TIL收集起来。

随后，1×10⁶TIL重悬于含150mL完全培养基、30ng/mL抗CD3抗体、不少于200倍于TIL的照射过的饲养细胞（来自3个不同健康人的PBMC）和6000IU/mL IL-2的T175培养瓶中，将培养瓶竖直培养。培养至第5天，瓶内65%液体换为新的完全培养基和IL-2。培养至第7天，2个T175培养瓶内的细胞悬液转移至细胞培养袋内，加入300mL完全培养基和IL-2。从第6天开始，每隔1天进行一次台盼蓝染色计数，通过加入新的完全培养基和IL-2控制细胞密度至0.5-2×10⁶/mL。扩增的第14天，收集细胞。

实施例6：肝癌组织来源TIL的遗传修饰

于175-cm²flasks中培养包装细胞293T（购自ATCC，细胞数约为1-2×10⁷），利用Lipofectamine2000（Invitrogen）将纯化后的高品质pLV120gn-vCCR质粒与慢病毒包装辅助质粒（PCMV-delta8.91、PMD.G，Invitrogen）共转染到细胞中。3天后，收集含有病毒颗粒的细胞培养基，以4000g离心10min，收集上清液，并用0.45μm滤器过滤，滤过的液体置于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20分钟，使用500ul冰PBS液重悬病毒沉淀，分别获得携带vCCR表达框的重组慢病毒pLV120-vCCR-IRES-EGFP-neo。随后，分两次（每次100μL）将病毒悬液与2×10⁶的TIL细胞共培养，分别收集感染后的TIL细胞TIL^vCCR。

实施例7：经vCCR遗传修饰的肿瘤浸润淋巴细胞对肝癌细胞株SMMC-7721的体外杀伤能力

按不同的效靶比（50:1，25:1，5:1，1:1），将TIL^vCCR以及未修饰的TIL细胞与SMMC-7721共培养，应用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒（LDH-Cytotoxicity AssayKit，Biovision）检测遗传修饰前后的TIL细胞对SMMC-7721细胞的体外杀伤能力。方法如下：靶细胞铺96孔板（5×10³/孔），设培养基背景、体积校正、靶细胞自发LDH释放、靶细胞最大LDH释放、效应细胞自发LDH释放对照孔，治疗组孔，每组重复3孔，每个孔的终体积相同且不少于100μL。250g离心4min，在37℃，5%CO2孵育至少4h。在离心前45min，向靶细胞最大释放孔加入10×裂解液，体积校正孔加入等量的裂解液。再次离心，从每孔转移50μL上清至新的96孔板中，再加入50μL底物溶液，室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，1h内测定D490。细胞毒性（%）=[（D实验孔-D培养基背景孔）-（D效应细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）-（D靶细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）]/[（D靶细胞最大LDH释放孔-D体积校正孔）-（D靶细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）]×100%。

结果表明，经遗传修饰TIL^vCCR能有效杀伤肝癌细胞SMMC07721，杀伤作用与未经修饰的TIL细胞相当，说明vCCR的修饰未对肿瘤浸润淋巴细胞的杀伤活性造成影响（见图6）。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种分离的融合蛋白，包括：

1)高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段、

2)跨膜区肽段，以及

3)可使T细胞高效迁移的信号域肽段；

其中，

所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段为SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的肽段；

所述跨膜区肽段为选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的任意一种；

所述促使T细胞高效迁移的信号域肽段为氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的肽段；

所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段与所述跨膜区之间、所述跨膜区与所述促使T细胞高效迁移的信号域肽段之间均通过linker连接；所述linker为相同或不同的选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于如下的(1)-(5)项中的任意一项或多项：

(1)所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段为单拷贝或双拷贝；

(2)所述促使T细胞高效迁移的信号域肽段为单拷贝或双拷贝；

(3)所述融合蛋白还包含信号肽；

(4)所述高效结合肿瘤细胞或肿瘤基质细胞分泌产生的因子的肽段、跨膜区和促使T细胞高效迁移的信号域肽段与可选的信号肽之间直接连接或通过linker连接；

(5)所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，第(3)项中，所述信号肽包含SEQ ID NO：1所示的序列。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，第(4)项中，所述linker包含或者为相同或不同的选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的序列。

5.一种多核苷酸，其编码权利要求1至4中任一权利要求所述的融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列或其简并性序列。

7.一种重组载体，其包含权利要求5或6所述的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其中，所述重组载体为重组真核表达载体或重组病毒载体。

9.根据权利要求8所述的重组载体，其中，所述重组病毒载体为重组逆转录病毒载体或重组慢病毒载体。

10.一种重组细胞，其包含权利要求7至9中任一权利要求所述的重组载体。

11.根据权利要求10所述的重组细胞，其中，所述重组细胞为重组T细胞。

12.根据权利要求10所述的重组细胞，其中，所述重组细胞为重组Jurkat E6.1细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。

13.一种重组T细胞，其表达权利要求1至4中任一权利要求所述的融合蛋白。

14.被权利要求5或6所述的多核苷酸或权利要求7至9中任一权利要求所述的重组载体遗传修饰的T细胞。

15.根据权利要求14所述的T细胞，其为遗传修饰的Jurkat E6.1细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。

16.根据权利要求14所述的T细胞，其中，所述遗传修饰为基因枪法、转染或电转。

17.根据权利要求14所述的T细胞，其中，所述遗传修饰为病毒转导。

18.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1至4中任一权利要求所述的融合蛋白或权利要求5或6所述的多核苷酸或权利要求7至9中任一权利要求所述的重组载体或权利要求10至12中任一权利要求所述的重组细胞或权利要求13至17中任一权利要求所述的T细胞。

19.根据权利要求18所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。

20.根据权利要求18所述的组合物，其还包含药学上可接受的辅料。

21.权利要求1至4中任一权利要求所述的融合蛋白或权利要求5或6所述的多核苷酸或权利要求7至9中任一权利要求所述的重组载体或权利要求10至12中任一权利要求所述的重组细胞或权利要求13至17中任一权利要求所述的T细胞在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一种或多种。