CN113322238B - 表达趋化因子受体的具有实体肿瘤定向趋化能力的单核细胞和巨噬细胞、及其制备和应用 - Google Patents

表达趋化因子受体的具有实体肿瘤定向趋化能力的单核细胞和巨噬细胞、及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达趋化因子受体的具有实体肿瘤定向趋化能力的单核细胞和巨噬细胞、及其制备和应用，涉及生物技术领域。本发明提供了一种巨噬细胞，该巨噬细胞过表达趋化因子受体，具有向实体肿瘤趋化迁移的能力以及显著的向肿瘤趋化迁移和浸润的效果，能够提高过继移植巨噬细胞的特异性杀伤效率和利用率，降低对正常组织的非特异性免疫攻击。本发明提供了一种巨噬细胞的制备方法，包括构建含有趋化因子受体基因的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将趋化因子受体基因整合到多能干细胞或者单核巨噬细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞，该巨噬细胞能够长期稳定的过表达趋化因子受体。

Description

表达趋化因子受体的具有实体肿瘤定向趋化能力的单核细胞 和巨噬细胞、及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种表达趋化因子受体的具有实体肿瘤定向趋化能力的单核细胞和巨噬细胞、及其制备和应用。
背景技术
CAR-T是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，在血液肿瘤中起到了较好的治疗效果，但由于受到脱靶效应和肿瘤微环境抑制因素的影响，其在各类实体瘤的治疗中仍不理想。因此针对实体肿瘤的免疫治疗急需找到更加有效和安全的替代者。Macrophage由于在过继性免疫系统和先天性免疫系统的相互作用中起着核心作用，且具备较强的可塑性和在肿瘤组织中长时间驻存等方面的特性，正在成为实体肿瘤免疫细胞治疗的新选择。另外，已有研究试图通过颅内注射的方式将CAR-T等免疫细胞输送到肿瘤灶，以期达到治疗的目的。然而该方法可操作性较差。因此，针对胶质母细胞瘤(GBM)等实体肿瘤的治疗探索出一种新的递送过继移植Macrophage的方式就成了肿瘤免疫细胞治疗的关键。
在实体肿瘤免疫细胞治疗的过程中，过继移植免疫细胞的有效递送和对肿瘤组织的浸润是制约治疗效果的关键。例如，胶质母细胞瘤(GBM)位于机体大脑内部，受到血脑屏障和细胞外致密的基质的阻扰，传统的过继移植免疫细胞往往很难递送到肿瘤病发灶。因此开发出过继免疫细胞新的递送方式就成为包括脑癌在内的实体肿瘤治疗的关键一环。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种巨噬细胞，该巨噬细胞具有向实体肿瘤组织趋化迁移的能力，能够提高继移植巨噬细胞的特异性杀伤效率和利用率，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种巨噬细胞的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种多能干细胞。
本发明的第四目的在于提供一种单核巨噬细胞。
本发明的第五目的在于提供一种单核细胞。
本发明的第六目的在于提供一种巨噬细胞、多能干细胞或单核巨噬细胞在制备用于治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明的第七目的在于提供一种用于治疗肿瘤的产品。
第一方面，本发明提供了一种巨噬细胞，所述巨噬细胞过表达趋化因子受体。
作为进一步技术方案，所述趋化因子受体包括CCR2B、CCR5、CCR9、CX3CR3、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CCR1、CCR3、CCR4、CCR6、CCR7、CCR8、CCR10、XCR1、CXCR3、CXCR5或CXCR6中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述巨噬细胞由多能干细胞、单核细胞或者单核巨噬细胞分化得到。
作为进一步技术方案，所述多能干细胞、单核细胞和单核巨噬细胞含有编码所述趋化因子受体的基因。
第二方面，本发明提供了一种巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：构建含有趋化因子受体基因的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将趋化因子受体基因整合到多能干细胞或者单核巨噬细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞；
优选地，所述多能干细胞先诱导分化为单核细胞，再分化得到巨噬细胞。
第三方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的多能干细胞，所述多能干细胞含有编码所述趋化因子受体的基因。
第四方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的单核巨噬细胞，所述单核巨噬细胞含有编码所述趋化因子受体的基因。
第五方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的单核细胞，所述单核细胞含有编码所述趋化因子受体的基因；
所述单核细胞由多能干细胞分化得到。
第六方面，本发明提供了一种巨噬细胞、多能干细胞、单核巨噬细胞或单核细胞在制备用于治疗肿瘤的产品中的应用；
优选地，所述肿瘤包括胶质母细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、恶性胶质瘤、恶性纤维组织细胞瘤或肺癌。
第七方面，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的产品，所述产品包括上述巨噬细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
经发明人研究发现，成熟的巨噬细胞中趋化因子受体的表达水平显著下调，不具备向实体肿瘤迁移的能力，将趋化因子受体过表达在巨噬细胞中后，赋予了该巨噬细胞向实体肿瘤趋化迁移的能力，基于此，本发明提供一种巨噬细胞，该巨噬细胞过表达趋化因子受体，具有向实体肿瘤趋化迁移的能力以及显著的向肿瘤浸润的效果，能够提高过继移植巨噬细胞的特异性杀伤效率和利用率，降低对正常组织的非特异性免疫攻击。
经发明人研究发现，直接在巨噬细胞中引入基因存在效率低和基因持续表达的时间短的问题，而采用慢病毒表达体系导入目的基因制备得到的巨噬细胞可以实现100％的细胞表达此基因，导入基因的转化效率高，且可长期稳定表达。基于此，本发明提供了一种巨噬细胞的制备方法，包括构建含有趋化因子受体基因的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将趋化因子受体基因整合到多能干细胞或者单核巨噬细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞，该巨噬细胞能够长期稳定的过表达趋化因子受体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的趋化因子CCL2在不同实体肿瘤中的分泌情况；
图2为本发明实施例2提供的iMAC在GBM小鼠模型中的分布情况，箭头指示肿瘤部位；
图3为本发明实施例3提供的CCR2B-tMAC和WT-tMAC中CCR2B的表达情况；
图4为本发明实施例4提供的CCR2B-tMAC和WT-tMAC向GBM细胞系U87MG趋化的能力；
图5为本发明实施例5提供的CCR2B-iMAC和WT-iMAC向GBM细胞系U87MG趋化的能力；
图6为本发明实施例6提供的GBM小鼠模型中检测CCR2B-iMAC向GBM趋化迁移的能力。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本申请中，术语“巨噬细胞(Macrophage)”通常是指一种由单核细胞(Monocyte)穿出血管后发育而来的髓样免疫细胞，广泛分布于机体组织的各个脏器中。其在正常组织中的主要生理作用是：通过加工和呈递抗原的方式介导特异性免疫反应；以固定细胞或游离细胞的形式吞噬并降解坏死细胞、碎片和异物，继而参与机体内非特异性反应；通过分泌炎症因子激活淋巴球或其他免疫细胞，进而协调炎症过程。
在本申请中，术语“趋化因子(chemokines)”通常是指一类由细胞分泌的小分子细胞因子或信号蛋白。具有诱导表达相应趋化因子受体的免疫细胞向分泌部位定向趋化的能力。根据成熟肽N端半胱氨酸残基的排列，趋化因子被分为CXC、C-C、CX3C和XC四个主要亚家族。研究发现各类肿瘤细胞可分泌不同种类的趋化因子。
在本申请中，术语“单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1/CCL2)”通常是指属于C-C趋化因子亚家族的成员，是调节Monocyte/Macrophage迁移的关键趋化因子之一。该因子可由多种类型的细胞分泌，如M1型Macrophage，包括胶质母细胞瘤在内的多种肿瘤细胞等。
在本申请中，术语“C-C亚家族趋化因子受体2(C-C chemokine receptors2,CCR2)”通常是指隶属于一类可识别胞外趋化因子的蛋白受体家族。根据羧基末端的不同，CCR2可形成CCR2A和CCR2B两种剪切体形式。其中CCR2B约占细胞膜表面CCR2表达量的90％。CCR2B通常表达在Monocyte和自然杀伤细胞(NK)的膜表面。然而，随着Monocyte向Macrophage分化，其表达水平显著下调。该受体可通过识别MCP-1/CCL2，继而将Monocyte募集到炎症和肿瘤部位。
在本申请中，术语“诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)”通常是指是通过在成体细胞中转入多能性因子继而起始基因组表达谱重新编程得到的具有分化为多种细胞潜能的多能性干细胞。
在本申请中，术语“iMAC”通常是指由iPSC诱导分化而来的Macrophage。
在本申请中，术语“单核巨噬细胞(THP1)”通常是指一种来源于急性单核细胞白血病，具有吞噬功能，缺乏表面和细胞质免疫球蛋白的单核肿瘤细胞。该细胞具有诱导分化为Macrophage的潜能。
在本申请中，术语“tMAC”通常是指由THP1诱导分化而来的Macrophage。
在本申请中，术语“T淋巴细胞(T lymphocyte)”简称T细胞，通常是指来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身免疫器官和组织中发挥免疫功能。T细胞可分为细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,Tc)、辅助性T细胞(Helper T cells,Th)、抑制性T细胞(Suppressor T cells,Ts)、效应T细胞(Effector Tcells,Te)、记忆T细胞(Memory T cell,Tm)等亚群。
在本申请中，术语“单核细胞”是指由骨髓中的造血干细胞分化而来，并在骨髓中发育的细胞。可进一步分化为成熟的巨噬细胞和树突状细胞的。单核细胞具有明显的变形运动的特点，具有吞噬和清除受伤、衰老的细胞及其碎片的能力。此外，单核细胞还参与免疫反应，将吞噬抗原后所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，继而诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应。单核细胞还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。
肿瘤细胞通过表达各类趋化因子来招募血液中的Monocyte、骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)等白细胞，进而促进肿瘤的进一步恶化并向外迁移。例如，包括前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、恶性胶质瘤、恶性纤维组织细胞瘤和肺癌在内的实体肿瘤细胞可分泌趋化因子CCL2。该趋化因子可引导表达其受体CCR2B的Monocyte向胶质母细胞瘤等实体肿瘤组织浸润，继而分化为具有促癌功能的M2型Macrophage。因此利用CCL2/CCR2B信号轴引导免疫细胞向肿瘤定向迁移是实现过继移植免疫细胞有效递送的可行策略。
发明人的研究发现CCR2B在由iPSC诱导分化而来的iMAC中低表达。同时iMAC在小鼠肿瘤模型中不具备向实体肿瘤组织定向迁移的能力。这提示我们通过基因工程化手段在过继移植的iMAC/Macrophage中过表达CCR2B将有利于其向包括胶质母细胞瘤在内的实体肿瘤定向迁移和浸润。这一策略有望实现通过患者静脉注射过继移植iMAC/Macrophage进而治疗实体瘤的目的，并提高治疗效率。据此，提出以下发明。
第一方面，本发明提供了一种巨噬细胞，所述巨噬细胞过表达趋化因子受体。该巨噬细胞具有向实体肿瘤趋化迁移的能力，能够提高过继移植巨噬细胞的特异性杀伤效率和利用率，降低对正常组织的非特异性免疫攻击。
在一些实施方式中，所述趋化因子受体包括但不限于CCR2B、CCR5、CCR9、CX3CR3、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CCR1、CCR3、CCR4、CCR6、CCR7、CCR8、CCR10、XCR1、CXCR3、CXCR5或CXCR6中的至少一种。
通过将与肿瘤分泌趋化因子相对应的受体在巨噬细胞中高表达，以提高巨噬细胞向肿瘤组织趋化的能力。
在一些实施方式中，所述巨噬细胞由多能干细胞、单核细胞或者单核巨噬细胞分化得到。多能干细胞、单核细胞或者单核巨噬细胞经过诱导能够分化得到巨噬细胞。
在一些实施方式中，所述多能干细胞、单核细胞和单核巨噬细胞含有编码所述趋化因子受体的基因。
第二方面，本发明提供了一种巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：构建含有趋化因子受体基因的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将趋化因子受体基因整合到多能干细胞或者单核巨噬细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞；
优选地，所述多能干细胞先诱导分化为单核细胞，再分化得到巨噬细胞。
通过慢病毒表达体系将识别实体肿瘤细胞分泌的趋化因子CCL2的受体CCR2B稳定表达在过继移植iMAC/Macrophage中的策略可以赋予该免疫细胞在临床治疗中三个方面的能力：1显著提高其向GBM等可分泌趋化因子的实体肿瘤趋化和迁移的能力，从而增强对肿瘤细胞的特异性杀伤效果；2最大限度的减少过继移植iMAC/Macrophage因无法向病灶迁移而在机体正常组织(如肝脏)的堆积，进而降低对正常组织的非特异性免疫攻击；3提高过继移植iMAC/Macrophage的利用率。
第三方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的多能干细胞，所述多能干细胞含有编码所述趋化因子受体的基因。
第四方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的单核巨噬细胞，所述单核巨噬细胞含有编码所述趋化因子受体的基因。
第五方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的单核细胞，所述单核细胞含有编码所述趋化因子受体的基因；
所述单核细胞由多能干细胞分化得到。
第六方面，本发明提供了一种巨噬细胞、多能干细胞或单核巨噬细胞在制备用于治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明提供的巨噬细胞具有向实体肿瘤趋化迁移的能力，能够提高过继移植巨噬细胞的特异性杀伤效率和利用率，降低对正常组织的非特异性免疫攻击。而多能干细胞或单核巨噬细胞能够分化得到上述巨噬细胞，因此，巨噬细胞、多能干细胞或单核巨噬细胞能够用于治疗肿瘤产品的制备。
在一些实施方式中，所述肿瘤包括但不限于胶质母细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、恶性胶质瘤、恶性纤维组织细胞瘤或肺癌，或者本领域技术人员所熟知的其他具有分泌趋化因子功能的其他肿瘤。
第七方面，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的产品，所述产品包括上述巨噬细胞。
本发明提供的巨噬细胞具有向实体肿瘤趋化迁移的能力，能够提高过继移植巨噬细胞的特异性杀伤效率和利用率，降低对正常组织的非特异性免疫攻击。因此，包含该巨噬细胞的产品也具有治疗肿瘤的作用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
以下实施例以趋化因子CCL2和趋化因子受体CCR2B为例进行阐述。
实施例1不同实体肿瘤细胞中趋化因子CCL2的分泌情况
对来源于肿瘤细胞数据库CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)的数据进行分析，结果显示，包括GBM、间皮细胞瘤和肾癌在内的实体肿瘤分泌较高水平的趋化因子CCL2。
进一步对该数据库进行数据挖掘和比对，结果如图1中的A所示，发现GBM分泌的CCL2的水平显著高于大脑正常组织。
体外培养GBM细胞系(U87MG、U251和LN229)、卵巢癌细胞系(OVCAR8和HO-8910)和血液单核巨噬细胞(THP1)，分别对上述细胞进行ELISA实验，结果如图1中的B所示，可以看出，GBM细胞系(U87MG、U251和LN229)高表达趋化因子CCL2，且其表达水平显著高于卵巢癌细胞系(OVCAR8和HO-8910)，以及血液单核巨噬细胞(THP1)。因此，本发明选择高表达趋化因子CCL2的GBM细胞系进行研究。
上述ELISA实验步骤如下：
1、分别将相同细胞数量的U87MG、U251、LN229、SH-SY-5Y、OVCAR8、HO-8910、THP1和HEK293T细胞以2ml体积的培养接种到六孔板的一个孔中。37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时后，分别收集培养基上清。
2、将第1步中不同种类细胞培养基上清各100ul，以及标准品工作液100ul加入到购买于Elabscience并已经包被好CCL2捕获抗体的酶标板的相应孔中。加上覆膜，37℃孵育90分钟。
3、弃去步骤2中酶标板中的液体，每个样品孔中加入100ul生物化抗体工作液。加上覆膜，37℃孵育60分钟。
4、弃去酶标板中的液体，用350ul洗涤液清洗3次。用力甩干液体。
5、每个样品孔中加入100ul HRP酶结合工作液。加上覆膜，37℃孵育30分钟。
6、弃去酶标板中的液体，用350ul洗涤液清洗5次。用力甩干液体。
7、每个空中加入90ulTMB底物溶液，加上覆膜，避光，37℃孵育10-15分钟。
8、每个孔加入50ul终止液，并立即用酶标仪在450nm波长条件下测量各孔的光密度(OD值)。
9、对照标准品数值，计算各孔样品中CCL2的数值，该结果即是本实验中不同细胞CCL2的分泌水平。
实施例2
在免疫缺陷型的NSG小鼠腹侧皮下注射1×106个带有荧光素酶(Luciferase)基因的U87MG细胞。成瘤后，通过尾静分别注射1×106个带有荧光染料的iMAC和T淋巴细胞。5天后通过小鼠活体成像显示，iMAC与不表达趋化因子受体CCR2B的T淋巴细胞均集中在了小鼠肝脏部位，均不具备向GBM部位迁移的能力(图2)。
实施例3
构建稳定表达CCR2B的体外诱导CCR2B-iMAC和CCR2B-tMAC。
1)构建CCR2B慢病毒表达体系
从NCBI中获取CCR2B基因的编码序列，并通过分子克隆将其克隆到慢病毒表达载体Lenti-EF1A-T2A-EGFP-Puro中。最后借助HEK293T细胞包装成含有CCR2B基因表达原件的慢病毒颗粒。
2)iPSC和THP1细胞中稳定表达CCR2B，并分别诱导分化为CCR2B-iMAC和CCR2B-tMAC
利用慢病毒系统将CCR2B基因整合到iPSC和THP1细胞中。通过挑取单细胞克隆和基因测序技术得到稳定整合CCR2B基因的细胞系。
将整合了CCR2B的iPSC和THP1细胞分别诱导分化为CCR2B-iMAC和CCR2B-tMAC。以整合了CCR2B的iPSC诱导分化为CCR2B-iMAC为例，实验方法包括如下步骤：
1.拟胚体(EB)形成(第0天)。当iPSC培养到覆盖培养皿的60-80％的面积的时候，利用versene将其消化成单个细胞或较小的细胞聚集块儿。600rpm/3min离心后，用含有Y-27632的mTeSR1培养基重悬，并以1:2或1：3的比例接种到低吸附六孔板中。于37℃/5％CO2培养箱中，摇床培养约24小时。便可形成EB。
2.原条和中胚层诱导(第1天)。去除步骤1中培养EB的培养基。加入MI培养基(APELII medium+10ng/mL BMP4+5ng/mL bFGF)。继续以步骤1的条件培养24小时。
3.造血干细胞(HSC)诱导(第2-7天)。去除步骤2中的MI培养基。加入HS培养基(APEL II medium+10ng/mL BMP4+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mL SCF)。以步骤1的条件继续培养。
4.髓系细胞和单核前体细胞(MPC)扩增(第8-10天)。去除步骤3中的HS培养基。加入ME-1培养基(APEL II medium+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mL SCF+10ng/mLIGF1+25ng/mL IL-3+50ng/mL M-CSF+50ng/mL GM-CSF)。以步骤1的条件继续培养。
5.单核细胞(iMONO)的诱导(约第11天)。将步骤4中的EB转移到基质胶(Matrigel)包被的六孔板中。加入ME-2培养基(StemSpan-XF medium+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mL SCF+10ng/mL IGF1+25ng/mL IL-3+50ng/mL M-CSF+50ng/mL GM-CSF),于37℃/5％CO2培养箱中静置培养。在这个时间段里面会有呈单个细胞状态的iMONO不断的漂浮在培养基中。换液并离心收集iMONO。
6.iMAC的成熟(约第17天)。将步骤5中收集到的iMONO收集到新的Matrigel包被的六孔板中。加入MM培养基(StemSpan-XF medium+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mLSCF+10ng/mL IGF1+25ng/mL IL-3+100ng/mL M-CSF+100ng/mL GM-CSF),于37℃/5％CO2培养箱中静置培养。这个时间段里面会看到体积较小的iMONO向体积较大并呈空泡状的iMAC成熟。
7.iMAC的M1极化。收集步骤6中成熟的iMAC，加入含有100ng/ml LPS和100ng/mlIFN-γ的MS培养基(RPMI1640+100ng/mL M-CSF+100ng/mL GM-CSF)，大约24小时便可得到极化的iMAC。
分别对CCR2B-tMAC和野生型tMAC(WT-tMAC)进行QPCR(图3中的A)和WB(图3中的B)实验(β-ACT为内参)，QPCR显示CCR2B基因的转录水平在CCR2B-tMAC中显著表达；WesternBlotting实验进一步证明CCR2B蛋白在CCR2B-tMAC中稳定表达。
实施例4
利用绿色荧光染料DiR分别对CCR2B-tMAC和WT-tMAC进行染色，而后通过Transwell实验检测该两种细胞向表达tdTomato红色荧光蛋白的U87GM细胞迁移的能力。分别设置2h、4h、8h三个时间点。结果如图4所示，从图4中的A中可以看出，在2h、4h、8h三个不同时间点成像表明CCR2B-tMAC(GFP)相对于WT-tMAC(GFP)具有显著的向U87MG(tdTomato)趋化的效果。图4中的B统计了三个连续不同时间点向U87MG迁移的tMAC的数量，进一步表明随着时间的推移，CCR2B显著增强了tMAC向肿瘤趋化的能力。结果表明CCR2B-tMAC相对于WT-tMAC具有向U87MG细胞显著趋化的能力。
实施例5
利用绿色荧光染料DiR分别对CCR2B-iMAC和WT-iMAC进行染色，而后通过Transwell实验检测CCR2B-iMAC向表达tdTomato红色荧光蛋白的U87GM细胞迁移的效果。在迁移实验进行到24h时分别对实验组和对照组成像(图5中的A)，并统计分析向U87MG细胞迁移的CCR2B-iMAC和WT-iMAC细胞数量(图5中的B)，结果显示在U87MG(tdTomato)培养环境中迁移的CCR2B-iMAC(GFP)细胞数量显著高于WT-iMAC(GFP)细胞数量，结果表明，CCR2B显著增强了iMAC向U87MG细胞趋化的能力(图5)。
实施例6
1)建立GBM小鼠模型
利用慢病毒表达质粒pCDH-EF1α-Luc2-T2A-tdTomato将荧光素酶和红色荧光蛋白tdTomato稳定整合到U87MG细胞中，通过筛选红色荧光阳性克隆得到稳定整合的U87MG细胞系。将约1×106个该U87MG细胞注射到NSG小鼠腹腔皮下和颅内。约一周后能看到明显的皮下凸起。通过注射荧光素Lucferin检测到小鼠颅内和皮下明显的生物素发光即说明颅内肿瘤模型和皮下肿瘤模型构建完成。
2)体内趋化能力的检验
通过小鼠尾静脉分别向GBM小鼠皮下模型注射DiR染料标记的CCR2B-iMAC和不表达CCR2B的WT-iMAC。注射一天后通过活体成像系统观察DiR染料标记的CCR2B-iMAC和WT-iMAC在小鼠体内的分布情况。并分离肿瘤组织块、肝脏和脾脏，进行成像，以表征DiR染料标记的CCR2B-iMAC和WT-iMAC在具体的器官和组织中的分布，进一步证明CCR2B-iMAC相对于WT-iMAC向GBM趋化迁移的能力的提升情况。另外，我们拟后期对GBM小鼠颅内模型注射DiR染料标记的CCR2B-iMAC和WT-iMAC，以检测CCR2B-iMAC相对于WT-iMAC穿透血脑屏障并向颅内GBM趋化迁移的能力。同时我们还将通过流式分选和免疫组化技术分析CCR2B-iMAC在肿瘤组织和不同脏器中的浸润情况。
3)实验结果
在4-6周龄的NSG小鼠中通过皮下注射1×106个过表达了荧光素酶(Luciferase)基因的U87MG细胞。在第七天成瘤后，通过尾静脉分别向不同个体的GBM小鼠注射1×106个DiR标记的WT-iMAC，1×106个DiR标记的CCR2B-iMAC，以及等体积的PBS。24小时后，通过活体成像系统观测WT-iMAC和CCR2B-iMAC向GBM迁移的情况。从图6中的A中可以看出，WT-iMAC(DiR)集中在了小鼠肝脏部位，而CCR2B-iMAC(DiR)具有显著的向GBM组织(Luc)趋化的能力。GBM小鼠模型中分别通过尾静脉注射PBS、WT-iMAC和CCR2B-iMAC约30天后，分别获取GBM(1)、脾脏(2)和肝脏(3)，并检测WT-iMAC和CCR2B-iMAC的信号(图6中的B)。结果表明注射30天后CCR2B-iMAC依然能够存在于GBM部位。因此，WT-iMAC不具备向GBM浸润的能力，而CCR2B-iMAC展现出显著的向GBM浸润的效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞过表达趋化因子受体；
所述趋化因子受体为CCR2B；
所述巨噬细胞的制备方法包括如下步骤：构建含有趋化因子受体基因的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将趋化因子受体基因整合到诱导多能干细胞或者单核巨噬细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞，其特征在于，所述诱导多能干细胞先诱导分化为单核细胞，再分化得到巨噬细胞。
3.权利要求1-2任一项所述巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建含有趋化因子受体基因CCR2B的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将趋化因子受体基因整合到诱导多能干细胞或者单核巨噬细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞。
4.权利要求1-2任一项所述的巨噬细胞在制备用于治疗肿瘤的产品中的应用；
所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
5.一种用于治疗胶质母细胞瘤的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-2任一项所述的巨噬细胞。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1872879B (zh) * 2006-06-29 2011-09-14 孙晗笑 来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的cxcr4受体拮抗活性多肽及其应用
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CN103993028A (zh) * 2014-05-18 2014-08-20 浙江大学 非病毒载体与cxcr4质粒的复合物及其制备方法和应用
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CN109082411B (zh) * 2018-09-07 2022-06-07 赛元生物科技(杭州)有限公司 一种通过多能干细胞分化获得具有吞噬功能的巨噬细胞的方法
CN109402175B (zh) * 2018-09-20 2022-03-22 博品(上海)生物医药科技有限公司 表达趋化因子受体ccr2b的脂肪干细胞及制备方法与应用
CN109266618B (zh) * 2018-10-18 2021-04-23 赛元生物科技(杭州)有限公司 能够靶向肿瘤细胞的巨噬细胞及其制备方法
CN113214408B (zh) * 2021-04-30 2022-12-27 清华大学深圳国际研究生院 一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途

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