JP2003524407A

JP2003524407A - 多能性前−間葉、前−造血先祖幹細胞の同定

Info

Publication number: JP2003524407A
Application number: JP2001511158A
Authority: JP
Inventors: アーリンダエムゴードン; フレデリックエルホール
Original assignee: ユニバーシティオブサザンカリフォルニア
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2003-08-19
Also published as: US7795023B2; US20110052670A1; WO2001005944A9; NZ516738A; DE60040292D1; US20030157078A1; EP1200555A4; CA2379683A1; AU6231500A; WO2001005944A1; IL147722A0; ATE408667T1; EP1200555B1; AU759643B2; EP1200555A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、多能性前−間葉、前−造血幹細胞の同定のための分子マーカーを提供する。更に、本発明はその分子マーカーで同定される原始的先祖細胞を提供する。それらの細胞は間葉細胞および造血細胞の両表現型に分化する能力を有し、誘導性の増殖因子やサイトカインに対する増殖反応性、およびそれらの形態学的および細胞化学的な性質によって同定される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願との参照本出願は、１９９９年７月２０日に受理された米国仮出願定期刊行、番号６０
／１４４，７８６の優先権を主張し、その開示はここに参照することにより含ま
れる。

【０００２】

【発明の属する技術分野】

本発明は、サイトカイン−反応性の幹細胞の単離および同定、特に、特有な分
子マーカーを発現する多能性前−間葉、前−造血先祖細胞およびそれらの細胞の
同定法に関する。

【０００３】

【従来の技術】

骨髄からの原始的な先祖細胞は、それらの自己再生能力、多系統分化、および
明らかな体組織への関与（Ｆｅｌｌａｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：１５
２８，１９９８年）により、細胞−基礎治療の有用なターゲットである。有力
な議論により骨髄には組織発生的に異なる３種の細胞系が定義されている：造血
細胞、内皮細胞、および間質細胞である。しかし、これは分娩後の哺乳動物に共
通の前駆体があることを意味するものではない（Ｗａｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，
８５：２４２，１９９５年）。造血幹細胞は広範囲に研究され、それらの
系統図および分化経路は、先祖細胞が、赤血球系、骨髄系、およびリンパ球系の
表現型に分化するように多くの細胞表面マーカーにより定義されている（Ｂｅｒ
ｔｏｌｉｎｉら、ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ，２４：３５０，１９９７）。
造血幹細胞は、モノクローナル抗体のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびＲｈｏ
ｄａｍｉｎｅ１２３を用いたフローサイトケミストリーによって精製が可能で
ある。また、サイトカインおよび増殖因子の存在下での長期の骨髄培養において
、非付着細胞として維持することが可能である。逆に、骨髄間質細胞は、長期の
ｉｎｖｉｔｒｏ骨髄培養において付着性の細胞層を形成し、骨格の線維性−骨
形成性組織の基になる細胞系を産生する間葉細胞起源の細胞から成り立っている
。これは、微小造血環境を支持している間質組織の場合と同様である。骨髄間質
細胞は、操作上間葉幹細胞（ＭＳＣ）と呼ばれるが、密度勾配遠心および付着性
によって単離され、線維形成性、骨形成性、軟骨形成性、および脂質生成性能力
を含む、明らかな表現型の可塑性を有している（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２８４：１４３，１９９９年）。危機的状況に対するｉｎｖ
ｉｖｏの緊急予備として働くならば、ＭＳＣの多能力は、自己細胞−基礎治療お
よび／あるいはｅｘｖｉｖｏ遺伝子治療の発達に有利な治療に利用することが
可能である。

【０００４】改変法は、緊迫生存条件下での間葉先祖細胞の単離法として発達した（Ｇｏｒ
ｄｏｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，８：１３８５，１９９７
年）。この技術は、低血清条件下で、コラーゲンマトリックスあるいは遺伝子的
に加工した増殖因子を植え付けたゲル、即ち、補助のコラーゲン結合ドメインを
含有しているＴＧＦｂ溶融タンパク上での骨髄−由来細胞の培養を含む。

【０００５】興味深いことに、コラーゲンマトリックスへのＴＧＦｂ１の結合は生物学的な
半減期を延長させ、従って、ＴＧＦｂ１−反応性間葉先祖細胞の単離と増殖を可
能にした。このＴＧＦｂ１への生理学的反応は、これら骨細胞の捕捉（即ち、生
存）に必要かつ十分であった。さもなければ、これらの骨細胞は、その大きさ、
密度、付着性、あるいは細胞表面マーカーを基準にしては、造血細胞か他の間葉
細胞のどちらかから物理的に分離することはできない。ＴＧＦｂ１−反応性細胞
は、血清再構成下で容易に増殖し、ＴＧＦｂ１−ｖＷＦを植え付けたコラーゲン
ゲル内に区別し得るコロニーを形成する。これらの細胞の形態は、初期には骨細
胞様で、球状かつ非付着性で、線維芽細胞様ではない。しかし、増殖性細胞は、
線維芽細胞、軟骨形成細胞および／あるいは骨形成細胞への明らかな細胞質分化
能があり、間葉細胞前駆体であることを示している。ラット皮下モデルにおける
骨チャンバーに置くと、ＴＧＦｂ１−反応性間葉先祖細胞は、ｉｎｖｉｖｏで
骨と供に軟骨を形成する。一方、骨形態発生タンパク（ＢＭＰ）−捕捉幹細胞は
、増殖性が少なく分化能の高いｉｎｖｉｖｏ骨形成細胞表現型を有している（
Ａｎｄｒａｄｅｓら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，２５０：４８５，
１９９７年）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】

間葉あるいは造血幹細胞の基となり得る先祖細胞を同定および単離する必要が
ある。更に、これらの先祖細胞が細胞集団の中にあった場合、これらの先祖細胞
を同定する方法も必要になる。これらの細胞の同定、および同定するための方法
は、細胞生物学および遺伝子治療プロトコールに対して明らかに関連する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】

本発明は、前−間葉、前−造血幹細胞の同定のための分子マーカーを提供する
。更に、本発明はその分子マーカーで同定される原始的先祖細胞を提供する。そ
れらの細胞は間葉細胞および造血細胞の両表現型に分化する能力を有するが、こ
れは細胞の分子マ−カ−発現、誘導性の増殖因子やサイトカインに対する増殖反
応性、および形態学的かつ細胞化学的な性質によって同定される。

【０００８】このように、一実施例において本発明は、単離した多能性前−間葉、前−造血
先祖幹細胞を提供する。一面において、本発明の細胞は更にＯｓｆ２遺伝子発現
産物を含む。もう一つの面では、細胞は細胞増殖修飾因子に対して反応する。更
には、細胞は骨髄組織に由来する。

【０００９】もう一つの観点において、本発明は、治療的に有効な量の多能性前−間葉、前
−造血先祖幹細胞を含有する医薬品組成、および医薬的に可能な担体あるいは賦
型剤を含有する医薬品組成を提供する。

【００１０】もう一つの観点において、本発明は、患者の結合組織に関連した異常を軽減す
る方法で、医薬的に可能な担体中に治療的に有効な量の単離した多能性前−間葉
、前−造血幹細胞を患者に投与する方法を提供する。

【００１１】更にもう一つの観点において、本発明は、患者の血液組織に関連した異常を軽
減する方法で、医薬的に可能な担体中に治療的に有効な量の多能性前−間葉、前
−造血幹細胞を患者に投与する方法を提供する。

【００１２】もう一つの観点において、本発明は、患者の骨髄組織再生を促進する方法で、
治療的に有効な量の多能性前−間葉、前−造血幹細胞を患者に投与し、その細胞
が患者の骨髄組織再生を促進する方法を提供する。

【００１３】もう一つの実施例では、本発明は、動物種から細胞集団を採取すること；その
細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養させること；その細胞に骨芽細胞特異的因子２（
Ｏｓｆ２）の発現を誘導する細胞増殖調節剤を接触すること；および骨芽細胞特
異的因子（Ｏｓｆ２）を発現する前−間葉、前−造血幹細胞を同定することによ
って、その細胞集団から前−間葉、前−造血幹細胞を同定する方法を提供する。
もう一つの面では、Ｏｓｆ２発現はＯｓｆ２ポリペプチドを検出することでモニ
ターされる。

【００１４】更なる観点で、本発明は、本発明の方法により同定される前−間葉、前−造血
幹細胞を提供する。

【００１５】もう一つの面では、本発明は、動物種から細胞集団を採取すること；その細胞
をｉｎｖｉｔｒｏで培養すること；その細胞にＯｓｆ２の発現を誘導する細胞
増殖調節剤を接触させること；Ｏｓｆ２調節部位と操作可能なように関連した検
出可能なマーカーをコードしている核酸配列からなる遺伝子構造を誘導すること
；および検出可能なマーカー（この発現は前−間葉、前−造血幹細胞を示してい
る）を発現する細胞を同定することによって、その細胞集団から前−間葉、前−
造血幹細胞を同定する方法を提供する。

【００１６】もう一つの例で、本発明は、前−間葉、前−造血幹細胞を同定するのに有用な
キットで、コラーゲン結合ドメインと細胞増殖調節剤から成る溶融ポリペプチド
を含む最初の容器以下；およびＯｓｆ２−特異的プローブを含む二番目の容器で
ある、２つないしそれ以上の容器からなるキットを提供する。もう一つの面では
、Ｏｓｆ２−特異的なプローブはＯｓｆ２ＲＮＡに結合する。更に、Ｏｓｆ２
−特異的プローブはＯｓｆ２ポリペプチドに結合する。

【００１７】本発明の一つないしそれ以上の実施例の詳細が、以下の図および説明により明
らかにされる。本発明の他の特徴、目的、および優位性は、説明や図により、ま
た請求項により明らかになるであろう。

【００１８】

【発明の実施の形態】

本発明は、間葉または造血幹細胞から原始的な前−間葉、前−造血先祖幹細胞
を区別するのに有用な分子マーカーを提供する。そのような分子マーカーは、原
始的前−間葉前−造血幹細胞を同定するのに有用である。本発明は、さらに、そ
のような分子マーカーを発現する幹細胞を提供する。

【００１９】間葉および造血幹細胞集団は、物理的および抗原基準に従って、ならびに種々
のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイ系において広く特徴付けられ
てきた。幹細胞に作用できるサイトカインの同定におけるかなりの進歩にかかわ
らず、間葉または造血幹細胞を生起できる原始的幹細胞（すなわち、先祖）を単
離することはできなかった。同様に、系列−特異的経路に沿って分化を指令する
ことはできなかった。これらの制限は、幹細胞生物学の最も基本的な態様を媒介
する調節メカニズムの解明；すなわち、分化を自己更新またはそれを行う決定を
妨げてきた。その結果、いずれの生物においても最も原始的な前−間葉、前−造
血幹細胞の分子生物学についてはほとんど知られていない。

【００２０】造血幹細胞（ＨＳＣ）は、赤血球、リンパ球、マクロファージおよび巨核球の
ごとき、造血または血液細胞の特異的型に分化することができる骨髄および末梢
血液にとりわけ見出される形成性多能性胚細胞である。Ｇ−ＣＳＦおよびＷ−Ｃ
ＳＦのごときある因子の投与、および引き続いての末梢血液からの回収による骨
髄からのＨＳＣの動員の後、ＨＳＣは末梢血液先祖細胞（ＰＢＰＣ）と言われる
ようにもなった。

【００２１】間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、サイトカインのごとき生物活性因子からの種々の影
響に応じて、１を超える型の間葉または結合組織（例えば、脂肪、骨、支質、軟
骨、弾性、および線維結合組織）に分化することができる骨髄、血液、皮膚およ
び骨膜にとりわけ見い出される形成性多能性胚細胞である。骨芽細胞および軟骨
細胞のごとき細胞に分化する能力は、単離および培養における増殖後に保持され
；細胞が特異的条件下でｉｎｖｉｔｒｏで誘導されるかまたは損傷された組織
の部位にｉｎｖｉｖｏで置かれた場合に分化は起こる。

【００２２】１つの具体例において、本発明は、間葉または造血組織いずれかに分化するこ
とができる単離された多能性前−間葉、前−造血幹細胞を提供する。Ｐ４幹細胞
と命名された先祖細胞は、造血障害、筋ジストロフィー、結合組織障害、脂質貯
蔵障害、骨格障害、および骨髄移植の遺伝子治療につき、ならびに病気となって
免疫系の潜在的復元につき大きな能力を有する。

【００２３】本明細書中で用いるごとく、「単離された」とは、動物またはヒトから単離さ
れ、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少な
くとも約５０％、最も好ましくは約８０％のごとく少なくとも約６０％まで精製
された細胞画分をいう。本発明のこの態様の特別の具体例において、単離された
細胞の純度は約９０％のごとく１００％に近い。約９０％の純度を有するそのよ
うな細胞集団において、幹細胞の恐らくは約４％のみが「活性な」幹細胞として
明瞭に作用するが、幹細胞の残りはそのような「活性な」幹細胞に転換する能力
を有することができるものとして休止している。「活性な」幹細胞は、自己−更
新を受け、多能性である細胞と定義された。本発明の文脈においては、「単離さ
れた」とは好ましくは、所望の細胞型についての細胞の集団の豊富化が達成され
るような、複数または混合された細胞の集団からの少なくとも１つの細胞型の取
り出しをいう。

【００２４】本明細書中で用いるごとく、前−間葉、前−造血幹細胞は、赤血球、リンパ球
、マクロファージおよび巨核球のごとき血液細胞、または脂肪、骨、支質、軟骨
、弾性および線維結合組織のごとき結合組織を生起させることができる細胞であ
る。前−間葉、前−造血細胞は、例えば、Ｏｓｆ２ＲＮＡおよび／またはポリ
ペプチドの発現において同定することができる。

【００２５】本明細書中で用いるごとく、「多能性細胞」は、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏにて少なくとも２つの異なる細胞型に分化するよう誘導することがで
きる細胞である。これらの細胞型はそれ自体多能性であり、さらなる細胞型に分
化することができるか、最終形態に分化することができる、すなわち、その現実
の状態を超えて分化することはできない。

【００２６】多能性細胞は、いずれの選択された発生経路に沿っても分化することができる
全能性細胞を含む。例えば、胚幹(embryonal stem)細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ：２８２：１１４５，１９９８）は全能性幹細胞である。多能性細
胞は造血幹細胞、間葉幹細胞、ニューロン幹細胞、神経外胚葉細胞、外胚葉細胞
および内胚葉細胞、例えば、皮膚または毛髪、血液細胞等のごとき、筋肉または
骨格構成要素、皮膚構成要素を与える能力を有する腸内胚葉および中胚葉幹細胞
のような他の組織−特異的幹細胞も含む。「発生経路」とは、特定の前駆体細胞
から追跡されるごとができる通常の細胞の運命をいう。かくして、例えば、本発
明の前−間葉、前−造血細胞は血液細胞または結合組織細胞を生起させることが
できる。かくして、本発明の方法によって同定される先祖細胞はより原始的であ
り、すなわち、間葉幹細胞または造血幹細胞よりも特定の発生経路に運命付けら
れていない。

【００２７】「部分的に分化された（partially committed）」細胞は、もはや全能性では
ないが依然として多能性である細胞型である。例えば、適当な条件下で、本発明
の先祖細胞は間葉または造血細胞を生起することができる。

【００２８】多能性細胞は種々の手段の内のいずれか１以上によって「選択」することがで
き、該用語は、発生する胚からの組織型の解剖、全能性細胞を含めた多能性細胞
のｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでの単離または発生を含む。好ましく
は、該用語は１以上の他の細胞型からの多能性細胞の１つのクラスの単離をいう
。本発明の文脈において、該細胞は、さらに、Ｏｓｆ２遺伝子発現産物を含み、
かくして、分子マーカーとしてＯｓｆ２遺伝子産物の発現を用いる選択において
より大きな精度を可能とする。例えば、Ｏｓｆ２遺伝子発現産物は、Ｏｓｆ２ポ
リペプチドをコードするＲＮＡであり得る。別法としてＯｓｆ２遺伝子発現産物
はＯｓｆ２ポリペプチドで有り得る。

【００２９】本発明の前−間葉、前−造血細胞は細胞増殖−変調剤に応答する。本明細書中
で用いるごとく、「細胞増殖−変調剤」は、細胞の増殖または分化を促進または
阻害することができるいずれの剤でもある。好ましくは、本発明の細胞増殖−変
調剤はポリペプチドである。より好ましくは、ポリペプチドはコラーゲン結合ド
メインおよび成長因子を含む融合ポリペプチド、またはその活性な断片である。

【００３０】本明細書中で用いられる用語「成長因子」は、成長刺激剤（マイトジェン）と
して、または（時々、負の成長因子といわれる）増殖阻害剤として機能する分子
を含む。成長因子は細胞移動を刺激する（例えば細胞分裂サイトカイン）、走化
性剤として機能する、腫瘍細胞の細胞移動または侵入を阻害する、細胞の分化し
た機能を変調する、アポトーシスに関与する、および細胞の生存を促進すること
も知られている。そのような因子は拡散性因子として分泌されたり、膜結合型で
存在することもできる。従って、それらはオートクリン、パラクリン、ジュクス
タクリンまたはレトロクリン様式で作用することができる。サイトカインは成長
因子の１つの型である。サイトカインは、ナノないしピコモル濃度において液性
レギュレーターとして作用し、正常または病理学的条件下で個々の細胞および組
織の機能的活性を変調することができるポリペプチドである。サイトカインは細
胞の間の相互作用を媒介することができ、および／または細胞外環境で起こるプ
ロセスを調節することができる。サイトカインは、種々の他の蛋白質に加えて、
インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー−
刺激因子およびケモカインを含む。

【００３１】本明細書中で用いられる「成長因子−応答性」細胞とは、例えば、サイトカイ
ンと接触した場合には、成長因子に応答性がない細胞では生存することができな
い細胞培養条件下において、生存し続ける細胞をいう。

【００３２】成長因子は、さらに、表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因
子（ＴＧＦ）、血小板−由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧ
Ｆ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、造血成長因子（ＨｅＧＦ），腫瘍壊死因子（
ＴＮＦ−アルファ）、血小板−由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、イン
スリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−８、成長ホルモン、アンジオ
ポエチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、酸性および塩基性線維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）およびＣ
ＹＲ６１を含む（Ｂａｂｉｃら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，９５：６３５５，１９８８；Ｋｉｒｅｅｖａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，１６：１３２６，１９９６）。そのような因子は、さらに、インスリン
、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、神経成長因子、ＮＧＦ受容体、ＥＧＦ，ＴＧＦ−
α、ＥＧＦ受容体、ｎｅｕ、ＴＧＦ−β1、ＴＧＦ−β2、ＴＧＦ−β3、インヒ
ビンα、インヒビンβ、ミレリアン阻害物質、ＴＮＦ−α／β、ＴＮＦ−受容体
（１型）、ＴＮＦ−受容体（２型）、ＰＤＧＦＡ−鎖、ＰＤＧＦＢ−鎖、Ｐ
ＤＧＦ受容体α、ＰＤＧＦ受容体β、ａ−ＦＧＦ、ｂ−ＦＧＦ、ｗｎｔ−２、ｈ
ｓｔ／ｋｓ３、肝細胞成長因子、ＨＧＦ受容体（ｃ−ｍｅｔ）、ＩＬ−１α／β
、（α−鎖）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５，ＩＬ−６、ＩＬ−７、
ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）、ＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）、イ
ンターロイキン−１（１型）、インターロイキン−２α、インターロイキン−２
β、インターロイキン−４、インターロイキン−５α、インターロイキン−６、
インターロイキン−７、Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１とも呼ばれる）、Ｍ−ＣＳＦ受
容体（ｃ−ｆｍｓ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α、ＧＭ−ＣＳＦ受容
体β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ受容体、幹細胞因子、ＳＣＦ受容体（ｃ−ｋｉｔ
）、エリスロポエチン（ｅｐｏ）、ｅｐｏ受容体、および白血病阻害因子を含む
。これらの分子の各々は、細胞増殖、細胞成長または分化をｉｎｖｉｖｏで誘
導することが示されている。細胞の成長または分化変調活性を呈する他の同様な
分子はヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）である。

【００３３】「融合ポリペプチド」は、２以上の異なる蛋白質に由来するアミノ酸配列の１
部、または正常に連続しない同一蛋白質の２以上の領域を含有するポリペプチド
である。「コラーゲン−結合ドメイン」はコラーゲンに結合できるいずれのポリ
ペプチドまたはその部分でもある。いくつかのコラーゲン−結合ドメインが当該
分野で知られている（Ｃｒｕｚ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７
０：１０８２２，１９９５；Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ，Ｍ．Ｆ．ら．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．，３２４：１８５，１９９７；Ｌａｎｋｈｏｆ，Ｈ．ら．，Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓＨａｅｍｏｓｔａｓ，７５；９５０，１９９６）。１つの具体例に
おいて、コラーゲン結合ドメインは、露出された欠陥コラーゲンの認識に関与す
るｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄのコラーゲン結合ドメインである（Ｔａｋａｇ
ｉ，Ｊ．ら．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：８５３０，１９９２；Ｔｕ
ａｎ，Ｔ．Ｌ．ら．，Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．，３４：１，１９９６；Ｇ
ｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，８：１３８５。こ
れらの文献を引用して、全てを本明細書に一体化させる）。フォンビルブラント
（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子は、遺伝した血友病の研究において止血
因子として最初に同定され（Ｗａｇｎｅｒ，Ａｎｎ．，Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，６：２１７，１９９０）、血小板凝集体を血管病巣に標的化することに
よって活力のあるサーヴェイランス機能を行うことが示されている（Ｇｉｎｓｂ
ｕｒｇ及びＢｏｗｉｅ，Ｂｌｏｏｄ，，７９：２５０７，１９９２）。デカペ
プチドＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号：１）は、ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎ
ｄ因子のコラーゲンへの結合において鍵となることが確認されている（Ｔａｋａ
ｇｉ，Ｊ．ら．，前出，１９９２；Ｔｕａｎ，Ｔ．Ｌ．ら．，前出，１９９
６）。本発明で用いるコラーゲン−結合ドメインを同定するアッセイは当該分野
で知られている（Ｔａｋａｇｉ，Ｊ．ら．，前出，１９９２；Ｔｕａｎ，Ｔ．Ｌ
．ら．，前出，１９９６）。

【００３４】本発明は、さらに、分化または細胞死滅を誘導しない条件下で培養した場合に
未分化状態を維持できる単離された多能性前−間葉、前−造血先祖幹細胞に関す
る。

【００３５】本発明は、さらに、例えば、骨髄組織に由来する前−間葉、前−造血先祖幹細
胞を含む調製物に関する。そのような調製物は、本明細書中で開示した単離方法
のいずれかによって得ることができる。そのような調製物は前−間葉、前−造血
幹細胞の少なくとも約１０％、１０−５０％のような、例えば約３５％、または
好ましい具体例においては、約９０％までまたは最も好ましくは実質的に純粋な
培養を含む。好ましくは、これらの細胞の少なくとも約４％は十分に活性な幹細
胞である。選択されたスクリーニング方法に応じて、より高い濃度を得るのが可
能である。そのような手法は、前−間葉、前−造血幹細胞の単離された集団を決
して得なかった。というのは、細胞の同一性および特徴（および、特異的分子マ
ーカーの発現）は、本発明の前には知られていなかったからである。かくして、
現実に、本発明の方法は所望の濃度の細胞型、すなわち、これまで決して同定お
よび／または突き止められなかったここに開示する前−間葉、前−造血幹細胞を
生じる。特別の具体例において、産物は約９０−９５％の前−間葉、前−造血幹
細胞よりなる。１つの有利な具体例において、該方法の産物は、ほとんど、すな
わち、約１００％の前−間葉、前−造血幹細胞よりなる細胞画分である。従って
、本発明は本発明の方法によって得ることができる単離された前−間葉、前−造
血幹細胞、ならびに単離された前−間葉、前−造血幹細胞のいずれかの画分にも
関する。

【００３６】もう１つの態様において、本発明は、そのような治療を必要とする対象におい
て血液細胞および／または結合組織の再生を促進する方法を提供する。例えば、
支質組織は身体全体に分布したゆるいおよび密な結合組織の比較的不均一な収集
である。間葉幹細胞に由来する骨髄支質は、血液細胞の合成、すなわち、造血を
支持するのに必要な足場および可溶性因子を提供する。強い放射線照射および化
学療法的処置の間に、骨髄組織は対象において枯渇するかまたは破壊される。本
発明の前−間葉、前−造血先祖細胞の対象への導入は生存を増加させ、血液およ
び骨髄細胞の再生に必要な時間を減少させることができる。かくして、本発明の
細胞を移植して、例えば、血液および骨髄組織を再生させることができる。

【００３７】本発明は、本発明の前−間葉、前−造血先祖幹細胞の細胞移植を介して骨髄組
織の再生を増強する方法を提供する。本発明の細胞は骨髄細胞に、または末梢血
液に由来することができる。前−間葉、前−造血先祖細胞移植を増強する方法は
、それを必要とする個体に前−間葉、前−造血先祖細胞を投与することを含み、
ここに、該前−間葉、前−造血先祖幹細胞は個体において骨髄の再生を促進する
のに効果的な量で投与される。

【００３８】Ｘ線照射またはアルキル化療法による癌の治療は骨髄ミクロ環境ならびに造血
幹細胞を破壊する。本発明の先祖幹細胞は、間葉および造血幹細胞双方を生起す
る能力を有する。その結果、本発明は、支質復元および最終的には骨髄の移植の
プロセスを加速する単離された前−間葉、前−造血先祖細胞を移植する利点に指
向される。

【００３９】前−間葉、前−造血幹細胞調製物の投与の様式は、限定されるものではないが
、全身静脈内注射および活性の意図された部位への直接的な注射を含む。調製物
はいずれかの便宜な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射（bolus in
jection）によって投与することができ、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与
することができる。投与は好ましくは全身投与である。

【００４０】また、本発明は治療上有効量の本発明の幹細胞および医薬上許容される担体も
しくは賦形剤を含む医薬品組成を提供する。そのような担体は、限定されるもの
ではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水およびその組
合せを含む。処方は投与の様式に適合すべきである。

【００４１】好ましい具体例において、前−間葉、前−造血幹細胞調製物または組成物は、
ヒトへの静脈内投与に適合した医薬品組成としてルーチン的手法に従って処方さ
れる。典型的には、静脈内投与のための組成物は滅菌等張水性緩衝液中の溶液で
ある。必要であれば、組成物は注射の部位においていずれの疼痛も軽減させるた
めに局所麻酔剤を含むこともできる。組成物が注入によって投与されるべき場合
、それは、滅菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルで分注
することができる。組成物を注射によって投与すべき場合、成分を投与に先立っ
て混合できるようにするために、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを供
することができる。

【００４２】本発明の細胞は、細胞を特定の組織に標的化するのに適したいずれの送達系に
よっても標的化部位に送達することができる。例えば、細胞は、標的化部位にお
いて細胞のゆっくりとした放出を可能とする送達ビヒクル(delivery vehicle)に
カプセル化することができる。送達ビヒクルは、それが特異的に特定の組織に標
的化されるように修飾することができる。標的化送達系の表面は種々の方法で修
飾することができる。リポソーム標的化送達系の場合には、脂質基をリポソーム
の脂質二層に一体化させて、リポソーム二層と安定な会合に標的化リガンドを維
持することができる。脂質鎖を標的化リガンドに結合するのに、種々の連結基を
用いることができる。一般に、標的化送達系の表面に結合した化合物は、標的化
送達系が所望の細胞に見い出され、そこに「ホームイン」することを可能とする
リガンドおよび受容体であろう。リガンドは、受容体のごときもう１つの化合物
に結合する注目するいずれかの化合物であり得る。

【００４３】例えばコロイド分散系を本発明で用いることができる。コロイド分散系はマク
ロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズおよび脂質を基礎とし
た系を含み、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含
む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、ｉｎｖ
ｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにて送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である
。サイズが０．２−４．０μｍの範囲にある大きな単層小胞（ＬＵＶ）は、大き
なマクロ分子を含有する水性緩衝液の実質的なパーセンテージをカプセル化する
ことができるのが示されている。

【００４４】本発明の方法は、特に、（１）注射した前−間葉、前−造血幹細胞の量を増加
または減少させる；（２）注射の数を変更する；（３）細胞の送達の方法を変更
する；または（４）前−間葉、前−造血幹細胞の源を変更することによって改変
することができる。治療すべき対象の骨髄に由来する細胞が好ましいが、前−間
葉、前−造血幹細胞は他の個体または種から、または遺伝子工学により作成され
た純系ドナー株から、またはｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養から得ることができる。

【００４５】前−間葉、前−造血幹細胞調製物は、受容者において間葉および／または造血
幹細胞の移植を促進するのに有効な量で用いる。前−間葉、前−造血幹細胞調製
物は、好ましくは、１日当たり１ないし３回静脈内投与され、最適な効率および
薬理学的用量に適合するように調製することができる。

【００４６】従って、本発明は、本発明による少なくとも１つの前−間葉、前−造血幹細胞
および医薬上許容される担体を含む医薬製剤に関する。本発明による製剤は、例
えば、骨の適当な部分への注射に適合させることができる。そのような医薬製剤
は水性担体、例えば、緩衝化生理食塩水等のごときいずれの適当な担体も含む。
本発明の製剤の活性な組成物は、一般に、滅菌されており、いずれの望まれない
物質も含まない。加えて、製剤はｐＨ調製剤等のごとき生理学的条件を近似する
のに必要な医薬上許容される補助的物質を含有することができる。製剤中の本発
明の前−間葉、前−造血幹細胞の濃度はその意図された適用に応じて変化し、そ
の投与量は患者の医師によってそれに従って決定される。使用される幹細胞は、
本発明の方法またはいずれかの他の適当な方法によって単離することができるか
、またはいずれかの他の方法で得ることができる。好ましい具体例において、本
発明の幹細胞を遺伝子操作して、その意図された使用に特に適合させることがで
きる。

【００４７】さらなる態様において、本発明の細胞を、投与が治療的に有用な患者に投与す
ることができる。別法として、本発明の細胞を用いて、本発明の細胞の投与によ
り患者において対応する細胞型を置き換えまたは補充することができる。本発明
の細胞は、移植物の周囲を覆うために用いることができ、かくして、移植物と患
者との間のバリアとして作用する。本発明の細胞の投与は、当業者に知られた方
法によって達成される。

【００４８】もう１つの態様において、本発明は、医薬上許容される担体中にて治療上有効
量の単離された多能性前−間葉、前−造血幹細胞を対象に投与することを含む、
対象において結合組織−関連障害を緩和する方法を提供する。関連する態様にお
いて、本発明は、医薬上許容される担体中にて治療上有効量の多能性前−間葉、
前−造血幹細胞を対象に投与することを含む、対象において血液組織−関連障害
を緩和する方法を提供する。結合組織および血液組織−関連障害は、限定される
ものではないが、筋ジストロフィー、脂質貯蔵障害、骨格障害、または骨髄障害
、ならびに病気となった免疫系の潜在的復元を含む。

【００４９】用語「緩和する」は、治療を受ける患者における病気−誘導応答の有害な効果
を少なくすることをいう。例えば、障害が減少した量の結合組織または血液組織
細胞の増殖による場合、本発明の幹細胞を障害の部位と接触させることができる
。

【００５０】用語「治療する」、「治療」等は、ここでは、所望の薬理学的および／または
生理学的効果を得ることを意味するように用いられる。該効果は、障害またはそ
の症状または徴候を完全にまたは部分的に妨げる点で予防的であり得るおよび／
または障害および／または該障害に帰すことができる有害効果についての部分的
または完全な治癒の点で治療的であり得る。ここに用いられる「治療する」は哺
乳動物における障害のいずれの治療をもカバーし、および；（ａ）障害の素因が
あり得るがそれを有すると未だ診断されていない対象において障害が起こるのを
防ぐこと；（ｂ）障害を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること；または（ｃ）障害を軽減または緩和すること、例えば、障害の退行を引き起こすこと
を含む。

【００５１】該方法は、治療上有効量の本発明の前−間葉、前−造血先祖幹細胞を対象に投
与することを含む。一般に、そのような方法は、損なわれていない機能、および
障害に応じて血液組織、結合組織または他の細胞型を生じる能力を持つ本発明に
よる前−間葉、前−造血先祖幹細胞の投与に基づく。

【００５２】従って、本発明の細胞は、移植部位に適した当該分野で知られたいずれかの方
法によって病気または負傷の治療のために患者に移植することができる。

【００５３】本発明の細胞の投与方法は、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔
内、静脈内、皮下、鼻孔内および硬膜外経路を含む。本発明の細胞はいずれかの
便宜は経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜
皮膚内層を通じる吸収によって（例えば、口の粘膜、直腸および腸粘膜等）投与
することができ、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与することができる。投与
は全身または局所であり得る。

【００５４】本発明の細胞を治療を必要とする領域に局所投与するのは望ましいであろう；
これは、例えば、限定されるものではないが、外科的処置の間の局所注入、局所
適用（例えば、外科的処置後の創傷包帯と組み合わせる）、注射、カテーテル、
または移植によって達成することができ、その移植はシアラスチック膜（sialas
tic）のような膜または線維を含めた、多孔性（porous）、非多孔性（non-porou
s）またはゼラチン状物質である。

【００５５】もう１つの態様において、本発明の方法によって調製された前−間葉、前−造
血幹細胞を遺伝子的に修飾することができる。操作を行って、細胞の種々の特性
を修飾し、例えば、それをある環境条件により適したものまたはそれに対して抵
抗性とし、それから１以上のある物質の生産を誘導することができ、その物質は
、例えば、細胞の生存率を改良することができ、あるいは薬物または医薬として
有用であり得る。いくつかのそのような遺伝子的改変を行って、細胞を移植で用
いるのにより適したものとし、例えば、受容者からの拒絶を回避することができ
る（遺伝子治療の手法のレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５６：８０８；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，９２６；Ｍｉｌ
ｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５；ＶａｎＢｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，６（１０）：１１４９；およびＹｕら，ＧｅｎｅＴｈｅ
ｒａｐｙ，１：１３参照）。かくして本発明は遺伝子治療方法も含み、ここに
、前−間葉、前−造血幹細胞、ならびに本発明による細胞を含むそのような方法
で用いることが意図された製剤が用いられる。そのような遺伝子治療方法を用い
て、血液または結合組織が修復、置換または増加を必要とするいずれの疾患も治
療および／または予防することもできる。例えば、ベクターを用いて、細胞を修
飾して病理学的障害の治療に対して有益な核酸または蛋白質を発現するように本
発明の細胞に遺伝子要素を導入することができる。別法として、ベクターを用い
て、本発明の幹細胞に対して天然である特定の核酸配列の機能をノックアウトす
ることができる。

【００５６】「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または本発明の
適当な宿主細胞への導入に対して、前−間葉、前−造血幹細胞の修飾がもたらさ
れる他のベクターのごとき組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築体をいう。適当な発現
ベクターは当業者によく知られており、真核生物および／または原核生物細胞で
複製できるもの、およびエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノムに
組み込まれるものを含む。

【００５７】本発明によるベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記
載されている通常の技術を使用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を
切断し、仕立て上げ、望まれる形態に再び連結して必要なプラスミドを得る。所
望ならば、構築されたプラスミドにおいて正しい配列を確認するための分析を公
知の方法で行う。発現ベクターを構築し、ｉｎｖｉｔｒｏ転写体を調製し、Ｄ
ＮＡを宿主細胞に導入し、遺伝子の発現および機能を評価するための分析を行う
適当な方法は当業者に知られている。遺伝子の存在、増幅および／または発現は
、例えば、ここに提供される配列に基づき適切に表紙に記されたブローブを用い
、通常のサザーンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブ
ロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはイン
・サイチュハイブリダイゼーションによって直接的に試料で測定することができ
る。当業者であれば、所望ならば、どのようにしてこれらの方法を修飾すること
ができるかを容易に考えつくであろう。

【００５８】Ｐ４先祖細胞を同定するための方法もう１つの具体例において、本発明は、動物種から細胞の集団を得；ｉｎｖ
ｉｔｒｏで細胞を培養し；細胞を、骨芽細胞特異的因子２（Ｏｓｆ２）発現を誘
導する細胞増幅−変調剤と接触させ；次いで、骨芽細胞特異的因子２（Ｏｓｆ２
）を発現する前−間葉、前−造血幹細胞を同定することを特徴とする細胞の集団
から前−間葉、前−造血幹細胞を同定する方法を提供する。本発明の方法は、骨
髄吸引物から収穫し、培養で増殖させ、刺激して血液または骨／結合組織エレメ
ントに分化させることができる誕生後中胚葉幹細胞を同定するのに有用である。

【００５９】本明細書中で用いられる「同定する」とは、細胞の集団における多能性幹細胞
の検出をいう。「細胞の集団」は、特定の試料中の不均一混合物または複数の異
なる細胞型よりなることができる。あるいは、「細胞の集団」は、当該細胞が同
一である点で均一であり得る。好ましくは、本発明の方法で有用な細胞は骨髄−
由来細胞である。

【００６０】本発明の方法は、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞の集団を培養し、該細胞を、骨芽細
胞特異的因子２（Ｏｓｆ２）発現を誘導する細胞増殖−変調剤と接触させること
を含む。本明細書中で用いるごとく、本発明の「培養」細胞は，前−間葉、前−
造血幹細胞を増殖させるための後記する方法を含む。しかしながら、Ｏｓｆ２遺
伝子産物の発現を可能とするそのような幹細胞を培養するいずれの方法も本発明
の方法に含まれると理解される。好ましくは、該剤は、前記したごとく、コラー
ゲン結合ドメインおよび増殖因子、またはその断片を含む融合ポリペプチドであ
る。

【００６１】適当な多能性幹細胞は多数の源に由来し得る。例えば、ヒトＥＳ細胞のごとき
ＥＳ細胞および胚細胞に由来する細胞（ＥＧ細胞）は胚組織に由来することがで
き、細胞系として培養することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２８２：１１４５，１９９８）。別法として、多能性細胞は後退分化によって、
増殖因子その他の投与によって、成人から卵のごとき多能性細胞への核導入によ
るごときクローニングによって調製することができる。特異的系列のヒト幹細胞
はヒト組織から直接的に単離することができる。別法として、齧歯類のごとき非
−ヒト動物からの幹細胞を用いることができる。好ましくは、本発明の多能性幹
細胞が骨髄組織から由来する。

【００６２】本発明は、Ｏｓｆ２発現産物を有する、またはそれを有すると考えられる試料
をスクリーニングすることによってＯｓｆ２発現を同定する方法を含む。本明細
書中で用いるごとく、「Ｏｓｆ２遺伝子発現産物」はＯｓｆ２遺伝子のコーディ
ング配列に由来するいずれの分子でもある。例えば、Ｏｓｆ２遺伝子発現産物は
、Ｏｓｆ２ポリペプチドをコードする核酸分子、該ポリペプチドそれ自体、また
はその断片であり得る。

【００６３】これらの方法において、Ｏｓｆ２ポリペプチドをコードする核酸またはＯｓｆ
２ポリペプチドそれ自体を含有する試料、例えば、骨髄−由来細胞は、Ｏｓｆ２
−特異的プローブ、例えば、Ｏｓｆ２−特異的核酸プローブまたはＯｓｆ２ポリ
ペプチドに対する抗体でスクリーニングされる。

【００６４】１つの態様において、本発明のこの方法の文脈における用語「Ｏｓｆ２−特異
的プローブ」とは、Ｏｓｆ２ポリペプチドをコードする核酸に結合するプローブ
またはその相補的配列をいう。Ｏｓｆ２−特異的核酸プローブは、Ｏｓｆ２ポリ
ペプチドをコードする核酸、またはその相補的配列に特異的にハイブリダイズす
る核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含有する分子、または
その組合せまたは修飾）であり得る。

【００６５】Ｏｓｆ２遺伝子の発現は、Ｏｓｆ２ポリペプチドをコードする核酸を含有する
試料と核酸プローブとを接触させることによって検出することができる。プロー
ブの配列は、Ｏｓｆ２ポリペプチドをコードする核酸分子（およびその断片）に
由来することができ、（１）Ｏｓｆ２ポリペプチドをコードする核酸に対して相
補的は、またはそれにハイブリダイズする配列を含有する核酸、またはその断片
（例えば、少なくとも１０、１２、１５、２０または２５ヌクレオチドを含有す
る断片）；および（２）Ｏｓｆ２ポリペプチドをコードする核酸に相補的な配列
にハイブリダイズする配列を含有する核酸またはその断片（例えば、少なくとも
１０、１２、１５、２０または２５ヌクレオチドを含有する断片）のごとき関連
核酸を、それらのハイブリダイゼーション特性に焦点を当てる方法で用いること
ができる。例えば、後記にてさらに詳細に記載するように、そのような核酸分子
を以下の方法で用いることができる；つまり、Ｏｓｆ２核酸を合成するためのＰ
ＣＲ方法、試料中のＯｓｆ２核酸の存在を検出するための方法、新しいＯｓｆ２
ファミリーのメンバーをコードする核酸を同定するためのスクリーニング方法、
または試料中のＯｓｆ２転写体を同定するためのＲＴ−ＰＣＲ方法である。

【００６６】スクリーニング方法で有用なオリゴヌクレオチドプローブは長さが約１０ない
し約１５０ヌクレオチドである。さらに、そのような方法は、好ましくは長さが
１０ないし約１００ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１０ないし約５０ヌ
クレオチドである。

【００６７】そのようなプローブを得るための方法は、Ｏｓｆ２について当該分野で知られ
たアミノ酸配列に基づいてデザインすることができる。少なくとも１０、例えば
、１５、２５、３５、５０、１００または１５０ヌクレオチドを含有することが
できるプローブは、いくつかの標準的な方法のいずれかを用いて生産することが
できる。

【００６８】核酸ハイブリダイゼーションに依拠するスクリーニング手法は、適切なプロー
ブを得ることができれば、いずれかの生物に由来するいずれかの生物からのいず
れかの遺伝子配列またはそれに由来するＲＮＡを単離するのを可能とする。例え
ば、問題の蛋白質をコードする配列の一部に対応するヌクレオチドプローブを化
学的に合成することができる。これは、アミノ酸配列の短いオリゴペプチドスト
レッチが知られていなければならないことを必要とする。蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列は遺伝暗号から推定することができるが、該暗号の縮重を考慮しなけれ
ばならない。配列が縮重している場合、混合付加反応を行うことができる。これ
は変性された二本鎖ＤＮＡの不均一な混合物を含む。そのようなスクリーニング
では、ハイブリダイゼーションは好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性された二本
鎖ＤＮＡいずれかで行われる。ハイブリダイゼーションは、注目するポリペプチ
ドに関連するごく少量のｍＲＮＡ配列が存在する源に由来するｃＤＮＡクローン
の検出で特に有用である。換言すれば、非特異的結合を回避するのに向けられた
選択的ハイブリダイゼーション条件を用いることによって、例えば、標的ＤＮＡ
の、その完全な相補体である混合物中のその単一プローブへのハイブリダイゼー
ションによる特異的ｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフィー可視化を可能と
することができる（Ｗｌｌａｃｅら，ＮｕｃｌｒｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａ
ｒｃｈ，９：８７９，１９８１）。また、そのような選択的ハイブリダイゼーシ
ョンプローブを分析的に検出できる試薬で標識することができ、好ましくはその
ようにしてプローブの同定を促進することができるのも認識される。有用な試薬
は、限定されるものではないが、放射能、蛍光色素、または検出可能な産物の形
成を触媒できる酵素を含む。かくして、選択的ハイブリダイゼーションプローブ
は、他の源からＤＮＡの相補的コピーを単離し、または関連配列につきそのよう
な源をスクリーニングするのに有用である。

【００６９】ここに開示される特定の核酸配列にハイブリッド形成する核酸配列に関して、
ハイブリダイゼーションは、減じられたストリンジェント条件下、中程度のスト
リンジェント条件下で、またはストリンジェントな条件下でさえ行われうる。オ
リゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションの例として、固定された変性核酸を
含む高分子膜を、最初に、０．９ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐ
Ｈ７．０）、５．０ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０×デンハート
液、および０．５ｍｇ／ｍＬポリリボアデニル酸から構成される溶液中で、４５
℃で３０分間、予備ハイブリッド形成させる。その後、^３２Ｐ末端標識オリゴヌ
クレオチドプローブのおよそ２×１０^７ｃｐｍ（４×１０^８ｃｐｍ／ｍｇの比活
性）を、その溶液に添加する。１２〜１６時間のインキュベーションの後、膜を
０．５％ＳＤＳを含む１×ＳＥＴ（１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリスヒド
ロクロリド（ｐＨ７．８）、１ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡ）中で、３０分間、室温で
洗浄し、続いて、オリゴヌクレオチドプローブについて、Ｔｍ−１０℃で、新鮮
な１×ＳＥＴ中で３０分間洗浄する。その後、膜をハイブリダイゼーション・シ
グナルの検出のために自動放射線透過写真フィルムに露出させる。

【００７０】核酸ハイブリダイゼーション反応では、特定レベルのストリンジェンシーを達
するために使用される条件は、ハイブリッド形成されるべき核酸の特性によって
変化する。例えば、核酸のハイブリッド形成領域の長さ、相補性の程度、ヌクレ
オチド配列組成（例えば、ＧＣ対ＡＴ含量）、および核酸型（例えば、ＲＮＡ対
ＤＮＡ）は、ハイブリダイゼーション条件を選択する上で考慮されうる。別の考
慮は、核酸の内の１つが、例えばフィルターに固定されるかどうかである。

【００７１】進行的に高いストリンジェント条件の例は、以下のとおりである：ほぼ室温で
、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温で、
０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェント条件）；約４２℃で、０
．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度のストリンジェント条件）；および約６
８℃で、０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェント条件）である。洗浄は、これらの
条件のうちの一つ、例えば高ストリンジェント条件の内の１つのみを使用して行
ってもいいし、または各々の条件、例えば、上記のいずれか又は全てを列記順に
１０〜１５分ずつ反復して使用してもよい。しかし、上に明記されるとおり、最
適な条件は、関与される特定のハイブリダイゼーション反応によって変化し、経
験的に決定されうる。

【００７２】そしてまたこのようなプローブは、できればプローブの同定を促進する分析的
に検出可能な試薬で標識され得ることが好ましい。有用な試薬としては、それに
限定されないが、放射線活性、蛍光染料、または検出可能な生成物の形成を触媒
する能力のあるタンパク質が挙げられる。したがって、プローブは、ＤＮＡの相
補的コピーを、他の動物源から単離するか、または関連配列のためのこのような
源をスクリーニングするのに有用である。

【００７３】別の観点では、発明のこの方法の状況では、語句「Ｏｓｆ２−特異的プローブ
」は、Ｏｓｆ２ポリペプチド、またはその断片に結合するプローブに該当する。
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、サンプル中のＯｓｆ２の
存在を検出するために使用され、それにより前−間葉、前−造血幹細胞の存在を
示しうる。モノクローナル抗体の製造のために、連続的な細胞株培養によって産
生される抗体を提供する任意の技術が使用されうる。例としては、ハイブリドー
マ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５年）、トリ
オマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙＴｏｄａｙ、４：７２、１９８３年）、およびヒトモノクローナル抗体を
産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、モノクローナル抗体および
癌治療（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ）、アラン・アール．リス，インク．、７７−９６、１９８５
年）が挙げられる。

【００７４】本発明の別の観点によれば、Ｏｓｆ２調節領域に操作可能に結合した検出可能
なマーカーをコードする核酸配列を包含する遺伝子構築物は、細胞の集団に導入
される。検出可能なマーカーの発現は、前−間葉、前−造血幹細胞を示す。した
がって、前−間葉、前−造血幹細胞は、レポーター系を使用してｉｎｖｉｖｏ
でＯｓｆ２ポリペプチドの発現を検出することによって他の細胞型から活発に選
別されうる。

【００７５】Ｏｓｆ２は、Ｏｓｆ２−特異的調節領域からの転写を活性化する転写性アクチ
ベーターである。したがって、例えば、本発明は、Ｏｓｆ２調節領域に操作的に
結合した検出可能なマーカーをコードするコード領域を包含する遺伝子構築物を
、細胞の集団に導入し；検出可能なマーカーを発現する細胞を検出し；そして細
胞の集団から検出可能なマーカーを発現する細胞を選別することを特徴とする、
細胞の集団から所望の細胞型を分離する方法を提供する。したがって、前−間葉
、前−造血幹細胞の分子マーカーとしてのＯｓｆ２遺伝子発現の同定は、間葉ま
たは造血細胞へのそれらの分化の前に、このような細胞の検出についての機会を
提供する。

【００７６】検出可能なマーカーは、Ｏｓｆ２を発現しない細胞のものから、Ｏｓｆ２−発
現細胞を区別する手段を提供する任意の存在でありうる。このようなマーカーは
、抗生物質のような薬剤で選択されうるものが挙げられる。検出可能なマーカー
は、放射線活性マーカーも包含しうる。好ましくは、本発明の検出可能なマーカ
ーは、自動細胞選別アプローチ法によって検出および選別されうる蛍光またはル
ミネッセンスのマーカーである。例えば、マーカーは、ＧＦＰまたはルシフェラ
ーゼでありうる。他の有用なマーカーとしては、細胞膜で発現され、したがって
、親和性手段により細胞選別を促進するものが挙げられる。

【００７７】「Ｏｓｆ２調節領域」は、Ｏｓｆ２ポリペプチドにより調節または制御される
遺伝子から由来する核酸配列を包含する。Ｏｓｆ２対照配列は、当業界で知られ
ている。

【００７８】本発明の遺伝子構築物は、Ｏｓｆ２調節配列に操作的に結合した異種の核酸配
列をコードする核酸を発現する能力のある発現ベクターでありうる。全体的制御
が、Ｏｓｆ２ポリペプチドに感受性を残している限り、本発明による遺伝子構築
物は、要求される場合、任意のプロモーターおよびエンハンサーを包含しうる。
Ｏｓｆ２ポリペプチドに応答性のある調節配列は、当業界で知られ、そしてここ
に引用される文献で記述され、そして参照してここに組込まれる；しかし、少な
くとも、本発明の構築物は、Ｏｓｆ２結合部位を包含する。好ましくは、自然な
Ｏｓｆ２−応答性制御要素は、それらの全体として使用される；しかし、他のプ
ロモーターおよびエンハンサー要素は、それらが、Ｏｓｆ２発現の影響下で維持
する場合、置換されうる。

【００７９】したがって、発現ベクターは、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、また
はＯｓｆ２を発現する適切な宿主細胞に導入することにより、検出可能なマーカ
ーの発現、および前−間葉、前−造血幹細胞の連続同定を生じる他のベクターの
ような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物に該当する。適切な発現ベクターは、当
業者に十分に知られており、そして真核生物および／または原核生物の細胞で複
製できるもの、およびエピソーム性のままであるもの、または宿主細胞ゲノムに
組込むものが挙げられる。

【００８０】本発明によるベクターの構築は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年で記
述されるとおり従来の技術を使用する。単離プラスミドまたはＤＮＡ断片は、必
要とされるプラスミドを生じる所望の形態で開裂され、既製化され、そして連結
される。所望の場合、構築プラスミド中の修正配列を確認する分析は、公知形態
で行われる。発現ベクターを構築し、ｉｎｖｉｔｒｏ転写物を製造し、ＤＮＡ
を宿主細胞に導入し、そして遺伝子発現および機能を評価するための分析を行う
適切な方法は、当業者に知られている。遺伝子存在、増幅および／または発現は
、例えば、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブ
ロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはここ
に供される配列に基づく可能性のある適切に標識されたプローブを使用してイン
シチュ・ハイブリダイゼーションによって、直接サンプル中で測定されうる。当
業者は、所望であれば、どのようにこれらの方法が、修飾されうるかを容易に予
想する。

【００８１】検出可能なマーカーは、これらの細胞のみが、関連のＯｓｆ２ポリペプチドを
発現するので、所望の細胞型で発現されるのみであり、そしてそれは、Ｏｓｆ２
制御配列からの転写のために必要とされる。したがって、好ましくは、検出可能
なマーカーを発現するために使用される発現手段は、漏れがちでなく、そしてＯ
ｓｆ２ポリペプチドの不在下でマーカーの最小量を発現する。本発明によるコー
ディング遺伝子構築物で、細胞を形質転換させ、マーカーを検出し、そして細胞
を選別するための技術は、当業界に知られている。

【００８２】ここに使用される場合、「形質移入」、「形質転換」、および同等物のような
語句は、核酸を機能性形態で細胞または生物に移動することを示すことが意図さ
れる。このような語句は、バイオリスチックスおよび同等物のような、ＣａＰＯ _４を用いた形質移入、電気穿刺法、ウイルス形質導入、脂質移入、リポソームを
使用する送出、および他の送出ベヒクルを含めた、核酸を細胞に移動する種々の
手段を包含する。

【００８３】細胞は、アフィニティー技術によるか、またはそれらが、例えば、アンチセン
ス核酸分子または免疫グロブリンに連結した発蛍光団またはその一部、または緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異体のような内因的に蛍光のタンパク
質のような適切な標識で標識される場合に、細胞選別（蛍光活性化細胞選別のよ
うな）によって選別されうる。ここに使用される場合、「選別」は、第二のもの
から第一の細胞型の少なくとも部分的な物理的分離に該当する。

【００８４】Ｏｓｆ２遺伝子の発現の検出に基づいた細胞の選別は、上に例示されるとおり
、当業界で知られる任意の技術によって行われうる。例えば、細胞は、フローサ
イトメトリーまたはＦＡＣＳによって選別されうる。一般的資料については、フ
ローサイトメトリーおよび細胞選別：実験室マニュアル（ＦｌｏｗＣｙｔｏｍ
ｅｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ）、Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ編、シュプリンガー・ラボラトリー、ニュ
ーヨーク（１９９２年）を参照する。

【００８５】フローサイトメトリーは、細胞を研究し、そして精製する強力な方法である。
それは、特に免疫学および細胞性物学での広範な用途が見られた：しかし、ＦＡ
ＣＳの能力は、生物学の多くの他の分野で使用されうる。頭字語「ＦＡＣＳ」は
、蛍光活性化細胞選別を意味し、そして「フローサイトメトリー」と相互交換可
能に使用される。

【００８６】ＦＡＣＳの概念は、流動体の希薄な流れで保持された個々の細胞に、１つまた
はそれ以上のレーザービームを通過させ、それにより光が分散され、そして蛍光
染料に種々の周波数で発光させることである。光電子増倍管（ＰＭＴ）は、光を
電子シグナルに変換させ、そしてそれは、細胞についてのデータを発生するソフ
トウエアによって解釈される。定義された特徴を示す細胞の副集団が、同定され
、そして非常に高い純度で懸濁液から自動的に選別されうる。

【００８７】ＦＡＣＳ装置は、様々なレーザー励起および蛍光放出波長に対応する数種のチ
ャンネルの内の１つに蛍光シグナルを収集する。蛍光標識は、細胞構造および機
能の多くの態様の調査を可能にする。最も広範に使用される用途は、免疫蛍光で
ある：フルオレセインおよびフィコエリスリンのような蛍光染料に接合した抗体
を用いた細胞の染色がある。この方法は、細胞表面で細胞を染色するためにしば
しば使用されるが、しかし抗体は、細胞内の標的に向けられもする。直接免疫蛍
光では、特定の分子Ｏｓｆ２ポリペプチドに対する抗体は、蛍光染料に直接的に
接合される。その後、細胞は、１段階で染色されうる。間接的免疫蛍光では、一
次抗体は、標識されないが、しかし一次抗体に特異的である二次蛍光で接合され
た抗体が、付加される：例えば、抗−Ｏｓｆ２抗体が、マウスＩｇＧである場合
、それにより二次抗体は、マウスＩｇＧに対して生じたラットまたはウサギ抗体
でありうる。

【００８８】ＦＡＣＳは、内因性Ｏｓｆ２を同定する目的で、本発明の遺伝子構築物に含有
されるレポーター遺伝子の遺伝子発現を測定するために使用されうる。レポータ
ー遺伝子の例は、Ｐ−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で
ある。Ｐ−ガラクトシダーゼ活性は、フルオレセイン・ジガラクトシド（ＦＤＧ
）のような蛍光誘発基質を用いたＦＡＣＳによって検出されうる。ＦＤＧは、低
張ショックによって細胞に導入され、そして細胞内に捕捉される蛍光産物を発生
する酵素によって開裂される。したがって、１種の酵素は、多量の蛍光産物を発
生しうる。ＧＦＰ構築物を発現する細胞は、基質の添加なしに発光する。異なる
励起頻度を示すが、同じチャンネルで蛍光を発光するＧＦＰの突然変異体が、利
用できる。２つのレーザーＦＡＣＳ装置では、異なるレーザーによって励起され
る細胞を区別し、したがって、同時に２つの形質移入を分析することが可能であ
る。

【００８９】細胞選別の選択的手段も、使用されうる。例えば、本発明は、Ｏｓｆ２ｍＲＮ
Ａに相補的な核酸プローブの使用を包含する。このようなプローブは、それらが
、順次、手動で、またはＦＡＣＳ選別を使用するかのいずれかで選別されうるよ
うに、個別にＯｓｆ２ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用されう
る。Ｏｓｆ２ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８
９年）によって記述されるとおり一般的手段を使用して製造されうる。したがっ
て、別の具体例では、本発明は、Ｏｓｆ２ｍＲＮＡに相補的で、ＦＡＣＳ細胞選
別で使用されうる発蛍光団に接合したアンチセンス核酸分子の使用を包含する。

【００９０】ＦＡＣＳと共に使用するための適切な画像形成剤は、細胞培養中にそれに対す
る簡単な露出、ウイルスまたは非ウイルス性ベクター手段による一過的に発現す
る核酸の送出、核酸または画像形成剤のリポソーム依存性移動、および同等物を
含めた任意の適切な技術によって細胞に送出されうる。

【００９１】特定の具体例では、本発明は、Ｏｓｆ２ポリペプチドを特異的に認識および結
合する抗体を包含する。例えば、このような抗体は、上に規定されるアミノ酸配
列を示すＯｓｆ２ポリペプチドに対して発生されうる。代わりに、Ｏｓｆ２ポリ
ペプチドまたはその断片（ｉｎｖｉｔｒｏ法によっても合成されうる）は、免
疫原性ポリペプチドに（組換え発現またはｉｎｖｉｔｒｏペプチジル結合によ
って）融合され、そしてこの融合ポリペプチドは、順次、Ｏｓｆ２エピトープに
対する抗体を生じるために使用される。

【００９２】さらに、本発明は、サンプルを、Ｏｓｆ２タンパク質と接触させることを特徴
とする、サンプル中の先祖幹細胞から前−間葉、前−造血幹細胞を発生する方法
を提供する。本発明は、さらに、サンプルを、Ｏｓｆ２をコードする核酸と接触
させることを特徴とする、サンプル中の先祖幹細胞から前−間葉、前−造血幹細
胞を発生する方法を提供する。

【００９３】本発明は、前−間葉、前−造血幹細胞の発生に一時的に関連する分子マーカー
を提供する。Ｏｓｆ２遺伝子の発現は、このような細胞の先祖細胞を同定する手
段を提供するのみならず、前−間葉、前−造血幹細胞から、間葉の、造血幹細胞
への発生を制御する機会をも提供する。Ｏｓｆ２の発現を調節することによって
、前−間葉、前−造血幹細胞から間葉の、造血幹細胞への移行が、制御されうる
。例えば、Ｏｓｆ２をコードする核酸は、哺乳類細胞、例えば、ｐＥＶＲＦ（Ｍ
ａｔｔｉａｓら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．、１７：６４１８、１９８９年
）のようなＣＭＶエンハンサー基本のベクターでのｃＤＮＡの発現に適切なベク
ターに挿入されうる。

【００９４】代わりに、本発明は、細胞を、このような発現を阻害するポリヌクレオチドと
接触させることを特徴とする、先祖細胞でのＯｓｆ２の発現を調節する方法を提
供する。したがって、間葉または造血幹細胞の発生が、Ｏｓｆ２の発現を調節す
ることによって制御できる場合、Ｏｓｆ２をＲＮＡに転写すること、またはＯＳ
Ｆ２ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳することに直接的に干渉する治療的アプロー
チ法は、可能である。ここで使用される場合、「Ｏｓｆ２標的核酸配列」は、Ｏ
ｓｆ２タンパク質またはその断片をコードする任意の核酸を包含する。例えば、
Ｏｓｆ２転写物ＲＮＡに結合するか、それを開裂するアンチセンス核酸またはリ
ボザイムも、本発明内に含まれうる。アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、
標的にされた遺伝子のＲＮＡメッセージと特異的に結合し、その遺伝子のタンパ
ク質産物の発現を中断する。アンチセンスは、細胞によって翻訳され得ない二本
鎖分子を形成する転写物ＲＮＡに結合する。約１５−２５ヌクレオチドのアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、それらが、容易に合成され、そしてちょうどアン
チセンスＲＮＡ分子のような阻害効果を示すので、好ましい。さらに、鉄結合エ
チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ−Ｆｃ）のような化学的に反応性の群は、
アンチセンス・オリゴヌクレオチドに付着され、それによりハイブリダイゼーシ
ョンの部位でＲＮＡの開裂を引起しうる。遺伝子のｉｎｖｉｖｏ翻訳を阻害す
るアンチセンス法のこれらおよび他の用途は、当業界で十分に知られている（例
えば、ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉ
ｏｌ．、５：３４３、１９９５年；Ｇｅｗｉｒｔｚ，Ａ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９３：３１６１、１９９６年；Ｓｔ
ｅｉｎ，Ｃ．Ａ．、Ｃｈｅｍ．ａｎｄＢｉｏｌ．，３：３１９、１９９７年）
。

【００９５】ここで使用される場合、「転写物ＲＮＡ」は、タンパク質産物をコードするヌ
クレオチド配列を含むＲＮＡである。好ましくは、転写物ＲＮＡは、メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ここで使用される場合、「ｍＲＮＡ」は、１つ
またはそれ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖ＲＮＡ分子で
ある。さらに、転写物ＲＮＡは、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）またはマスクＲＮ
Ａでありうる。ここで使用される場合、「ｈｎＲＮＡ」という語は、ＲＮＡポリ
メラーゼＩＩの一次転写物を表し、そしてそれからイントロンがスプライシング
によって除去される全てのメッセンジャーＲＮＡの前駆体を包含する。ｈｎＲＮ
Ａは、ｍＲＮＡを付与するように集約的に加工され、そしてそれは、タンパク質
合成が起る細胞質に伝えられる。このプロセシングとしては、５’末端での５’
−結合７−メチル−グアニレート「キャップ」および３’末端でのアデニレート
基の配列、ポリＡ「尾部」の付加、並びに任意のイントロンの除去、およびエキ
ソンと一緒のスプライシングが挙げられる。ここで使用される場合、「マスクＲ
ＮＡ」は、不活性形態で存在するｍＲＮＡの任意の形態である。さらに詳細には
、マスクＲＮＡは、形態発生の初期段階の間にマスクされていない（低下した）
タンパク質合成についての母系の情報の保存を構築する。

【００９６】アンチセンス核酸は、特定の転写物ＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であ
るＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ａｍｅｒｉｃａｎ、２６２：４０、１９９０年）。細胞では、アンチセンス核
酸は、対応の転写物ＲＮＡにハイブリッド形成し、それにより二本鎖分子を形成
する。例えば、細胞が、二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス
核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を干渉する。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴ
マーは、それらが、容易に合成され、そして大型分子より問題を生じそうにない
ので、好ましい。遺伝子のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳を阻害するアンチセンス法の使
用は、当業界でよく知られている（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．、１７２：２８９、１９８８年）。

【００９７】転写を失速させるオリゴヌクレオチドの使用は、オリゴマーが、二重らせんの
ＤＮＡに巻きついて、三本鎖らせんを形成するので、三重らせん攻略法として知
られている。したがって、これらの三重らせん化合物は、選択遺伝子上の特徴的
部位を認識するように設計されうる（Ｍａｈｅｒら、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅ
ｓ．ａｎｄＤｅｖ．，１（３）：２２７、１９９１年；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．、
ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ、６（６）：５６９、１９９１
年）。

【００９８】リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の手段で他の一本鎖ＲＮ
Ａを特異的に開裂する能力を保持するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコー
ドするヌクレオチド配列の修飾を通して、ＲＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配
列を認識し、そしてそれを開裂する分子を遺伝子操作することが可能である（Ｃ
ｅｃｈ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．、２６０：３０３０、１９８８年）
。このアプローチ法の主要な利点は、それらが、配列特異的であるので、特定の
配列を有するｍＲＮＡのみが、不活性化されることである。

【００９９】主に、テトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８
５、１９８８年）および「ハンマーヘッド」型の２種の基本的な型のリボザイム
がある。テトラヒメナ型リボザイムは、長さ４つの塩基である配列を認識する一
方で、「ハンマーヘッド」型リボザイムは、長さ１１−１８塩基の塩基配列を認
識する。認識配列が長ければ長いほど、配列が、標的ｍＲＮＡ種で集約的に起る
可能性は大きくなる。結局、ハンマーヘッド型リボサイムは、特定のｍＲＮＡ種
を不活性にするテトラヒメナ型リボザイムに好ましく、そして１８塩基認識配列
は、短い認識配列に好ましい。遺伝子のｉｎｖｉｖｏ翻訳を阻害するアンチセ
ンス法のこれらおよび他の用途は、当業界で十分に知られている。

【０１００】別の具体例では、本発明は、融合ポリペプチドを含む第一のコンテナーが、コ
ラーゲン結合ドメインおよび細胞成長または分化調節剤を包含し；そしてＯｓｆ
２−特異的結合剤を含む第二のコンテナーが、Ｏｓｆ２遺伝子産物に結合するこ
とを特徴する、２つまたはそれ以上のコンテナーを包含する、前−間葉、前−造
血幹細胞の検出のために有用なキットを提供する。１つの態様では、Ｏｓｆ２−
特異的結合剤が、Ｏｓｆ２ＲＮＡに結合する。別の態様では、Ｏｓｆ２結合剤
は、Ｏｓｆ２ポリペプチドに結合する。

【０１０１】本発明の別の態様により、ｅｘｖｉｖｏで同定された前−間葉、前−造血幹
細胞は、治療用途に利用できる。細胞は、間葉または造血細胞への分化の前に同
定されたので、それらは、先に記述されるとおり、結合組織または血液組織の発
生のために治療的に使用される能力がある。細胞は、一周の複製を必要とするレ
トロウイルスまたは他のベクターによって含まれる外因性遺伝子を受けるために
利用できる。代わりに、細胞は、自己で、または異種でのいずれかでの移殖に利
用できる。

【０１０２】ここに使用される場合、そして付随の請求項で、文脈が、別に明らかに指示さ
れないかぎり、単数形態（英語原文中の、「a」、「and」および「the」）は、複
数の指示物を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「標的
細胞」に対する指示物は、このような細胞の複数を包含し、そして「発現ベクタ
ー」に対する指示物は、１つまたはそれ以上の形質転換ベクターおよび当業者に
知られるその等価物などを包含する。

【０１０３】特に定義されない限り、ここに使用される全ての技術および科学用語は、本発
明が属する分野で通常に技術を習得した者に一般に理解されるのと同じ意味を示
す。あらゆる方法でも、ここに記述されるものに類似または等しい細胞および遺
伝子は、本発明の実施または試験で使用でき、好ましい方法、デバイス、および
材料は、ここで記述される。

【０１０４】ここに明記される全ての出版物は、ここで記述される発明と関連して使用され
うる出版物中に記述されるセルライン、ベクターおよび方法論を記述および開示
する目的のため、全部参照してここに組込まれる。上記及びテキスト全体でふれ
た出版物は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ提供される。ここ
で、本発明者らが、先行発明のおかげでこのような開示に先行する資格がないと
認めることと解釈されるべきものはなにもない。

【０１０５】材料および方法組換えＴＧＦｂ１−Ｖｗｆ融合タンパク質の遺伝子操作。原核生物の発現ベクターは、ヒトＴＧＦｂ１の成熟した活性な断片をコードす
るｃＤＮＡ配列、二次的フォンビルブラント因子由来のコラーゲン結合ドメイン
、および６×Ｈｉｓ精製タグ（ＴＧＦｂ１−ｖＷＦ）（Ｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉ
ｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１１：１６９、１９９７年）から構成される三者
間融合タンパク質を産生するように操作された。発現された融合タンパク質が単
離され、そしてニッケルキレート・クロマトグラフィーを用いて、大腸菌封入体
から均一となるまで精製され、８Ｍ尿素で可溶化され、そして最適化された酸化
還元条件下で酸化的に再生することによって復元された。ＴＧＦｂ１−ｖＷＦ融
合タンパク質の生物学的活性は、標準化された対照として市販のＴＧＦｂ１を使
用して、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイ（比活性：〜８５％）によって評価
された。

【０１０６】コラーゲン・ゲルの作製。ラット尾部腱Ｉ型コラーゲンは、Ｎｉｍｎｉら（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅ
ｒ．Ｒｅｓ．、２１：７４１、１９８７年）によって記述されるとおり作製され
た。簡潔には、ラット尾部腱を回収し、そして１×ＰＢＳで洗浄し、続いて一夜
、ペプシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）消化を行い、２回の１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．
５）沈降、および最初に０．５Ｍ酢酸に透析させ、その後０．００１ＮＨＣｌ
に透析させた。コラーゲンの濃度は、ヒドロキシプロリンアッセイによって測定
された；その純度は、２−Ｄペプチドマッピングによって確認された。３ｍｇ／
ｍｌコラーゲンを、３回、３×ＤＭＥＭで希釈して、１×コラーゲン溶液を作り
、ｐＨを７．５に調整し、分注して４℃で保存した。固形コラーゲン・マトリッ
クスは、Ｎｉｍｎｉおよび共同研究者によって先に記述されるとおり作製された
（Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ，１７：５１、１９８０年）。

【０１０７】細胞集団の作製。骨髄吸引液は、６週齢で安楽死させた２０グラムのＢ６ＣＢＡ免疫コンピータ
ント・マウス（ジャクソン・ラボズ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ），メイン州バ
ー・ハーバー（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ））から得られた。大腿中央
幹骨髄組織を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１０
０ｍｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭで洗浄した。数回、骨髄を１８ゲージ針の装
備されたシリンジに吸取ることによって、骨髄は収集された。低密度フラクショ
ンを収集し、そしてＤ１０培地で培養した後、骨髄吸引液をパーコールグラジエ
ントに積層した。これらの条件下で培養された骨髄細胞は、線維芽細胞コロニー
を生じる。これらの粘着細胞は、密集するまで迅速に成長し、そしてしばしば、
髄線維芽細胞として参照される。非接着細胞は、三日後に培地交換によって除去
され、そして残りの細胞は、密集するまで成長することができ、それにより多血
統能力を示し、したがって、間葉の幹細胞として操作的に知られた均質に線維芽
細胞様の細胞の集団を生じた。

【０１０８】ＴＧＦｂ１−Ｖｗｆを浸漬したコラーゲン・ゲル上でのＴＧＦｂ１−応答性幹
細胞の捕捉。上に記述されたネズミ骨髄吸引液から作製された細胞を５分間、１０００ＲＰ
Ｍで遠心分離によりペレット採取し、血清不含培地に再浮遊させ、血球計で計数
した。洗浄した細胞ペレットを、１０ｍｌ血清不含培地および２００ｍｌ中和コ
ラーゲンに浮遊させ、その後、１０ｍｌ組換えＴＧＦｂ１−ｖＷＦまたは対照培
地が添加された。細胞／コラーゲン混合物を、２４穴の組織培養プレートに移し
、そしてコラーゲン分子が原線維に凝集されるまで、３０分間、３７℃でインキ
ュベートし、コラーゲン・ゲル内に細胞を捕捉した。その後、ＤＭＥＭ培地中の
０．５％ＦＢＳ０．５ｍｌをゲル上に載せ、そして細胞を、培地を交換するこ
となしに７日間、３７℃でインキュベートした。血清奪取の７日後に、培地をＤ
ＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｄ１０）に交換し、そして培地を、３日毎に交換した。
この方法で製造される細胞は、上の条件下でｉｎｖｉｔｒｏで培養され、造血
および線維芽細胞の両方が死滅し、ＴＧＦｂ１−応答性細胞のみの選択および生
存を可能にする（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、８：１３８
５、１９９７年）。

【０１０９】ネズミ間葉およびＴＧＦｂ１−応答性間葉先祖細胞における骨芽細胞特異的因
子２（Ｏｓｆ２）発現の検出のための逆転写結合ＰＣＲ分析（ＲＴ−ＰＣＲ）。総ＲＮＡを、ＲＮＡゾール試薬を用いて、間葉およびＴＧＦｂ１−応答性骨髄
細胞から抽出した。簡潔には、５ｍｇの総ＲＮＡをランダムヘキサマーと２０ｍ
ｌ反応容積中でスーパースクリプトＩＩＲナーゼＨ−逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／
ＢＲＬ）で処理した。ＰＣＲ増幅は、５０ｍｌのインキュベーション容積で、２
．０ｍｌのｃＤＮＡ溶液を用いて、遺伝子ＡｍｐＰＣＲシステム９６００（パー
キン−エルマー）およびタックＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）
）を用いて行われた。ＰＣＲ増幅は、９４℃で２分間の反応の後、３０サイクル
（９４℃で１分間、５５℃で４５秒間、７２℃で４５秒間を１サイクルとする）
を行い、７２℃で７分間のＰＣＲ産物の最終的伸長を行った。マウスＯｓｆ２プ
ライマーは、センス：５’ＣＡＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＡ３
’（配列番号：２）およびアンチセンス：５’ＣＣＣＡＴＣＴＧＧＴＡＣ
ＣＴＣＴＣＣ３’（配列番号：３）から選択された。マウス１８Ｓリボソ
ーム・プライマー（内部対照）は、テキサスのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）から
購入された。１．６％アガロースゲル上で５０ｍｌ反応容積からＯｓｆ２につい
て４ｍｌ、そして１８Ｓについて２ｍｌをかけることによって、ＰＣＲ産物は、
分析され、そして臭化エチジウム染色によって可視化された。

【０１１０】間葉および造血の表現型へのＴＧＦｂ１応答性細胞の分化。Ｄ１０培地を用いた再生の７日後、培養物は、骨誘導剤（Ｄ１０培地中の１０ ^−８Ｍデキサメタソン、２．８×１０^−４Ｍアスコルビン酸および１０ｍＭβ−
グリセロールホスフェート）、上皮成長因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧ
Ｆｂ１−ｖＷＦ（濃度：１ｎｇ／２ｍｌＤＭＥＭ（血清不含培地）、および２
００ｍｌ中和コラーゲン（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、８
：１３８５、１９９７年）、造血幹細胞因子（ｃ−キットリガンドまたはｒｈＳ
ＣＦ−濃度：５０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン３（ＩＬ３−濃度：１０ｎｇ
／ｍｌ）のいずれかで補足されるか、またはあらゆる成長因子の補足なしに、Ｄ
１０で維持された。ＳＣＦまたはＩＬ３で補足された細胞をチャンバースライド
で培養し、そしてリューコスタチン染色で染色するか、またはＣＤ３４、ＣＤ３
またはＣＤ４５モノクローナル抗体で免疫染色した（カリフォルニア州ロサンジ
ェルスのサザンカリフォルニア大学医学部、ユニバーシティー・パソロジスツ）
。

【０１１１】結果ＴＧＦｂ１−応答性幹細胞と線維芽細胞性間葉幹細胞との間の単離、分化およ
び形態学上の区別。先の研究は、中胚葉起源の幹細胞を単離するために使用される方法論を特徴づ
け、そして遺伝子療法用途でのその潜在的な利用性を記述した。この技術は、非
常に選択的条件下で、二次的コラーゲン結合ドメインを担持するＴＧＦｂ融合タ
ンパク質に浸漬したコラーゲン・マトリックス上での骨髄由来の細胞の培養に関
与する。骨髄支質から単離された粘着性線維芽細胞の幹細胞と、操作的に指示さ
れた間葉幹細胞（ＭＳＣ）との間の明らかな形態学上の区別（Ｐｉｔｔｉｎｇｅ
ｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３、１９９９年；Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂ
ｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１４：７００、１９９９年）、およびＴＧＦｂ
１−ｖＷＦ選択によって捕捉され、そして前−間葉幹細胞（ＰＭＣ）と称された
非粘着性芽様前駆体細胞は、図１に示される。

【０１１２】間葉の表現型へのＴＧＦｂ１−応答性細胞の分化。（ｉ）支質細胞、（ｉｉ）脂肪細胞、（ｉｉｉ）軟骨細胞、および（ｉｖ）骨
細胞への定義された条件下の芽様前−間葉幹細胞の連続分化は、図２に示される
。本研究は、ＴＧＦｂ１−応答性細胞培養が、ビメンチン（vimentin）陽性であ
る支質細胞に分化されたＤ１０で維持する一方で、骨芽誘導性因子で補足した細
胞培養は、カルシウム沈着によって立証される骨形成コロニーを形成することを
示す。さらに、軟骨細胞へのＴＧＦｂ１−誘導分化での補足は、コラーゲンに陽
性である一方で、脂肪細胞へのＥＧＦ処理で誘導される分化は、スーダンブラッ
クに陽性に染色した（図２）。

【０１１３】Ｔｇｆｂ１−応答性幹細胞についての特徴のある分子マーカーとしてのＯｓｆ
２の同定。分化した血管の平滑筋細胞に対する増殖性新内膜平滑筋細胞における分化遺伝
子発現の先の研究は、線維芽細胞性支質細胞と比較して前−間葉幹細胞と特徴づ
けるために使用されうる分子マーカーとして骨芽細胞特異的因子２（Ｏｓｆ２）
を同定した（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３、１９９
９年）。デフィレンシアル・ディスプレーＰＣＲ技術によって測定されると、Ｏ
ｓｆ２は、血管損傷に対する応答で増殖するために調達される新内膜細胞で劇的
に上方調節される。Ｏｓｆ２は、（ｉ）最も早期段階の間葉の縮合で発生学的に
存在し、（ｉｉ）骨細胞でなくて骨芽細胞で発現され、（ｉｉｉ）分化ＳＭＣで
なくて増殖性平滑筋前駆体細胞で発現され、そして（ｉｖ）線維芽細胞で存在し
ない。本研究は、初回について、Ｏｓｆ２転写因子が、それ自体骨芽細胞特異性
でなく、中胚葉の幹細胞特異性で、したがって、最も発生学的に未発達な中胚葉
の幹細胞を同定するために使用されうることを示した。Ｏｓｆ２が、前−間葉幹
細胞を特異的に同定する「原理の立証」は、図３に示され、そしてそれは、ＲＴ
−ＰＣＲによって示される線維芽細胞（パネルＣ，レーン１）、粗骨髄吸引液（
パネルＣ，ＢＭ−ＳＣレーン４）、頭蓋冠骨（パネルＣ、レーン５）、全胚（パ
ネルＣ、レーン６）または成熟平滑筋細胞（パネルＣ、レーン７）でなくて、骨
髄由来の前−間葉幹細胞（パネルＣ、ＢＭ−ＰＭＳＣレーン２）におけるＯｓＦ
２の発現を樹立する。図３、パネルＤは、さらに、Ｏｓｆ２が、ＴＧＦｂ１−応
答性細胞の精製培養物で安定に検出され、前−間葉幹細胞（パネルＤ、ＰＭＣ；
レーン１および２）として表されるが、間葉幹細胞（ＭＳＣ）集団（パネルＤ、
レーン４）または全能胚性胚幹（ＥＳ）細胞（パネルＤ、レーン５）の培養物で
検出されないことの確認を供する。

【０１１４】造血成長因子に対する前−間葉幹細胞の応答性。ＴＧＦｂ１−応答性幹細胞の特徴的球状の非粘着性形態学の試験（図１）、定
義された条件下での血清再構築の後に発生した間葉の表現型の宿主の観察（図２
）、およびこの細胞型についての決定的な分子マーカー（Ｏｓｆ２）の特徴付け
（図３）は、これらの前−間葉幹細胞が、実際に、同様に造血分化能力を示すの
に十分に未発達でありうることを示した。この仮説を試験するために、我々は、
ＴＧＦｂ１−応答性幹細胞培養物における２つの造血成長因子（すなわち、ＳＣ
ＦおよびＩＬ３）の効果を試験した。図４に示されるとおり、選択された細胞集
団は、１０％ＦＢＳの添加で培養物中で増殖し始めた。これらの条件下で、限定
された範囲の分化が観察され（図４、パネルＡおよびパネルＢ）、そして高い核
対細胞質比を示す小型球状芽細胞である段階１；薄い糸状偽足および双極性表現
型の外観である段階２；細胞体の公然のへばりつき、すなわち、粘着応答の段階
３；および細胞質の増加した産生、および線維芽細胞表現型への変換の段階４と
して段階で特徴づけられる。造血幹細胞因子ＳＣＦを用いた治療は、増殖性応答
を誘導した（図４、パネルＣおよびパネルＤ）；しかし、形態学上の表現型は、
一般に上に記述される表現型の範囲に残った（段階１−４）。対照的に、ＩＬ３
の添加は、細胞サイズにおける際だった増加、そして後に、細胞のサイズばかり
でなく、形状（星型細胞および薄い糸状偽足付属物を伴う細胞）でも公然の変化
を付随した頑健な増殖応答（図４、パネルＥおよびパネルＦ）を誘導した。リュ
ーコスタチンで軽く染色することによって表されれるような培養での拡大した細
胞集団の形態学の実験は、Ｄ１０単独での処置のもの（図５、パネルＡおよびパ
ネルＢ）に比べて、ＩＬ３−処置細胞培養物の細胞質（図５、パネルＣおよびパ
ネルＤ）のサイズおよび造粒性における劇的増加を確認した。

【０１１５】ＩＬ３の存在下での骨髄様およびリンパ様の表現型へのＴＧＦｂ１−応答性幹
細胞の分化。Ｐ４幹細胞の造血分化を確認するために、ＩＬ３−処置細胞を、チャンバース
ライド上で育成し、リューコスタチン染色で染色し、そしてＣＤ３４、ＣＤ３お
よびＣＤ４５モノクローナル抗体で免疫染色した。拡大した細胞集団の免疫染色
は、幹細胞因子で処置された細胞と同様に、血清で刺激した細胞が、実際に、Ｃ
Ｄ３４＋であることを示した。対照的に、ＩＬ３で処置した細胞（図６）は、主
にＣＤ３４陰性（図６、パネルＢ）、ＣＤ４５＋（一般的白血球抗原；図６、パ
ネルＣ）およびＣＤ３＋（Ｔ細胞マーカー；図６、パネルＤ）であった。公知造
血成長因子、ＳＣＦおよびＩＬ３に対するこれらのＴＧＦｂ１−応答性幹細胞培
養の増殖性応答の例示は、間葉および造血細胞の共通の未発達な起点に対する最
初の連結を提供する。したがって、ＴＧＦｂ１−応答性幹細胞は、現在、多能性
前−造血、前−間葉の先祖Ｐ４幹細胞と称される。

【０１１６】考察支質組織は、体じゅうに分布された緩やかで、そして密集した結合組織の比較
的異種の集合である。間葉の、支質の、線維芽細胞性、網様の小網および紡錘は
、しばしば、これらの結合性組織を記述するために相互交換で使用されるが、し
かし、語句線維芽細胞性は、これらの細胞の全てを包含するために一般に使用さ
れる。利用できる技術および内在する基本的前提の両方で制限されて、細胞多様
性に関連した迅速に蓄積している情報を調節する継続的試みは、多くの仮説の血
統図の構築を生じた。

【０１１７】１つのこのような先祖細胞型は、操作的に間葉幹細胞と称される。これらの細
胞は、穏やかな機械的破壊、続いて、等級分けした針および時々ナイロンメッシ
ュを通過させることにより、脾臓、胸腺、リンパ節および骨髄のような組織の単
一細胞懸濁液から作成される。骨髄細胞は、選択された多量の胎児ウシ血清で補
足された培養用培地で維持される。代わりに、骨髄吸引液は、パーコールグラジ
エントに積層され得て、その後、低密度フラクションを収集し、そして標準培養
条件下で平板培養される。この手段で作成される細胞が、上の条件下でｉｎｖ
ｉｔｒｏで培養された場合、造血細胞の大半は死滅し、そして支質の線維芽細胞
コロニーが形成される。これらの全般的条件下で培養された骨髄細胞は、線維芽
細胞コロニーを引起し、各々は、単一細胞から由来する。いずれかの場合に、非
粘着性細胞は、培地交換によって除去され、そして残りの細胞は、密集するまで
生育し、それにより均質に線維芽細胞様細胞の集団を生じる。これらの粘着性線
維芽細胞は、標準培養条件下で継代されうる、および／または骨形成、軟骨形成
、または脂肪形成性に分化するように誘導されうるが、造血表現型は、定義され
た条件下でされない。これらの部分的に精製された培養物での大半（９５−９８
％）の間葉幹細胞は、骨芽細胞を認識しないが、真皮じゅうに分散された他の線
維芽細胞を認識するモノクローナル抗体によって認識される。さらに、腹膜液お
よび末梢血からと同様に、脾臓および胸腺のような他の臓器から得られる線維芽
細胞は、骨誘導剤で骨から形成できる。

【０１１８】最近開発された技術は、凝固フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）由来のＤ２コ
ラーゲン結合ドメインを組込む遺伝子操作されたＴＧＦｂ１融合タンパク質を使
用する（Ｔｕａｎら、Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．、３４：１、１９９６年）
。二次的コラーゲン結合ドメインを欠く非標的ＴＧＦｂ１タンパク質が、おそら
く、可溶性成長因子の短い半減期のため、先祖細胞の生存を支持しない場合、こ
れらのコラーゲン標的ＴＧＦｂ１−ｖＷＦ融合タンパク質は、ＴＧＦｂ１−応答
性先祖細胞の捕捉に有用である。これらのＴＧＦｂ１−応答性先祖細胞は、（ｉ
）骨形成および支質コロニーに分化すること、（ｉｉ）組換えタンパク質、例え
ば凝固因子ＩＸの産生のためにレトロウイルス依存性形質導入になじみやすいこ
と、および（３）移行した遺伝子産物の連続ｉｎｖｉｖｏ回復を示す免疫コン
ピーテントマウスに首尾よく移植されることを示した。したがって、ＴＧβ１−
ｖＷＦ−浸漬コラーゲン・マトリックスでの間葉の先祖細胞の捕捉および伸長は
、外傷治癒と同様に、遺伝子療法における集約的使用を示し得た。

【０１１９】本研究は、ＴＧＦｂ１−応答性先祖細胞の同定のための分子マーカーを提供す
る。この手段で同定され、多能性前−間葉、前−造血前駆体細胞（Ｐ４幹細胞）
として表される細胞は、多血統分化能力を保有する幹細胞の特徴的クラスを供す
る。ここで記述されるＰ４幹細胞は、多数の決定的な形態学および生理学上の条
件によって線維芽細胞の支質細胞から容易に区別されうる。第一に、Ｐ４幹細胞
は、均質的に小型、球状および芽様であり、そして骨髄吸引液からのそれらの最
初の単離により明らかに非粘性であるのに対して、線維芽細胞の支質細胞集団は
、細胞培養プレートに対する粘性に基づいて定義および単離の両方がなされる。
血清因子の再構築により、Ｐ４幹細胞は、コロニー形成単位に増殖し、そしてそ
れは、培養中で非常に限定された範囲の表現型多様性を示すが、しかし定義され
た条件下で骨形成前駆体に分化することをまだ誘導され得ない。支質の線維芽細
胞および真皮の線維芽細胞は、線維形成、骨形成、軟骨形成、および脂肪形成性
の分化を含めて相当に表現型の形成性を示すので、これらの細胞は、形態学上線
維芽性であるままであり、そしてＰ４幹細胞の球状の芽様形態学をけして仮定し
ない。さらに、本研究で同定されたＰ４幹細胞は、早期胚における最も未発達の
間葉の縮合を記録する決定的な分子マーカーＯｓｆ２を発現する（Ｄｕｃｙら、
Ｃｅｌｌ、８：７４７、１９９７年）が、粗骨髄吸引液、粘着性間葉幹細胞、ま
たは全能胚性幹細胞のいずれかでかなりの量では発現されない（例えば、図３参
照）。第三に、それぞれ、ＣＤ４５およびＣＤ３についての陽性染色によって立
証されるとおり、Ｐ４幹細胞は、骨髄様およびリンパ様表現型への細胞増殖およ
び分化における際だった増加とともに、ＩＬ３のような定義された造血成長因子
に均質に応答する。これらのデータは、未発達の前−間葉、前−造血幹細胞が、
生後のネズミ骨髄で存在し、そしてストリンジェント条件下で単離され、大規模
産生についての数に拡大され、そして伝達形成または造血経路に沿った分化に誘
導されうることを示す。

【０１２０】造血系統と異なり、細胞系統の同定、分化および段階は、比較的十分に定義さ
れる場合、いわゆる「間葉の幹細胞」の用語および系統は、生化学的または免疫
組織化学的に特徴づけられるよりむしろ、操作的なままである。選択的成長条件
を利用することによる造血幹細胞の機能的単離が報告されたとき、細胞致死性条
件が、支持性コラーゲンマトリックスに埋設される長期作用成長／生存因子と組
み合わされる選択的生理学的条件による間葉の前駆体細胞の単離は、特徴的な精
製攻略法を表す。Ｏｓｆ２転写因子の発現が、分画された細胞集団を同定および
特徴づけるために使用されうる。

【０１２１】本発明の多数の具体例が記述された。それにもかかわらず、種々の修飾は、本
発明の概念および範囲から逸脱することなく行われうることが分かる。したがっ
て、他の具体例でも、本請求項の範囲内にあり得る。

【０１２２】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF SOUTHERN CALIFORNIA <120> IDENTIFICATION OF PLURIPOTENT PRE-MESENCHYMAL, PRE-HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELL <130> Pre-Mesenchymal,Pre-Hematopoietic <140> PCT/US00/19989 <141> 2000-07-20 <150> 60/144,786 <151> 1999-07-20 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:von Willebrand factor (decapeptide) <400> 1 Trp Arg Glu Pro Ser Phe Met Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Mouse Osf2 sense primer <400> 2 catatgcttc attcgcctca caa 23 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Mouse Osf2 antisense primer <400> 3 cccatctggt acctctcc 18

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、骨髄由来間葉幹細胞およびＴＧＦｂ１−選択性前−間葉
幹細胞との形態的な比較を示す写真である。パネルＡは付着性間葉幹細胞である
。パネルＢは付着性間葉幹細胞の線維芽細胞の表現型を示す。逆に、骨髄採出液
からのＴＧＦｂ１−選択性幹細胞（パネルＣ）は、高い核対細胞質比を持つ球状
の牙細胞（パネルＤ）を示す。

【図２】図２は、前−間葉幹細胞の分化を示す写真である。ＴＧＦｂ１−
反応性前−間葉幹細胞は培養して増殖可能であり（左側）、増殖因子を添加した
培養条件下では、角膜細胞（パネルＡ）、脂肪細胞（パネルＢ）、軟骨細胞（パ
ネルＣ）、あるいは骨細胞（パネルＤ）に分化誘導される。

【図３】図３は、骨芽細胞特異的因子２（Ｏｓｆ２）がＴＧＦｂ１−反応
性幹細胞の分子マーカーであることを示す。パネルＡは、ＴＧＦｂ１−ｖＷＦを
植え付けたコラーゲン細胞上に７日間のストリンジェント選択を行った後で捕捉
される骨髄由来前−間葉幹細胞（ＢＭ−ＰＭＳＣ）を示している。パネルＢは、
パネルＡで述べたように処理した細胞は特徴的な骨細胞の形態をしていることを
示す。パネルＣは、相対的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、骨芽細胞特
異的因子２（矢印）の発現がＢＭ−ＰＭＳＣでは起こるが、線維芽細胞、粗抽出
骨髄液（ＢＭ−ＳＣ）、頭蓋骨上部骨、全胚、あるいは血管平滑筋細胞等では見
られなかった。パネルＤは、初代細胞培養へのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。骨芽
細胞特異的因子２（Ｏｓｆ２）はＴＧＦｂ１−選択性前−間葉幹細胞（ＰＭＣ、
列１および２）には検出されたが、間葉幹細胞（ＭＳＣ）（列４）や胚幹細胞（
ＥＳ、列５）には検出されなかった。

【図４】図４は、ＴＧＦｂ１−反応性幹細胞への造血増殖因子処理の影響
を示す。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養したＴＧＦｂ１−選択性前−間葉
幹細胞は増殖を始め（パネルＡ）一定の分化を示した：段階１、小さな非付着性
芽細胞；段階２、細偽足の伸展および二極性の表現型；段階３，二極性細胞の明
らかな平坦化および付着；段階４，細胞質の増加および線維芽細胞形態への分化
（パネルＢ）。幹細胞因子は細胞増殖を有意に促進させたが（パネルＣ）明白な
細胞質分化の限定された様相は変えることはなかった（パネルＤ）。逆に、ＩＬ
３で処理した細胞は大規模な増殖をし（パネルＥ）大きなＣＦＵ−ＧＥＭＭ−様
細胞に形質転換した（パネルＦ）。

【図５】図５は、ＩＬ３処理後のＰ４幹細胞の形態を示す。コラーゲンゲ
ルに捕捉されたＴＧＦｂ１−反応性幹細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで
特徴的な形態を示し（パネルＡ）、これは修飾Ｗｒｉｇｈｔｓ染色法により示さ
れた（パネルＢ）。ＩＬ３の添加は、Ｗｒｉｇｈｔｓ染色で明らかなように（パ
ネルＤ）顆粒性の細胞質を持つ、より大きい細胞の増殖と出現を促した（パネル
Ｃ）。

【図６】図６は、ＩＬ３で処理したＰ４幹細胞の免疫染色を示す。成熟し
た顆粒球、好酸球、および単核球（パネルＡ）は、ロイコスタチン染色（パネル
Ｂ）、ＣＤ３４陰性細胞（パネルＣ）、ＣＤ４５＋細胞（パネルＤ）およびＣＤ
３＋細胞（パネルＥ）で染色された。種々の図における参照シンボル類は要素類を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/04 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/06 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ホールフレデリックエルアメリカ合衆国カリフォルニア州 91203 グレンデールパイオニアドライブ 345 スイート 1803 ウエストＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA09 CA11 HA12 4B063 QA18 QQ08 QQ43 QQ79 QR40 QR48 QR56 QS33 QX02 4B065 AA91 AA93 AC14 BB34 CA44 4C076 AA19 AA29 BB11 BB13 CC03 CC14 CC26 4C087 AA01 AA02 AA03 BB44 BB63 MA24 MA44 MA66 NA14 ZA51 ZA96

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離した多能性前−間葉、前−造血先祖幹細胞。
【請求項２】請求項１に記載する細胞で、Ｏｓｆ２遺伝子発現産物を含む
細胞。
【請求項３】請求項２に記載する細胞で、Ｏｓｆ２遺伝子発現産物がＯｓ
ｆ２ポリペプチドをコードしているＲＮＡである細胞。
【請求項４】請求項２に記載する細胞で、Ｏｓｆ２遺伝子発現産物がＯｓ
ｆ２ポリペプチドである細胞。
【請求項５】請求項１に記載する細胞で、細胞増殖調節剤に反応する細胞
。
【請求項６】請求項５に記載する細胞で、反応する前記細胞増殖調節剤が
ポリペプチドである細胞。
【請求項７】請求項６に記載する細胞で、前記ポリペプチドが、コラーゲ
ン結合ドメインおよび増殖因子あるいはその活性画分からなる融合ポリペプチド
である細胞。
【請求項８】請求項７に記載する細胞で、前記増殖因子が、上皮成長因子
（ＥＧＦｓ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ
ｓ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦｓ）、および
造血細胞増殖因子（ＨｅＧｆｓ）から選択したものである細胞。
【請求項９】請求項８に記載する細胞で、前記増殖因子が、ＴＧＦｂ１で
ある細胞。
【請求項１０】請求項７に記載する細胞で、前記コラーゲン結合ドメイン
がフォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインである細胞。
【請求項１１】請求項１０に記載する細胞で、前記フォンビルブラント因
子のコラーゲン結合ドメインがＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）のデカペプ
チドである細胞。
【請求項１２】請求項１に記載する細胞で、哺乳動物の骨髄に由来する細
胞。
【請求項１３】請求項１２に記載する細胞で、前記哺乳動物が、霊長類、
ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、マウス、ヒツジ、ヤギ、オオカミ、ヒョウおよびウシ
から選択したものである細胞。
【請求項１４】請求項１３に記載する細胞で、前記霊長類がヒトである細
胞。
【請求項１５】単離した多能性前−間葉、前−造血幹細胞であり、分化や
細胞死を誘導しない条件下で培養した場合に未分化の状態を維持できる幹細胞。
【請求項１６】請求項１で明らかにしたように、治療的に有効な量の幹細
胞および医薬的に可能な担体あるいは賦型剤を含有する医薬品組成。
【請求項１７】請求項１６に記載する医薬品組成で、徐放性の医薬品組成
。
【請求項１８】請求項１７に記載する医薬品組成で、リポゾーム形の医薬
品組成。
【請求項１９】請求項１６に記載する医薬品組成で、凍結乾燥品の医薬品
組成。
【請求項２０】請求項１６に記載する医薬品組成で、単一投与形の医薬品
組成。
【請求項２１】患者の結合組織に関連した異常を軽減する方法で、医薬的
に可能な担体中に治療的に有効な量の単離した多能性前−間葉、前−造血幹細胞
を患者に投与する方法。
【請求項２２】患者の血液組織に関連した異常を軽減する方法で、医薬的
に可能な担体中に治療的に有効な量の多能性前−間葉、前−造血幹細胞を患者に
投与する方法。
【請求項２３】患者の骨髄組織再生を促進する方法で、治療的に有効な量
の多能性前−間葉、前−造血幹細胞を患者に投与し、その細胞が患者の骨髄組織
再生を促進する方法。
【請求項２４】請求項２１−２３に記載するいずれかの方法で、多能性前
−間葉、前−造血幹細胞を静脈内注射あるいは目的の活性部位に直接注射するこ
とにより投与する方法。
【請求項２５】請求項２１−２３に記載するいずれかの方法で、多能性前
−間葉、前−造血幹細胞が自己のものである方法。
【請求項２６】以下の細胞集団から前−間葉、前−造血幹細胞を同定する
方法：（ａ）動物種からの細胞集団の採取、（ｂ）（ａ）項の細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの培養、（ｃ）（ｂ）項の細胞と骨芽細胞特異的因子２（Ｏｓｆ２）の発現を誘導する
細胞増殖調節剤との接触、および、（ｄ）骨芽細胞特異的因子（Ｏｓｆ２）を発現する前−間葉、前−造血幹細胞
の同定。
【請求項２７】請求項２６に記載する方法で、前記細胞増殖調節剤がポリ
ペプチドである方法。
【請求項２８】請求項２７に記載する方法で、前記ポリペプチドが、コラ
ーゲン結合ドメインおよび増殖因子あるいはその活性画分からなる融合ポリペプ
チドである方法。
【請求項２９】請求項２８に記載する方法で、前記増殖因子が、上皮成長
因子（ＥＧＦｓ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤ
ＧＦｓ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦｓ）、お
よび造血細胞増殖因子（ＨｅＧｆｓ）から選択したものである方法。
【請求項３０】請求項２８に記載する方法で、前記コラーゲン結合ドメイ
ンがフォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインである方法。
【請求項３１】請求項３０に記載する方法で、前記フォンビルブラント因
子のコラーゲン結合ドメインがＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）のデカペプ
チドである方法。
【請求項３２】請求項２６に記載する方法で、前記細胞集団が骨髄に由来
する方法。
【請求項３３】請求項２６に記載する方法で、Ｏｓｆ２遺伝子発現がＯｓ
ｆ２ＲＮＡの発現である方法。
【請求項３４】請求項２６に記載する方法で、Ｏｓｆ２遺伝子発現がＯｓ
ｆ２ポリペプチドである方法。
【請求項３５】請求項２６に記載する方法で、前記動物が哺乳動物である
方法。
【請求項３６】請求項３５に記載する方法で、その哺乳動物が、霊長類、
ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、マウス、ヒツジ、ヤギ、オオカミ、ヒョウおよびウシ
から選択したものである方法。
【請求項３７】請求項３６に記載する方法で、前記霊長類がヒトである方
法。
【請求項３８】請求項２６に記載する方法で同定される細胞。
【請求項３９】以下の細胞集団から前−間葉、前−造血幹細胞を同定する
方法：（ａ）動物種からの細胞集団の採取、（ｂ）（ａ）項の細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの培養、（ｃ）（ｂ）項の細胞と骨芽細胞特異的因子２（Ｏｓｆ２）の発現を誘導する
細胞増殖調節剤との接触、（ｄ）Ｏｓｆ２調節部位と操作可能なように関連した検出可能なマーカーをコ
ードしている核酸配列からなる遺伝子構造の誘導、および、（ｅ）検出可能なマーカーを発現する細胞の同定、さらに、検出可能なマーカーは前−間葉、前−造血幹細胞を示している方法。
【請求項４０】請求項３９に記載する方法で、更に、細胞集団から検出可
能なマーカーを発現する細胞の分類からなる方法。
【請求項４１】請求項４０に記載する方法で、前記細胞分類が蛍光活性化
細胞分類（ＦＡＣＳ）による方法。
【請求項４２】請求項４０に記載する方法で、検出可能なマーカーが蛍光
受容体である方法。
【請求項４３】請求項４２に記載する方法で、検出可能なマーカーが緑色
蛍光体タンパク（ＧＦＰ）である方法。
【請求項４４】請求項３３に記載する方法で同定される細胞。
【請求項４５】前−間葉、前−造血幹細胞を同定するのに有用なキットで
、以下の２つないしそれ以上の容器で密閉されて受け取るために仕切られた運搬
容器からなるもの、（ａ）細胞増殖調節剤を含む最初の容器、および（ｂ）Ｏｓｆ２−特異的なプローブを含む二番目の容器。
【請求項４６】請求項４５に記載するキットで、Ｏｓｆ２−特異的プロー
ブが、Ｏｓｆ２ポリヌクレオチドに加水分解される核酸プローブであるキット。
【請求項４７】請求項４５に記載するキットで、Ｏｓｆ２ポリヌクレオチ
ドが、Ｏｓｆ２ＲＮＡであるキット。
【請求項４８】請求項４５に記載するキットで、Ｏｓｆ２−特異的プロー
ブが、Ｏｓｆ２ポリペプチドに結合する抗体であるキット。
【請求項４９】請求項４５に記載するキットで、Ｏｓｆ２−特異的プロー
ブ試薬が、検出可能なように標識されているキット。
【請求項５０】請求項４９に記載するキットで、その標識が、放射性同位
元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光物質、金属キレート剤、および酵
素から選択されるキット。
【請求項５１】サンプルの先祖細胞から前−間葉、前−造血幹細胞を産生
する方法で、サンプルとＯｓｆ２タンパクを接触させる方法。
【請求項５２】サンプルの先祖細胞から前−間葉、前−造血幹細胞を産生
する方法で、サンプルとＯｓｆ２をコードする核酸を接触させる方法。