CN1122716C - 体外细胞培养和移植试剂盒 - Google Patents

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Abstract

公开了一种体外细胞培养和移植试剂盒，它含有：在从人体获得的细胞混合物中选择具有所需表现型的细胞的装置；从混合物分离选择的细胞的装置；孵育分离细胞的装置；含有有效量的细胞扩增因子的组合物，其中扩增因子选自：GM-CSF、G-CSF、IL-1、IL-3、IL-6、TPO、EPO、flt3-配体、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白；以及细胞生长培养基。

Description

体外细胞培养和移植试剂盒
发明领域
本发明涉及细胞选择和扩增技术，更具体地，涉及体外细胞培养和移植试剂盒。
发明背景
细胞减少疗法涉及采用电离辐射和化学毒素来杀死迅速分裂的细胞。由于对正常细胞的细胞毒性作用而带来的典型副作用限制了细胞减少疗法的应用。常见的副作用是骨髓抑制，或者损害产生红细胞、白细胞和血小板的骨髓细胞。而骨髓抑制的结果，将使病人得血细胞减少症，或血细胞缺乏，这些会增加感染和出血疾病的风险。血细胞减少症会增加发病率及死亡率，并导致在癌症治疗中的低剂量服药。另一方面，高剂量的化学疗法在治疗上是有益的，因为与标准剂量的疗法相比较，它可以提高患转移癌症尤其是乳腺癌病人的目标应答频率。它可使一些甚至预后不良病人长期无病缓解。然而，高剂量的化学疗法具有毒性，很多会导致与感染、出血疾病、及其它与长期骨髓再生障碍相关影响等有关的临床并发症。
许多临床研究者已经设计了各种细胞减少疗法的剂量方案和计划来增加癌症治疗的服药量，同时又可以限制其对骨髓的损害。另一种方法是利用这样一个事实：血细胞来自造血干细胞，而这些干细胞定向分化成不同的谱系，即红细胞系的、巨核细胞的、粒细胞的、单核细胞和淋巴细胞。因此，在用细胞减少疗法治疗癌症病人中，针对这些干细胞的细胞分离十分感兴趣。一种疗法涉及骨髓或外周血细胞移植，在该方法中，在细胞减少治疗之前，收集骨髓或循环系统中的造血祖细胞或干细胞并通过细胞培养而繁殖。接着在治疗后将扩增的细胞群再输入以恢复完整的造血功能。任选地，可以使用选择步骤以增加收集的外植体中造血祖细胞的相对数目。通过再输入分离的干细胞或祖细胞，可以大大减少将其他类型的细胞(包括恶性细胞)再输入的机会。此外，在同种异体移植过程中，通过仅选择干细胞或祖细胞可大大减少移植的T细胞的数目，从而降低引发病人患移植物抗宿主病(Graft-versus-Host Disease，GvHD)的可能性。
已知有各种细胞选择技术可在一群细胞中鉴别和分离出造血干细胞或祖细胞。用于鉴别和选择这些细胞类型的方法和材料是已知的。例如，可用单克隆抗体与干细胞或祖细胞上发现的标记蛋白或表面抗原蛋白结合。造血干细胞的这类标记物或细胞表面抗原包括CD34，My-10和Thy-1。在一种方法中，将抗体固定于某一表面如玻璃珠表面，然后与可能含有干细胞的细胞混合物接触。这使抗体可结合并将干细胞固定于玻璃珠。或者，可将抗体和细胞混合物一起孵育，将形成的共混物与对抗体—细胞复合物具有亲和性的表面进行接触。将不需要的细胞和细胞物质去除，得到较纯的干细胞群。具有CD34标记物的干细胞占骨髓中单核细胞的约1-3％。CD34+干细胞在外周血中数量比在骨髓中低约10-100倍。因此，为了减少从骨髓或外周血中获得的所需干细胞的数目，需要具有增加或扩增分离的干细胞数目的方法，以便在高剂量的放射或化学治疗后使骨髓快速而完全地恢复。
另一种细胞选择方法涉及用某种抗代谢物(antimetabolite)去除分裂细胞。通过将细胞因子刺激和抗代谢物处理两者结合起来，可在应答细胞中诱发细胞死亡。因此，抗细胞因子增殖效应的细胞被阳性选择出。参见Beradi等人，Sci-ence，267：104(1995)。
使用扩增的干细胞还允许在不能获得足量干细胞的情况下进行移植。一种被称为体外干细胞培养和移植(ESCCAT)的程序，也称为回体(ex vivo)扩增，通常涉及从外周血、骨髓或脐带血中获取自体或同种异体干细胞，分离出干细胞，然后体外扩增这些细胞。在扩增之后，将细胞输入病人。
发明概述
本发明涉及细胞选择和扩增技术，尤其是体外细胞培养和移植(ESCCAT)。更具体地，本发明涉及体外细胞培养和移植试剂盒，该试剂盒含有，但并不限于：在从人体获得的细胞混合物中选择具有所需表现型的细胞的装置；从混合物分离选择的细胞的装置；孵育分离细胞的装置；含有有效量的细胞扩增因子的组合物，其中扩增因子选自：GM-CSF、G-CSF、IL-1、IL-3、IL-6、TPO、EPO、flt3-配体、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白；以及细胞生长培养基。在试剂盒中，分离装置用于接受细胞混合物和选择装置，并用于从混合物中分离所需细胞。此外，孵育装置用于接受来自分离装置的分离细胞、细胞生长培养基和扩增因子组合物，并进一步用于使细胞扩增因子与分离细胞充分接触，从而发生细胞扩增。
任选地，本发明的试剂盒可含有容器，以盛装从人体收集来的细胞混合物，其中该容器用于接受收集的细胞，有时还可接受选择装置。
本发明的试剂盒提供了大量的细胞扩增因子，这些因子在ESCCAT中用于刺激能自我更新的干细胞增殖以及谱系定向(lineage-committed)的祖细胞的增殖和分化。这些细胞生长因子包括白细胞介素1和3(分别为IL-1和IL-3)、粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSFs)、GM-CSF和IL-3的分子融合蛋白(PIXY321)、flt3-配体和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。其他血细胞生长因子包括干细胞因子(SF)(也称为c-kit配体、肥大细胞生长因子和钢因子)、血小板生成素、红细胞生成素(EPO)和IL-6。这些因子可用于促进分离的干细胞和祖细胞的体外扩增。
本发明的试剂盒可用于选择和扩增具有所需表现型的任何细胞群。例如，该试剂盒可用于造血干细胞和祖细胞的扩增和移植、T细胞或B细胞的扩增和移植，以及基因治疗。发明的详细描述
本发明涉及细胞选择和扩增技术，尤其是体外细胞培养和移植。如此处所述，本发明包括一种ESCCAT试剂盒，它含有：
1)在细胞混合物中选择具有所需表现型的细胞的装置；
2)从混合物中分离选择的细胞的装置；
3)孵育分离细胞的装置；
4)含有有效量的细胞扩增因子的组合物，其中扩增因子选自：GM-CSF、G-CSF、，IL-1、IL-3、IL-6、TPO、EPO、flt3-配体、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白；以及
5)细胞生长培养基。
可设计任选的容器，以便最初接受收集的细胞，有时还可接受选择装置。分离装置用于接受直接来自病人或来自任选的容器的细胞混合物和选择装置。分离装置还用于从混合物中分离选择出的细胞。孵育装置用于接受来自分离装置的分离细胞、细胞生长培养基和扩增因子组合物，并进一步用于使细胞扩增因子与分离细胞充分接触以诱发分离细胞的扩增。
可从各种来源收集细胞混合物。对于选择造血干细胞或祖细胞，一般是从包括骨髓、外周血或脐带血在内的来源收集细胞。定义
术语“干细胞”和“祖细胞”指多潜能的早期谱系细胞。与本领域中一般习惯相同，在本文中这两个术语可互换使用。术语“干细胞或祖细胞”指或者干细胞、或祖细胞，或者干细胞和祖细胞的混合物。如本领域中通常使用的那样，干细胞和祖细胞一般可用下列细胞特征进行鉴别：CD34+，CD33-，CD38-，Thy-1+和My-10+。
此处所用的术语“flt3-L”是指在祖细胞和干细胞中所发现的能够与flt3受体独立结合或复合的一类多肽。术语“flt3-L”还包含EP-A 627 487中所述的蛋白质，该专利在此引用作为参考。术语“flt3-L”包含具有EP-A 627 487中氨基酸顺序SFQ ID NO：6的1至235的蛋白质，以及与该蛋白质具有高度相似性或高度同一性的、具有生物活性并可结合flt3受体的蛋白质。并且，此术语指EP-A 627,487中序列SEQ ID NO：5的DNA的具有生物活性的基因产物。术语“flt3-L”更进一步包括膜结合蛋白质(包括胞内区域、跨膜区域和胞外区域)，以及基本含有蛋白质的胞外部分、保留生物活性并能被分泌的可溶性或被截短的蛋白质。这类可溶性蛋白质的特殊例子是在EP-A 627,487中具有氨基酸顺序SEQ ID NO：6的28至160的蛋白质。
术语“IL-1”指IL-1α和IL-1β中任何一个或两个(March et al.，Na-ture，315：641，1985)。IL-1α和IL-1β都能与IL-1受体(I型和II型)结合。前体和成熟形式的IL-1α都有活性，而IL-1β只有在成熟形式下才有活性(March et al.，同上)。术语“IL-1”也指活性片段和具有不同氨基酸序列的类似物和衍生物如具有IL-1组份和IL-1生物活性的融合蛋白，参见Mosley etal.，Proc.Natl.Acad，Sci 84：4572(1987)。
术语“IL-3”指在美国专利No.5,108,910中所述的一组白细胞介素3多肽，该专利在此引用作为参考。这些多肽包括氨基酸序列与天然的人白细胞介素3的氨基酸序列(例如在欧洲专利出版物No.275,598和282,185中公开的，这些文献在此引用作为参考)基本相似的类似物。术语“IL-3”还包括具有至少某些与天然人IL-3相同生物活性的IL-3分子的类似物和等位基因。IL-3的代表性的类似物公开于欧洲专利出版物No.282,185。其他形式的IL-3包括人IL-3[Pro8Asp15Asp70]、人IL-3[Ser8Asp15Asp70]和人IL-3[Ser8]。编码适用于本发明的人IL-3蛋白质的DNA序列可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)公开获得，索引号为ATCC67747。此处所用的括号中的氨基酸序列的有关术语是用于指出与天然人的蛋白质不同的氨基酸。例如，人IL-3[Ser8Asp15Asp70]指8位氨基酸变为丝氨酸残基，15位氨基酸变为天冬氨酸残基以及70位氨基酸变为天冬氨酸残基的人IL-3蛋白。
术语“IL-6”指在PCT出版物WO88/00206、EP 257406和EP-A 331,640中所述的一组蛋白质，这些专利在此引用作为参考。IL-6与“干扰素-β2”(Zilberstein et al.，EMBO J.，5：2529(1986))及“可在人成纤维细胞中诱导的26KD蛋白质”(Haegeman et al.，Eur.J.Biochem.，159：625(1986))是相同的。这些蛋白质包括氨基酸序列与天然的人白细胞介素6的氨基酸序列基本相同的、具有生物活性(可结合IL-6受体、通过结合IL-6受体而引发生物信号的转换、或与抗IL-6抗体交叉反应)的类似物。IL-6的核苷酸序列和推导的氨基酸序列已经公开，例如在WO88/00206中。术语“IL-6”还包括足以保留天然人IL-6的生物活性的天然人IL-6分子的类似物。
如本文所用，“GM-CSF”指在美国专利No.5,108,910和5,229,496中所述的一组蛋白质，这些专利在此引用作为参考。这些蛋白质包括氨基酸序列与天然人GM-CSF的氨基酸序列(例如公开获得的ATCC53157或ATCC39900)基本相同的、具有生物活性(可结合GM-CFS受体或与抗GM-CSF抗体交叉反应)的类似物。氨基酸序列已经公开，例如在Anderson，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：6250(1985)中。市售的GM-CSF(sargramostim)可从Immunex Corp.，Seattle，WA处获得。术语“GM-CSF”还包括足以保留天然人GM-CSF的生物活性的天然人GM-CSF分子的类似物。GM-CSF的代表性类似物包括例如在欧洲专利出版物No.212914和WO89/03881中描述的类似物，这些专利在此引用作为参考。GM-CSF的其他类似物还可用于构建与IL-3的融合蛋白。编码特别优选的、潜在糖基化位点被去除的GM-CSF蛋白的DNA序列可从ATCC公开获得，索引号为ATCC67231。
术语“GM-CSF/IL-3融合蛋白”指GM-CSF和IL-3的C末端与N末端融合的融合蛋白。融合蛋白是已知的，在美国专利No.5,199,942、5,108,910和5,073,627中有所描述，这些专利在此引用作为参考。优选的融合蛋白是在美国专利No.5,199,942中描述的PIXY321。
术语“基本相似(或类似)”指变异体氨基酸序列较佳地与天然氨基酸序列有至少80％相同，最佳至少90％相同。同源性的百分比可通过比较顺序资料加以确定，例如使用Devereux等人(Nucl.Acids.Res 12：387，1984)所描述的6.0版的GAP计算机程序，此程序可从威斯康辛大学遗传学计算机组(Univesity ofWiscousin Genetics Computer Group(UWGCG))得到。GAP程序使用了经Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1981)修订过的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的排列方法。对于GAP程序较好的缺省参数包括：(1)对核苷酸的一元比较矩阵(包含数值1指同一和数值0指非同一)，以及如Schwartz和Dayhoff所描述的Gribskov-Burgess(Nucl.AcidsRes.14：6745，1986)的加权比较矩阵(Atlas of Protein Sequence and Struc-ture，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358，1979)；(2)对每一个缺隙的罚分为3.0，对每一个缺隙中的每一个符号有附加0.10的罚分；(3)对末端缺隙没有罚分。变异体可以包含保守替换顺序，这指一个氨基酸残基被一个具有相似的物理化学性质的氨基酸残基所替换。保守替换的例子包括用一个脂肪族氨基酸替换另一个。例如用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸间相互替换；或用一个极性氨基酸替换另一个，如赖氨酸和精氨酸之间，谷氨酸和天冬氨酸之间以及谷氨酰胺和天冬酰胺之间的替换。其他这类保守性替换是已知的，例如，具有相似疏水性的整个区域的替换。本发明也包括天然产生的细胞扩增因子的变异体。这类变异体的例子有由于交替的mRNA剪接作用造成的或由于天然蛋白的蛋白酶解作用而得到的蛋白质，其中生物活性仍保留。
术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如重组宿主细胞培养物的纯化产物或纯化的抽提物。
术语“自体移植”指将所需表现型的细胞从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需表现型的细胞从某病人中取出并再施用于另一不同病人的方法。术语“同基因移植”指在遗传上相同的人之间发生的细胞移植。
如本文所用，术语“扩增”指提高、增加、或丰富具有所需表现型的细胞的数目。
术语“ESCCAT”指这样一种方法，它包括(1)从人体收集具有所需表现型的细胞；(2)用含有有效量细胞扩增生长因子的组合物扩增回体细胞，从而提供所需细胞的数目增加的细胞制剂；和(3)结合细胞减少治疗或在细胞减少治疗之后，将细胞制剂给病人施用。
与细胞扩增因子连用的术语“有效量”指为了实现所需水平的细胞扩增而所需要的扩增因子的量。特定的细胞扩增因子的有效量取决于各种变量因素，这对本领域的一般技术人员而言是很显而易见的。这些变量包括，所需的扩增水平、某个因子是否与其他因子一起使用以及待扩增的细胞类型。有效量的确定是属于本领域技术范畴之内。
在一个优选例子中，细胞扩增生长因子选自：GM-CSF/IL-3融合蛋白、IL-1α或flt3-配体。
在另一个例子中，本发明的体外细胞培养和移植试剂盒含有一种组合物，该组合物含有有效量的选自下组的扩增因子：G-CSF、IL-3，IL-6、TPO、EPO和SF。
此外，本发明的试剂盒可用于基因治疗。基因治疗涉及将外源DNA转染的细胞给某宿主施用从而进行移植。参见，例如Boggs，International J.CellCloning，8：80-96，(1990)；Kohn et al.，Cancer Invest.，7(2)：179-192(1989)；Lehn，Bone Marrow Transpl.，5：287-293(1990)；和Verma，Scien-tific American，pp.68-84(1990)。因为外源DNA向细胞的遗传转移发生于细胞分裂时，所以用本发明的试剂盒可大大提高这种转移的有效性。使用含有有效量的选自下组的至少一种细胞扩增因子的组合物：GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-3、IL-6、TPO、EPO、flt3-配体、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白，将有助于选择的细胞更快速地增殖或分化。因此，可大大增加在收集的细胞中的遗传物质的摄入量。通常，基因治疗方法是本领域中已知的，它包括步骤(a)在生长培养基中培养分离的干细胞，其中该培养基含有至少一种选择上组的细胞扩增因子；(b)用外源基因转染步骤(a)的培养细胞；和(c)将转染的细胞施用于哺乳动物。
在需要选择、分离和扩增造血干细胞或祖细胞时，在优选试剂盒中用于分离造血干细胞的装置含有(a)flt3受体结合蛋白和(b)与选自CD34，My-10或Thy-1的细胞标记物结合的单克隆抗体中至少一种。
对本发明试剂盒的各方面而言，试剂盒含有从收集的细胞混合物中选择具有所需表现型的细胞的装置。选择合适的选择装置将取决于所需的待分离的细胞表现型。造血干细胞可利用它们的物理特性加以选择，例如利用它们表达膜结合flt3受体、或者利用它们具有下列细胞标记物：CD34，Thy-1和My-10。识别这些抗原的单克隆抗体(抗-My-10)在美国专利No.4,714,680中有描述，该专利在此引用作为参考。抗-CD34可从Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ购得。抗-Thy-1单克隆抗体可用Dalchau et al.，J.Exp.Med.149：576(1979)所述的方法方便地获得，该文献在此引用作为参考。也可使用flt3受体结合蛋白，例如抗-flt3单克隆抗体或flt3-配体，它们描述于EP-A 627,487中。其中flt3-配体可从Immunex Corporation，Seattle，WA获得。让细胞结合蛋白与收集的细胞混合物接触，共混物再充分保温一段时间使所需的细胞与细胞结合蛋白结合。
另一种选择静止干细胞的方法是用抗代谢物如5-氟尿嘧啶(5-FU)或烷化剂如4-羟基环磷酰胺(4-HC)诱导分裂的、谱系定向的细胞类型中的细胞死亡。通过加入对干细胞无影响或只有很小影响的生长因子，可刺激非静止的细胞增殖和分化，使除干细胞之外的细胞增殖和分化，从而使它们更容易受到5-FU或4-HC的细胞毒效应的伤害。参见Berardi等人，Science，267：104(1995)，该文献在此引用作为参考。
本发明的试剂盒还包括分离具有所需表现型的选择细胞的装置。分离细胞可用例如亲和色谱、涂有抗体的磁性珠或固定于固体基质如玻璃、烧瓶的抗体等进行。可将识别干细胞表面标记的抗体连于或共轭于其他化学成分如生物素，它可用固定于固相载体的抗生物素或链霉抗生物素蛋白部分、用于荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)中的荧光团等移去。较佳地，分离用免疫亲和柱完成。免疫亲和柱可以是任何形式，但一般是填塞的床式反应器。在生物反应器中的填塞反应床最好是用多孔材料制成，而多孔材料具有基本均匀的底物涂层。提供高表面积对体积比的多孔材料使得细胞混合物流过时可与很大的表面接触而又不会阻碍细胞流出反应床。典型的底物包括抗生物素和链霉抗生物素蛋白，尽管也可使用其他常规底物。这些底物，或者因其自身特性，或者因为添加了化学成分而对细胞结合蛋白如单克隆抗体上的某部分有高亲和性。单克隆抗体识别待分离细胞上的细胞表面抗原，而且一般还可进一步修饰使其具有生物素成分。众所周知，生物素对抗生物素有高亲和性，而且对这些物质的亲和使单克隆抗体可固定于填塞床的表面，而且也可移去。这些亲和柱是本领域中已知的，参见Berenson，et al.，J.Cell Biochem.，10D：239(1986)。用PBS溶液洗涤柱以去除未结合物质。可用常规方法将靶细胞从珠上释放下来。例如在PCT出版物No.WO93/08268中描述了上述类型的免疫亲和柱，它采用了固定于涂有抗生物素的填塞床的、生物素化的抗-CD34单克隆抗体。这种方法的另一种形式是采用细胞结合蛋白例如单克隆抗体或上述的flt3-配体，它们被可移去地固定于分离装置的固定表面。结合后的细胞结合蛋白再与收集的细胞混合物接触，并且充分保温一段时间以分离所需的细胞。
或者，用荧光标记如生色团或荧光团标记可识别细胞表面抗原的单克隆抗体，然后根据标记产物的存在或不存在或数量用细胞分选法进行分离。
分离装置的另一例子基于常规的磁性分离方法和设备。对磁强化梯度基质进行施涂以用于分离设备的方法的一个例子公开于美国专利No.5,385,707，该专利在此引用作为参考。
本发明的试剂盒还包括孵育装置。这种装置被用于接受和盛装分离的干细胞、含有有效量细胞扩增生长因子的组合物和细胞生长培养基。孵育装置可以是任何设备或装置，在细胞扩增过程中它盛装分离的干细胞并与扩增因子和生长培养基接触。合适的孵育装置包括，例如，包、空心纤维、玻璃瓶、多孔平板或培养皿。许多这类孵育装置可方便地从各种地方购得。特别优选的孵育装置是无菌包和空心纤维。
在本发明的试剂盒中还提供细胞扩增生长因子。这些扩增因子包括GM-CSF，G-CSF，IL-1，IL-3，IL-6，TPO，EPO，flt3-配体、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白。优选的扩增因子是GM-CSF、flt3-配体、IL-1α和GM-SCF/IL-3融合蛋白。在试剂盒中提供的扩增因子是处于组合物形式，即组合物含有这些因子。这类组合物的例子是在常规的稳定配方中含有重组产生的、抑或纯化的扩增因子的组合物。其他可包含于试剂盒的组合物是得自哺乳动物细胞的条件培养基，该条件培养基中含有一定量足以扩增所需细胞的扩增因子。
本发明的试剂盒还含有细胞生长培养基。可使用各种生长培养基，而且这些培养基的组成可由本领域中一般技术人员方便地确定。合适的生长培养基是含有养分或代谢添加剂的溶液，而且包括那些去除血清或含有血清的。生长培养基的代表性例子是RPMI、TC199、Iscoves改良的Dulbecco’s培养基(Iscove，etal.，F.J.Exp.Med.，147：923(1978))、DMEM、Fischer’s培养基、α培养基、NCTC、F-10、Leibovitz’s L-15培养基、MEM和McCoy’s培养基。对熟练技术人员而言显而易见的养分的具体例子包括血清白蛋白、转铁蛋白、脂类、胆固醇、还原剂如2-巯基乙醇或单硫代甘油、丙酮酸盐、丁酸盐和糖皮质激素如氢化可的松2-半琥珀酸盐。更具体地，标准培养基包括能量来源、维生素或其他支持细胞的有机化合物、起稳定培养基pH作用的缓冲液如HEPES、Tris，以及各种无机盐。可特别参考PCT出版物No.WO95/00632，其中公开了各种不含血清的细胞生长培养基，该专利的公开内容在此引用作为参考。
如上所述，可有可无的(即任选的)用于盛装从人体收集来的细胞的容器可以是任何无菌的、适合最初盛装细胞混合物的设备或装置。较佳地，盛装装置是无菌的、有开口以接受收集细胞混合物的包。
例如，本发明的试剂盒可如下用于外周干细胞(PSC)或外周血祖细胞(PBPC)移植。典型地，PBPC和PSC移植是在因为骨髓异常或恶性而使骨髓不适合收集的病人中进行的。PBPC和PSC用本领域中已知的分离性输血程序进行收集。参见例如，Bishop et al.，Blood，Vol.83，No.2，pp.610-616(1994)。简而言之，PBPC和PSC是用常规设备如Haemonetics V50型分离性输血设备(Haemonetics，Braintree，MA)进行收集的。进行每次4小时的收集，一般每周不超过5次，直至收集到约6.5×108单核细胞(MNC)/kg病人。将细胞悬浮于标准培养基中，然后离心以去除红血球和中性白细胞。位于两相界面之间的细胞(本领域中也称为缓冲层(buffy coat))被取出并再悬浮于HBSS。悬浮的细胞主要是单核细胞而细胞混合物的基本组成是早期干细胞。得到的干细胞悬浮液再与生物素标记的抗-CD34单克隆抗体接触。接触时间维持足够一段时间以便抗-CD34单克隆抗体和干细胞表面的CD34抗原发生充分反应。典型地，至少1小时的时间是足够的。接着，细胞悬浮液与试剂盒中分离装置接触。分离装置含有填塞涂有抗生物素珠的柱。这种柱是本领域中熟知的，参见Beren-son，et al.，J.Cell Biochem.，10D：239(1986)。用PBS溶液洗涤柱以去除未结合物质。用常规方法将靶干细胞从珠上及抗-CD34单克隆抗体上释放下来。用这种方法获得的干细胞可在带有控制冷却速度的冷冻器(如Cryo-Med.Mt.Clemens，MI)中冰冻，再储藏在液氮的蒸气相中。将10％二甲基亚砜用作冷冻防护剂。在来自供体的所有收集都完成后，将干细胞融化，倒入孵育装置。每份都含有干细胞、试剂盒中提供的培养基如MoCoy’s 5A培养基、0.3％琼脂和浓度为200U/ml的至少一种试剂盒提供的扩增因子：重组的人GM-CSF、重组的人flt3-L和重组的人GM-CSF/IL-3融合蛋白(PIXY321)，将其在试剂盒提供的孵育装置中，于37℃、5％二氧化碳和完全湿化的空气中培养和扩增14天。任选地，也可在培养物中加入人IL-1α。最优选的扩增因子的组合是flt3-L加上IL-3或者加上GM-CSF/IL-3融合蛋白。然后可将扩增的干细胞通过静脉再输给病人。

Claims (22)

1.一种体外细胞培养和移植试剂盒，其特征在于，含有：
1)在从人体获得的、含造血干细胞和/或祖细胞的细胞混合物中，选择人造血干细胞和/或祖细胞的选择装置，
所述选择装置含有(a)flt3受体结合蛋白和(b)与选自CD34，Thy-1或My-10的细胞标记物结合的单克隆抗体中至少一种；或者所述选择装置含有选自5-氟尿嘧啶和4-羟基环磷酰胺的抗代谢物；
2)从混合物中分离选择出的造血干细胞和/或祖细胞的细胞的装置；
3)含有有效量的flt3-配体和细胞扩增因子的组合物，其中扩增因子选自：GM-CSF、G-CSF、IL-1、IL-3、IL-6、TPO、EPO、SF和GM-SCF/IL-3融合蛋白；
其中，分离装置用于接受细胞混合物和选择装置，并用于从混合物中分离选择出的造血干细胞和/或祖细胞。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还含有用于最初盛装从人体收集的细胞混合物的容器。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的选择装置含有抗代谢物，且所述的扩增因子选自下组：SF和flt3-配体。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括接受分离的造血干细胞和/或祖细胞、和扩增细胞的所述组合物的孵育装置。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的孵育装置选自下组：无菌包、空心纤维、玻璃瓶、多孔平板和培养皿。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括细胞生长培养基。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体用荧光标记进行标记。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的细胞混合物是从骨髓、外周血或脐带血分离出的。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的flt3受体结合蛋白和/或单克隆抗体连于或共轭于生物素。
10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述选择装置是固相载体，且该固相载体固定有flt3受体结合蛋白或单克隆抗体。
11.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的分离装置是固相载体，且该固相载体上固定有抗生物素或链霉抗生物素蛋白。
12.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的flt3受体结合蛋白或单克隆抗体被固定在磁性珠上。
13.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，flt3受体结合蛋白选自下组：flt3-配体和抗-flt3受体的单克隆抗体。
14.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述因子是GM-CSF/IL-3融合蛋白。
15.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述因子是IL-1α。
16.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述因子是GM-CSF。
17.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述因子是IL-3。
18.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的细胞扩增因子是G-CSF。
19.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的细胞扩增因子是IL-6。
20.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的细胞扩增因子是TPO。
21.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的细胞扩增因子是EPO。
22.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的细胞扩增因子是SF。
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