CN104745668A - 一种新型造血干细胞检测试剂制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型造血干细胞检测试剂制备方法和应用。所述制备方法，包括：溶解甲基纤维素，依次按照比例加入IMDM培养基、胎牛血清、经过离子交换树脂处理的牛血清白蛋白、2-ME、重组人干细胞生长因子、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素3。本发明获得的造血干细胞检测试剂可以检测人和小鼠骨髓、外周血、脐带血中的造血干细胞数量，富有应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的造血干细胞检测试剂制备方法和应用，具体的说是涉及人和鼠的造血干细胞检测试剂的制备方法。
技术背景：
造血干细胞具有自我更新和定向分化的两大功能。造血干细胞在体内定向分化为粒系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、巨核祖细胞，粒系祖细胞又进一步分化为粒细胞、单核细胞、巨噬细胞，发挥免疫和抗细菌感染作用；淋巴系祖细胞分化为淋巴细胞，发挥免疫和抗病毒感染作用；红系祖细胞分化为红细胞，发挥输送氧气，排出二氧化碳的功能，巨核祖细胞分化为血小板，发挥抗凝血功能，从而实现造血。
在人体中，造血干细胞存在于骨髓，当造血干细胞发生病理性数量减少时，粒系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、巨核祖细胞就会减少，血液中白细胞、红细胞、血小板也会减少，人体就会患再生障碍性贫血。
造血干细胞移植是治疗白血病、再生障碍性贫血等疾病的有效方法。造血干细胞移植需要对造血干细胞数量进行检测，以确保人体获得足够数量的造血干细胞，保证移植获得成功。
在体外，只要提供合适的造血干细胞生长条件，即造血干细胞培养基，造血干细胞可以分化成粒单系造血细胞集落和红系造血细胞集落，粒单系造血细胞集落中含有造血干细胞分化的粒系造血祖细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞；红系造血细胞集落中含有红系造血祖细胞、红细胞。根据集落数量，测定造血干细胞的数量。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种造血干细胞活性检测的方法。
一种新型的造血干细胞培养基试剂，是由下述步骤组成：
1.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37℃。
2.于步骤(1)中加入IMDM(2×)250mL，并反复振荡200次，使之充分混匀后置4℃冰箱中，2小时后，置-20℃冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4℃冰箱中保存。
3.称取BSA100g，加入去离子水440mL，混匀，4℃过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501(D)20-50筛孔离子交换树脂15g，4℃下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4℃下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后1000rpm／min，离心30分钟，测体积，再加等体积2×IMDM混匀，无菌过滤，分装10mL／管，-20℃冻存备用。
4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10％BSA1.5mL，100uL2-ME，100uL重组人干细胞生长因子，100uL重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子，100uL重组人白细胞介素3，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.1mL，充分混匀，-20℃冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4℃保存备用。
至此，一种新型的造血干细胞检测试剂制备已经完成。
上述全部过程均在无菌环境中进行操作。
实施例1
1.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37℃。
2.于步骤(1)中加入IMDM(2×)250mL，并反复振荡200次，使之充分混匀后置4℃冰箱中，2小时后，置-20℃冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4℃冰箱中保存。
3.称取BSA100g，加入去离子水440mL，混匀，4℃过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501(D)20-50筛孔离子交换树脂15g，4℃下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4℃下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后1000rpm／min，离心30分钟，测体积，再加等体积2×IMDM混匀，无菌过滤，分装10mL／管，-20℃冻存备用。
4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10％BSA1.5mL，100uL2-ME，100uL重组人干细胞生长因子，100uL重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子，100uL重组人白细胞介素3，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.1mL，充分混匀，-20℃冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4℃保存备用。
制备的造血干细胞检测试剂检测人(或鼠)骨髓造血干细胞：
1.骨髓造血干细胞制备：取淋巴细胞分离液(比重1.077)3mL，于离心管中，取骨髓液3mL，加入3mLPBS，充分混匀，将充分混匀的骨髓液轻轻的加入淋巴细胞分离液表面，2000rpm×20min，离心，骨髓细胞分层，上层为血浆，下层为红细胞，中间层白膜层富含造血干细胞，取中间白膜层放置于10mLPBS中，离心1000rpm×10min，洗涤2次，骨髓造血干细胞沉淀于试管底部，去除上清液，加入20％胎牛血清，调整细胞数至1×106／mL，备用。
2.取100uL骨髓造血干细胞(1×105细胞)悬液于试管中，加入甲基纤维素，充分混匀后，将含有骨髓造血干细胞的甲基纤维素放置于细胞培养皿中，置于37℃，5％的CO2培养箱中湿度培养7天，倒置显微镜下，观察结果。
3.集落计数：
采用OLympus CKX41倒置式显微镜，目镜10X，分别采用物镜4X、10X和20X观察，采用物镜4X集落计数。
CFU-GM：细胞数量大于40个的细胞团为集落。其形态分3种，a.致密型：细胞紧密成团，细胞个体较小，是以粒细胞为主。b.混合型：细胞团中央为聚集的粒细胞，周围弥散分布单核细胞或巨噬细胞。C.疏散型：细胞团比较均匀分散，细胞个体较大，多由单核巨噬细胞组成。CFU-E、BFU-E：呈粉红色／暗红色／橙色，CFU-E含1-2个细胞族，有8-200个细胞，BFU-E为2个以上细胞族，至少含200个细胞。CFU-GEMM：至少含50个细胞，多为粒细胞和巨噬细胞，巨核细胞和有核红细胞数量不定。正常情况下，1×105骨髓造血干细胞中含有CFU-GM大约70-80个集落，含有CFU-E和BFU-E集落60-70个，含有CFU-GEMM集落5-7个。
实施例2
1.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37℃。
2.于步骤(1)中加入RPMI1640(2×)250mL，并反复振荡200次，使之充分混匀后置4℃冰箱中，2小时后，置-20℃冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4℃冰箱中保存。
3.称取BSA100g，加入去离子水440mL，混匀，4℃过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501(D)20-50筛孔离子交换树脂15g，4℃下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4℃下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后1000rpm／min，离心30分钟，测体积，再加等体积2×RPMI1640混匀，无菌过滤，分装10mL／管，-20℃冻存备用。
4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10％BSA1.5mL，100uL2-ME，100uL重组人干细胞生长因子，100uL重组人巨噬细胞集落刺激因子，100uL重组人白细胞介素5，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.1mL，充分混匀，-20℃冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4℃保存备用。
制备的造血干细胞检测试剂检测人外周血造血干细胞：
1.外周血造血干细胞制备：取淋巴细胞分离液(比重1.077)3mL，于离心管中，取外周血3mL，加入3mLPBS，充分混匀，将充分混匀的外周血液轻轻的加入淋巴细胞分离液表面，2000rpm×20min，离心，外周血细胞分层，上层为血浆，下层为红细胞，中间层白膜层富含造血干细胞，取中间白膜层放置于10mLPBS中，离心1000rpm×10min，洗涤2次，外周血造血干细胞沉淀于试管底部，去除上清液，加入20％胎牛血清，调整细胞数至1×106／mL，备用。
2.取100uL外周血造血干细胞(1×105细胞)悬液于试管中，加入甲基纤维素，充分混匀后，将含有外周血造血干细胞的甲基纤维素放置于细胞培养皿中，置于37℃，5％的CO2培养箱中湿度培养7天，倒置显微镜下，观察结果。
3.集落计数：采用OLympus CKX41倒置式显微镜，目镜10X，分别采用物镜4X、10X和20X观察，采用物镜4X集落计数。
CFU-GM：细胞数量大于40个的细胞团为集落。其形态分3种，a.致密型：细胞紧密成团，细胞个体较小，是以粒细胞为主。b.混合型：细胞团中央为聚集的粒细胞，周围弥散分布单核细胞或巨噬细胞。C.疏散型：细胞团比较均匀分散，细胞个体较大，多由单核巨噬细胞组成。CFU-E、BFU-E：呈粉红色／暗红色／橙色，CFU-E含1-2个细胞族，有8-200个细胞，BFU-E为2个以上细胞族，至少含200个细胞。CFU-GEMM：至少含50个细胞，多为粒细胞和巨噬细胞，巨核细胞和有核红细胞数量不定。
实施例3
1.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37℃。
2.于步骤(1)中加入DMEM(2×)250mL，并反复振荡200次，使之充分混匀后置4℃冰箱中，2小时后，置-20℃冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4℃冰箱中保存。
3.称取BSA100g，加入去离子水440mL，混匀，4℃过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501(D)20-50筛孔离子交换树脂15g，4℃下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4℃下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后1000rpm／min，离心30分钟，测体积，再加等体积2×DMEM混匀，无菌过滤，分装10mL／管，-20℃冻存备用。
4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10％BSA1.5mL，100uL2-ME，100uL重组人干细胞生长因子，100uL重组人巨噬细胞集落刺激因子，100uL重组人白细胞介素5，促人红细胞生成素10ug，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.1mL，充分混匀，-20℃冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4℃保存备用。
制备的造血干细胞检测试剂检测人脐带血造血干细胞：
1.脐带血造血干细胞制备：取淋巴细胞分离液(比重1.077)3mL，于离心管中，取脐带血3mL，加入3mLPBS，充分混匀，将充分混匀的脐带血液轻轻的加入淋巴细胞分离液表面，2000rpm×20min，离心，脐带血细胞分层，上层为血浆，下层为红细胞，中间层白膜层富含造血干细胞，取中间白膜层放置于10mLPBS中，离心1000rpm×10min，洗涤2次，脐带血造血干细胞沉淀于试管底部，去除上清液，加入20％胎牛血清，调整细胞数至1×106／mL，备用。
2.取100uL脐带血造血干细胞(1×105细胞)悬液于试管中，加入甲基纤维素，充分混匀后，将含有脐带血造血干细胞的甲基纤维素放置于细胞培养皿中，置于37℃，5％的CO2培养箱中湿度培养7天，倒置显微镜下，观察结果。
3.集落计数：
采用OLympus CKX41倒置式显微镜，目镜10X，分别采用物镜4X、10X和20X观察，采用物镜4X集落计数。
CFU-GM：细胞数量大于40个的细胞团为集落。其形态分3种，a.致密型：细胞紧密成团，细胞个体较小，是以粒细胞为主。b.混合型：细胞团中央为聚集的粒细胞，周围弥散分布单核细胞或巨噬细胞。C.疏散型：细胞团比较均匀分散，细胞个体较大，多由单核巨噬细胞组成。CFU-E、BFU-E：呈粉红色／暗红色／橙色，CFU-E含1-2个细胞族，有8-200个细胞，BFU-E为2个以上细胞族，至少含200个细胞。CFU-GEMM：至少含50个细胞，多为粒细胞和巨噬细胞，巨核细胞和有核红细胞数量不定。
Claims (1)
1.一种新型的造血干细胞检测试剂，其特征在于，是由下述步骤组成：
1.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37℃。
2.于步骤(1)中加入IMDM(2×)250mL，并反复振荡200次，使之充分混匀后置4℃冰箱中，2小时后，置-20℃冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4℃冰箱中保存。
3.称取BSA100g，加入去离子水440mL，混匀，4℃过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501(D)20-50筛孔离子交换树脂15g，4℃下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4℃下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后1000rpm／min，离心30分钟，测体积，再加等体积2×IMDM混匀，无菌过滤，分装10mL／管，-20℃冻存备用。
4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10％BSA1.5mL，100uL2-ME，100uL重组人干细胞生长因子，100uL重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子，100uL重组人白细胞介素3，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.1mL，充分混匀，-20℃冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4℃保存备用。
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2014
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