CN105002140B - 一种增强lak细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法和用途。所述增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法为将LAK细胞与DC细胞共培养。DC细胞用于增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的用途。本发明通过将LAK细胞和DC细胞共培养，促进LAK细胞的增殖，增强了LAK细胞的杀伤活性。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法和用途。
背景技术
伴随着老龄化加剧、生态环境遭受破坏、不健康生活方式及食品安全问题凸现，我国肿瘤发病率多年持续上升，已成为一个必须高度重视的公共卫生问题乃至社会问题，中国亟须向肿瘤宣战。据世界癌症报告估计，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。当前我国癌症发病率、死亡率呈持续增长趋势，我国癌症发病率接近世界水平，但死亡率高于世界水平。更为严峻的是，这种势头并未得到有效的遏制。今后20年，我国癌症的发病数和死亡数还将持续上升：根据国际癌症研究署预测，如不采取有效措施，我国癌症发病数和死亡数到2020年将上升至400万人和300万人；2030年将上升至500万人和350 万人。
长期以来，肿瘤的治疗一般都采用手术、化疗和放疗三种治疗模式。随着生物科学的发展，生物治疗成为肿瘤治疗的第四种治疗模式。生物治疗是指利用人体自身的免疫系统来杀死清除肿瘤细胞的治疗方法。这种方法安全有效，只杀肿瘤细胞，不伤害正常组织，副作用非常小。生物治疗还能缓解放疗和化疗的副作用，增强患者对其他治疗的敏感性和耐受性。LAK细胞治疗是一种有效的抗肿瘤生物治疗方法，是将体外激活和扩增的LAK细胞再过继输入给患者的治疗方法。LAK细胞不需抗原刺激，缺乏靶细胞特异性，因此具有广谱的抗肿瘤效应，在细胞治疗上具有广泛的应用前景。近年来，国外已将LAK细胞回输与IL-2联合应用对肿瘤患者进行治疗，特别是晚期肿瘤，取得了较为满意的疗效。LAK细胞(Lymphokine-activated killer)即淋巴因子激活的杀伤细胞，将外周血淋巴细胞在体外经淋巴因子白介素-2(IL-2)激活3～5天扩增制备LAK 细胞是LAK细胞培养的最经典方法，但是这样得到的LAK细胞杀伤活性相对较弱，应用有限。
因此，LAK细胞的培养体系和杀伤效果是目前的研究热点。如公开号为CN101495620A的中国发明专利申请公开了在培养LAK细胞时，向培养基中添加伴刀豆球蛋白A等植物凝集素和具有白细胞介素-2(IL-2)样活性的增殖因子，来达到增殖活化LAK细胞。该培养体系培养的LAK细胞增殖速度较慢，细胞的杀伤活性也不够强，很难满足LAK细胞临床回输的需求。
为此，亟需一种增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的LAK细胞增殖活性和杀伤活性低的问题，提供一种增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法和用途。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，将LAK细胞与DC 细胞共培养。
优选地，所述增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，包括以下步骤：
S1、细胞的分选：
采用抗CD14抗体的磁珠将PBMC分为CD14+细胞和CD14-细胞；
S2、DC细胞的诱导：
将步骤S1分选得到的CD14+细胞诱导并培养为成熟的DC细胞；
S3、LAK细胞的诱导：
将步骤S1分选得到的CD14-细胞诱导并培养为LAK细胞；
S4、DC细胞和LAK细胞共培养：
将S2获得的DC细胞和S3获得的LAK细胞共培养7-8天。
优选地，所述步骤S2中DC细胞的诱导具体方法为：将步骤S1分选得到的CD14+细胞按照5-10×105个/mL的细胞密度进行培养，培养基为含有100-1000U/mLGM-CSF、100-1000U/mLIL-4的X-VIVO 15无血清培养基；第 5-6天加入100-1000U/mL的TNF-α促进DC细胞的成熟，培养至第6-7天获得成熟的DC细胞。
优选地，所述步骤S3中LAK细胞的诱导具体方法为：步骤S1分选后得到的CD14-细胞按照5-10×105个/mL的密度接种培养，培养基为含有10-50ng/mL OKT-3、100-1000U/mLIL-2的X-VIVO 15无血清培养基，培养6-7天收集LAK 细胞。
优选地，所述步骤S4中DC细胞和LAK细胞共培养具体方法为：将S2获得的DC细胞和S3获得的LAK细胞共同培养，培养基为含10-50ng/mL OKT-3、 100-1000U/mL IL-2的X-VIVO15无血清培养基，共培养7-8天后收集细胞共培养物。
优选地，步骤S2-S4中的培养条件为37℃、5％CO2。
优选地，所述步骤S2-S4在培养过程中按照1×106个/mL的细胞密度补加培养液和细胞因子。
优选地，DC细胞与LAK细胞按数量比1:10-25共培养。
更优选地，DC细胞与LAK细胞按数量比1:15-20共培养。
更进一步优选地，DC细胞与LAK细胞按数量比1:20共培养。
本发明还提供DC细胞的用途，DC细胞用于增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的用途。
本发明将DC细胞(Dendritic Cells，树突状细胞)与LAK细胞共培养，利用DC细胞的抗原提呈来增强LAK细胞的杀伤活性和增殖活性。DC细胞是一类起源于骨髓、散在分布、发生迁移的白细胞，是由形态、表型和功能不完全相同的多种细胞组成的一个细胞体系。DC细胞能敏锐的捕捉肿瘤细胞与正常细胞那微小的差异，并把这种差异传递给T淋巴细胞，进而将人体内残存的、转移的癌细胞全部、彻底地消灭干净。迄今为止，DC细胞被认为是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞。
与现有技术相比，本发明增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的方法具有如下有益效果：
本发明增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的方法通过将LAK细胞和DC 细胞共培养，明显促进LAK细胞的增殖，共培养3天后，LAK细胞数量约1× 109个，共培养6天后，LAK细胞数量约3.8×109个，约为单独培养LAK细胞浓度的2倍。
本发明增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的方法通过将LAK细胞和DC 细胞共培养，增强了LAK细胞的杀伤活性，效靶比40:1、20:1、10:1时的杀伤活性分别为52.6％、39.3％和15.7％，远远高于现有技术中LAK细胞的杀伤活性。
附图说明
图1为实施例1中DC细胞的形态图。
图2为实施例1中LAK细胞的形态图。
图3为实施例1中共培养7 天后DC细胞和LAK细胞形态图。
图4为实施例1中LAK细胞的流式检测结果图。
图5为实施例1中LAK细胞增殖曲线图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明LAK细胞保存液中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
在本发明中使用的主要仪器分别购自以下公司：细胞培养箱购自德国 MEMMERT公司，倒置显微镜购自福建MOTIC公司，流式细胞仪购自美国BD 公司，酶标仪购自美国梅里埃公司。
实施例1、LAK细胞的培养方法
一种LAK细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、细胞的分选
采用抗CD14抗体磁珠从PBMC(外周血单个核细胞)悬液中分为CD14+细胞和CD14-细胞。
本实施例中PBMC的制备方法如下：20mL外周血在400-600g离心10-15min 后，收集上层血浆；下层血细胞用生理盐水进行稀释，将稀释液加入已有Ficoll 分离液(购自STEMCELL公司)的sepmate离心管(购自STEM CELL公司) 中，600-800g离心10-20min；离心后将含有单个核细胞的上层液体从sepmate 离心管中倒出，再加入一定量的RPMI 1640培养基重悬细胞，400-500g离心 3-5min；获得PBMC。
本实施例中采用STEM CELL磁珠分选试剂盒分选CD14+的单核细胞，使用的CD14抗体为Easy SepTM人单核细胞富集抗体，抗CD14抗体磁珠为Easy Sep TMD磁珠。实验步骤简述如下(该实验操作适用于250μL-2mL的样品，多达1 ×108个细胞)：
1.在缓冲液中制备浓度为5×107个/mL的单个核细胞悬液，取1mL上述单个核细胞悬液置于5mL的聚苯乙烯试管(12×75mm)中，以便恰好装入Easy SepTM磁极中。
2.向每毫升细胞中加入50μL的Easy SepTM人单核细胞富集抗体混合物混合均匀，在室温(15-25℃)下孵育10分钟。
3.涡旋震荡Easy SepTMD磁珠30秒钟，以确保磁珠均匀混悬，没有可见的聚集体。
4.向每毫升细胞中加入100μL的磁珠，混合均匀，在室温(15-25℃)下孵育5分钟。
5.添加缓冲液使细胞悬液的总体积达到2.5mL。轻轻上下吹打细胞悬液2-3次以将其混合均匀。将试管(不带盖)在磁极中放置2.5分钟。
6.拿起Easy SepTM磁极，连贯地将细胞悬液倾倒于一个新的5mL聚苯乙烯试管中。经磁珠标记的CD14+细胞由于受Easy SepTM磁极的磁场作用，仍将留在原来的试管中。倾倒出的细胞悬液中含有CD14-细胞，离心洗涤备用。
S2、DC细胞的诱导
将步骤S1分选得到的CD14+细胞(即单核细胞)按照5×105个/mL的细胞密度用含有500U/mLGM-CSF(粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子)和 500U/mLIL-4(白细胞介素-4)的X-VIVO 15无血清培养基(购自LONZA)进行重悬，然后将细胞转移到T75培养瓶中，将细胞培养瓶放入37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养；每日在显微镜下观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据1×106/mL的细胞密度补加一定量的X-VIVO 15无血清培养基，补加GM-CSF和IL-4，使GM-CSF的浓度为5000U/mL和IL-4的浓度为 5000U/mL；第6天加入500U/mL的TNF-α(肿瘤坏死因子α)促进DC细胞的成熟，培养至第7天收集成熟的DC细胞。
在倒置显微镜下观察，随着诱导培养时间的延长，细胞周边的树枝状或毛刺状或绒线状的突起更加明显。图1为培养7天后成熟的DC细胞的形态图，其中活的成熟DC细胞大小不等，形态各异，形状极不规则；细胞表面伸出很多粗细不等、长短不一、疏密不同的树枝状或毛刺状或绒线状的突起；细胞核大而不规则，有时呈扭曲状；细胞质较疏松，内有线粒体构成的致密颗粒。
S3、LAK细胞的诱导
步骤S1分选得到的CD14-细胞用X-VIVO 15无血清培养基重悬，按照5× 105个/mL的密度接种至T75培养瓶中，使用含25ng/mL OKT-3(鼠抗人CD3单克隆抗体)、500U/mLIL-2的X-VIVO 15无血清培养基、在37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，每日在显微镜下观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据1×106个/mL的细胞密度补加适量的X-VIVO15培养液和OKT-3、 IL-2，使OKT-3的浓度为25ng/mL、IL-2的浓度为500U/mL；培养7天收集LAK 细胞。
在倒置显微镜下观察，随着培养时间的延长，LAK细胞体积增大，细胞核更加明显，且折光性更强。图2为培养7天后的LAK细胞，其形态规则，核大，圆形，胞浆少。
S4、DC细胞和LAK细胞共培养
将步骤S2获得的DC细胞和S3获得的LAK细胞按照数量比1:20混合后，再按1×106个/mL浓度接种共同培养，使用含25ng/mL OKT-3、500U/mLIL-2 的X-VIVO 15无血清培养基，在37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔两天计数一次，并根据1×106个/mL的细胞密度补加适量的X-VIVO 15培养液和OKT-3、IL-2，使OKT-3的浓度为25ng/mL、IL-2的浓度为500U/mL，共培养7天后收集细胞共培养物。在共培养过程中，图3为共培养7天后两种细胞形态图，两种形态的细胞形态不发生改变，LAK细胞为圆形细胞，DC细胞为不规则形状的细胞。
实施例2、LAK细胞的培养方法
一种LAK细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、细胞的分选方法与实施例1相同。
S2、DC细胞的诱导
将步骤S1分选得到的CD14+细胞按照1×106个/mL的细胞密度用含有 1000U/mLGM-CSF和1000U/mLIL-4的X-VIVO 15无血清培养基进行重悬，然后将细胞转移到T75培养瓶中，将细胞培养瓶放入37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养；每日在显微镜下观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据1×106个/mL的细胞密度补加一定量的X-VIVO 15无血清培养基，补加 GM-CSF和IL-4，使GM-CSF的浓度为1000U/mL和IL-4的浓度为1000U/mL；第6天加入1000U/mL的TNF-α促进DC细胞的成熟，培养至第7天收集成熟的DC细胞。
S3、LAK细胞的诱导
步骤S1分选得到的CD14-细胞用X-VIVO 15无血清培养基重悬，按照1× 106个/mL的密度接种至T75培养瓶中，使用含50ng/mL的OKT-3、100U/mLIL-2 的X-VIVO 15无血清培养基、在37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，每日在显微镜下观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据1×106/mL的细胞密度补加适量的X-VIVO 15培养液和OKT-3、IL-2，使OKT-3的浓度为 50ng/mL、IL-2的浓度为100U/mL；培养7天收集LAK细胞。
S4、DC细胞和LAK细胞共培养
将步骤S2获得的DC细胞和S3获得的LAK细胞按照数量比1:10混合后，再按1×106个/mL浓度接种共同培养，使用含50ng/mL的OKT-3、100U/mLIL-2 的X-VIVO 15无血清培养基，在37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔两天计数一次，并根据1×106/mL的细胞密度补加适量的X-VIVO 15培养液和 OKT-3、IL-2，使OKT-3的浓度为50ng/mL、IL-2的浓度为100U/mL，共培养7 天后收集细胞共培养物。
实施例3、LAK细胞的培养方法
一种LAK细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、细胞的分选方法与实施例1相同。
S2、DC细胞的诱导
将步骤S1分选得到的CD14+细胞按照1×106个/mL的细胞密度用含有 100U/mLGM-CSF和500U/mLIL-4的X-VIVO 15无血清培养基进行重悬，然后将细胞转移到T75培养瓶中，将细胞培养瓶放入37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养。每日在显微镜下观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据1 ×106个/mL的细胞密度补加一定量的X-VIVO 15无血清培养基，补加GM-CSF 和IL-4，使GM-CSF的浓度为100U/mL和IL-4的浓度为500U/mL。第6天加入100U/mL的TNF-α促进DC细胞的成熟，培养至第7天收集成熟的DC细胞。
S3、LAK细胞的诱导
步骤S1分选得到的CD14-细胞用X-VIVO 15无血清培养基重悬，按照1× 106个/mL的密度接种至T75培养瓶中，使用含10ng/mLOKT-3、800U/mLIL-2 的X-VIVO 15无血清培养基、在37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，每日在显微镜下观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据1×106/mL的细胞密度补加适量的X-VIVO 15培养液和OKT-3、IL-2，使OKT-3的浓度为 10ng/mL、IL-2的浓度为800U/mL；培养7天收集LAK细胞。
S4、DC细胞和LAK细胞共培养
将步骤S2获得的DC细胞和S3获得的LAK细胞按照数量比1:20混合后，再按1×106个/mL浓度接种共同培养，使用含800U/mLIL-2的X-VIVO 15无血清培养基，在37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔两天计数一次，并根据1×106个/mL的细胞密度补加适量的X-VIVO 15培养液和OKT-3、IL-2，使OKT-3的浓度为10ng/mL、IL-2的浓度为800U/mL，共培养7天后收集细胞共培养物。
实施例2-3中细胞的形态、数量变化、获得的LAK细胞的杀伤活性和增殖活性与实施例1基本相同。下面以实施例1的LAK细胞的培养方法或获得的细胞为例进行以下效果试验。
效果实施例1、流式检测结果
对上述实施例1收集的LAK细胞与DC细胞的共培养物(实验组)进行流式检测。以未与DC细胞共培养的LAK细胞作为对比例。对比例具体为：将PBMC 按照5-10×105个/mL的细胞密度接种培养，添加10-50ng/mL的OKT-3和 100-1000U/mL的IL-2溶液培养LAK细胞；每日观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据细胞密度补加细胞培养液和细胞因子；培养14天后，收集 LAK细胞进行流式检测。
流式检测方法如下：取1×106个LAK细胞；250g离心5min去上清；用含 10％FBS的PBS溶液清洗2次；避光加入CD3、CD56抗体2.5μL室温孵育30min；用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；用500mL RPMI 1640培养基重悬细胞并过滤；上流式细胞仪进行检测。
流式检测结果，如下图4所示。流式检测结果显示，实验组培养的LAK细胞中CD3-CD56+效应细胞(CD3阴性表达和CD56阳性表达)表达率为21.8％，明显高于对比例培养的LAK细胞的CD3-CD56+效应细胞的表达率17.7％。本发明增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的方法通过将LAK细胞和DC细胞共培养，增强了效应细胞的比例。
效果实施例2、LAK细胞增殖活性
对上述实施例1中步骤S2-4的LAK细胞诱导培养及其与DC细胞共培养过程中每三天抽取20μL细胞悬液进行细胞计数，共计数5次，绘制LAK细胞增殖曲线图(见图5)，进行细胞增殖活性检测。
以未与DC细胞共培养的LAK细胞作为对比例(对照组)。对比例具体为：将PBMC按照5-10×105个/mL的细胞密度接种培养，添加10-50ng/mL的OKT-3 和100-1000U/mL的IL-2溶液培养LAK细胞；每三天抽取20μL细胞悬液进行细胞计数，共计数5次，绘制LAK细胞增殖曲线图。
图5显示，在共培养后，本发明培养体系(实验组)培养的LAK细胞开始更快增殖，明显快于现有技术中培养体系(对比例)培养的LAK细胞。共培养 3天后，实验组LAK细胞数量约为1×109个，对比例细胞数量约为5×108个；共培养6天后，LAK细胞浓度约为3.8×109个，对比例细胞浓度约为2×109个，共培养细胞数量约为单独培养LAK细胞数量的2倍。
效果实施例3、LAK细胞的杀伤活性
对上述实施例1收集的LAK细胞与DC细胞的共培养物进行杀伤活性检测。以未与DC细胞共培养的LAK细胞作为对比例。对比例具体为：将PBMC按照 5-10×105个/mL的细胞密度接种培养，添加10-50ng/mL的OKT-3和 100-1000U/mL的IL-2溶液培养LAK细胞；每日观察细胞的形态，每隔两天进行细胞计数，并根据细胞密度补加细胞培养液和细胞因子；培养14天后，收集 LAK细胞。
本实施例杀伤活性检测中使用的细胞裂解液为9％Triton X-100，购自 PROMEGA；底物液为Substrate Mix，购自PROMEGA；终止液为1M acetic acid。
铺板时各实验孔和对照设置如下：
实验孔：按效靶比40:1、20:1和10:1进行靶细胞(K562)和效应细胞(实施例1-3得到的共培养物)的铺板。其中，效应细胞的浓度分别为4×106个/mL， 2×106个/mL，1×106个/mL，每孔100μL，每组3个复孔；K562浓度为1×105个/mL，每孔100μL，每组3个复孔。
效应细胞自然释放孔：4×106个/mL，2×106个/mL，1×106个/mL，每孔 100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。
靶细胞最大释放孔：1×105个/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入 20μL细胞裂解液。
靶细胞自然释放孔：1×105个/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。
培养液空白对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔。
体积纠正对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。
铺板后将培养板250g离心4min，置于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育4h。在培养结束前45min，取出培养板，在靶细胞最大释放组和体积纠正组每孔加入 20μL细胞裂解液，250g离心4min，继续培养45min后取出。
进行LDH(乳酸脱氢酶)测定，具体步骤如下：250g离心4min，每孔吸出 50μL上清转移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μL，室温避光孵育 30min。每孔加入50μL终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测定490波长处的吸光度值。
试验组、靶细胞LDH自然释放组和效应细胞LDH自然释放组的吸光度均值减去培养液空白对比例吸光度值均值，获得校正值。靶细胞LDH最大释放组的吸光度均值减去体积纠正组吸光度值均值，获得校正值。
杀伤活性按如下公式计算：
活性＝(A-E-T)/(Tmax-T)×100％………………(1)
A:试验组吸光度值校正值，
E:效应细胞自然释放孔吸光度值校正值，
T：靶细胞自然释放孔吸光度值校正值，
Tmax：靶细胞最大释放组吸光度值校正值。
检测结果见下表1。
表1 LAK细胞的杀伤活性
| 组别 | 40:1 | 20:1 | 10:1 |
| 实施例1 | 52.6％ | 39.3％ | 15.7％ |
| 对比例 | 34.86％ | 28.52％ | 8.3％ |
根据表1可知，与DC细胞共培养后，LAK细胞的杀伤活性要强于未与DC 共培养的细胞，且差异具有统计学意义。实验组效靶比40:1、20:1、10:1时的杀伤活性分别为52.6％、39.3％和15.7％，远远高于对比例中LAK细胞的杀伤活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，其特征在于，将LAK细胞与DC细胞共培养，包括以下步骤：
S1、细胞的分选：采用抗CD14抗体的磁珠将PBMC分为CD14+细胞和CD14-细胞；
S2、DC细胞的诱导：将步骤S1分选得到的CD14+细胞诱导并培养为成熟的DC细胞；
S3、LAK细胞的诱导：将步骤S1分选得到的CD14-细胞诱导并培养为LAK细胞；
S4、DC细胞和LAK细胞共培养：将S2获得的DC细胞和S3获得的LAK细胞共培养7-8天；
所述步骤S3 LAK细胞的诱导具体方法为：步骤S1分选得到的CD14-细胞按照5-10×105个/mL的密度接种培养，培养基为含有10-50ng/mL OKT-3、100-1000U/mL IL-2的X-VIVO 15无血清培养基，培养6-7天收集LAK细胞。
2.根据权利要求1所述的增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，其特征在于，所述步骤S2 DC细胞的诱导具体方法为：将步骤S1分选得到的CD14+细胞按照5-10×105个/mL的细胞密度进行培养，培养基为含有100-1000U/mL GM-CSF、100-1000U/mL IL-4的X-VIVO 15无血清培养基；第5-6天加入100-1000U/mL的TNF-α促进DC细胞的成熟，培养至第6-7天获得成熟的DC细胞。
3.根据权利要求2所述的增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，其特征在于，所述步骤S4 DC细胞和LAK细胞共培养具体方法为：将S2获得的DC细胞和S3获得的LAK细胞共同培养，培养基为含10-50ng/mL OKT-3、100-1000U/mL IL-2的X-VIVO 15无血清培养基，共培养7-8天后收集细胞共培养物。
4.根据权利要求2所述的增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，其特征在于，步骤S2-S4中的培养条件为37℃、5％CO2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，其特征在于，DC细胞与LAK细胞按数量比1:10-25共培养。
6.根据权利要求5所述的增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，其特征在于，DC细胞与LAK细胞按数量比1:15-20共培养。
7.根据权利要求6所述的增强LAK细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法，其特征在于，DC细胞与LAK细胞按数量比1:20共培养。
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