CN105087489B - 一种dc细胞培养试剂及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种DC细胞培养试剂及其培养方法。该DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；第一DC细胞培养试剂包括GM‑SCF和IL‑4；第二DC细胞培养试剂包括GM‑SCF、IL‑4、TNF‑α和MDC。该方法通过改进DC细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC细胞数量的增殖，并保持较好的细胞活率，使DC细胞的抗原递呈能力增强，具有更好的抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种DC细胞培养试剂及其培养方法。
背景技术
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。
恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的第一病害，在继切除手术、放疗、化疗之后，肿瘤免疫细胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。
树突状细胞(Dendritic cells,DC)是2011年诺贝尔医学奖得到加拿大科学家拉尔夫·斯坦曼与1973年发现并命名。DC细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。DC细胞目前已广泛应用于临床肿瘤治疗，结合各类杀伤性免疫细胞，可以发挥更加高效的肿瘤杀伤效果。
目前已有的DC细胞培养最新方案是利用：GM-CSF、IL-4、IL-1β和TLR共4类因子诱导获得，具体流程如下：
1.血液分离单个细胞，贴壁获得贴壁单个核细胞，分别添加GM-CSF、IL-4的无血清培养基，诱导培养5-6天；
2.添加GM-CSF、IL-4、IL-1β和TLR的无血清培养24-48h，得到成熟的DC细胞。
然而，TLR(即toll样受体)是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。只识别来源于微生物的入侵机体的保护，激活DC细胞后，对人体免疫系统抗肿瘤方面无多大功效。而且，该培养方案制得的成熟DC细胞在递承肿瘤抗原效果中较弱，回输人体后肿瘤杀伤效果不佳；缺乏激活聚集T细胞于外敏源的功能，在疾病感染中达不到快速高效的抗原清除功能。因此，急需建立一套DC细胞培养方案，使得获得的成熟DC细胞能快速递承抗原，并激活和聚集T细胞，达到高效杀伤肿瘤、病毒微生物等抗原的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种DC细胞培养试剂及其培养方法。该方法通过改进DC细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC细胞数量的增殖，并保持较好的细胞活率，使DC细胞的抗原递呈能力增强，具有更好的抗肿瘤效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种DC细胞培养试剂，DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；
第一DC细胞培养试剂包括GM-CSF和IL-4；
第二DC细胞培养试剂包括GM-CSF、IL-4、TNF-α和MDC。
本发明通过改进DC细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC细胞数量的增殖，并保持较好的细胞活率，使DC细胞的抗原递呈能力增强，具有更好的抗肿瘤效果。
作为优选，还包括含有血浆的无血清培养基。
作为优选，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％～15％。
在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％。
在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为10％。
在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为15％。
作为优选，血浆为自体血浆。
本发明还提供了一种DC细胞的培养方法，包括如下步骤：
步骤1：将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞；
步骤2：采用第一DC细胞培养试剂培养贴壁细胞，培养4～6天后，采用第二DC细胞培养试剂培养24～48h，得到DC细胞；第一DC细胞培养试剂为包含GM-CSF和IL-4的培养基，第二DC细胞培养试剂为包含GM-CSF、IL-4、TNF-α和MDC的培养基。
作为优选，第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为100～1000U/mL，IL-4的浓度为100～1000U/mL。
在本发明提供的一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为100U/mL，IL-4的浓度为100U/mL。
在本发明提供的另一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为500U/mL，IL-4的浓度为500U/mL。
在本发明提供的另一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为1000U/mL，IL-4的浓度为1000U/mL。
作为优选，第二DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为50～500U/mL，IL-4的浓度为50～500U/mL，TNF-α的浓度为100～1000U/mL，MDC的浓度为1～20ng/mL。
在本发明提供的一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为50U/mL，IL-4的浓度为50U/mL，TNF-α的浓度为100U/mL，MDC的浓度为1ng/mL。
在本发明提供的另一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为200U/mL，IL-4的浓度为200U/mL，TNF-α的浓度为500U/mL，MDC的浓度为12ng/mL。
在本发明提供的另一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为500U/mL，IL-4的浓度为500U/mL，TNF-α的浓度为1000U/mL，MDC的浓度为20ng/mL。
作为优选，步骤1中单个核细胞的密度为(2～8)×106/mL，细胞培养的时间为1～5h。
作为优选，第一DC细胞培养试剂或第二DC细胞培养试剂中的基础培养基为含有血浆的无血清培养基，血浆的体积百分含量为5％～15％。
作为优选，DC细胞培养试剂中还包括含有血浆的无血清培养基。
作为优选，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％～15％。
在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5％。
在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为10％。
在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为15％。
作为优选，血浆为自体血浆。
在本发明提供的一些实施例中，DC-CIK细胞的培养方法包括如下步骤：
(一)单个核细胞分离：
1.将外周血或脐带血离心，吸取上层血浆，经灭活后，离心，得到上清血浆；
2.取下层血液，加入生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
3.离心，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
(二)DC细胞分离培养
1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，离心，清洗；
2.加无血清培养基(含5％～15％自体血浆)重悬细胞，按(2～8)×106/mL接种，静置1～5h，获得贴壁细胞；
3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5％～15％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-CSF为100～1000U/mL，IL-4为100～1000U/mL进行培养；
4.三天后补加GM-CSF为100～1000U/mL，IL-4为100～1000U/mL，培养至4～6天后换液，同时添加GM-CSF为50～500U/mL，IL-4为50～500U/mL、TNF-α为100～1000U/mL、MDC为1～20ng/mL，培养24～48h，得到DC细胞。
本发明还提供了一种DC-CIK细胞的培养方法，采用本发明提供的DC细胞的培养方法获得的DC细胞制备DC-CIK细胞。
本发明提供了一种DC细胞培养试剂及其培养方法。该DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；第一DC细胞培养试剂包括GM-CSF和IL-4；第二DC细胞培养试剂包括GM-CSF、IL-4、TNF-α和MDC。本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过改进DC细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC细胞数量的增殖，并保持较好的细胞活率和纯度，40mL外周血通过本发明方法获得的DC细胞第7天时细胞数量可达2.68×107～2.79×107，活率可保持在97.2％～98.0％；
2、通过本发明方法获得的DC细胞的抗原递呈能力增强，本发明实施例3提供的培养方法得到的DC细胞的CD86+效应细胞比例为84.4％，具有更好的抗肿瘤效果。
附图说明
图1示流式细胞仪检测结果；其中，1-1示组A1中阴性对照组检测细胞数量，1-2示组A1中CD86+效应细胞含量，1-3示组B3中阴性对照组检测细胞数量，1-4示组B3中CD86+效应细胞含量。
具体实施方式
本发明公开了一种DC细胞培养试剂及其培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
GM-CSF:GM-CSF(人粒细胞-巨噬细胞集弱刺激因子)，能刺激粒细胞及巨噬细胞等白细胞的增殖、分化及活化作用，从而增强造血功能。它也能增强中性粒细胞，嗜曙红细胞及单核细胞的多种功能。它还能促使效应细胞增强如吞噬细菌及消灭癌细胞等免疫活动。
IL-4：白细胞介素4，是促进B细胞增殖的因子，是T细胞自身分泌的生长因子，在DC细胞培养中，可以抑制铁壁的单个核细胞朝巨噬细胞分化。
TNF-α：肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor，简写TNF)是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。
MDC:巨噬细胞活化因子(macrophage-derived chemokine)，由活化T细胞产生的一种淋巴因子，可招引巨噬细胞至局部，亦可诱发免疫细胞聚集，进行特异性抗原清理，是迟发型超敏反应的介质之一。
本发明提供的DC细胞培养试剂及其培养方法中所用试剂、培养基等均可由市场购得。细胞培养所用的无血清培养基为Lonza的X-VIVO15、BioWiseTech的BICBM0001或PC-1TM培养基等。在本实施例中所用无血清培养基为Lonza的X-VIVO15。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 DC-CIK细胞共培养实例
(一)单个核细胞分离
1.外周血或脐带血40mL，500-800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000-3000g离心5min，上清血浆2-8℃备用；
2.下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
3.500-700g离心15-30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
(二)DC细胞分离培养
1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200-400g离心5min，清洗两遍；
2.加无血清培养基(含5％自体血浆)重悬细胞，按2-8×106/mL接种T75培养瓶中静置1-5h，获得贴壁细胞；
3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-CSF为100U/mL、IL-4为100U/mL进行培养；
4.三天后补加GM-CSF为100U/mL、IL-4为100U/mL，培养至4-6天后换液，同时添加GM-CSF为50U/mL、IL-4为50U/mL、TNF-α为100U/mL、MDC为1ng/mL，培养48h，得到目的DC细胞。
实施例2 DC-CIK细胞共培养实例
(一)单个核细胞分离
1.外周血或脐带血40mL，500-800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000-3000g离心5min，上清血浆2-8℃备用；
2.下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
3.500-700g离心15-30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
(二)DC细胞分离培养
1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200-400g离心5min，清洗两遍；
2.加无血清培养基(含15％自体血浆)重悬细胞，按2-8×106/mL接种T75培养瓶中静置1-5h，获得贴壁细胞；
3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含15％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-CSF为1000U/mL、IL-4为1000U/mL进行培养；
4.三天后补加GM-CSF为1000U/mL、IL-4为1000U/mL，培养至4-6天后换液，同时添加GM-CSF为500U/mL、IL-4为500U/mL、TNF-α为1000U/mL、MDC为20ng/mL，培养24h，得到DC细胞。
实施例3 DC-CIK细胞共培养实例
(一)单个核细胞分离
1.外周血或脐带血40mL，500-800g离心10分钟，吸取上层血浆，经56℃灭活30min后，2000-3000g离心5min，上清血浆2-8℃备用；
2.下层血液，加入2倍体积的生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
3.500-700g离心15-30min，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
(二)DC细胞分离培养
1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，按200-400g离心5min，清洗两遍；
2.加无血清培养基(含10％自体血浆)重悬细胞，按2-8×106/mL接种T75培养瓶中静置1-5h，获得贴壁细胞；
3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含10％自体血浆的无血清培养基，同时添加因子GM-CSF为500U/mL、IL-4为500U/mL进行培养；
4.三天后补加GM-CSF为500U/mL、IL-4为500U/mL，培养至4-6天后换液，同时添加GM-CSF为200U/mL、IL-4为200U/mL、TNF-α为500U/mL、MDC为12ng/mL，培养36h，得到DC细胞。
实施例4 效果验证试验
(一)DC细胞7天后计数及流式检测实验
1、试验方法：
分别取外周血40ml，分离得到单个核细胞，按CN 104593325 A、CN 103589685 A、CN 103602634 A公开的培养方案和本发明实施例1～3培养方案进行培养至第7天，用0.25％胰酶消化收集计数，并对组A1和B3做流式检测。分组情况如下：
组A1：专利号为CN 104593325 A实施例1公开的DC细胞培养方案；
组A2：专利号为CN 103589685 A具体实施方式公开的DC细胞培养方案；
组A3：专利号为CN 103602634 A实施例4、5公开的DC细胞培养方案；
组B1：实施例1培养方案；
组B2：实施例2培养方案；
组B3：实施例3培养方案。
2、试验结果：
(1)DC细胞数量统计结果如下：
表1DC细胞数量
| 类别 | 细胞量 | 活率 |
| 组A1 | 1.6×107 | 97.5％ |
| 组A2 | 1.28×107 | 96.7％ |
| 组A3 | 1.17×107 | 97.2％ |
| 组B1 | 2.68×107 | 98.0％ |
| 组B2 | 2.77×107 | 97.4％ |
| 组B3 | 2.79×107 | 97.2％ |
(2)流式检测结果见图1。
结果分析：组B1、B2、B3得到的DC细胞量为2.68×107～2.79×107，明显高于组A1、A2、A3(1.28×107～1.28×107)，活率无明显差异；
从流式细胞仪检测结果可知，本发明实施例3提供的培养方法得到的DC细胞的CD86+效应细胞比例为84.4％，高于A1组的62.5％。
(二)DC抗原提程效果实验
重复上述组A1-A3，B1-B3的实验，培养DC细胞的同时，上清液细胞同时进行CIK细胞培养，至第7天，DC和CIK细胞混合培养，得到DC-CIK细胞，另同时培养一株CIK细胞，为组C，培养至14天，收集细胞对K562进行杀伤实验(杀伤性细胞为效应细胞，K562为靶细胞)。杀伤试验流程具体如下：
分别取杀伤性细胞(效应细胞)和肿瘤细胞(靶细胞K562)，分别按效应细胞：靶细胞为10:1、20:1、40:1进行3组，每组3个平行实验的试验，并做1组靶细胞自然凋亡。一般取靶细胞1×105，效应细胞分别取1×106，2×106，4×106。共培养4h。
通过酶标仪检测靶细胞死亡后分泌的蛋白成分鉴定，确定靶细胞自然凋亡量和各组杀伤后靶细胞死亡量，计算：杀伤组死亡的靶细胞量减去自然凋亡的细胞量，再除以靶细胞总量，得到杀伤效率值(效靶比)。
结果如下：
表2对K562杀伤的效靶比
| 效靶比 | 10:1 | 20:1 | 40:1 |
| 组A1 | 18.5％ | 44.6％ | 65.9％ |
| 组A2 | 15.8％ | 34.9％ | 52.7％ |
| 组A3 | 16.2％ | 35.5％ | 50.5％ |
| 组B1 | 32.5％ | 66.3％ | 80.6％ |
| 组B2 | 38.7％ | 70.5％ | 83.8％ |
| 组B3 | 37.9％ | 71.6％ | 85.2％ |
| 组C | 10.8％ | 35.7％ | 42.9％ |
结果分析：
从7组细胞对K562细胞的杀伤效果可知，经DC递呈得到的CIK细胞在杀伤效果上明显优于未经递承得到的CIK细胞，而组B1～B3的DC-CIK细胞的杀伤效果明显优于组A1～A3。可见，本发明提供的DC培养方案获得的DC细胞的递承抗原能力更强，而且针对的是肿瘤抗原，而非微生物病毒类抗原。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种DC细胞培养试剂，其特征在于，所述DC细胞培养试剂由第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂组成；
所述第一DC细胞培养试剂由GM-CSF、IL-4和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为100～1000U/mL，IL-4的浓度为100～1000U/mL；
所述第二DC细胞培养试剂由GM-CSF、IL-4、TNF-α、MDC和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50～500U/mL，IL-4的浓度为50～500U/mL，TNF-α的浓度为100～1000U/mL，MDC的浓度为1～20ng/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，血浆为自体血浆。
3.一种DC细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞；
步骤2：采用第一DC细胞培养试剂培养所述贴壁细胞，培养4～6天后，采用第二DC细胞培养试剂培养24～48h，得到DC细胞；
所述第一DC细胞培养试剂由GM-CSF、IL-4和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第一DC细胞培养试剂中，GM-CSF的浓度为100～1000U/mL，IL-4的浓度为100～1000U/mL；
所述第二DC细胞培养试剂由GM-CSF、IL-4、TNF-α、MDC和含有体积百分含量5％～15％血浆的无血清培养基组成；所述第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50～500U/mL，IL-4的浓度为50～500U/mL，TNF-α的浓度为100～1000U/mL，MDC的浓度为1～20ng/mL。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤1中所述单个核细胞的密度为(2～8)×106/mL，细胞培养的时间为1～5h。
5.一种DC-CIK细胞的培养方法，其特征在于，采用权利要求3或4所述的培养方法获得的DC细胞制备DC-CIK细胞。
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| CN104498434A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-04-08 | 北京益诺勤生物技术有限公司 | 一种大量树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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