CN104531617A

CN104531617A - 一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞

Info

Publication number: CN104531617A
Application number: CN201510015556.2A
Authority: CN
Inventors: 史军; 吕垚
Original assignee: BEIJING IMMUNOGENE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING IMMUNOGENE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-01-13
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明属于细胞免疫技术领域，公开了一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞。本发明提供的制备方法包括：获得间充质干细胞；取所得间充质干细胞，贴壁培养后，得贴壁细胞；培养、诱导所得贴壁细胞，收集树突状细胞。本发明提供的制备方法利用间充质干细胞作为种子细胞，贴壁培养后，诱导所得贴壁细胞，即制备获得树突状细胞，操作简单，可用于树突状细胞的大量制备，使该制备方法更利于推广和应用。

Description

一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞

技术领域

本发明属于细胞免疫技术领域，特别一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞。

背景技术

细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多、靶向杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受、激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫治疗具有副作用小、靶向治疗、作用范围更加广泛等特点，在临床研究中备受关注。据报道，经过多个疗程的细胞免疫治疗，能够有效杀除患者体内肿瘤细胞，促进康复，改善患者的生活质量。树突状细胞疗法是目前研究最多的细胞免疫治疗疗法之一。

树突状细胞(Dendritic cells，DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，一方面，其能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答；另一方面，树突状细胞还能够呈递抗原给MHC-I类限制性CD8⁺和MHC-II类限制性CD4⁺T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为“天然免疫佐剂”，因此，树突状细胞在诱导免疫应答中具有独特的地位。近年来，以DC细胞为基础的免疫治疗在临床应用中得到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点。

随着研究的深入，发现充足的DC细胞成为了DC细胞免疫治疗研究中的技术瓶颈。现有的DC细胞制备方法中，大多采用抽取外周血培养，分离出造血干细胞，之后在多种细胞因子存在下培养、诱导所得造血干细胞，制备获得DC细胞。整个过程操作复杂，并且因为细胞来源数量低、所得造血干细胞的数量也少，最终影响了DC细胞数量和质量，导致治疗效果不理想。所以，十分有必要需找新的DC细胞的制备方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供了一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞。本发明利用间充质干细胞，成功制备获得了树突状细胞，为树突状细胞的制备提供了一种新的制备方法，且操作简单，可用于树突状细胞的大量制备。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种树突状细胞的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：获得间充质干细胞；

步骤2：取所得间充质干细胞，贴壁培养后，得贴壁细胞；

步骤3：培养、诱导所得贴壁细胞，收集树突状细胞。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是一类多能干细胞，源于发育早期的中胚层和外胚层。主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。优选地，本发明提供的制备方法中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明以间充质干细胞为种子细胞，贴壁培养后，诱导所得贴壁细胞，即制备获得树突状细胞，操作简单，可用于树突状细胞的大量制备。

优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中的诱导所用诱导试剂包括第一诱导试剂和第二诱导试剂；

该第一诱导试剂包括GM-CSF、IL-4、胎牛血清和谷氨酰胺；

该第二诱导试剂包括TNF-α。

GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，是一种细胞因子。优选地，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中GM-CSF的浓度100ng/mL～200ng/mL。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中的GM-CSF的浓度为100ng/mL。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中的GM-CSF为rhGM-CSF。

IL-4为白细胞介素4，是一种细胞因子。优选地，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中IL-4的浓度为30ng/mL～50ng/mL。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中的IL-4的浓度为30ng/mL。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，IL-4为rhIL-4。

优选地，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中胎牛血清的浓度为10％。

优选地，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中，谷氨酰胺的浓度为2mmol/L～4mmol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中，谷氨酰胺的浓度为2mmol/L。

TNF-α是一种肿瘤坏死因子。优选地，本发明提供的制备方法中，第二诱导试剂中，TNF-α的浓度为500UI/mL～1500UI/mL。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，第二诱导试剂中，TNF-α的浓度为1000UI/mL。

优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中培养、诱导包括：

向所得贴壁细胞中加入含第一诱导试剂的培养液，培养；在补加含第一诱导试剂的培养液之后，再加入含第二诱导试剂的培养液；之后，进行检测，收集树突状细胞，即得。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤3中所述培养、诱导具体为：

向所得贴壁细胞中加入含第一诱导试剂的培养液，培养；

在培养的第三天补加半量该含第一诱导试剂的培养液；

在培养的第六天，半量离心，补加含第二诱导剂的培养液，

在培养的第七天，进行检测，收集树突状细胞，即得。

在本发明的一些实施例中，所述收集树突状细胞为：将诱导并促熟后的DC细胞离心清洗后吸去上清，加入1mL细胞冻存液，混匀后冻存于2mL的冻存管中，置于冻存盒中，放入-80℃冰箱，次日转入液氮保存；所述细胞冻存液包括20％人血白蛋白、无血清培养基和DMSO，所述20％人血白蛋白、无血清培养基和DMSO的体积比为5:4:1。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤1中获得间充质干细胞的方法具体为：

获得沃尔顿胶，种植于含FBS的1640培养液中，组织块贴壁法培养，即获得间充质干细胞。

间充质干细胞的制备方法优选但不限定为本发明提供的制备方法，本领域技术人员可以根据实际情况选择制备间充质干细胞的方法。

本发明提供了一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞。本发明提供的树突状细胞的制备方法包括：获得间充质干细胞；取所得间充质干细胞，贴壁培养后，得贴壁细胞；培养、诱导所得贴壁细胞，收集树突状细胞。本发明提供的制备方法利用间充质干细胞作为种子细胞，贴壁培养后，诱导所得贴壁细胞，即制备获得树突状细胞，操作简单，可用于树突状细胞的大量制备，使该制备方法更利于推广和应用。实验结果证实，本发明提供的制备方法成功制备获得了树突状细胞，所得树突状细胞与常规方法所得树突状细胞相比，形态及功能上并无差异，说明该方法可用于树突状细胞的大量制备。

附图说明

图1示实施例2所得间充质干细胞细胞分析结果；其中，图1-A为间充质干细胞的流式图；图1-B为间充质干细胞的倒置显微镜下形态图；

图2示实施例2中所得树突状细胞的流式细胞分析结果；其中，DC代表树突状细胞；

图3示实施例2中所得树突状细胞的HLA-DR⁺CD86⁺的流式细胞分析结果；

图4示实施例2中所得树突状细胞的CD83⁺CD86⁺的流式细胞分析结果；

图5示实施例2中所得树突状细胞的HLA-DR⁺CD83⁺的流式细胞分析结果；

图6示实施例2中所得树突状细胞的CD83⁺的流式细胞分析结果；

图7示实施例2中所得树突状细胞的HLA-DR⁺的流式细胞分析结果；

图8示实施例2中所得树突状细胞的CD86⁺的流式细胞分析结果。

具体实施方式

本发明公开了一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞。本领域技术人员可以参考本文内容，制备获得树突状细胞、实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞中的试剂和原料、间充质干细胞均可由市场购得。

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例树突状细胞的制备

实验材料：

脐带为北京大学首钢医院妇产科捐赠；也可由市场购买。

1640培养液来源于Takala；

RPMI-1640培养基来源于Takala；

rhGM-CSF来源于peprotech；

rhIL-4来源于厦门特宝；

胎牛血清来源于Gibco；

荧光标记的抗体均来源于BD；

含rhGM-CSF、rhIL-4、Gln和含10％FBS的RPMI-1640培养基的配置方法：将rhGM-CSF、rhIL-4、Gln和FBS等按所需浓度加入RPMI-1640培养基中。

实验方法：

(一)间充质干细胞制备(也可由中源协和干细胞生物工程股份有限公司购得)

分离脐带获得沃尔顿胶，种植于含10％FBS的1640培养液中，采用组织块贴壁法获得间充质干细胞，具体为：将胶体切成5cm³小块，种植于培养瓶中，贴壁细胞融合至约80％时，按1：3比例进行酶消化传代，获得P1代细胞；当贴壁细胞再次融合至约80％时，再传代，以P2计，依次类推，获得足够数量的细胞。

(二)间充质干细胞诱导为DC细胞

用含10％FBS的RPMI-1640培养基调整P3代间充质干细胞浓度为5×10⁵个/mL，取10mL加到T75培养瓶中，放置在37℃、5％CO₂孵箱中；24h后取出，镜下观察大部分细胞贴壁，倒掉培养液，向贴壁的细胞加入含rhGM-CSF(终浓度为100ng/mL)、rhIL-4(终浓度为30ng/mL)、Gln(终浓度为2mmol/L)、10％FBS的RPMI-1640培养基10mL开始培养，此为第1天；第3天补加含rhGM-CSF(终浓度为100ng/mL)、rhIL-4(终浓度为30ng/mL)、Gln(终浓度为2mmol/L)、10％FBS的RPMI-1640培养基5mL继续培养；第6天，半量离心换液加入含TNF-α(终浓度为1000UI/mL)的10％FBS的RPMI-1640培养基5mL，并孵育过夜；第7天，进行常规检测后收获DC细胞并保存。

免疫表型检测：

间充质干细胞：收集间充质干细胞(P3代细胞)后用PBS洗2次后，各取1×10⁵/mL，分别加入相应的FCM管中。加入待检测单克隆抗体，包括：阳性抗原检测：CD29，CD44，CD73，CD90，CD105；阴性抗原检测：CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR抗体各5μL，4℃避光孵育30分钟，每10分钟摇晃1次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400μL的PBS中，采用流式细胞仪FASCSCalibur(BD Biosciences)检测，结果见图1，其中图1-A示间充质干细胞细胞的流式图，图1-B示间充质干细胞的倒置显微镜下形态图。从图1中可知本实施例成功获得了间充质干细胞。

本实施例制备获得的树突状细胞：取促成熟后DC细胞(第7天，将细胞混匀后取样)，用PBS洗2次后，各取1×10⁵/mL，分别加入相应的FCM管中。加入待检测单克隆抗体，包括：抗HLA-DR抗体、抗CD83抗体和抗CD86抗体各5μL，4℃避光孵育30分钟，每10分钟摇晃1次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400μL的PBS中，采用流式细胞仪FASCSCalibur(BDBiosciences)检测，结果见表1、图2-图8。

表1本实施例所得树突状细胞检测结果

检测指标	阳性率
		HLA-DR⁺	98.6％
CD83⁺	21.6％
		CD86⁺	41.2％
HLA-DR⁺CD83⁺	19.9％
		HLA-DR⁺CD86⁺	40.8％

从表1、图2-图8中检测结果可知：诱导后细胞表达树突状细胞的标记，说明本发明提供的制备方法成功制备获得了树突状细胞。该制备方法简单，容易操作，可以进行树突状细胞的大量制备。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获得间充质干细胞；

步骤2：取所述间充质干细胞，贴壁培养后，得贴壁细胞；

步骤3：培养、诱导所述贴壁细胞，收集树突状细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的所述诱导所用诱导试剂包括第一诱导试剂和第二诱导试剂；

所述第一诱导试剂包括GM-CSF、IL-4、胎牛血清和谷氨酰胺；

所述第二诱导试剂包括TNF-α。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一诱导试剂中，所述GM-CSF的浓度为100ng/mL～200ng/mL。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述第一诱导试剂中，所述IL-4的浓度为30ng/mL～50ng/mL。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一诱导试剂中，所述胎牛血清的浓度为10％。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一诱导试剂中，所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/L～4mmol/L。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第二诱导试剂中，所述TNF-α的浓度为500UI/mL～1500UI/mL。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述培养、诱导包括：

向所述贴壁细胞中加入含所述第一诱导试剂的培养液，培养；补加所述培养液，再加入含所述第二诱导试剂的培养液；收集树突状细胞。

9.根据权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述收集树突状细胞为：

将诱导并促熟后的树突状细胞离心清洗后吸去上清，加入1mL细胞冻存液，混匀后冻存于2mL的冻存管中，置于冻存盒中，放入-80℃冰箱，次日转入液氮保存；所述细胞冻存液包括20％人血白蛋白、无血清培养基和DMSO，所述20％人血白蛋白、无血清培养基和DMSO的体积比为5:4:1。

10.如权利要求1至9中任意一项所述的制备方法制备获得的树突状细胞。