CN103421739B - 一种高效分离脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种简单、高效分离脐带间充质干细胞的方法，包括：使用插管分离脐带间充质干细胞以及使用trypLE^TM消化和无血清培养基培养脐带间充质干细胞的步骤。本发明能够更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞，而且对细胞的损伤更小；经试验证明本发明的方法能最大可能的保护间充质干细胞，具有更高活率，以及有更高的活性，可以更加有效进行成脂、成骨诱导分化。

Description

一种高效分离脐带间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于间充质干细胞的分离、培养的方法，特别涉及一种人脐带间充质干细胞的分离、制备的方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点：1)造血支持作用。作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干/祖细胞，MSCs与造血干细胞共同移植可促进造血干祖细胞的植入。2)免疫调控。MSCs不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，治疗自身免疫系统疾病有重要意义。3)基因治疗。由于MSCs体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，加之MSC具有对肿瘤的靶向性，在肿瘤的基因治疗中有着十分诱人的前景。4)多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。

脐带是连接胎儿与胎盘间的索状结构,外包被羊膜,内含黏液性的结缔组织，该结缔组织内有脐动脉和脐静脉。血管周围被黏蛋白样组织所包裹,后者被称为华通氏胶(Wharton′s jelly),它富含透明质酸,形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构。目前已有众多研究组从脐带中分离出能形成成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）的细胞，这些细胞符合国际细胞治疗协会（The International Society for Cellular Therapy，ISCT）制定的最低标准【Cytotherapy(2006)Vol.8,No.4,315-317】：（1）贴壁（塑料材质培养器皿）生长能力；（2）细胞表型：应该表达的一类表型CD73、CD90和CD105必须阳性，阳性率不低于95％；同时为了确保MSC中没有混杂原代分离培养物中存在的一些细胞，选取一组已知的MSC不表达的表型做为辅助的排查标准，CD34（造血祖细胞和内皮细胞标记）、CD45（白细胞标记）、CD14/CD11b（单核细胞和巨噬细胞标记）、CD79α/CD19（B细胞标记）和HLA-DR阴性，阳性率不高于2％；（3）多向分化潜能，包括向骨、软骨、脂肪分化的能力。

目前的研究结果显示，脐带组织中的间充质干细胞主要分布在：①脐带血管周（perivascular）：Covas等【Braz J Med Biol Res.2003;36(9):1179-83】从人脐带血管内皮和内皮下分离出形态学和免疫表型类似于BM-MSC的细胞,并表现出多向分化潜能；②华通氏胶（Wharton’s Jelly）：Wang等【Stem Cells.2004;22(7):1330-7.】在华通氏胶中发现了一种细胞,具有出较高的分化潜能,可向多个方向进行分化。这两种细胞均为间充质干细胞，同样具有多向分化能力，同样具有免疫调节活性。

目前，已经有多个单位申请了脐带间充质干细胞分离的专利，这些专利从脐带中获得间充质干细胞的方法多为用胶原酶或混合酶消化而获得（ZL201010605542.3、ZL200510015492.2、ZL200610067537.5、ZL200810102035.0、ZL200910157731.6），或者是组织块贴壁法(ZL200910242375.8)。这些方法的一个共同特点是需要将脐带组织通过机械力破碎。由于产妇大部分生产方式为顺产，在生产过程中，尤其是顺产过程中会导致脐带外表携带细菌等微生物。虽然在分离脐带间充质干细胞过程前会对脐带进行清洗，但这并不能完全去除脐带表面携带的细菌等微生物，在机械力破碎脐带的过程会导致分离的细胞被污染。目前，国内外已经建立了多个脐带间充质干细胞库，对每个保存脐带间充质干细胞的储户来说，干细胞资源是独一无二的，细胞污染是很难被接受的，所以开发新的工艺迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于一种简单、高效分离脐带间充质干细胞的方法；所述的脐带间充质干细胞主要来自脐静脉血管内皮下层，属于血管周部分。

本发明的技术方案概述如下：

一种脐带源间充质干细胞的制备方法，其特征是由下述步骤组成：

（1）脐带间充质干细胞的分离：将两头结扎的脐带组织用无菌等渗溶液清洗，从一端结扎处内侧1-2厘米处剪断，从断端的脐静脉插入适宜长度及直径的无菌管子，在脐带外留出2厘米以上管子，在脐带断端内侧1-2厘米左右处固定脐带与管子，从外侧预留管子处注入无菌等渗溶液5-20毫升清洗脐静脉，清洗2次以上；再从管子注入10-25毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.3-0.5小时，排出消化液；通过上述步骤去除脐静脉的血管上皮细胞，暴露出下层的血管周细胞。然后，用无菌等渗溶液清洗一次；再次从管子注入5-20毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.5-1小时，收集第二次消化后的消化液，将消化液用滤网过滤得到单细胞为主的悬液；将细胞悬液离心；

（2）脐带间充质干细胞的培养：将上述细胞按0.5-2×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中进行原代细胞培养。所用培养基为无血清培养基。细胞培养到80-90%融合时，用trypLE^TM消化，按分种率1：2--1：10接种到新培养瓶中培养。经过数次传代（优选1-5代），间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代细胞库冻存到液氮中长期保存。

本发明的优点：

本发明提供一种对细胞损伤小、更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞的制备方法，与现有技术相比至少有以下优点：

1）本发明的快速分离脐带间充质干细胞的方法，能有效的减少脐带分离过程的污染，且能降低分离的成本。在分离过程中不需要机械破碎脐带，减少机械剪切力对细胞的损害，获得的细胞活率更高。

2）本发明由于在分离过程中未采用异种消化酶和异种血清，所以所得到的细胞不含异种蛋白，也更安全，可以满足临床使用的需要，也为建立脐带间充质干细胞库提供了技术保障。

3）本发明采用二步消化的方法，更加方便和快捷，不需要用血清中和，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率，如本发明后续实施例所示，本发明方法获得的间充质干细胞可以更加有效进行成脂、成骨诱导分化。

附图说明

图1为；人脐带间充质干细胞分离步骤中的插管示意图；

图2为：人脐带间充质干细胞形态图；

图3为；人脐带间充质干细胞流式表型图；

图4为；人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化图

图5为；人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化图

图6为；人脐带间充质干细胞能明显抑制活化淋巴细胞分泌γ-干扰素的能力图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1人脐带间充质干细胞的分离、培养及原代传代细胞库冻存

（1）脐带间充质干细胞的分离：将两头结扎的脐带组织用无菌等渗溶液清洗，两头结扎的脐带能基本保证脐静脉内壁不被污染。从一端结扎处内侧1-2厘米处剪断，从断端的脐静脉插入适宜长度及直径的无菌管子，在脐带外留出2厘米以上管子（管子的长度和直径可以根据脐带静脉进行调整，使在其能够牢固地插在脐带静脉中，并在脐带外留出2cm以上的管子即可），在脐带断端内侧1-2厘米左右处固定脐带与管子（插管的方法见图1），从外侧预留管子处注入无菌等渗溶液10-25毫升清洗脐静脉，清洗2次以上；再从管子注入5-20毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.3-0.5小时，排出消化液；然后，用无菌等渗溶液清洗一次；再次从管子注入5-20毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.5-1小时，收集第二次消化后的消化液，将消化液用滤网过滤得到单细胞为主的悬液；将细胞悬液离心；

（2）脐带间充质干细胞的培养：将上述细胞按0.5-2×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中进行原代细胞培养。所用培养基为无血清培养基。细胞培养到80-90%融合时，用trypLE^TM消化，按分种率1：2--1：10接种到新培养瓶中培养。经过数次传代，间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代细胞库冻存到液氮中长期保存；

结果：我们获得的细胞形态为均一的长梭形（图2），将细胞进行流式检测分析，符合间充质干细胞特征（图3），其中CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR为阴性，CD73、CD90、CD105为阳性。

实施例2人脐带间充质干细胞的扩增和制剂制备

（1）从合格的原代传代细胞库取出含3×10⁶细胞的冻存管，在37℃解冻复苏细胞，（2）用无血清培养基（LONZA）按2×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90%融合时按1：3传代，经过3次传代，（3）在第三次传代细胞融合度达90%时用trypLE^TM消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在合适环境保存。（4）取部分制剂用专业人事熟知的方法进行细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞纯度检查，细胞活力检测、内毒素检测、相关残留物检测。

结果：获得的细胞无细菌、真菌和病毒的病原微生物污染，细胞纯度检查，细胞活力检测、内毒素检测、相关残留物检测均合格。

实施例3分离方式对顺产分娩方式所获脐带间充质干细胞污染的影响

分别采用本专利方法和机械破碎脐带后用胶原酶胰酶消化的方法分离顺产脐带各80根。对脐带采集液和分离后培养的原代培养液上清进行无菌检测，比较细胞拯救成功率，计算公式如下：

细胞拯救成功率=（1-原代上清污染数/脐带采集液污染数）×100%结果：采用本专利方法：脐带采集液污染17例，分离后培养无原代上清污染，细胞拯救成功率为100%，而采用机械破碎脐带后用胶原酶胰酶消化的方法：脐带采集液污染15例，分离后培养有4例原代上清污染，所以细胞拯救成功率为73.33%。

实施例4人脐带间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化

（1）成骨分化检测：选取第4代脐带间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按2×10⁴/孔接种于24孔板，待细胞融合达70%时更换成骨培养基(Hyclone公司)，然后每3d换液1次，21d后茜素红染色检测成骨情况。

（2）成脂分化检测：选取第4代脐带间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按2×10⁴/孔接种于24孔板，待细胞融合达70%时更换成脂培养基(Hyclone公司)。然后每3d换液1次，21d后油红O染色检测成脂情况。

结果：成脂诱导的细胞连续培养，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合，培养3周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，经油红O染色可见被染成红色的脂滴(图4)。成骨诱导后培养3周以上，细胞基质矿化物逐渐出现，形成多层小结结构，可见明显钙化结节，经茜素红染色后呈深红色(图5)。

实施例5人脐带间充质干细胞对活化淋巴细胞的γ-干扰素分泌抑制试验

经供者授权同意后，无菌条件下采集健康供者外周静脉血10ml，分离单个核细胞备用。将融合度为80-90%的脐带间充质干细胞以铯源照射20Gy，以2×10⁴/孔和1×10⁴/孔两种浓度接种于96孔板，在37℃，体积分数5%CO2，饱和湿度培养箱中培养1h，待细胞贴壁后每孔加入1×10⁵人外周血单个核细胞，2μL植物血凝素(10mg/L)与人脐带间充质干细胞共培养。72h后1600r/min离心10min，采集上清。ELISA检测培养上清中γ-干扰素水平。

结果：经检测人脐带间充质干细胞能明显抑制活化淋巴细胞分泌γ-干扰素的能力（图6），由图可见1：10与1:20均能很好抑制PHA活化的淋巴细胞分泌γ-干扰素（*P<0.01），两种浓度之间没有明显统计学差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种分离脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)脐带间充质干细胞的分离：将两头结扎的脐带组织用无菌等渗溶液清洗，从一端结扎处内侧1-2厘米处剪断，从断端的脐静脉插入无菌管子，并使得无菌管子在脐带外留出2厘米以上，在脐带断端内侧1-2厘米左右处固定脐带与管子，从外侧预留管子处注入无菌等渗溶液5-20毫升清洗脐静脉，清洗2次以上；再从管子注入10-25毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.3-0.5小时，排出消化液；然后，用无菌等渗溶液清洗一次；再次从管子注入5-20毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.5-1小时，收集第二次消化后的消化液，将消化液用滤网过滤得到单细胞为主的悬液；将细胞悬液离心，即得到脐带间充质干细胞；

(2)脐带间充质干细胞的培养：将上述步骤(1)获得的细胞按(0.5-2)×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO₂培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLE ^TM消化，按分种率(1：2)--(1：10)接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，间充质干细胞得到纯化，将细胞作为原代传代细胞库冻存到液氮中保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中无菌等渗溶液为与人体体液等渗的无菌溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中无菌等渗溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所述脐带间充质干细胞培养的培养基为无血清培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中传代次数为1-5代。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中 冻存所用的冻存保护液含5-10％的DMSO和1-10％的人血清白蛋白和适量DMEM/F12。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的原代传代细胞库的细胞为经过染色体核型检查，细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞纯度鉴定，细胞生物学功能鉴定均需合格的干细胞。