CN104983742A - 一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法，属于生物技术领域。具体制备方法如下：以健康新生儿的脐带为原料，原代分离培养并大规模扩增培养脐带间充质干细胞，利用扩增后的脐带间充质干细胞制备细胞制剂，该制剂可直接用于临床治疗退行性骨关节病。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法。
背景技术
退行性骨关节病又称骨关节炎、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等，实际上其并非炎症，而是一种退行性病变，属于关节提前老化，特别是关节软骨的老化，由增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。多见于中老年人群，好发于负重关节及活动量较多的关节(如颈椎、腰椎、膝关节、髋关节等)。过度负重或使用这些关节，均可促进退行性变化的发生。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。
目前退行性骨关节病的主要治疗方法是减少关节的负重和过度的大幅度活动，以延缓病变的进程。例如肥胖患者应减轻体重，下肢关节病变患者可用拐杖或手杖等。理疗及适当的锻炼可保持关节的活动范围，对控制急性期症状有所帮助。对晚期病例，目前公认的消除疼痛、矫正畸形、改善功能的有效方法是在患者全身情况能耐受手术的条件下行人工关节置换术，可以大大提高患者的生活质量。
但是不管是理疗还是人工关节置换术，并不能从根本上修复损伤的关节软骨，退行性骨关节病患者将终生带病生存。体外实验显示间充质干细胞可以向软骨细胞分化，动物实验也提示间充质干细胞可以修复受损的关节软骨。有学者提出从健康成人骨髓中分离间充质干细胞并用于修复受损的关节软骨，但是抽取骨髓对人体有损伤，且抽取的骨髓量较少，有骨髓疾病时无法采集。各项研究显示，新生儿脐带中含有大量的间充质干细胞，其生物学特性与健康成人骨髓来源的间充质干细胞相似，并且具有易于分离培养、增殖能力强、低免疫原性等优点，其已成为生物医学工程领域的“明星细胞”。脐带是胎儿娩出后的附属产物，往往作为废弃物丢掉或烧毁。采集脐带过程很简单，且采集时对胎儿及产妇没有任何损伤。基于以上优点，我们认为脐带来源的间充质干细胞可以替代骨髓来源间充质干细胞用于治疗退行性骨关节病。
发明内容
基于上述原因，本发明为了克服现有技术的不足，通过长期的研究，确定了一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法：以健康新生儿的脐带为原料，原代分离培养并大规模扩增培养脐带间充质干细胞，利用扩增后的脐带间充质干细胞制备干细胞制剂，该制剂可直接用于临床治疗退行性骨关节病。
本发明是通过下述技术方案实现的。
一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，以健康新生儿的脐带为原料，原代分离培养并大规模扩增培养脐带间充质干细胞，扩增后脐带间充质干细胞用人血白蛋白和二甲基亚砜的复方电解质注射液重悬，反复吸吹混匀后，将细胞逐渐降低保存温度冷冻成制剂。
优选地，上述治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，所述扩增后脐带间充质干细胞通过7代扩增培养后制得。
优选地，所述治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，所述扩增后脐带间充质干细胞用PBS重悬，反复吸吹混匀，再离心；离心结束后吸弃上清液；离心后扩增后脐带间充质干细胞用含有2～5％人血白蛋白和10％二甲基亚砜的复方电解质注射液重悬，反复吸吹混匀后，将细胞冻存盒置于普通冰箱保存30～60min，继续将细胞置于超低温冰箱(-80℃)保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(-196℃)中长期保存。
一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，经过以下步骤：
采集脐带：取健康新生儿脐带，48小时内运输至实验室处理；
原代培养：将脐带灭菌消毒，去除脐静脉与脐动脉，撕取脐带华通氏胶，将华通氏胶置于离心管中；剪碎脐带华通氏胶，加入脐带间充质干细胞完全培养液，在细胞培养箱中培养；吸弃旧脐带间充质干细胞完全培养液及华通氏胶，浸洗贴壁细胞；加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为原代培养的脐带间充质干细胞(P0代)；
传代培养1：将P0代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5～2.0×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全细胞培养液至每瓶15～20ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用10～20ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P1代)；
参照上述传代培养1的方法，将脐带间充质干细胞传代至P3代，然后冻存P3代细胞建立脐带间充质干细胞种子库；
冻存细胞1：将P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，反复吸吹混匀后分装；将细胞置于常温(20℃)放置的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(-196℃)中长期保存；
复苏细胞1：从液氮罐(-196℃)中取出细胞，细胞在37℃水浴解冻；解冻完成后，将细胞冻存液转移至离心管内，加入20～30ml PBS重悬细胞，用反复吸吹混匀；离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P3代)；
传代培养2：将复苏后的P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用反复吸吹混匀后接种4.5～6.0×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45～60ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用20～30ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P4代)；
参照上述传代培养2的方法，将脐带间充质干细胞传代至P6代，然后冻存P6代细胞已建立脐带间充质干细胞半成品库；
冻存细胞2：将P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，用反复吸吹混匀后分装；将细胞置于常温(20℃)的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(-196℃)中长期保存；
复苏细胞2：从液氮罐(-196℃)中取出细胞，细胞置于37℃水浴解冻；解冻完成后，将细胞冻存液转移至离心管内，加入30～40ml PBS，反复吸吹混匀；离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P6代)；
传代培养3：将复苏后的P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用反复吸吹混匀后接种2.7～3.6×107个细胞至底面积1272cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶250～360ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用180～200ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P7代)；
制剂并冻存：将P7代脐带间充质干细胞再用30～40ml PBS重悬，再用电动吸液器反复吸吹混匀；再离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，继续用30～40ml PBS重悬，继续用电动吸液器反复吸吹混匀；继续离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，按以下方法制备治疗退行性骨关节病的干细胞制剂：将P7代脐带间充质干细胞用助悬液重悬，使其细胞终密度为1～4×107个/ml，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装4ml细胞悬液至容积为5ml的细胞冻存管中；将细胞冻存管置于细胞冻存盒内，再将细胞冻存盒置于普通冰箱(4℃)保存30～60min，继续将细胞冻存夹置于超低温冰箱(-80℃)保存过夜，最后将细胞冻存夹置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存。
从液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上制定的细胞冻存位置取出细胞冻存盒，从细胞冻存盒中取出细胞冻存管，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动；解冻完成后即可直接关节腔注射用于治疗退行性骨关节病。
优选地，一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述原代培养中适合接种的华通氏胶组织块数为48～60块/75cm2。
优选地，所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述脐带间充质干细胞完全培养液为DMEM/F12(1∶1)与FBS混合液，二者体积比为9∶1，配制时分别取9份DMEM/F12(1∶1)与1份FBS于室温下直接混合，配制完成后冷藏于普通冰箱(4℃)中。需要使用时从普通冰箱(4℃)中取出并恢复至常温(20℃)。
优选地，根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，冻存细胞步骤中所述脐带间充质干细胞冻存保护液为DMSO与FBS混合液，二者的体积比为1∶9，配制时分别取1份DMSO缓缓滴入9份预先冷藏至4℃的FBS中，用电动吸液器吸吹混匀，配制完成后冷藏于普通冰箱(4℃)。需要使用时从普通冰箱(4℃)中取出直接使用。
优选地，根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述P0代传代至P3代采用的是接种1.8×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶；所述P4代传代至P6代采用接种5.4×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶；所述P6代传代至P7代采用的是接种3.0×106个细胞至底面积1272cm2的细胞培养瓶。
具体的，所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述P7代细胞制剂的助悬液为含有适量1～10％人血白蛋白和10％二甲基亚砜(DMSO)的复方电解质注射液，优选含有2～5％人血白蛋白和10％DMSO的复方电解质注射液，其配制方法为：常温下取出20％人血白蛋白注射液2～5份，滴入15～18份复方电解质注射液中，用电动吸液器反复吸吹混匀后，置于4～12℃避光保存10min，再缓缓滴入1份DMSO至冷藏后的混合液9份中，用电动吸液器反复吸吹混匀后，置于4～12℃避光保存。
具体的，所述一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述P7代细胞制剂中细胞含量为1～4×107个/ml。优选的，P7代细胞制剂中细胞含量为2×107个/ml。
一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的具体制备方法：
取健康新生儿脐带，结扎脐带两端，用400～500ml磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗脐带外表面以去除胎粪等杂物，将脐带放入含100～200ml DMEM/F12(1∶1)培养液的采集瓶中保存，采集瓶置于4～12℃运输箱内，48小时内运输至实验室处理；
将采集瓶由传递窗进入洁净工作区，在超净工作台中取出脐带置于容量为100ml的灭菌烧杯中，加入适量70％医用酒精浸泡脐带消毒1min；取出脐带置于另一100ml的灭菌烧杯中，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗去除70％医用酒精；用组织剪剪去脐带结扎两端，中段部分剪成小段，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗净小段残血后置于细胞培养皿中；用组织捏从两根脐动脉之间撕开脐带，去除脐静脉与脐动脉，撕取脐带华通氏胶，将华通氏胶置于容积为50ml的离心管中；用组织剪剪碎脐带华通氏胶；加入少量脐带间充质干细胞完全培养液，用巴氏吸管混匀并吸取华通氏胶接种至底面积75cm2的细胞培养瓶中；向培养瓶内加入15～20ml脐带间充质干细胞完全培养液，将细胞培养瓶倒置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中静置1～3h，取出细胞培养瓶，轻轻翻转，使脐带间充质干细胞完全培养液流遍细胞培养瓶底面；将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；以后逐日观察细胞培养瓶，若出现污染，则立即废弃；若未出现污染，则继续培养；
连续培养10-20天后，取出细胞培养瓶，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液及华通氏胶，用10～20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞；吸弃洗涤液，加入1～1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min；加入10～20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为原代培养的脐带间充质干细胞(P0代)；
将P0代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5～2.0×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全细胞培养液至每瓶15～20ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用10～20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入1～1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min，加入10～20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P1代)；
将P1代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5～2.0×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶15～20ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用10～20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入1～1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min，加入10～20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P2代)；
将P2代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5～2.0×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶15～20ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用10～20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入1～1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min，加入10～20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P3代)；
将P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装3.0～4.0×106个细胞至容积为2ml的细胞冻存管内，旋紧管盖并于外壁上标注细胞信息；将细胞冻存管置于常温(20℃)放置的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，再将细胞冻存管取出后置于细胞冻存盒中，最后将细胞冻存盒置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存；
从液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置取出细胞冻存盒，从细胞冻存盒中取出细胞冻存管，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动；解冻完成后，在超净工作台上将细胞冻存液转移至容积为50ml的离心管内，加入20～30ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P3代)；
将复苏后的P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种4.5～6.0×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45～60ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用20～30ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入3～4.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min，加入20～30ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P4代)；
将P4代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种4.5～6.0×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45～60ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用20～30ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入3～4.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min，加入20～30ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P5代)；
将P5代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种4.5～6.0×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45～60ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用20～30ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入3～4.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min，加入20～30ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P6代)；
将P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装7.5～8.0×106个细胞至容积为5ml的细胞冻存管内，旋紧管盖并于外壁上标注细胞信息；将细胞冻存管置于常温(20℃)的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，再将细胞冻存管取出后置于细胞冻存盒中，最后将细胞冻存盒置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存；
从液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上制定的细胞冻存位置取出细胞冻存盒，从细胞冻存盒中取出细胞冻存管，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动；解冻完成后，在超净工作台上将细胞冻存液转移至容积为50ml的离心管内，加入30～40ml磷酸盐缓冲液(PBS)，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P6代)；
将复苏后的P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种2.7～3.6×107个细胞至底面积1272cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶250～360ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用180～200ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入20～30ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞1～3min，加入180～200ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P7代)；
将P7代脐带间充质干细胞再用30～40ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，再用电动吸液器反复吸吹混匀；再离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，继续用30～40ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，继续用电动吸液器反复吸吹混匀；继续离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，按以下方法制备治疗退行性骨关节病的干细胞制剂：
将P7代脐带间充质干细胞用适量含有2～5％人血白蛋白和10％二甲基亚砜(DMSO)的复方电解质注射液重悬，使其细胞终密度为1～8×107个/ml，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装4ml细胞悬液至容积为5ml的细胞冻存管中，将细胞冻存管置于细胞冻存盒内，再将细胞冻存盒置于普通冰箱(4℃)保存30～60min，继续将细胞冻存夹置于超低温冰箱(-80℃)保存过夜，最后将细胞冻存夹置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存；从液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上制定的细胞冻存位置取出细胞冻存夹，从细胞冻存夹中取出细胞冻存管，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动；解冻完成后即可直接关节腔注射用于治疗退行性骨关节病；
上述所述的DMEM/F12(1∶1)培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)购自Gibco公司，人血白蛋白购自于杰特贝林公司，复方电解质注射液购自于百特公司，二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司；
上述所述的底面积分别为75cm2、225cm2、1272cm2的细胞培养瓶以及容积分别为2ml、5ml的细胞冻存管均购自于CORNING公司，容积为50ml的离心管购自于BD公司，电动吸液器、超低温冰箱购自于ThermoFisher公司，程序降温盒购自于NUNC公司，液氮罐购自于MVE公司；
上述所述的脐带间充质干细胞完全培养液为DMEM/F12(1∶1)与FBS混合液，二者体积比为9∶1，配制时分别取9份DMEM/F12(1∶1)与1份FBS于室温下直接混合，配制完成后冷藏于普通冰箱(4℃)中，需要使用时从普通冰箱(4℃)中取出并恢复至常温(20℃)；
上述所述的脐带间充质干细胞冻存保护液为DMSO与FBS混合液，二者的体积比为1∶9，配制时分别取1份DMSO缓缓滴入9份预先冷藏至4℃的FBS中，用电动吸液器吸吹混匀，配制完成后冷藏于普通冰箱(4℃)，需要使用时从普通冰箱(4℃)中取出直接使用；
上述所述的所有冻存于液氮罐中的P3代细胞可建立脐带间充质干细胞种子库，所有冻存于液氮罐中的P6代细胞可建立脐带间充质干细胞半成品库，所有冻存于液氮罐中的P7代细胞冻存制剂可建立脐带间充质干细胞成品库。
本发明一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂所具有的优点是：1、原材料脐带属于医疗废弃物，其来源丰富、易于获得；2、采集方便，对产妇和胎儿无任何不良影响及损伤；3、脐带来源的间充质干细胞免疫原性低，异体移植不会发生免疫排斥反应；4、脐带间充质干细胞通过关节腔注射的方法给药，可以修复受损的关节软骨，不仅改善退行性骨关节病患者生活质量，甚至治愈退行性骨关节病。
附图说明
图1为实施例1接种的脐带华通氏胶组织块照片
图2为实施例1拍照记录的P0代脐带间充质干细胞；
图3为实施例1拍照记录的P3代脐带间充质干细胞；
图4为实施例1拍照记录的P6代脐带间充质干细胞；
图5为实施例1拍照记录的P7代脐带间充质干细胞；
图6为实施例4P7代脐带间充质干细胞流式表型结果；
图7为实施例5P7代脐带间充质干细胞三向诱导分化结果。
具体实施方式
实施例1
将采集瓶由传递窗进入洁净工作区，在超净工作台中取出脐带，测量长度约17cm，将脐带置于容量为100ml的灭菌烧杯中，加入30ml 70％医用酒精浸泡脐带消毒1min；取出脐带置于另一100ml的灭菌烧杯中，用200ml磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗去除70％医用酒精；用组织剪剪去脐带结扎两端，中段部分剪成小段，共获得8小段，用200ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗净小段残血后置于细胞培养皿中；用组织捏从两根脐动脉之间撕开脐带，去除脐静脉与脐动脉，撕取脐带华通氏胶，将华通氏胶置于容积为50ml的离心管中，共获得约12ml脐带华通氏胶，脐带华通氏胶组织照片如图1所示；用组织剪剪碎脐带华通氏胶；加入3ml脐带间充质干细胞完全培养液，用巴氏吸管混匀并吸取华通氏胶接种至底面积75cm2的细胞培养瓶中，共接种5瓶；向每个细胞培养瓶内加入15ml脐带间充质干细胞完全培养液，将细胞培养瓶倒置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中静置110min，取出细胞培养瓶，轻轻翻转，使脐带间充质干细胞完全培养液流遍细胞培养瓶底面；将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；
接种后第二日轻轻取出细胞培养瓶，未见污染，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；
连续培养第16天，取出细胞培养瓶，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液及华通氏胶，每瓶用20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞；吸弃洗涤液，每瓶加入1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min；加入20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P0代脐带间充质干细胞，拍照记录如图2所示；
将P0代脐带间充质干细胞用15ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，共接种3瓶；补充脐带间充质干细胞完全细胞培养液至每瓶15ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第三天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，每瓶用20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，每瓶加入1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min，加入20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P1代脐带间充质干细胞；
将P1代脐带间充质干细胞用45ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，共接种9瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶15ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第三天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，每瓶用20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，每瓶加入1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min，加入20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P2代脐带间充质干细胞；
将P2代脐带间充质干细胞用27ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，共接种27瓶；补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶15ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第三天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，每瓶用20ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，每瓶加入1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min，加入20ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P3代脐带间充质干细胞；
将P3代脐带间充质干细胞用40.5ml脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装4.5×106个细胞至容积为2ml的细胞冻存管内，共分装27管，旋紧管盖并于外壁上标注细胞信息；将细胞冻存管置于常温(20℃)放置的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，再将细胞冻存管取出后置于细胞冻存盒中，最后将细胞冻存盒置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存；
从液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置取出细胞冻存盒，从细胞冻存盒中取出细胞冻存管，共取出1管，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动；解冻完成后，在超净工作台上将细胞冻存液转移至容积为50ml的离心管内，加入30ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到复苏后的P3代脐带间充质干细胞；
将复苏后的P3代脐带间充质干细胞用15ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种4.5×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第三天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用30ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入4.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min，加入30ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P4代脐带间充质干细胞，拍照记录如图3所示；
将P4代脐带间充质干细胞用45ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种4.5×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，共接种3瓶；补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第三天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，每瓶用30ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，每瓶加入4.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min，加入30ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P5代脐带间充质干细胞；
将P5代脐带间充质干细胞用45ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种4.5×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，共接种9瓶；补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第三天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，每瓶用30ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，每瓶加入4.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min，加入30ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P6代脐带间充质干细胞，拍照记录如图4所示；
将P6代脐带间充质干细胞用60ml脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装8.0×106个细胞至容积为5ml的细胞冻存管内，共分装15管，旋紧管盖并于外壁上标注细胞信息；将细胞冻存管置于常温(20℃)的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，再将细胞冻存管取出后置于细胞冻存盒中，最后将细胞冻存盒置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存；
从液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上制定的细胞冻存位置取出细胞冻存盒，从细胞冻存盒中取出细胞冻存管，共取出4管，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动；解冻完成后，在超净工作台上将细胞冻存液转移至容积为50ml的离心管内，加入40ml磷酸盐缓冲液(PBS)，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1500、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P6代)；
将复苏后的P6代脐带间充质干细胞用150ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种3.2×107个细胞至底面积1272cm2的细胞培养瓶，共接种1瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶300ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第四天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用200ml磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入30ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)消化贴壁细胞3min，加入200ml含有2％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，用电动吸液器反复吸吹混匀后吸取细胞悬液分装至容积为50ml的离心管中，共分装5管；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，即得到P7代脐带间充质干细胞，拍照记录如图5所示；
实施例2
取实施例1中得到的P7代脐带间充质干细胞，用40ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，再用40ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀；再离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，将细胞用400ml含有2％人血白蛋白和10％二甲基亚砜(DMSO)的复方电解质注射液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装4ml细胞悬液至容积为5ml的细胞冻存管中，共分装100管；将细胞冻存管置于细胞冻存夹内，再将细胞冻存夹置于普通冰箱(4℃)保存30min，继续将细胞冻存夹置于超低温冰箱(-80℃)保存过夜，最后将细胞冻存夹置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存；
实施例3
细胞形态观察：取液氮(-196℃)保存的实施例2中得到的P7代脐带间充质干细胞冻存制剂，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动，共复苏1管；解冻完成后，在超净工作台上将细胞冻存液转移至容积为50ml的离心管内，加入30ml磷酸盐缓冲液(PBS)，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞中加入45ml脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，共接种3瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶15ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；接种后第三天，脐带间充质干细胞已经贴满细胞培养瓶底面80％，拍照记录细胞形态。
结果：经观察发现细胞形态为成纤维细胞样，单层贴壁生长，排列紧密，成漩涡状。接种30min开始贴壁，3h内活细胞可全部贴壁。贴壁的细胞逐渐由圆形向不规则形状变化。随着细胞分裂，细胞数目逐渐增多，细胞排列越来越紧密，形态逐渐均一。
实施例4
流式细胞检测细胞表面标志：取液氮(-196℃)保存的实施例2中得到的P7代脐带间充质干细胞冻存制剂，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动，共复苏1管；解冻完成后，在超净工作台上将细胞冻存液转移至容积为50ml的离心管内，加入30ml磷酸盐缓冲液(PBS)，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞按照流式细胞术检测细胞表面标志：收集3.5×106个细胞，分装至7个微量离心管，加入磷酸盐缓冲液(PBS)至1ml，离心1500rpm、10min、RT，弃上清，加入PE标记的CD73、CD90、CD105抗体以及FITC标记的CD45、CD34、HLA-DR抗体各10μl，剩余一管作为对照，4℃下避光孵育30min，磷酸盐缓冲液(PBS)重复洗涤一次，再加入200μl的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，直接用流式细胞仪检测。
结果：经检测发现流式细胞表面标志CD73、CD90、CD105均为阳性，其中CD73阳性率98.4％、CD90阳性率99.3％、CD105阳性率98.8％。CD45、CD34、HLA-DR均为阴性，其中CD34阳性率0.113％，CD45阳性率0.006％、HLA-DR阳性率0.00％，P7代脐带间充质干细胞流式表型结果如图6所示。
实施例5
三向诱导分化实验：取液氮(-196℃)保存的实施例2中得到的P7代脐带间充质干细胞冻存制剂，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动，共复苏1管；解冻完成后，在超净工作台上将细胞冻存液转移至容积为50ml的离心管内，加入30ml磷酸盐缓冲液(PBS)，用电动吸液器反复吸吹混匀；离心，1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞按照如下方案进行三向诱导分化实验。
(1)成脂诱导：用脐带间充质干细胞完全培养液将细胞按2×104/孔的细胞量接种于24孔板中，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长至80％融合时，实验组吸去原培养基，加入成脂诱导培养基，对照组用原培养基继续培养。每3天换液一次，培养14天后终止，行油红O染色，方法如下：吸弃培养基，用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定10min，蒸馏水冲洗2次，60％异丙醇1min，0.3％油红O应用液常温避光封闭染色10min，弃去染料，60％异丙醇分色30s，蒸馏水冲洗5次，显微镜下观察并拍照。
(2)成骨诱导：用脐带间充质干细胞完全培养液将细胞按2×104/孔的细胞量接种于24孔板中，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长至80％融合时，实验组吸去原培养基，加入成骨诱导培养基，对照组用原培养基继续培养。每3天换液一次，培养21天后终止，行茜素红染色，方法如下：吸弃培养基，用PBS冲洗2次，95％乙醇固定10min，0.1％茜素红染液常温染色30min，弃去染料，蒸馏水冲洗3次。显微镜下观察并拍照。
(3)成软骨诱导：用脐带间充质干细胞完全培养液调整细胞密度至1.6×107/ml，吸取5μl细胞接种至24孔板中央，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。接种2小时后，实验组加入成软骨诱导培养基，对照组加入原培养基继续培养。每3天换液一次，培养21天后终止，行阿利新蓝染色，方法如下：吸弃培养基，用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定10min，0.1mol/L HCl漂洗2次，1％阿利新蓝染液常温染色过夜，弃去染料，0.1mol/L HCl漂洗3次，显微镜下观察并拍照。
结果：(1)成脂诱导结束后，可见细胞内充满脂滴，油红O染色后可见脂滴成红色；(2)成骨诱导结束后，碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，提示有钙化结节形成；(3)成软骨诱导结束后，阿利新蓝可将细胞染成蓝色，说明有II型胶原形成，P7代脐带间充质干细胞三向诱导分化结果，如图7所示。
实施例3、4、5将液氮(-196℃)保存的冻存制剂中P7代脐带间充质干细胞参照国际细胞治疗协会对于间充质干细胞的相关标准进行研究，结果充分证明经液氮(-196℃)保存的冻存制剂中P7代脐带间充质干细胞符合要求。
实施例6
取液氮(-196℃)保存的实施例2中得到的P7代脐带间充质干细胞冻存制剂，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37℃水浴中快速晃动，共复苏1管；解冻完成后，取退行性骨关节病兔模型，吸取复苏后的细胞悬液给予兔关节腔注射，给药后6周，动物麻醉处死后，解剖膝关节观察关节腔积液、溃烂、损伤、囊肿、滑膜肿胀等表观；于10倍手术显微镜下，观察股骨髁关节面的病理变化；部分膝关节标本采集后自来水冲洗，蒸馏水冲洗，然后脱转、常规脱水、浸蜡、包埋、切片，分别做HE染色和甲苯胺蓝染色。
结果：给药后6周，动物麻醉处死后，解剖膝关节观察发现关节软骨有不同程度的增厚，HE染色和甲苯胺蓝染色证明增厚处为软骨细胞，退行性骨关节病兔模型实验证明经液氮(-196℃)保存的冻存制剂中P7代脐带间充质干细胞对软骨损伤有修复作用。
具体实施方式包括但不限于上述。
Claims (10)
1.一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，其特征在于，以健康新生儿的脐带为原料，原代分离培养并大规模扩增培养脐带间充质干细胞，扩增后脐带间充质干细胞用含有人血白蛋白和二甲基亚砜的复方电解质注射液重悬，反复吸吹混匀后，将细胞逐渐降低保存温度冷冻成制剂。
2.根据权利要求1所述治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，其特征在于，所述扩增后脐带间充质干细胞通过7代扩增培养。
3.根据权利要求1或2所述治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，其特征在于，所述扩增后脐带间充质干细胞用PBS重悬，反复吸吹混匀，再离心；离心结束后吸弃上清液；离心后扩增后脐带间充质干细胞用含有2～5％人血白蛋白和10％二甲基亚砜的复方电解质注射液重悬，反复吸吹混匀后，将细胞冻存盒置于普通冰箱保存30～60min，继续将细胞置于超低温冰箱(-80℃)保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(-196℃)中长期保存。
4.权利要求1-3任一项所述治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：
采集脐带：取健康新生儿脐带，48小时内运输至实验室处理；
原代培养：将脐带灭菌消毒，去除脐静脉与脐动脉，撕取脐带华通氏胶，将华通氏胶置于离心管中；剪碎脐带华通氏胶，加入脐带间充质干细胞完全培养液，在细胞培养箱中培养；吸弃旧脐带间充质干细胞完全培养液及华通氏胶，浸洗贴壁细胞；加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为原代培养的脐带间充质干细胞(P0代)；
传代培养1：将P0代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5～2.0×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全细胞培养液至每瓶15～20ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用10～20ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P1代)；
参照上述传代培养1的方法，将脐带间充质干细胞传代至P3代，然后冻存P3代细胞建立脐带间充质干细胞种子库；
冻存细胞1：将P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，反复吸吹混匀后分装；将细胞置于常温(20℃)放置的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(-196℃)中长期保存；
复苏细胞1：从液氮罐(-196℃)中取出细胞，细胞在37℃水浴解冻；解冻完成后，将细胞冻存液转移至离心管内，加入20～30ml PBS重悬细胞，用反复吸吹混匀；离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P3代)；
传代培养2：将复苏后的P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用反复吸吹混匀后接种4.5～6.0×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45～60ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用20～30ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P4代)；
参照上述传代培养2的方法，将脐带间充质干细胞传代至P6代，然后冻存P6代细胞已建立脐带间充质干细胞半成品库；
冻存细胞2：将P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，用反复吸吹混匀后分装；将细胞置于常温(20℃)的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(-80℃)中保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(-196℃)中长期保存；
复苏细胞2：从液氮罐(-196℃)中取出细胞，细胞置于37℃水浴解冻；解冻完成后，将细胞冻存液转移至离心管内，加入30～40ml PBS，反复吸吹混匀；离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P6代)；
传代培养3：将复苏后的P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用反复吸吹混匀后接种2.7～3.6×107个细胞至底面积1272cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶250～360ml，将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80％以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用180～200ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2％FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P7代)；
制剂并冻存：将P7代脐带间充质干细胞再用30～40ml PBS重悬，再用电动吸液器反复吸吹混匀；再离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，继续用30～40ml PBS重悬，继续用电动吸液器反复吸吹混匀；继续离心，1000～1500rpm、5min、RT；离心结束后吸弃上清液，按以下方法制备治疗退行性骨关节病的干细胞制剂：将P7代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞制剂助悬液重悬，使其细胞终密度为1～4×107个/ml，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装4ml细胞悬液至容积为5ml的细胞冻存管中；将细胞冻存管置于细胞冻存盒内，再将细胞冻存盒置于普通冰箱(4℃)保存30～60min，继续将细胞冻存夹置于超低温冰箱(-80℃)保存过夜，最后将细胞冻存夹置于液氮罐(-196℃)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存。
5.根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述原代培养中适合接种的华通氏胶组织块数为48～60块/75cm2。
6.根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞完全培养液为DMEM/F12(1∶1)与FBS混合液，二者体积比为9∶1，配制时分别取9份DMEM/F12(1∶1)与1份FBS于室温下直接混合，配制完成后冷藏于普通冰箱(4℃)中。
7.根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，冻存细胞步骤中所述脐带间充质干细胞冻存保护液为DMSO与FBS混合液，二者的体积比为1∶9，配制时分别取1份DMSO缓缓滴入9份预先冷藏至4℃的FBS中，用电动吸液器吸吹混匀，配制完成后冷藏于普通冰箱(4℃)。
8.根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述P0代传代至P3代采用的是接种1.8×106个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶；所述P4代传代至P6代采用接种5.4×106个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶；所述P6代传代至P7代采用的是接种3.0×107个细胞至底面积1272cm2的细胞培养瓶。
9.根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述P7代脐带间充质干细胞制剂助悬液为含有2～5％人血白蛋白和10％DMSO的复方电解质注射液，其配制方法为：常温下取出20％人血白蛋白注射液2～5份，滴入15～18份复方电解质注射液中，用电动吸液器反复吸吹混匀后，置于4～12℃避光保存10min，再缓缓滴入1份DMSO至冷藏后的混合液9份中，用电动吸液器反复吸吹混匀后，置于4～12℃避光保存。
10.根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述P7代脐带间充质干细胞制剂中细胞含量为2×107个/ml。
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