CN101974484B - 一种人脐带间充质干细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一种人脐带间充质干细胞的制备方法，它包括脐带的采集、运输、交接、分离、冻存、复苏、原代培养和传代培养，工艺简便、生产成本低、冻存效果好、细胞损伤少，最大限度降低冻存保护液在组织块复苏后细胞内的残留，毒副作用小，对人体无伤害，制备出的间充质干细胞可以用于临床治疗多种疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种人脐带间充质干细胞的制备方法，制备出的间充质干细胞主要应用于干细胞移植、组织工程、器官移植和免疫治疗等方面。
背景技术
人脐带华通氏胶(Wharton’s Jelly)内的细胞具有能自我更新和多向分化、增殖能力强等干细胞的特征，我们称之为脐带间充质干细胞(huMS℃s)。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，因其具有支持造血和促进干细胞植入、调控免疫等特点而日益受到人们的关注，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞。
干细胞培养是一个连续的过程，一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化，而其需求时间是不确定性的，因此制备过程中及时进行冻存十分必要。传统的间充质干细胞的制备包括脐带的采集、运输、分离、原代培养和传代培养、冷冻保存和复苏，多采用完全培养基添加10％的二甲基亚砜冻存制备好的间充质干细胞，细胞复苏后短时间内即应用于临床。传统的制备方法存在以下缺点：(1)细胞冻存需要一定的细胞浓度，前期的细胞培养过程要耗费大量的人力物力；(2)细胞复苏后从复苏中完全恢复活性需要较长的时间，在较短时间内应用于临床的效果令人担忧；(3)复苏后的细胞也不可避免有微量冻存液残留，在较短时间内不能排除，会造成患者恶心、呕吐、腹痛等不良反应。
发明内容
本发明的目的在于克服传统制备间充质干细胞工艺中的缺陷，提供了一种工艺简便、生产成本低、制备出更高质量的间充质干细胞的制备方法。
本发明的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带的采集
胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中2-8℃恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各不少于4ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血4ml做收集血清用；
(2)脐带的运输
将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；
(3)脐带的交接
交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交分离实验室分离；
(4)脐带的分离
脐血、母血检测样本检测合格后，将步骤(3)转交至分离实验室的脐带分离成1-3mm3的组织块，脐带的分离步骤是沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2-3cm的小段，沿脐带静脉血管剪开并剥离静脉血管壁和动脉血管，剥离出华通氏胶后将华通氏胶移至离心管中，用组织剪将华通氏胶剪碎至1-3mm3大小的组织块，脐带从截取到实验室分离前的时间不能超过24小时；
(5)组织块的冻存
将组织块浸入2-8℃的冻存保护液中5-10分钟后分装到2ml的冻存管中，并将冻存管置于程序降温盒中放入-80℃冰箱，820小时后将冻存管转移至液氮罐内保存；或者将冻存管置于程控降温仪中以1℃/分钟降温至-80℃，然后转移至液氮罐内保存；
(6)组织块的复苏
将装有冻存的脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻2-5分钟，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤1-5次后接种至含有完全培养基的培养瓶中，接种密度为0.05-0.2g/ml；
(7)原代培养
将接种组织块的培养瓶置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天更换一次完全培养基，培养10-20天后得到P0代脐带间充质干细胞；
(8)传代培养
待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合80％-90％后以0.25％的胰酶消化后1∶3传代得到P1代脐带间充质干细胞，依此扩增可得到P5代的间充质干细胞。
本发明中所述的脐带保存液包括培养液DMEM/F12、青霉素、链霉素、庆大霉素、磷酸盐缓冲液PBS中的一种或几种的组合。
本发明中所述的冻存保护液包括基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂，所述脐带冻存保护液中的基础液包括培养液DMEM/F12、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、含10％胎牛血清的培养液DMEM/F12、步骤(1)脐血中的自体脐血血清、Invitrogen公司
MSC SFM培养液、Stem Cell公司
-XF Medium培养液中的一种或几种的组合；所述脐带冻存保护液中的渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种的组合；所述脐带冻存保护液中的非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合。
本发明中所述的复苏缓冲液包括培养液DMEM/F12、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种或几种的组合。
本发明中所述的完全培养基包括含10％胎牛血清的培养液DMEM/F12、Invitrogen公司
MSC SFM培养液、Stem Cell公司
-XF Medium培养液中的一种或几种的组合。
本发明的人脐带间充质干细胞的制备方法为采集、运输、交接、分离、冻存、复苏、原代培养、传代培养，本发明区别传统技术的优点是将脐带组织块直接进行冻存长期保存，无需扩增出大量的干细胞，这样可以大大节约储存成本。若储户需用自己的脐带治疗疾病，只需将冻存的组织块复苏后原代、传代培养出间充质干细胞，经直接冻存的组织块扩增出的细胞冻存液残留低，细胞活力好，细胞原代生长的时间、细胞的生长曲线、细胞的多向分化能力与未冻存的新鲜脐带基本无差异。
本发明为了制备出高质量的脐带间充质干细胞，是在脐带采集过程中采用了等渗的培养液或缓冲液中添加抗生素的脐带保存液，恒温条件下使脐带能在短时间内最大限度的保持新鲜状态，又避免了保存过程中污染的可能；同时创造性地采用了由基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂组合成的冻存保护液直接冷冻脐带华通氏胶组织块，结合了各种冷冻保护剂的优点，改变传统单一成份的细胞冻存保护液，同时相对于传统的玻璃化组织冻存液其各种冻存剂浓度也较低，冻存过程中对细胞活性保护最好、对细胞的毒性最小；并且组织块复苏采用了含有低毒、高粘度大分子的复苏缓冲液洗涤，最大限度地避免了组织块中的细胞在复苏过程中的损伤，经过复苏缓冲液多次洗涤，也最大限度地排除了组织块中的冻存保护液残余。
附图说明
图1：制备出的P2人脐带间充质干细胞
图2：制备出的P2代间充质干细胞成骨诱导鉴定图
图3：制备出的P2代间充质干细胞成脂诱导鉴定图
图4：制备出的P2代间充质干细胞的生长曲线
图5：制备出的P2代间充质干细胞表面标记的流式检测
具体实施方式
下文给出了本发明的具体实施例，但对本发明不构成任何限制。
实例一：
(1)脐带的采集
足月胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中2℃恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各4ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血4ml做收集血清用，所述脐带保存液的成分为含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的磷酸盐缓冲液PBS；
(2)脐带的运输
将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；
(3)脐带的交接
交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交给分离实验室分离；
(4)脐带的分离
脐血、母血检测样本检测合格后，将分离实验室的脐带沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2cm的小段，沿脐带静脉血管剪开并剥离静脉血管壁和动脉血管，剥离出华通氏胶后将华通氏胶移至离心管中，用组织剪将华通氏胶剪碎成若干个1mm3大小的组织块，脐带从截取到实验室分离前的时间不能超过24小时；
(5)组织块的冻存
将组织块浸入2℃的冻存保护液中5分钟后分装到2ml的冻存管中，并将冻存管置于程控降温仪中以1℃/分钟降温至-80℃，将冻存管迅速转移至液氮罐内长期保存，所述冻存保护液为含甘油1M、二甲基亚砜0.5M、甘露醇0.1M、自体脐血血清为10％的培养液DMEM/F12；
(6)组织块的复苏
当有临床需求时，将装有脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻2分钟，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤1次后接种至含有完全培养基的培养瓶中，接种密度为0.05g/ml，所述复苏缓冲液的成分为含海藻糖0.2M的磷酸盐缓冲液PBS；
(7)原代培养
将接种组织块的培养瓶置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天更换一次完全培养基，培养10-20天后得到P0代脐带间充质干细胞，所述完全培养基为含10％胎牛血清的培养液DMEM/F12；
(8)传代培养
待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合80％-90％后以0.25％的胰酶消化后1∶3传代得到P1代脐带间充质干细胞，依此扩增得到P5代的间充质干细胞。
实例二：
(1)脐带的采集
足月胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中8℃恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各4ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血4ml做收集血清用，所述脐带保存液的成分为含20ug/ml庆大霉素的培养液DMEM/F12；
(2)脐带的运输
将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；
(3)脐带的交接
交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交给分离实验室分离；
(4)脐带的分离
脐血、母血检测样本检测合格后，将分离实验室的脐带沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成3cm的小段，沿脐带静脉血管剪开并剥离静脉血管壁和动脉血管，剥离出华通氏胶后将华通氏胶移至离心管中，用组织剪将华通氏胶剪碎成若干个3mm3大小的组织块，脐带从截取到实验室分离前的时间不能超过24小时；
(5)组织块的冻存
将组织块浸入8℃的冻存保护液中10分钟后分装到2ml的冻存管中，并将冻存管置于程序降温盒中放入-80℃冰箱，20小时后将冻存管迅速转移至液氮罐内长期保存，所述冻存保护液为含丙二醇2M、甘露醇0.2M的磷酸盐缓冲液PBS；
(6)组织块的复苏
当有临床需求时，将装有脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻5分钟，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤5次后接种至含有完全培养基的培养瓶中，接种密度为0.2g/ml，所述复苏缓冲液5次洗涤的成分分别为含0.5M、0.4M、0.3M、0.2M、0M蔗糖的生理盐水；
(7)原代培养
将接种组织块的培养瓶置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天更换一次完全培养基，培养10-20天后得到P0代脐带间充质干细胞，所述完全培养基为Stem Cell公司
-XF Medium培养液；
(8)传代培养
待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合80％-90％后以0.25％的胰酶消化后1∶3传代，得到P1代脐带间充质干细胞。
实例三：
(1)脐带的采集
足月胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中4℃恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各4ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血4ml做收集血清用；所述脐带保存液的成分为含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的磷酸盐缓冲液PBS；
(2)脐带的运输
将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；
(3)脐带的交接
交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交给分离实验室分离；
(4)脐带的分离
脐血、母血检测样本检测合格后，将分离实验室的脐带沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2.5cm的小段，沿脐带静脉血管剪开并剥离静脉血管壁和动脉血管，剥离出华通氏胶后将华通氏胶移至离心管中，用组织剪将华通氏胶剪碎成若干个2mm3大小的组织块，脐带从截取到实验室分离前的时间不能超过24小时；
(5)组织块的冻存
将组织块浸入4℃的冻存保护液中8分钟后分装到2ml的冻存管中，并将冻存管置于程序降温盒中放入-80℃冰箱，16小时后将冻存管迅速转移至液氮罐内长期保存，所述冻存液的成分为含生理盐水30％、乙二醇1.2M、蔗糖0.3M的含10％胎牛血清培养液DMEM/F12；
(6)组织块的复苏
当有临床需求时，将装有脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻3分钟，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤3次后接种至含有完全培养基的培养瓶中，接种密度为0.1g/ml，所述复苏缓冲液3次洗涤的成分分别为含0.5M、0.25M、0M蔗糖的培养液DMEM/F12；
(7)原代培养
将接种组织块的培养瓶置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天更换一次完全培养基，培养10-20天后得到P0代脐带间充质干细胞，其中完全培养基为Invitrogen公司
MSC SFM培养液；
(8)传代培养
待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合80％-90％后以0.25％的胰酶消化后1∶3传代得到P1代脐带间充质干细胞，细胞融合80％-90％后再次传代得到P2代脐带间充质干细胞。
实例四：
(1)脐带的采集
足月胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中4℃恒温保存，从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各4ml作为检测样本，从胎盘端另抽取脐血4ml做收集血清用；所述脐带保存液的成分为含20ug/ml庆大霉素的培养液DMEM/F12；
(2)脐带的运输
将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；
(3)脐带的交接
交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交给分离实验室分离；
(4)脐带的分离
脐血、母血检测样本检测合格后，将分离实验室的脐带沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2.5cm的小段，沿脐带静脉血管剪开并剥离静脉血管壁和动脉血管，剥离出华通氏胶后将华通氏胶移至离心管中，用组织剪将华通氏胶剪碎成若干个2mm3大小的组织块，脐带从截取到实验室分离前的时间不能超过24小时；
(5)组织块的冻存
将组织块浸入4℃的冻存保护液中8分钟后分装到2ml的冻存管中，并将冻存管置于程序降温盒中放入-80℃冰箱，8小时后将冻存管迅速转移至液氮罐内长期保存，所述冻存液的成分为含Invitrogen公司
MSCSFM培养液30％、乙二醇1.7M、海藻糖0.1M的Stem Cell公司
-XF Medium培养液；
(6)组织块的复苏
当有临床需求时，将装有脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻5分钟，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤1次后接种至含有完全培养基的培养瓶中，接种密度为0.1g/ml，所述复苏缓冲液的成分为含甘露醇0.2M的培养液DMEM/F12；
(7)原代培养
将接种组织块的培养瓶置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天更换一次完全培养基，培养10-20天后得到P0代脐带间充质干细胞，其中完全培养基为Invitrogen公司
MSCSFM培养液；
(8)传代培养
待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合80％-90％后以0.25％的胰酶消化后1∶3传代得到P1代脐带间充质干细胞，依此扩增得到P5代的间充质干细胞。
以下是对最佳实施例三制备出的P2代脐带间充质干细胞进行的如下测试：
所涉及的参数是由下述仪器测定的：倒置显微镜、FACSCanto流式细胞仪、酶标仪、培养箱、低温冰箱、液氮罐等。
(一)显微镜拍照
培养出的P2代人脐带间充质干细胞融合至60-80％，将其置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一，排列整齐，如图1所示。
(二)多向分化能力鉴定
将1×104/ml的P2代细胞悬液接种于24孔培养板中，0.5ml/孔；细胞融合至60-80％，换成Invitrogen公司的成骨诱导完全培养基，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导7天后，茜素红染色后拍照，可见有大量钙结节产生，如图2所示。
将1×104/ml的P2代细胞悬液接种于24孔培养板中，0.5ml/孔；细胞融合至60-80％，换成Invitrogen公司的成脂诱导完全培养基，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导14天后，油红O染色后拍照，可见所有细胞内均有脂滴产生，如图3所示。
(三)生长曲线的绘制
取制备好的P2代细胞，消化至单细胞悬液；以含10％牛血清的培养液DMEM/F12调整浓度至1×104/ml，点加入96孔板中；设13组每组8个复孔，每孔200μl，置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养；每2天换液，分别在培养至1-13天后，每孔加20μl的浓度为5mg/mL的噻唑蓝(MTT)，继续培养；4小时后小心移去培养上清；每孔加入100μl的二甲基亚砜，微量振荡器震荡5分钟；置酶标仪上测570nm或490nm下的光吸收值，统计学分析后绘制出生长曲线，生长曲线显示此细胞倍增时间为49小时，增殖状态良好，无异常，如图4所示。
(四)流式细胞检测
将5×106细胞消化成单细胞悬液；以PBS洗涤两遍后调整浓度至1×105/ml，流式细胞仪检测细胞表面标记CD73和CD105，阳性细胞率均超过95％，符合间充质干细胞的特征，如图5所示。
Claims (1)
1.一种人脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带的运输
将脐血、母血检测样本和置于脐带保存液中保存的脐带送至交接实验室；所述脐带保存液为含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的磷酸盐缓冲液PBS；
(2)脐带的交接
交接实验室登记后将脐血、母血检测样本交给质控实验室做微生物学和免疫学检测，将脐带转交分离实验室分离；
(3)脐带的分离
脐血、母血检测样本检测合格后，将步骤(2)转交至分离实验室的脐带分离成1-3mm3的组织块；
(4)组织块的冻存
将组织块浸入2-8℃的冻存保护液中5-10分钟后分装到2ml的冻存管中，并将冻存管置于程序降温盒中放入-80℃冰箱，8-20小时后将冻存管转移至液氮罐内保存；所述冻存保护液为含生理盐水30%、乙二醇1.2M、蔗糖0.3M的含10%胎牛血清培养液DMEM /F12；
(5)组织块的复苏
将装有脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻2-5分钟，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤1-5次后接种至含有完全培养基的培养瓶中；所述复苏缓冲液为含蔗糖的培养液DME M/F12；
(6)原代培养
将接种组织块的培养瓶置于37℃、含5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天更换一次完全培养基，培养10-20天后得到P0代脐带间充质干细胞；所述完全培养基为含10%胎牛血清的培养液DMEM/F12、Invitrogen公司STEMPRO® MSC SFM培养液、Stem
Cell 公司MesenCult®-XF Medium培养液中的一种；
(7)传代培养
待脐带间充质干细胞P0代长至细胞融合80%-90%后传代，依此扩增可得到P5代的间充质干细胞。
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