CN102191218B - 一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的培养方法。完全培养基是按体积比向低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液中加入3％-10％的人自体脐带血血清配制而成；培养方法包括：(1)分离；(2)原代培养；(3)传代培养。本发明采用前述完全培养基用于hAMSCs培养的优点为：回避了使用胎牛血清的风险，且无需添加L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和丙酮酸等，仍可保持hAMSCs较好的增殖特性和表型特征及一些干细胞多向分化潜能标志基因和蛋白表达；传代培养中hAMSCs贴壁的牢固程度明显低于FBS培养条件，消化时间明显缩短，减少了胰酶消化对细胞的损伤和细胞数量的损失。

Description

一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymalstem cells，hAMSCs)的培养方法，属于细胞工程及生物医药技术领域。

背景技术

人羊膜为附着在胎盘绒毛膜表面的一层半透明薄膜，属于胎膜组织的一部分，由胚胎发育期的细胞滋养层演化而来。除人羊膜上皮细胞以外，hAMSCs是构成人羊膜组织的主要细胞类型之一，表达胚胎干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的标志，具有多谱系分化潜能，是一种具有代表性的MSCs。在体外特定诱导条件下，hAMSCs可分化成来自三个胚层的所有细胞，包括神经细胞、心肌样细胞、胰腺细胞和肝细胞等。hAMSCs因其多向分化潜能和低免疫原性，体外扩增能力明显强于骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，加之其来源丰富，易于富集，不牵涉医学伦理问题等优势，且目前临床已用于角膜损伤、眼皮肤损伤和肌腱损伤等治疗，并取得较好的治疗效果。因而，hAMSCs在体细胞治疗和组织工程研究中显示出良好的应用前景。

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)含有丰富的生长因子、营养成分及维持细胞生长的激素，还可为细胞贴壁、铺展提供所需的因子。因此，干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如FBS)的培养基，BMSCs和脐带血间充质干细胞的培养也多采用FBS。目前，hAMSCs的培养体系通常为LG-DMEM培养基中加入10％的FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、55μmol/L 2-巯基乙醇和1mmol/L丙酮酸钠，传代培养2-4代，hAMSCs的表面标志与BMSCs相似，除表达典型的间充质细胞标志，如：波形蛋白(vimentin，VIM)、CD105⁺、CD90⁺、CD73⁺、CD44⁺、CD29⁺、HLA-A，B，C⁺、CD13⁺、CD10⁺、CD49c⁺、CD49d、CD49e⁺、CD54⁺和CD166⁺、CD271低表达，CD14^-、CD34^-、CD45^-、CD31^-、CD133^-和CD3^-，不表达HLA-DR，还表达干细胞标志Oct-4、TRA-1-60、SSEA-3、SSEA-4和其他CD分子CD349、CD140b和CD324(E-cadherin)等。但FBS等动物血清的应用，在干细胞移植后，输入异种蛋白对患者存在潜在的威胁，可产生抗FBS抗体及其他尚未知晓的不良反应，而且可能造成人与其他物种间病毒感染的传播。如何优化培养体系，找到一种既能促进MSCs增殖，又能提供多向分化潜能的优质干细胞，也是满足细胞治疗临床需求的基本条件，研究人员不断探索，努力提高细胞培养血清质量，或探索无血清培养体系等，因而，良好的培养体系的建立是生物技术产业中干细胞体外扩增应用于临床的关键、核心技术。

人脐带血血清(human cord blood serum，hCBS)来源于分娩后的脐带，含有一系列营养因子和细胞因子，来源丰富、易于获取、采集方便，对供者没有损害，无生理和伦理问题，较FBS等动物血清而言，引起动物性疾病在人的传播风险小，可以避免细胞吞噬FBS中的蛋白质及移植时宿主产生免疫反应。hCBS已用于BMSCs和脐带血间充质干细胞的培养，且hCBS在BMSCs的培养扩增中明显优于优等FBS。在hCBS为主体的培养体系中，脐带间充质干细胞可稳定生长，贴壁细胞呈现典型的MSCs特征，细胞呈成纤维细胞样，平行排列生长或旋涡状生长，并可传代扩增。但有关自体hCBS用于hAMSCs培养的研究国内外尚未见报道。

基于hAMSCs的良好临床应用前景，发明人在已建立的胰酶和II型胶原酶消化、分离、纯化和10％FBS LG-DMEM完全培养基培养hAMSCs方法基础上，首次建立自体hCBS培养体系，并观察、分析hCBS培养的hAMSCs的免疫表型、细胞增殖和细胞周期及其多能干细胞标志等，为hAMSCs用于人体细胞治疗提供基本培养技术，可望优先满足自体hAMSCs移植的需要和解决一定规模的hAMSCs细胞产品制备。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种完全培养基及hAMSCs的培养方法。本发明以人自体脐带血血清和低糖-Dulbecco极限必须培养基组成完全培养基，用于人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的培养，能使细胞保持良好形态学特征和增殖能力，并保持间充质细胞及干细胞的表型标志和蛋白特征及多向分化潜能。

本发明是这样构成的：一种完全培养基，它是按体积比向低糖-Dulbecco极限必须培养基(低糖-dulbecco’s minimum essentiai medium，LG-DMEM)溶液中加入3％-10％的人自体脐带血血清(human cord blood serum，hCBS)配制而成。

前述低糖-Dulbecco极限必须培养基(LG-DMEM)溶液这样制备：取低糖-Dulbecco极限必须培养基(LG-DMEM)10g(Gibco公司市售产品，10g/袋)溶于1000ml超纯水中，调pH值至7.2-7.4，过滤除菌，分装，4℃保存，即可。

前述人自体脐带血血清(hCBS)这样制备：无菌条件下抽取脐带血50-70ml，注入无菌玻璃瓶中，静置于37℃培养箱2h，待血凝块完全析出后，无菌条件下，超净台中吸取析出的血清，移入新的无菌离心管内，4℃、1000g离心20min，收集上清15-20ml，56℃水浴灭活30min，0.2μm滤器除菌后，血清分装于5ml小瓶，-20℃保存、备用；同时进行培养，检菌，无细菌生长即可。

一种人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)的培养方法，包括以下步骤：(1)分离：将羊膜组织用D-Hank’s液冲洗干净，剪碎，分装于离心管内，用0.05％胰蛋白酶-0.02％ EDTA-2Na消化液重复消化、过滤3次，剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液旋转消化，至组织完全消化，过滤，收集细胞滤液，离心，弃上清；(2)原代培养：离心后的沉淀用完全培养基进行原代培养；(3)传代培养：待人羊膜间充质干细胞生长到80％-90％融合后，再进行传代培养。

前述步骤(1)中用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液消化的过程为：先于37℃消化10min，弃去消化液；再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；同样方法重复消化、过滤2次。

前述步骤(1)中的旋转消化条件为37℃、200rpm，消化时间为2h，经300目不锈钢网滤过，收集细胞滤液于离心管。

前述步骤(2)所述原代培养过程为：用含3％-10％ hCBS的完全培养基悬浮细胞后计数，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，观察细胞生长情况。

前述步骤(3)所述传代培养过程为：取对数生长期内，融合率80％-90％的人羊膜间充质干细胞，弃去原有培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125％胰蛋白酶消化液30s-1min，观察消化程度，及时用完全培养基终止消化，收集细胞，离心，弃上清，沉淀用完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。

更具体的hAMSCs的培养方法为：(1)分离：将羊膜组织用D-Hank’s液反复冲洗，除尽残留的血迹，刮出羊膜表面的血管、粘液，剪碎羊膜分装于离心管内，加2.5-3倍体积的0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液，37℃消化10min，弃去消化液，再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；继续用同样方法重复消化、过滤2次；消化后剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液，37℃、200rpm旋转消化2h，至组织完全消化，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液于离心管，1500r/min离心10min，弃上清；(2)原代培养：离心后的沉淀用完全培养基悬浮后，台盼蓝染色、计数，当细胞活力＞90％后，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种于培养瓶，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液-次，观察细胞生长情况；(3)传代培养：待hAMSCs生长到80％-90％融合后，弃去原有的培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125％胰蛋白酶消化液30s-1min，观察消化程度，及时用完全培养基终止消化，收集细胞，1500r/min离心5min，弃上清，沉淀用完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。

为了验证本发明的可行性及效果，下面用具体实验例进一步详细说明。

一、材料和方法

1、材料

1.1人羊膜及脐带血来源经知情同意后，无菌采集12例剖宫产足月分娩的胎盘，孕妇及胎儿身体健康，艾滋病和乙型肝炎阴性，收集同一个体的羊膜和脐带血，采集后2小时内进入实验程序。

1.2主要试剂本实验所用主要试剂见表1，其它试剂均为国产或进口分析纯。

表1 主要试剂

1.3主要仪器流式细胞仪(FACS caiibur，Becton Dickinson，USA)，CO₂培养箱(3141，I/R，Thermo Forma，USA)，超纯水制备系统(MILLI-Q Biocel，MILLIPORE，USA)，高速低温离心机(Centrifuge 5804R，Eppendorf，Germany)，倒置相差显微镜(IX-71-S8F，Olympus，Japan)，Leica QwinV3图像分析系统(Leica DMIRB，DIC，Germany)，pH计(3310，Jenway，UK)，正压过滤器(XX8200237，Millipore，USA)，恒温水浴摇床(SBD 50，Heto，Denmark)，iQ5 Multicolor Real-Time PCR DetectionSystem(BioRad Laboratories，Inc.USA)，Mastercycler Gradient Cycler(EppendorfAG，Germany)，Model 550 Reader(BioTek Instruments，Inc.USA)和TU1810紫外可见分光光度计(北京普析仪器有限责任公司)、5415D Centrifuge(Eppendorf AG，Germany)，Leica QwinV3图像分析系统(Leica，Germany)。

1.4试剂配制LG-DMEM培养基：取LG-DMEM培养基一袋(10g)溶于1000ml超纯水中，调pH值至7.2-7.4，过滤除菌，分装，4℃保存。D-Hanks液(g/L)：KCL 0.40，KH₂PO₄0.06，NaCl 8.00，NaHCO₃0.35，Na₂HPO₄·7H₂O 0.09，加超纯水至1000ml，调pH至7.2-7.4，高压灭菌，冷却后4℃保存。D-PBS(g/L)：KCl 0.20，KH₂PO₄0.20，NaCl 8.00，Na₂HPO₄·7H₂O 2.16，加超纯水至1000ml，调pH至7.2～7.4，高压灭菌，冷却后4℃保存。0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na：胰蛋白酶0.05g，EDTA-2Na 0.02g，D-PBS 100ml搅拌溶解后，过滤除菌，分装，-20℃保存。0.125％胰蛋白酶：胰蛋白酶0.125g，D-PBS 100ml搅拌溶解后，过滤除菌，分装，-20℃保存。0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I：II型胶原酶75mg，Dnase I 7.5mg加入LG-DMEM培养基100ml搅拌溶解，过滤除菌，分装，-20℃保存。2％台盼蓝：台盼蓝2g，加少量水研磨后，再加水至50ml，充分溶解，离心，取上清，加入1.8％NaCl溶液至100ml。完全培养基：LG-DMEM(含L-谷氨酰胺)，分别加入3％-10％hCBS。0.1％牛血清白蛋白：牛血清白蛋白0.1g加入D-PBS 100ml搅拌溶解，过滤除菌，分装，-20℃保存。4％多聚甲醛：多聚甲醛4g，加入80ml PBS中，磁力搅拌器搅拌加热至60℃左右，待完全溶解后滴加少许1mol/L PBS定容至100ml。

2、方法

2.1hCBS制备参照金均等方法，无菌条件下抽取不抗凝脐带血50-70ml，注入无菌玻璃瓶中，静置于37℃培养箱2h。待血凝块完全析出后，无菌条件下，超净台中吸出析出的血清，移入新的无菌离心管内，4℃、1000g离心20min。收集上清15-20ml，56℃水浴灭活30min，0.2μm滤器除菌后，血清分装于5ml小瓶，-20℃保存、备用。同时留取2ml血清于37℃、5％CO₂孵箱培养3d，检菌，无细菌生长的合格血清用于hAMSCs培养。

2.2hAMSCs的分离和原代培养实验在无菌条件下进行操作。取回的羊膜组织，用D-Hank’s液反复冲洗，除尽残留的血迹，刮出羊膜表面的血管、粘液，剪碎羊膜分装于50ml离心管内，加2.5-3倍体积的消化液(0.05％的胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na)，37℃消化10min，弃去消化液。37℃，低速旋转200rpm，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内。继续用同样方法重复消化2次。经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液，37℃、200 rpm旋转消化2h，直至组织完全消化，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液，1500r/min离心10min，弃上清，沉淀用含3％-10％hCBS培养基悬浮后计数，2％台盼蓝染色检测细胞活力＞90％，按5×10⁵cells/cm²的细胞密度接种。37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d后，倒置显微镜下观察生长情况。细胞融合达80％以上，传代培养。

2.3传代培养原代培养的hAMSCs生长到80％-90％融合后，弃去原有的培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量的0.125％胰蛋白酶消化液30s-1min，显微镜下观察消化程度，及时用含3％-10％hCBS的培养基终止消化，收集细胞，1500r/min，离心5min，弃上清。hAMSCs沉淀用含3％-10％hCBS培养基重新悬浮，均按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养。每隔3-5d换液、传代一次，每日于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

2.4生长曲线的绘制取生长良好，达80％融合的第2代hAMSCs细胞，按1×10⁵/ml的细胞密度接种于24孔板，培养1-7d，每天于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态学特征，并拍照。每24h吸取3个孔的培养液，加入适量的0.125％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液后计数，计算平均值，以时间为横坐标、细胞浓度为纵坐标绘制生长曲线。计算细胞倍增时间(doubling time，DT)：DT＝I×lg2/lgN/N₀)，I为传代间隔天数，N为细胞计数，N0为接种数，以细胞长满瓶底的90％左右计传代时间。

2.5细胞周期测定0.125％胰蛋白酶消化，收集第3代hAMSCs，PBS洗3遍。用0.2ml的PBS重悬细胞，加入1ml的70％冰乙醇，4℃固定过夜。检测前离心，1000rpm，5min。PBS洗3遍，加入PBS 0.2ml，加入Rnase A和碘化丙啶，室温避光30min。流式细胞仪至少计数1×10⁶个细胞，应用Mod Fit LT 2.0软件分析结果。计算hAMSCs增殖指数(proliferationindex，PI)：PI＝[(S+G₂/M)÷(G₀/G₁+S+G₂/M)]×100％。

2.6流式细胞仪检测分析取传代培养第1代和第2、3代的hAMSCs，用0.1％牛血清白蛋白调细胞浓度均至1×10⁶/ml，取细胞悬液200μl按组合方案加入10μl荧光标记单抗CD44-FITC、CD45-FITC、CD29-PE、CD34-PE、CD73-PE、CD166-PE，混匀，室温避光孵育25-30min，每管加入2ml含0.1％叠氮钠的PBS，混匀，1000r/min离心5min，弃上清，振荡重悬细胞，每管加入300μl含1％多聚甲醛的PBS溶液，混匀，4℃避光放置，24h内进行流式细胞仪检测，每份样品的采集细胞≥2×10⁴个，采用Cell Quest软件进行表型分析。同型对照抗体为相应荧光素标记的小鼠IgG。

2.7RT real-time PCR

2.7.1hAMSCs总RNA提取及纯化按试剂盒说明书取冻存于0.5ml RNAriso试剂中的hAMSCs样本，每0.5ml加氯仿0.5ml，摇匀，离心12000g，10min，4℃取上清液并定量；加入与上清液等量的异丙醇，离心12000 g，4℃，10min，弃去上清液；加入75％的酒精0.5ml，12000g，4℃，10min，小心弃去含酒精上清；将EP管倒立于滤纸上空干；DEPC水50μl溶解白色沉淀。

2.7.2测定样品中RNA的浓度和纯度通过紫外分光光度计检测，A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8-2.0范围内为合格RNA，并根据A₂₆₀的值计算样品总RNA浓度(RNA浓度＝OD₂₆₀×40μg/ml×稀释倍数，本实验中稀释倍数为50)，配置50ng/μl的RNA样品液体，-70℃保存备用。

2.7.3两步法逆转录-聚合酶链反应(Two steps RT real time PCR)

(1)逆转录反应体系(冰上配制)：按试剂盒说明书分别加入5×PrimeScripe TM Buffer4.0μl，PrimeScripe TMRT Enzyme Mix 1.0μl，Oligod T Primer(50μM) 1.0μl，Random 6 mers(100μM) 1.0μl，Total RNA 13.0μl，总体积20μl。反应条件：37℃，15min；85℃，5sec，4℃保持。

(2)PCR产物稀释3.25倍；

(3)real time PCR反应体系：按试剂盒比例要求分别加入iQ SYBR Green Supermix10μl，模板混合液(上游、下游引物)1μl，cDNA template 4μl，和去DNA酶的双蒸水5μl，总体积20μl。反应条件：95℃，8min；95℃，15sec；60℃，1min，40个循环。

波形蛋白(vimentin，VIM)，细胞角蛋白18(cytokeratin，CK18)，白蛋白(albumin，Alb)，AFP(alpha fetoprotein，甲胎蛋白)，核糖体核糖核酸18S小亚基(18Ssmall subunit rRNA，18S，内参基因)引物用ABI Primer Express software(AppliedBiosystems，Foster City，CA)设计，由Sigma公司合成，Oct-4(由POU5F1基因编码产生，为POU转录因子家族的一个成员，Octamer-4的缩写，Oct-4)，Nanog(一个及早胚胎特异性NK基因)，β-肌动蛋白(β-actin)和18S作为内参基因，其引物由大连宝生物工程有限公司设计、合成。

表2VIM、CK18、Alb、AFP、Oct-4、Nanog和β-actin基因的上、下游引物

2.7.4mRNA表达的相对定量以Ct值为统计参数，按公式计算目的基因的相对定量。Ct average＝(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管)，dCt＝Ct average-中间值，基因的表达＝2^(-dCt)，相对定量＝目的基因的表达/内参基因的表达。

2.8苏木精-伊红染色观察细胞形态苏木精-伊红染色法(Hematoxylin and eosinstaining，HE染色法)是形态学最常用的染色方法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色后，细胞核呈蓝色，细胞浆呈不同程度的红色。培养的第2代hAMSCs经消化后，以1×10⁵个/孔接种在预先放有经无菌处理的盖玻片的6孔板内，待细胞在盖玻片上铺满80％左右后，取出盖玻片，PBS小心洗去残留培养基，4％多聚甲醛固定30min，去离子水冲洗3遍后进行常规HE染色，光学显微镜下观察细胞形态。

2.9免疫细胞化学染色按试剂盒说明在湿盒中进行染色。取hCBS第3代传代培养的hAMSCs细胞爬片，0.01M PBS缓冲液漂洗，4％多聚甲醛固定，封闭液封闭，滴加待测VIM、AFP、CK18及Abl蛋白的抗体，室温孵育1h(空白对照用PBS代替一抗)，PBS漂洗后，滴加兔抗小鼠或羊抗兔的通用型二抗，DAB显色，棕色颗粒为阳性表达标志，苏木素复染，显微镜观察并拍照。

2.10hAMSCs体外诱导向成骨细胞分化取传代至第4和第10代生长至80％～90％的hAMSCs，以2×10⁴/孔密度接种于6孔培养板，常规培养3d，成骨诱导组每孔加入2ml 10％胎牛血清的人脐带间充质干细胞成骨分化培养液(含地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸)，对照组加入等量普通培养液，按试剂盒要求每3d换液1次，诱导培养21d，取细胞爬片以PBS洗涤2次，4％甲醛固定，1％茜素红染色，镜下观察结果。

2.11hAMSCs体外诱导向成脂肪细胞诱导分化取传代至第4和第10代生长至80％～90％的hAMSCs，以2×10⁴/孔密度接种于6孔培养板，常规培养3d，达100％融合后，诱导组每孔分别按试剂盒说明书加入成脂肪分化培养基A液(含10％胎牛血清的人脐带间充质干细胞成脂分化基础培养基A、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素)及成脂肪分化培养基B液(含10％胎牛血清的人脐带间充质干细胞成脂分化基础培养基B和胰岛素)，对照组加入等量普通培养液。诱导21d，观察到有脂肪空泡形成，吸去培养液，取细胞爬片，PBS洗涤2次，4％甲醛溶液固定，油红O染色，镜下观察结果。

2.12统计学处理实验数据均以平均值±标准差表示，用SPSS 13.0软件进行统计分析，两组间均数比较采用t检验，以P＜0.05表示有统计学意义。

二、结果

1、hCBS培养hAMSCs的形态学观察原代培养hAMSCs 48h后，可见少量贴壁细胞，第3d贴壁细胞明显增多，细胞形态多样，呈梭形、多角形、星形等；5-7d后，细胞排列紧密，胞体拉伸，梭形细胞增多，呈漩涡状生长(图1A)。原代hAMSCs细胞至80％融合时，按1×10⁵/ml的细胞密度进行传代培养。hCBS培养后的第2、3代细胞均能在24h内贴壁。hCBS培养后的第2、3代细胞逐渐呈梭形、单层放射状伸展；10％hCBS传代培养第3d，hAMSCs已达80％以上融合，可见细胞呈纤维样状(图1B)，细胞密度高，第2、3代hAMSCs形态无显著差异。6％-7％等中间浓度的hCBS的LG-DMEM培养体系在原代培养和传代培养hAMSCs细胞时，hAMSCs的形态学和增殖速度及融合百分率变化与10％hCBS培养体系未见明显差异。而3％-5％hCBS传代培养第5d，hAMSCs细胞融合达80％左右。

2、10％hCBS培养的hAMSCs生长曲线hCBS培养的hAMSCs细胞融合达80％左右，用0.125％胰酶-0.02％EDTA-2Na消化20-30s，即可从培养瓶底吹打成为单细胞悬液；FBS培养的hAMSCs细胞一般须用0.125％胰酶-0.02％EDTA-2Na消化(37℃)2-3min，表明hCBS培养的hAMSCs贴壁不如FBS牢固。hCBS培养的hAMSCs细胞生长7d的细胞密度如图3所示，hCBS培养的hAMSCs按1.5×10⁴/ml的细胞密度接种于24孔板后，第1d，细胞稀疏，第3d开始呈现明显的纤维样，至第4-5d，hAMSCs密度明显提高，第7d细胞已呈叠片状排列(图3)。1-7d细胞生长曲线呈S型(图2)，DT为32h。

3、10％hCBS培养的hAMSCs的细胞周期流式细胞仪检测显示(表3)，10％hCBS培养体系下，hAMSCs细胞主要集中在G₀-G₁期，达到75.2％，而G₂-M期和S期的细胞比率分别为15.5％和9.3％，相对较少。hAMSCs的增殖指数为(24.8±4.3)％。

表310％hCBS培养的hAMSCs细胞增殖周期(

n＝3)

4、hCBS培养的hAMSCs的表型特征用抗人CD44-FITC抗体标记hAMSCs，流式细胞仪检测结果显示(表4)10％hCBS培养的第一代和第2、3代hAMSCs均表达以下细胞分化抗原(cell differentiation antigen，CD)分子，即CD44⁺、CD29⁺、CD34、CD73⁺和CD166⁺，而基本不表达CD45和CD34，第2、3代细胞经过差速贴壁传代后，表达CD44⁺和CD29⁺细胞的百分率较第一代细胞有增高趋势，但无统计学差异(P＞0.05)。5％hCBS传代培养第3代hAMSCs表达CD34和CD45的细胞百分率分别为0.67％和0.33％，表达CD44和CD29阳性细胞则高达95.06％和85.48％。

表4 10％hCBS培养hAMSCs的细胞分化抗原分子的表达(n＝3-4，

)

与第1代组比较，*P＜0.05。

5、10％hCBS培养hAMSCs的6个基因表达情况VIM、Alb、CK18、AFP基因以β-actin为内参基因，RT real time PCR相对定量检测结果显示(表5)，hCBS培养的hAMSCs细胞VIM mRNA表达高，AFP mRNA表达较高，而Alb和CK18 mRNA表达较低。以18S为内参基因，测定Oct-4和Nanog均在hAMSCs中均有一定表达(表6)。

表5 10％hCBS培养第3代hAMSCs VIM、Alb、CK18和AFP mRNA的表达(n＝3，

)

β-actin为内参基因。

表6 10％hCBS培养hAMSCs胚性标志基因Oct-4和Nanog mRNA的相对定量(n＝3，

)

18S为内参基因。

6、HE染色的hCBS培养hAMSCs形态

第3代hAMSCs经HE染色，如图4所示，细胞核呈蓝染，胞浆呈不同程度的红染。hAMSCs形态清晰，呈纤维样，有一定数量细胞铺展较好。

7、10％hCBS培养hAMSCs VIM、AFP、Alb和CK18蛋白的表达

免疫组化染色显示(图5)，10％hCBS培养hAMSCs VIM、AFP和Alb呈阳性表达，而CK18为低表达。

8、hAMSCs分化为成骨细胞hAMSCs向成骨细胞分化诱导9天，细胞外基质见有少量钙盐样沉积，似有些钙结节形成，随着诱导时间的延长，钙盐沉积增加，成骨诱导分化后21天进行茜素红染色，可见细胞外基质有大量红色钙盐沉积(图6A)。

9、hAMSCs分化为成脂细胞向hAMSCs加入脂肪细胞诱导培养基9天后，细胞中似有小脂滴出现，随着诱导时间的延长，细胞逐渐增大，由原来的梭形变为多角形，小脂滴增多，第21天油红O染色呈阳性(图6B)。

三、结论

本实验采用hCBS加LG-DMEM培养基组成的完全培养基培养hAMSCs，原代和传代培养，细胞均可良好贴壁生长，铺展呈纤维样，平行排列或旋涡状生长，并可传代扩增。传代至第3代，细胞纯度较高，生长良好，其生长曲线呈S形。10％hCBS传代培养hAMSCs第3-6天为对数生长期，DT为32h；细胞周期分析显示，与其他来源干细胞相似，hAMSCs主要分布在G₀-G₁期，hAMSCs在G₀-G₁期的比例为75％左右，增殖指数为(24.8±4.3)％，也表明10％hCBS培养的hAMSCs生长活跃。与10％hCBS的LG-DMEM完全培养基比较，7％等中间浓度的hCBS的LG-DMEM培养体系对hAMSCs细胞增殖速度及形态学等无明显影响；但3％-5％hCBS的LG-DMEM完全培养基原代和传代培养的hAMSCs生长速度相对较慢，但其形态学特征未见明显差异。传代培养第1至3代hAMSCs均表达CD29、CD44、CD73、CD166表面分子，而基本不表达CD34和CD45，具有较高纯度的hAMSCs的表面标志。定量PCR检测和免疫组化结果进一步显示，10％hCBS培养的第3代hAMSCs高表达间充质细胞标志VIM mRNA和蛋白表达，也表达决定干细胞增殖、分化潜能的胚性标志Oct-4和Nanog mRNA；此外还表达AFPmRNA和AFP蛋白，低表达Alb和CK18 mRNA及这2种肝细胞标志蛋白。进一步表明本发明所用含3％-10％ hCBS的LG-DMEM完全培养基体系不但可用于hAMSCs的培养，还较好地保持了hAMSCs的表型特征和一些干细胞多向分化潜能标志，传代培养至第4代和第10代的hAMSCs可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞，具有多向分化能力。

目前FBS或小牛血清的组织细胞培养体系已经非常成熟，其研究应用也取得了满意的效果。但动物血清作为异种蛋白，如果直接进入人体可能有发生免疫反应的风险，更存在将动物感染的病原体传给人体的风险，以动物血清为主体的干细胞培养体系已经成为目前限制干细胞技术向临床转化的一大障碍。理论上讲，利用人血清培养(自体或异体血清)所需的干细胞，对维持干细胞生长、增殖过程中的稳定以及保证组织工程化器官植入的安全性方面优于动物血清，但人血清的获取受到的伦理道德及法律限制更为严格。脐带血在过去很长的时期内，乃至目前在很多地区还是一种作为废弃物处理的生物样本，明显很好地回避上述两个突出问题。本发明在本实验室以往报道的胰蛋白酶和胶原酶II消化法分离、差速贴壁和传代培养、纯化hAMSCs的基础上，采用了不同于FBS的LG-DMEM培养体系。不同之处在于，以往所用培养体系中血清为10％FBS，并在LG-DMEM培养基使用基础上，需添加L-谷氨酰胺、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、55μM 2-巯基乙醇和1mM丙酮酸。而本发明所用为与羊膜同一个体来源的自体hCBS与LG-DMEM培养基组成的完全培养基，用于hAMSCs的培养，无需添加L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和丙酮酸，仍可保持hAMSCs较好的增殖特性和表型特征及一些干细胞多向分化潜能标志基因和蛋白表达，并保持多向分化能力，是该培养体系的一大优点。此外，在该自体hCBS培养体系传代培养中发现，hAMSCs的贴壁不如FBS培养者，易于消化，可能有利于减轻消化酶造成的细胞损伤和数量减少。以人血清代替动物血清是解决细胞治疗和组织工程的细胞移植和组织工程化器官植入的安全性方面的重要基础途径。鉴于一份脐带血能收到hCBS的量有限(约20ml左右)，不能满足较大规模培养hAMSCs的需要，因而应用hCBS培养体系进行培养，首先可望优先满足自体hAMSCs移植的需要，尤其是青少年及儿童等的细胞治疗需要；在本发明基础上，开辟自体hCBS培养及冻存体系，发展自体hCBS培养交替使用无血清培养体系与成人受体血清培养体系，也有望解决一定规模hAMSCs细胞产品的制备。

与现有技术相比，本发明将含3％-10％人自体脐带血血清的完全培养基用于hAMSCs的培养，具有如下优点：回避了使用胎牛血清的风险，且无需添加L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和丙酮酸等，仍可保持人羊膜间充质干细胞较好的增殖特性、表型特征、干细胞多向分化潜能标志基因和蛋白标志及多向分化能力；传代培养中人羊膜间充质干细胞贴壁的牢固程度明显低于FBS培养条件，消化时间明显缩短，减少了胰酶消化对细胞的损伤和细胞数量的损失。

附图说明

图1是hCBS原代和传代培养的hAMSCs；其中A：10％hCBS原代培养7d的hAMSCs(×100)；B：10％hCBS传代培养5d第2代hAMSCs(×100)；C：10％hCBS传代培养5d第3代hAMSCs(×100)；D：5％hCBS原代培养7d的hAMSCs(×100)；E：5％hCBS传代培养5d第2代hAMSCs(×100)；F：5％hCBS传代培养5d第3代hAMSCs(×100)。

图2是10％hCBS培养第3代hAMSCs的生长曲线。

图3是倒置相差显微镜下10％hCBS培养hAMSCs第1、3、5、7d生长情况照片(×40)。

图4是10％hCBS培养的第3代hAMSCs HE染色形态；其中A(×50)；B(×100)；C(×200)。

图5是10％hCBS培养第3代hAMSCs VIM、AFP、CK18和Alb的蛋白表达，免疫组化DAB显色法，阳性显色为棕色(×200)。

图6是5％hCBS完全培养基传代培养第4代hAMSCs诱导21d，分化为成骨细胞，以及传代培养第10代hAMSCs诱导21d，分化为成脂细胞的染色形态；其中A(×20)成骨细胞茜素红染色见红色钙盐沉积，B成脂细胞油红O染色阳性见红色脂滴。

具体实施方式

本发明的实施例1：完全培养基的配制：

(1)先制备hCBS：无菌条件下抽取脐带血50-70ml，注入无菌玻璃瓶中，静置于37℃培养箱2h，待血凝块完全析出后，无菌条件下，超净台中吸取析出的血清，移入新的无菌离心管内，4℃、1000g离心20min，收集上清15-20ml，56℃水浴灭活30min，0.2μm滤器除菌后，血清分装于5ml小瓶，-20℃保存、备用；同时进行培养、检菌，无细菌生长即可。

(2)再制备LG-DMEM溶液：取LG-DMEM10g(Gibco公司市售产品，10g/袋)溶于1000ml超纯水中，调pH值至7.2-7.4，过滤除菌，分装，4℃保存，备用。

(3)取体积比为90-97∶10-3的步骤(2)所制备的LG-DMEM溶液与步骤(1)所制备的hCBS，混匀即得含3％-10％hCBS的完全培养基。

本发明的实施例2：hAMSCs的培养方法，包括以下步骤：

(1)分离：将羊膜组织用D-Hank’s液反复冲洗，除尽残留的血迹，刮出羊膜表面的血管、粘液，剪碎羊膜分装于离心管内，加2.5-3倍体积的0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液，37℃消化10min，弃去消化液，再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；继续用同样方法重复消化、过滤2次；消化后剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液，37℃、200rpm旋转消化2h，至组织完全消化，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液于离心管，1500r/min离心10min，弃上清。

(2)原代培养：离心后的沉淀用实施例1制得的含3％-10％hCBS的完全培养基悬浮后，2％台盼蓝染色、计数，当细胞活力＞90％后，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种于25cm²培养瓶，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，倒置显微镜下观察细胞生长情况。

(3)传代培养：原代培养的人羊膜间充质干细胞生长到80％-90％融合后，弃去原有的培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125％胰蛋白酶消化液30s-1min，显微镜下观察消化程度，及时用实施例1制得的完全培养基终止消化，收集细胞，1500r/min离心5min，弃上清，沉淀用实施例1制得的完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

本发明的实施例3：hAMSCs的培养方法，包括以下步骤：

(1)分离：将羊膜组织用D-Hank’s液冲洗干净，剪碎，分装于离心管内，加入0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液，37℃消化10min，弃去消化液，再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；继续用同样方法重复消化、过滤2次；消化后剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液，37℃、200rpm旋转消化2h，至组织完全消化，经300目不锈钢网滤过，收集细胞滤液于离心管，离心，弃上清。

(2)原代培养：离心后的沉淀用含5％或10％hCBS的完全培养基悬浮细胞后计数，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，观察细胞生长情况。

(3)传代培养：取对数生长期内，融合率80％-90％的hAMSCs，弃去原有培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125％胰蛋白酶消化液30s-1min，观察消化程度，及时用含5％或10％hCSB的完全培养基终止消化，收集细胞，离心，弃上清，沉淀用含5％或10％hCBS的完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。

本发明的实施例4：hAMSCs的培养方法，包括以下步骤：

(1)分离：将羊膜组织用D-Hank’s液冲洗干净，剪碎，分装于离心管内，用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液重复消化、过滤3次，剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液旋转消化，至组织完全消化，过滤，收集细胞滤液，离心，弃上清。

(2)原代培养：离心后的沉淀用含7％hCBS的完全培养基悬浮细胞后计数，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养6d，观察细胞生长情况。

(3)传代培养：原代培养的hAMSCs生长到80％以上融合后，弃去原有培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125％胰蛋白酶消化液30-40s，观察消化程度，及时用含7％hCBS的完全培养基终止消化，收集细胞，离心，弃上清，沉淀用含7％hCBS的完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。

Claims (5)

1. 一种完全培养基，其特征在于：它是按体积比向低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液中加入3%-10%的人自体脐带血血清配制而成；所述低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液这样制备：取低糖-Dulbecco极限必须培养基10g溶于1000ml超纯水中，调pH值至7.2-7.4，过滤除菌，分装，4℃保存，即可；所述人自体脐带血血清这样制备：无菌条件下抽取脐带血50-70ml，注入无菌玻璃瓶中，静置于37℃培养箱2h，待血凝块完全析出后，无菌条件下，超净台中吸取析出的血清，移入新的无菌离心管内，4℃、1000g离心20min，收集上清15-20ml，56℃水浴灭活30min，0.2μm滤器除菌后,血清分装于5ml小瓶，－20℃保存、备用；同时进行培养，检菌，无细菌生长即可。

2. 采用权利要求1所述完全培养基的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：（1）分离：将羊膜组织用D-Hank’s液冲洗干净，剪碎，分装于离心管内，用0.05%胰蛋白酶－0.02% EDTA-2Na消化液重复消化、过滤3次，剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶－0.075mg/ml Dnase I消化液旋转消化，至组织完全消化，过滤，收集细胞滤液，离心，弃上清；（2）原代培养：离心后的沉淀用权利要求1所述完全培养基悬浮细胞后计数，按1×10⁷ cells/ml的细胞密度接种，37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，观察细胞生长情况；（3）传代培养：取对数生长期内，融合率80%-90%的人羊膜间充质干细胞，弃去原有培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125%胰蛋白酶消化液30s-1min，观察消化程度，及时用权利要求1所述完全培养基终止消化，收集细胞，离心，弃上清，沉淀用权利要求1所述完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。

3. 按照权利要求2所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：步骤（1）中用0.05%胰蛋白酶－0.02% EDTA-2Na消化液消化的过程为：先于37℃消化10min，弃去消化液；再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；同样方法重复消化、过滤2次。

4. 按照权利要求2所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：步骤（1）中的旋转消化条件为37℃、200rpm，消化时间为2h，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液于离心管。

5. 按照权利要求2-4中任一项所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：（1）分离：将羊膜组织用D-Hank’s液反复冲洗，除尽残留的血迹，刮出羊膜表面的血管、粘液，剪碎羊膜分装于离心管内，加2.5-3倍体积的0.05%胰蛋白酶－0.02% EDTA-2Na消化液，37℃消化10min，弃去消化液，再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；继续用同样方法重复消化、过滤2次；消化后剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶－0.075mg/ml Dnase I消化液，37℃、200rpm旋转消化2h，至组织完全消化，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液于离心管，1500r/min离心10min，弃上清；（2）原代培养：离心后的沉淀用权利要求1所述完全培养基悬浮后，台盼蓝染色、计数，当细胞活力＞90%后，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种于培养瓶，37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，观察细胞生长情况；（3）传代培养：待人羊膜间充质干细胞生长到80%-90%融合后，弃去原有的培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125%胰蛋白酶消化液30s-1min，观察消化程度，及时用权利要求1所述完全培养基终止消化，收集细胞，1500r/min离心5min，弃上清，沉淀用权利要求1所述完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。

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