CN106635976B - 获得羊膜间充质干细胞的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了获得羊膜间充质干细胞的方法及试剂盒。所述方法包括：利用第一酶制剂将羊膜进行第一消化处理，弃消化液，得到第一消化产物；利用第二酶制剂将所述第一消化产物进行第二消化处理，弃消化液，得到第二消化产物；以及从所述消化产物中分离所述羊膜间充质干细胞，其中，所述第一酶制剂包括：胰酶‑EDTA混合液；所述第二酶制剂包括：胶原酶；以及DNase I。利用本发明的获得羊膜间充质干细胞的方法及试剂盒能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

Description

获得羊膜间充质干细胞的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及获得羊膜间充质干细胞的方法及试剂盒。

背景技术

胎盘间充质干细胞是近年来新发现的从胎盘获取的一类干细胞，与从脐带血或骨髓中提取的干细胞相比较，胎盘间充质干细胞数量较多，且具有更广泛的多向分化潜能。此外，胎盘组织来源于产后，原料丰富，取材方便，其收取过程对母体和新生儿不造成任何损伤，不受伦理学和临床医学的限制。

胎盘的构造主要有3层：羊膜、绒毛膜和底蜕膜。绒毛膜和底蜕膜则富含血管和红细胞，不易分离，羊膜是一层易于分离，且结构简单的组织。如能从羊膜上分离出间充质干细胞，将是间充质干细胞的一个良好供体，为研究者提供一个获得间充质干细胞的简便途径。

然而，目前获得羊膜间充质干细胞的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前分离羊膜间充质干细胞的方法为传统的组织块贴壁法以及单一的酶消化法，这两种方法得率和纯度都较低，容易混入羊膜上皮细胞，不利于进一步扩增和应用。

发明人发现，为了防止羊膜上皮细胞的存在而导致获得的羊膜间充质干细胞的纯度较低，可以先通过酶消化处理，得到羊膜上皮细胞，再弃去羊膜上皮细胞，从而得到剩余的含有羊膜间充质干细胞的组织。接着，通过酶消化处理含有羊膜间充质干细胞的组织，以便获得羊膜间充质干细胞。

进一步地，发明人发现，胰酶-EDTA混合液能够有效地消化羊膜，得到羊膜上皮细胞，进而可以除去羊膜上皮细胞，得到含有羊膜间充质干细胞的组织(即剩余组织)。接着，利用胶原酶及DNase I混合酶将得到含有羊膜间充质干细胞的组织进行消化，从而能够获得羊膜间充质干细胞。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种获得羊膜间充质干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用第一酶制剂将羊膜进行第一消化处理，弃消化液，得到第一消化产物；利用第二酶制剂将所述第一消化产物进行第二消化处理，弃消化液，得到第二消化产物；以及从所述第二消化产物中分离所述羊膜间充质干细胞，其中，所述第一酶制剂包括：胰酶-EDTA混合液；所述第二酶制剂包括：胶原酶和DNase I。

发明人发现，利用传统的组织块贴壁法或单一的酶消化法分离得到的羊膜间充质干细胞的得率和纯度都较低，尤其是羊膜上皮细胞的存在，显著影响羊膜间充质干细胞的得率和纯度。为此，发明人深入研究发现，可以先通过酶消化处理，得到羊膜上皮细胞，再弃去羊膜上皮细胞，从而得到剩余的含有羊膜间充质干细胞的组织。接着，通过酶消化处理含有羊膜间充质干细胞的组织，以便获得羊膜间充质干细胞。

进一步地，发明人发现，胰酶-EDTA混合液的消化效率较高，能够有效地将羊膜组织中的羊膜上皮细胞之间的蛋白质降解，从而获得单个羊膜上皮细胞；胶原酶及DNase I的混合酶能够有效地将含有羊膜间充质干细胞的组织中的羊膜间充质干细胞之间的蛋白质降解，从而获得单个羊膜间充质干细胞。由此，根据本发明实施例的获得羊膜间充质干细胞的方法能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。然而，利用其他种类酶的效果不佳。

根据本发明的实施例，所述获得羊膜间充质干细胞的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述第一酶制剂包括：0.05质量％～0.25质量％的胰酶-EDTA混合液；所述第二酶制剂包括：0.75mg/mL～1mg/mL的胶原酶；以及0.075mg/mL～0.2mg/mL的DNase I。发明人意外地发现，当第一酶制剂中胰酶-EDTA混合液的浓度为0.05质量％～0.25质量％时，消化效率最高。若浓度过高，会损伤含有羊膜间充质干细胞的组织，若浓度过低，消化不充分，从而使得到的羊膜间充质干细胞的得率及纯度较低。根据本发明的具体实施例，第一酶制剂中胰酶浓度可以为0.08质量％、0.10质量％、0.13质量％、0.18质量％或0.21质量％。当第二酶制剂中胶原酶浓度为0.75mg/mL～1mg/mL，DNase I浓度为0.075mg/mL～0.2mg/mL时，消化效率最高。若胶原酶和/或DNase I浓度过高，将对羊膜间充质干细胞造成损伤，使其活性下降，若胶原酶和/或DNase I浓度过低，无法充分消化，从而使得到的羊膜间充质干细胞的得率及纯度较低。由此，根据本发明实施例的获得羊膜间充质干细胞的方法能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

根据本发明的实施例，所述胰酶-EDTA混合液中胰酶与EDTA的质量比为2.5:1，优选地，所述胰酶-EDTA混合液包括：0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA。由此，根据本发明实施例的获得羊膜间充质干细胞的方法能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

根据本发明的实施例，所述第一酶制剂与羊膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1，所述第二酶制剂与羊膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1。发明人发现，酶制剂的添加量显著影响消化处理效果，进而影响羊膜间充质干细胞的得率、纯度及活性。发明人意外地发现，当第一酶制剂与羊膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1时，能够充分消化得到羊膜上皮细胞。若用量过高，会损伤含有羊膜间充质干细胞的组织，若用量过低，消化不充分，从而使得到的羊膜间充质干细胞的得率及纯度较低。当第二酶制剂与羊膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1时，能够充分消化得到羊膜间充质干细胞。若第二酶制剂的用量过高，将对羊膜间充质干细胞造成损伤，使其活性下降，若第二酶制剂的用量过低，无法充分消化，从而使得到的羊膜间充质干细胞的得率及纯度较低。由此，根据本发明实施例的获得羊膜间充质干细胞的方法能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

在实际情况下，本领域技术人员可以根据需要选择第一消化处理条件，例如反应温度、时间，对此本申请不作严格限定，只要能够得到羊膜上皮细胞即可。根据本发明的一些实施例，所述第一消化处理是在35～37℃的温度、100～200rpm的转速下震荡45min～60min。根据本发明的优选实施例，所述第一消化处理是在37℃的温度、150rpm的转速下震荡60min。发明人意外地发现，在此条件下能够充分消化，以获得羊膜上皮细胞，进而保证了所得到的羊膜间充质干细胞的得率及纯度。

在实际情况下，本领域技术人员可以根据需要选择第二消化处理条件，例如反应温度、时间，对此本申请不作严格限定，只要能够得到羊膜间充质干细胞即可。根据本发明的一些实施例，所述第二消化处理是在37℃的温度、100～200rpm的转速下震荡45min～60min。根据本发明的优选实施例，所述第二消化处理是在37℃的温度、150rpm的转速下震荡45min。发明人意外地发现，在此条件下能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

根据本发明的具体实施例，第一次消化处理后，通过向消化反应体系中加入胎牛血清(FBS)，以终止消化反应。第二次消化处理后，通过加入生理盐水，以稀释酶液，以终止消化反应。

需要说明的是，对于从消化产物中分离羊膜间充质干细胞的方法不作严格限定，只要能够获得羊膜间充质干细胞即可。根据本发明的实施例，为了得到纯度较高的羊膜间充质干细胞，所述分离包括：将所述第二消化产物进行过滤，收集滤液；将所述滤液进行离心，收集细胞；以及将所述细胞进行清洗，以便获得所述羊膜间充质干细胞。由此，能够有效地除去附着于细胞上的消化液，且避免对细胞造成损伤，从而获得纯度较高且活性较强的羊膜间充质干细胞。

根据本发明的实施例，所述方法包括：将裁剪成尺寸为2cm×2cm的所述羊膜与胰酶-EDTA混合液进行混合震荡后，弃消化液，得到第一消化产物；将所述第一消化产物、胶原酶及DNase I进行混合震荡后，弃消化液，得到第二消化产物；利用100目网筛过滤所述第二消化产物，收集滤液；以及将所述滤液在2000rpm的转速下离心5min，弃上清液，以便获得所述羊膜间充质干细胞。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

发明人发现，将羊膜裁剪至尺寸为2cm×2cm，使得进行消化反应的面积较大，促使消化反应充分发生。接着，将第二消化产物过筛，以除去大块组织。此外，将滤液在2000rpm下离心5min，既能够沉淀细胞，便于收集，同时较小地破坏细胞的结构及活性。从而，能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括扩增处理，所述扩增处理包括：将所述羊膜间充质干细胞重悬于培养基中，得到混合液；以及将所述混合液接种于所述培养基中，37℃下培养至出现克隆，长至传代。根据本发明的具体实施例，所述培养基为间充质干细胞无血清培养基。发明人发现，分离获得的羊膜间充质干细胞为单个细胞，将其进行扩增以得到大量的羊膜间充质干细胞。在上述最优扩增处理条件下，扩增的同时还可以使其活性进一步提高。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第一酶制剂和第二酶制剂，所述第一酶制剂包括：胰酶-EDTA混合液；所述第二酶制剂包括：胶原酶；以及DNase I。

根据本发明的实施例，所述试剂盒用于获得羊膜间充质干细胞。

发明人发现，利用传统的组织块贴壁法或单一的酶消化法分离得到的羊膜间充质干细胞的得率和纯度都较低，尤其是羊膜上皮细胞的存在，显著影响羊膜间充质干细胞的得率和纯度。为此，发明人深入研究发现，可以先通过酶消化处理，得到羊膜上皮细胞，再弃去羊膜上皮细胞，从而得到含有羊膜间充质干细胞的组织。接着，通过酶消化处理含有羊膜间充质干细胞的组织，以便获得羊膜间充质干细胞。

进一步地，发明人发现，胰酶-EDTA混合液的消化效率较高，能够有效地将羊膜组织中的羊膜上皮细胞之间的蛋白质降解，从而获得单个羊膜上皮细胞；胶原酶及DNase I的混合酶能够有效地将含有羊膜间充质干细胞的组织中的羊膜间充质干细胞之间的蛋白质降解，从而获得单个羊膜间充质干细胞。

根据本发明的实施例，所述第一酶制剂包括：0.05质量％～0.25质量％的胰酶-EDTA混合液；所述第二酶制剂包括：0.75mg/mL～1mg/mL的胶原酶；以及0.075mg/mL～0.2mg/mL的DNase I。发明人意外地发现，当第一酶制剂中胰酶-EDTA混合液的浓度为0.05质量％～0.25质量％时，消化效率最高。若浓度过高，会损伤含有羊膜间充质干细胞的组织，若浓度过低，消化不充分，从而使得到的羊膜间充质干细胞的得率及纯度较低。根据本发明的具体实施例，第一酶制剂中胰酶浓度可以为0.08质量％、0.10质量％、0.13质量％、0.18质量％或0.21质量％。当第二酶制剂中胶原酶浓度为0.75mg/mL～1mg/mL，DNase I浓度为0.075mg/mL～0.2mg/mL时，消化效率最高。若胶原酶和/或DNase I浓度过高，将对羊膜间充质干细胞造成损伤，使其活性下降，若胶原酶和/或DNase I浓度过低，无法充分消化，从而使得到的羊膜间充质干细胞的得率及纯度较低。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

根据本发明的实施例，所述胰酶-EDTA混合液中胰酶与EDTA的质量比为2.5:1，根据本发明的优选实施例，所述胰酶-EDTA混合液包括：0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜间充质干细胞。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的显微镜照片，其中，(A)为放大40倍，(B)为放大100倍；

图2显示了根据本发明一个实施例的细胞表型鉴定分析图，其中，(A)为间质干细胞标志CDl05；(B)为间质干细胞标志CD90；(C)为间质干细胞标志CD73；(D)为造血细胞标志CD19；(E)为造血细胞标志CD34；(F)为造血细胞标志CD45；(G)为造血细胞标志CD14；(H)为人白细胞抗原HLA-DR；

图3显示了根据本发明一个实施例的放大倍数为400倍的显微镜照片，其中(A)为成脂细胞，染色剂为油红O；(B)为早期成骨细胞，染色剂为茜素红；(C)为晚期成骨细胞，染色剂为Von Kossa；(D)为成软骨细胞的HE染色；(E)为成软骨细胞，染色剂为阿尔辛兰；(F)为成软骨细胞，染色剂为甲苯胺蓝；以及

图4显示了根据本发明一个实施例的细胞活力分析图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

在该实施例中，按照下列方法获得羊膜间充质干细胞：

(1)从新鲜胎盘中剥离的羊膜，剪至2cm×2cm大小，生理盐水洗三次，尽量将血洗净；

(2)取5g剪好的羊膜装入50ml离心管中，加入5mL 0.25％胰酶-EDTA混合液(含有0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA)，37℃的温度、150rpm的转速下震荡60min，加入FBS终止消化；

(3)消化后的组织块用生理盐水清洗3次，尽量减少胰酶及FBS残留后，再转移到50ml离心管中，加入5mL1mg/mL胶原酶及0.2mg/mLDNase I混合液，37℃的温度、150rpm的转速下震荡45min，加入25ml生理盐水稀释终止，得到消化产物；

(4)将消化产物通过100目筛网过滤，收集滤液，2000rpm离心5min，弃上清，沉淀用生理盐水反复清洗两次，弃上清，得到羊膜间充质干细胞；

(5)用2ml间充质干细胞无血清培养基重悬羊膜间充质干细胞，并接种于含有间充质干细胞无血清培养基的10cm细胞培养皿中，37℃下培养，48h后换液，直至克隆出现，长至传代，得到扩增的羊膜间充质干细胞。

对比例

按照实施例的方法获得羊膜间充质干细胞，区别在于，步骤(3)中，利用1mg/mL胶原酶进行消化。

对实施例扩增后的羊膜间充质干细胞进行检测

1.细胞形态：

将羊膜间充质干细胞在显微镜下观察，结果如图1所示。可以看出，细胞贴壁，呈梭形，片状生长。

2.细胞表型鉴定：

取传至3代的羊膜间充质干细胞，消化后成单细胞悬液，按4×10⁵个每管进行分装。1×PBS洗一次，300g离心5min，弃上清。100μl 1×PBS重悬细胞，每管分别加入携带荧光标记的一抗CD90-FITC、CD73-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE、CD14-FITC及HLA-DR-PE(购自美国BD Pharmingen公司，按说明书给量)，设一管为直标抗体PE-isotype空白对照，一管为直标抗体FITC-isotype空白对照，4℃摇床，避光反应40min。1×PBS清洗3次，每次300g离心5min，1％多聚甲醛固定，4℃放置，流式细胞仪检测。结果如图2和表1所示，可以看出，细胞表型均一，细胞表达间质细胞标记CD73、CD90、CD105，不表达造血细胞标记CD34、CD14、CD45、CD19，且不表达人白细胞抗原HLA-DR，完全符合“国际细胞治疗协会”关于间充质干细胞表面标志物规定的标准。

表1流式细胞仪检测

细胞表型	检测值	正常参考值
			CD90	100％	>95％
CD73	99.03％	>95％
			CD105	99.28％	>95％
CD34	0.18％	<2％
			CD45	0％	<2％
CD14	0.53％	<2％
			CD19	0％	<2％
HLA-DR	0％	<2％

3.三系分化：

3.1脂肪诱导分化：

3.1.1取传至3代的羊膜间充质干细胞以1.0×10⁵/孔接种于24孔培养板中，待细胞密度达到100％时，弃上清(用移液枪轻轻吸走)加入提前配置好的成脂分化诱导A液(成脂诱导启动培养基)，3天后再换成诱导B液(成脂诱导维持培养基)。24h后再换成A液，如此循环3-5个周期，完成后用B液换掉旧的B液，每三天跟换一次，再放置七天，得到诱导细胞。

3.1.2油红O染色鉴定脂滴形成

诱导细胞去掉培养基，PBS洗一次，加入4％多聚甲醛固定30min，蒸馏水洗3次，原液(0.5％油红O)6ml，加蒸馏水4ml，静置5～10min，滤纸过滤；染色20min，蒸馏水洗3次，镜下观察照相，如图3所示。可以看出，诱导后出现明显的脂滴，油红O染色呈阳性，说明细胞具有较强的向脂肪细胞分化的能力。

3.2成骨诱导分化

3.2.1取传至3代的羊膜间充质干细胞以5×10⁴/孔接种于24孔培养板中，正常培养24h后弃上清(用移液枪轻轻吸走)加入提前配置好的成骨诱导培养基，每3天换液。

3.2.2成骨诱导检测方法

茜素红染色：诱导14d羊膜间充质干细胞，得到早期成骨细胞，吸弃诱导培养液，PBS冲洗，4％多聚甲醛室温固定30min，双蒸水冲洗，使用茜素红工作液37℃孵育30min，双蒸水冲洗。

Von kossa染色：诱导21d羊膜间充质干细胞，得到晚期成骨细胞，参照细胞VonKossas钙染色试剂盒进行染色。

分别将染色后的早期成骨和晚期成骨在显微镜下观察，如图3所示。可以看出，早期成骨细胞的茜素红染色呈阳性，说明细胞具有较强的向成骨细胞分化的能力。晚期成骨细胞Von kossa染色为阳性，说明诱导分化的细胞已形成骨细胞的钙化结节，证明细胞具有较强的向成骨细胞分化的能力。

3.3软骨诱导分化

3.3.1取传至3代的羊膜间充质干细胞以5×10⁵/管接种于15ml离心管中，正常培养24h后弃上清(用移液枪轻轻吸走)加入提前配置好的成软骨诱导培养基，临用前加TGF-β3，每3天换一次液。

3.3.2软骨诱导检测方法

形成的微团在上述体系内培养4周，每隔3天换液，诱导完毕后，进行石蜡包埋和切片。切片经1％甲苯胺蓝、阿尔辛兰染色、HE染色鉴定软骨特异性蛋白聚糖。如图3所示。可以看出，HE染色、甲苯胺蓝染色、阿尔辛兰染色呈阳性，说明细胞具有很强的向软骨细胞分化的能力。

活力测定

比较实施例和对比例的步骤(4)所得到的羊膜间充质干细胞的活力，具体步骤如下：

分别将实施例和对比例的步骤(4)所得到的羊膜间充质干细胞用生理盐水洗2遍，加入不含动物成分的TrypLE Express消化约30s，镜下可见短梭形贴壁细胞变圆并悬浮起来后，加入生理盐水吹打细胞并将细胞转移至离心管，1200rpm离心5min，弃掉上清液，用2ml的生理盐水重悬，通过细胞活力分析仪检测细胞的活力。

实施例步骤(4)所得到的羊膜间充质干细胞为93.1％。说明利用本发明的方法获得羊膜间充质干细胞过程中，消化处理条件温和，对羊膜间充质干细胞损伤较小，使得到的羊膜间充质干细胞活性较强。对比例所得到的羊膜间充质干细胞的活力仅为72.9％(如图4所示)，且实施例步骤(4)的羊膜间充质干细胞的得率为对比例的3倍。说明本发明的方法所得到的羊膜间充质干细胞的得率及活性均较高。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (1)

1.一种获得羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：

将裁剪成尺寸为2cm×2cm的所述羊膜与0.25质量％的胰酶-EDTA混合液在37℃的温度、150rpm的转速下震荡60min，弃消化液，得到第一消化产物；

将所述第一消化产物、胶原酶及DNase I在37℃的温度、150rpm的转速下震荡45min，弃消化液，得到第二消化产物；

利用100目网筛过滤所述第二消化产物，收集滤液；

将所述滤液在2000rpm的转速下离心5min，弃上清液，以便获得羊膜间充质干细胞；

将所述羊膜间充质干细胞重悬于间充质干细胞无血清培养基中，得到混合液；以及

将所述混合液接种于所述间充质干细胞无血清培养基中，37℃下培养至出现克隆，长至传代，以便获得扩增的羊膜间充质干细胞；

其中：

第一酶制剂为所述胰酶-EDTA混合液，所述第一酶制剂包括：0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mLEDTA，

第二酶制剂为所述胶原酶和所述DNase I的混合液，所述第二酶制剂包括：1mg/mL的胶原酶和0.2mg/mL的DNase I，

所述第一酶制剂与羊膜的用量比为1:1，

所述第二酶制剂与羊膜的用量比为1:1。

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