CN110577930A

CN110577930A - 一种多联管式脂肪干细胞提取方法

Info

Publication number: CN110577930A
Application number: CN201910938453.1A
Authority: CN
Inventors: 李伟强; 邵文陶; 邹桥
Original assignee: Chongqing Chong Sottos Biological Technology Development Co Ltd
Current assignee: Chongqing Chong Sottos Biological Technology Development Co Ltd
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2019-12-17

Abstract

本发明公开了一种多联管式脂肪干细胞提取方法，包括清洗、剪碎、消化、再消化、再消化后清洗、过滤、培养、换液、传代等步骤。在上述步骤中，采用多联管式的操作方法，有效清除脂肪组织中的血细胞、油滴及其他杂质，保证提取的脂肪干细胞的纯度；剪碎步骤，能够最大限度的促进后续脂肪组织与消化酶的接触面，缩短消化时间，避免消化酶对细胞的损伤；再消化步骤增加脂肪干细胞的获得率；换液步骤减少油滴对细胞贴壁的影响同时促进更多细胞贴壁。本发明的脂肪干细胞提取方法简单易用，能够极大的降低红细胞和油滴等对脂肪干细胞的影响，同时最大程度的利用脂肪组织获得脂肪干细胞，脂肪干细胞获得率明显提高。

Description

一种多联管式脂肪干细胞提取方法

技术领域

本发明涉及干细胞提取领域，具体涉及一种多联管式脂肪干细胞提取方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源于中胚层，是一种类似成纤维细胞样形态，贴壁生长，表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19的细胞；它可以从骨髓、脂肪、脐带华通氏胶、胎盘、脐带血、牙髓、绒毛膜等多种组织中被分离出来；它是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，能体外培养并在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSCs在细胞治疗中有广泛的用途，包括组织工程、再生医学和被用作基因治疗的载体。

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一种从脂肪组织中分离出来的间充质干细胞，具有多向分化潜能，能够在体外进行大规模培养，可向脂肪、骨、软骨、内皮等多种方向进行分化，且取材方便、创口小、不存在异体排斥性等特点，是一种理想的种子干细胞。脂肪干细胞能够分化成血管内皮细胞，促进血管生成和提高移植物存活率；可释放对抗缺氧和其他不利条件的血管内皮生长因子进而影响周围宿主组织；脂肪干细胞能够进行稳定增殖，维持一定的数量，因此脂肪干细胞移植在医学美容以及临床治疗上具有重要的应用价值。脂肪干细胞作为理想的干细胞来源排除了其他干细胞对于年龄和性别的限制，大大提高了获得和利用自体干细胞的条件。

目前脂肪干细胞的分离提取方法主要有组织块贴壁法和普通酶解法，但两种方法均存在一定的缺陷，组织块贴壁法细胞迁出时间久并且贴壁困难，普通酶解法细胞得率和纯度不高。此外，以上两种方法还存在以下问题：脂肪组织中的油滴阻碍脂肪细胞的贴壁以及红细胞占据培养瓶底贴壁空间，而这些问题都会极大的影响脂肪干细胞的得率和纯度。

发明内容

本发明旨在解决目前脂肪干细胞提取过程中存在的问题，提供一种多联管式脂肪干细胞提取方法，可以有效的去除脂肪干细胞中的油滴、清除脂肪组织中多余的杂质、提高脂肪干细胞的得率和纯度，很好的解决了脂肪干细胞迁出困难以及不易贴壁等问题。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种多联管式脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗：(1a)将无菌获取的脂肪组织加入离心管中，用等体积的生理盐水重悬脂肪组织，以转速400～600rpm离心4-8min；(1b)使用移液管将脂肪组织层挑取到另一空离心管中，加入等体积的生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心4-8min；

(2)剪碎：将所述步骤(1b)清洗之后的脂肪组织挑入另一空的离心管中，剪切约5～10min，使之成为组织块匀浆，再重复上述步骤(1b)直至生理盐水呈透明；

(3)消化：将上述清洗后的脂肪组织匀浆挑入空离心管中，并加入等体积的胶原酶，置于35-40℃水浴中、以转速100～200rpm震荡消化20～50min，然后加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～8min；

(4)再消化：将上述步骤(3)消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到空离心管中，加入等体积的胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液；

(5)再消化后清洗：收集上述步骤(3)和(4)底部所得的所有脂肪组织及细胞匀浆，并向收集的脂肪组织及细胞匀浆中加入2～3倍体积的生理盐水重悬，以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液；

(6)过滤：将步骤(4)再清洗后的脂肪组织及细胞匀浆，用100μm过滤器过滤，再将过滤得到的下层滤液以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上层溶液；

(7)培养：在步骤(5)过滤后的脂肪组织及细胞匀浆中，加入间充质干细胞无血清完全培养基重悬，并将其转移至细胞培养瓶，置于细胞培养箱中培养；

(8)换液：在步骤(6)培养3h-24h后，收集细胞培养瓶中的上清进行离心，加入间充质干细胞无血清完全培养基重悬后，加入到原来的培养瓶中继续培养；

(9)传代：每隔3天更换培养基，待细胞融合度达到80％时，用生理盐水清洗2次后，加入胰酶消化4-8min，再加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收获脂肪干细胞。

在本发明的一种优选方案中，在所述步骤(9)之后增加再植步骤，所述再植步骤为：将步骤(9)中消化后的培养瓶用PBS清洗2遍，向未消化完全的脂肪干细胞中加入间充质干细胞无血清完全培养基，继续培养，并重复步骤(9)，收获脂肪干细胞。

在本发明的一种优选方案中，所述步骤(1a)中加入离心管的脂肪组织为20ml；所述步骤(7)和步骤(8)中的间充质干细胞无血清完全培养基的加入量均为15ml；所述步骤(9)中胰酶Trypsin的加入量为3ml，终止消化的生理盐水或培养基的加入量为5-10ml。

在本发明的一种优选方案中，所述步骤(3)和(4)中的胶原酶为I型胶原酶，所述步骤(9)中的胰酶为胰酶Trypsin。

在本发明的一种优选方案中，所述生理盐水含有三抗。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：

1、本发明通过多个离心管之间脂肪组织的挑取，即通过多联管式挑取脂肪组织进入另外的离心管，可有效清除脂肪组织中的血细胞、油滴及其他杂质，保证提取的脂肪干细胞的纯度。

2、将首次消化后的脂肪组织离心得到脂肪细胞，同时将上清液中未完全消化的脂肪组织收集进行二次消化，增加了脂肪干细胞的获得率。

3、细胞贴壁后通过培养瓶换液，可以减少油滴对细胞贴壁的影响同时促进更多细胞贴壁：待细胞贴壁后收集上清离心，能够去除脂肪组织中的残留的油滴；将新鲜培养基重悬继续加入培养瓶中培养能够促进更多脂肪干细胞贴壁及提高增长速率。

4、本发明中，在消化步骤之前，并且在初步清洗之后，通过剪碎脂肪组织成为脂肪组织块匀浆，能够最大限度的促进后续脂肪组织与消化酶的接触面，缩短消化时间，避免消化酶对细胞的损伤。

5、此外，本发明用胰酶Trypsin消化贴壁的脂肪干细胞，设定5min终止，对于贴壁牢固的脂肪细胞，通过再植步骤将5min仍未从培养瓶壁上脱离下来的脂肪细胞清洗后继续培养，可以降低胰酶对细胞的伤害并增加脂肪干细胞的获得率。

本发明多联管式脂肪干细胞提取方法简单易用，通过上述步骤方法，能够极大的降低红细胞和油滴等对脂肪干细胞的影响，同时最大程度的利用脂肪组织获得脂肪干细胞，本发明方法提取的脂肪干细胞获得率明显提高。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例1换液步骤后培养瓶中的脂肪干细胞图片。

图2为本发明实施例2换液步骤后培养瓶中的脂肪干细胞图片。

图3为本发明实施例3再植步骤后培养瓶中的脂肪干细胞图片。

图4为对比例培养瓶中的脂肪干细胞图片。

图5A-5E为本发明实施例3再植步骤后脂肪干细胞的流式检测结果(荧光标记物为藻红蛋白)。

图6A-6E为本发明实施例3再植步骤后脂肪干细胞的流式检测结果(荧光标记物为异硫氰酸荧光素)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明脂肪组织的采集方法为：从年龄18～55岁，无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内通过负压无菌获取脂肪组织。本发明脂肪干细胞提取方法中所用的试剂耗材如表1所示，所用的设备如表2所示。本发明所用的I型胶原酶粉末，采用HBSS溶解，并且通过0.22μm过滤器过滤，得到无菌的I型胶原酶。

表1试剂耗材

序号	名称	规格	厂家
				1	无血清基础培养基	500ml	LONZA
2	胰酶Trysin	500ml	Gibco
				3	I型胶原酶	10mg	SIGMA
4	培养基添加剂		LONZA
				5	生理盐水		西南制药
6	HBSS		GIBCO

表2设备

实施例1

本实施例的多联管式脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗：取无菌获取的脂肪组织20mL加入离心管中，用等体积的含有三抗的生理盐水重悬脂肪组织，在离心机中以转速400～600rpm离心5min，使用移液管将脂肪组织层挑取到另一个离心管中，加入等体积(即，与挑取的脂肪组织体积相同)的含有三抗的生理盐水，震荡混匀后，在离心机中以转速500～600rpm离心5min，去除血细胞及其他杂质，继续重复上述清洗步骤直至生理盐水呈透明。

(2)消化：将清洗后的脂肪组织匀浆挑入另一离心管中，加入等体积的I型胶原酶中，置于恒温水浴震荡箱中，以37℃水浴、100～200rpm转速消化30～60min，加入20ml完全无血清培养基终止消化后，再在离心机中以转速1300～1800rpm离心5～8min。

(3)再消化：上述步骤(2)消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织(即，漂浮在混合溶液中的组织)收集到另一个离心管中，加入等体积的I型胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或培养基终止消化，再在离心机中以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液。

(4)再消化后清洗：收集上述步骤(2)和(3)底部所得的所有脂肪组织及细胞匀浆，并向收集的脂肪组织及细胞匀浆中加入2～3倍体积的生理盐水重悬，以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液。

(5)过滤：将生理盐水重悬离心后的脂肪组织及细胞匀浆用100μm过滤器过滤，再将过滤得到的下层滤液以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上层溶液。

(6)培养：加入15mL间充质干细胞无血清完全培养基重悬，并将其转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

(7)换液：3h-24h后收集细胞培养瓶中的上清进行离心，加入15ml新鲜间充质干细胞无血清完全培养基重悬后，加入到原来的培养瓶中继续培养。该步骤可去除上述清洗等步骤中的残留油滴，促进更多细胞贴壁。

(8)传代：每隔3天更换培养基，待细胞融合度达到80％时，用生理盐水清洗2次，加入3ml胰酶Trypsin消化5min，再加入5ml完全培养基终止消化，收获脂肪干细胞。

本实施例收获的脂肪干细胞可进行冻存：即，将上述传代步骤所收获的脂肪干细胞用生理盐水清洗1次，并用40μm过滤器过滤，以每管2*10⁶计数加入冻存保护液冻存。

上述提取方法中，通过多个离心管之间脂肪组织的挑取，即通过多联管式挑取脂肪组织进入另外的离心管，可有效清除脂肪组织中的血细胞、油滴及其他杂质，保证提取的脂肪干细胞的纯度。将首次消化后的脂肪组织离心得到脂肪细胞，同时将上清液中未完全消化的脂肪组织收集进行二次消化，增加了脂肪干细胞的获得率。细胞贴壁后通过培养瓶换液，可以减少油滴对细胞贴壁的影响同时促进更多细胞贴壁：待细胞贴壁后收集上清离心，能够去除脂肪组织中的残留的油滴；将新鲜培养基重悬继续加入培养瓶中培养能够促进更多脂肪干细胞贴壁及提高增长速率。

实施例2

本实施例的多联管式脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗：取无菌获取的脂肪组织20mL加入离心管中，用等体积的含有三抗的生理盐水重悬脂肪组织，在离心机中以转速400～600rpm离心5min，使用移液管将脂肪组织层挑取到另外一个离心管中，加入等体积的含有三抗的生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心5min，去除血细胞及其他杂质。

(2)剪碎：将上述清洗之后的脂肪组织挑到第三个空的离心管中，剪切约5～10min，使之成为组织块匀浆；再如步骤(1)所述，将剪碎后的脂肪组织块匀浆在生理盐水中离心洗涤1～3次，去除血细胞及其他杂质，直至洗涤的生理盐水呈透明状。

(3)消化：将脂肪组织匀浆挑入离心管中，加入等体积的I型胶原酶，置于恒温水浴震荡箱中，以37℃水浴、100～200rpm转速消化30～60min，加入20ml完全无血清培养基终止消化后，再通过离心机以转速1300～1800rpm离心5～8min。

(4)再消化：上述消化后得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到另一个离心管中，加入等体积I型胶原酶，消化15～30min，加入生理盐水或培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液。

(5)再消化后清洗：收集上述步骤(3)和(4)底部所得的所有脂肪组织及细胞匀浆，并向收集的脂肪组织及细胞匀浆中加入2～3倍体积的生理盐水重悬，以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液。

(6)过滤：生理盐水重悬离心后的脂肪组织及细胞匀浆，通过100μm过滤器过滤，再将过滤得到的下层滤液以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上层溶液。

(7)培养：加入15mL间充质干细胞无血清完全培养基重悬，转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。

(8)换液：3h-24h后收集细胞培养瓶中的上清进行离心，加入15ml新鲜间充质干细胞无血清完全培养基重悬后，加入到原来的培养瓶中继续培养。该步骤可去除上述清洗等步骤中的残留油滴，促进更多细胞贴壁。

(9)传代：每隔3天更换培养基，待细胞融合度达到80％时，用生理盐水清洗2次，加入3ml胰酶Trypsin消化5min，再加入5ml完全培养基终止消化，收获脂肪干细胞。

上述剪碎步骤的时机为在消化步骤之前，并且在初步清洗之后，剪碎之后再进行清洗至生理盐水呈透明状；剪碎的时间为5-10min；剪碎的时机和时间保证了最终提取的脂肪干细胞的获得率。通过剪碎脂肪组织成为脂肪组织块匀浆，能够最大限度的促进后续脂肪组织与消化酶的接触面，缩短消化时间，避免消化酶对细胞的损伤。

实施例3

本实施例的多联管式脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗：取无菌获取的脂肪组织20mL加入离心管中，用等体积的含有三抗的生理盐水重悬脂肪组织，在离心机中以转速400～600rpm，离心5min，使用移液管将脂肪组织层挑取到另外一个离心管中，加入等体积的含有三抗的生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心5min，去除血细胞及其他杂质。

(2)剪碎：将上述脂肪组织挑到另一个空的离心管中，剪切约5～10min,使之成组织块匀浆；如步骤(1)所述，将脂肪组织块匀浆在生理盐水中离心洗涤1～3次，去除血细胞及其他杂质，直至洗涤的生理盐水呈透明状。

(3)消化：将剪碎步骤之后的脂肪组织匀浆挑入另一离心管中，加入等体积的I型胶原酶，置于恒温水浴震荡箱中，以37℃水浴、100～200rpm转速消化30～60min，加入20ml完全无血清培养基终止消化后，在离心机中以1300～1800rpm转速离心5～8min。

(10)再植：将上述传代步骤中的消化后的培养瓶用PBS清洗2遍，向未消化完全的脂肪干细胞中加入15ml完全的间充质干细胞培养基，继续培养，再重复步骤(9)收获脂肪干细胞。

本实施例收获的脂肪干细胞可进行冻存：即，将上述传代和再植步骤所收获的脂肪干细胞用生理盐水清洗1次，并用40μm过滤器过滤，以每管2*10⁶计数加入冻存保护液冻存。

上述提取方法中，在传代步骤中通过合理控制胰酶消化时间，在收获脂肪干细胞之后，增加再植步骤，降低了长时间消化胰酶对细胞的伤害并增加脂肪干细胞的获得率：用胰酶Trypsin消化贴壁的脂肪干细胞，设定最优化时间为5min终止，对于贴壁牢固的脂肪细胞，通过再植步骤将5min仍未从培养瓶壁上脱离下来的脂肪细胞清洗后继续培养，可以降低胰酶对细胞的伤害并增加脂肪干细胞的获得率。

对比例

普通酶解法提取脂肪干细胞，包括以下步骤：

(1)清洗：取无菌获取的脂肪组织20mL加入离心管中，用等体积的含有三抗的生理盐水重悬脂肪组织，在离心机中以转速400～600rpm，离心5min，使用移液管抽掉下层液体并重新加入等体积生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心5min，直至生理盐水透明为止，去除血细胞及其他杂质。

(2)消化：将脂肪组织匀浆挑入等体积的I型胶原酶中，置于恒温水浴震荡箱中，以37℃水浴、100～200rpm消化30～60min，加入20ml完全无血清培养基终止消化后，以转速1300～1800rpm离心5～8min。

(3)清洗：向上述(2)所得的脂肪细胞中，加入2～3倍体积的生理盐水重悬，1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液。

(4)过滤：生理盐水重悬离心后的脂肪组织及细胞匀浆，过滤，1000～1300rpm离心5～8min，弃上层溶液。

(5)培养：加入15mL间充质干细胞无血清完全培养基重悬，转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。

(6)传代：每隔3天更换培养基，待细胞融合度达到80％时，生理盐水清洗2次，加入3ml胰酶Trypsin消化5min，加入5ml完全培养基终止消化，收获脂肪干细胞。

实施例1-3与对比例提取的脂肪干细胞的图片分别如图1-4所示。图1为实施例1换液步骤之后培养瓶中的脂肪干细胞图片，图2为实施例2换液步骤之后培养瓶中的脂肪干细胞图片，图3为实施例3再植步骤之后培养瓶中的脂肪干细胞图片，图4为对比例培养瓶中的脂肪干细胞图片。如图1-4可见，采用多联管式脂肪干细胞的分离方法对杂质及血细胞清楚更加彻底，可以更好的促进脂肪干细胞贴壁；将脂肪组织剪碎后消化增加组织和消化酶的接触面积，得到更多的脂肪干细胞，且脂肪组织剪碎后过滤更容易，培养瓶底更干净。图3示出再植后的脂肪干细胞，将经过约5min消化仍未脱离的脂肪干细胞进行再植培养，增加了脂肪干细胞的得率，并且再植后获得的脂肪干细胞从形态学上判断没有受到影响。

将实施例1-3提取的脂肪干细胞与对比例提取的脂肪干细胞进行鉴定，具体的鉴定方法为：利用计数、活率、流式检测方法对提取的脂肪干细胞进行表面标记物表达水平进行检测。鉴定结果如表3和表4所示。

表3脂肪干细胞的计数和存活率检测结果

表4脂肪干细胞的P1代和P3代细胞的稳定性检测结果

通过表3的检测结果可知，本发明的多联管式脂肪干细胞提取方法相比于普通酶解法，细胞贴壁多，收获的细胞总数较多，细胞存活率相对较高，并且脂肪干细胞从P0代到P1代的细胞培养天数减少。此外，在本发明中，通过加入剪碎和再植步骤，细胞贴壁增多、组织块减少，并且细胞存活率与收获的细胞总数增多。通过流式细胞仪检测实施例1-3和对比例的脂肪干细胞P1和P3代的稳定性，其检测结果如表4所示，其中，荧光标记物为藻红蛋白(PE)和异硫氰酸荧光素(FITC)，细胞表面标志物为CD105、CD34、CD79a、CD73、CD90、CD45、HLA-DR和CD14。图5A-5E(荧光标记物为PE)与图6A-6E(荧光标记物为FITC)示出了实施例3再植步骤后脂肪干细胞的流式检测结果，图中，横坐标为相对荧光强度，纵坐标为细胞计数(count)。其中，图5A为细胞表面标志物ISO的表达结果，图5B为细胞表面标志物CD105的表达结果，图5C为细胞表面标志物CD34的表达结果，图5D为细胞表面标志物CD79a的表达结果，图5E为细胞表面标志物CD73的表达结果；图6A为细胞表面标志物ISO的表达结果，图6B为细胞表面标志物CD90的表达结果，图6C为细胞表面标志物CD45的表达结果，图6D为细胞表面标志物HLA-DR的表达结果，图6E为细胞表面标志物CD14的表达结果。由流式细胞仪的检测结果可知，本发明的多联管式提取方法获得的脂肪干细胞，流式表型均稳定，表达了CD105、CD73、CD90，不表达CD34、CD79a、CD45、HLA-DR和CD14，即所测的表面标志物值均符合标准，说明本发明提取的为脂肪干细胞，并且获得的脂肪干细胞能够稳定传代。此外，在本发明中，将经过约5min消化仍未脱离的脂肪干细胞进行再植培养，获得的脂肪干细胞没有受前述胰酶消化步骤的影响，同样获得脂肪干细胞。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种多联管式脂肪干细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种多联管式脂肪干细胞提取方法，其特征在于，在所述步骤(9)之后增加再植步骤，所述再植步骤为：将步骤(9)中消化后的培养瓶用PBS清洗2遍，向未消化完全的脂肪干细胞中加入间充质干细胞无血清完全培养基，继续培养，并重复步骤(9)，收获脂肪干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种多联管式脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤(1a)中加入离心管的脂肪组织为20ml；所述步骤(7)和步骤(8)中的间充质干细胞无血清完全培养基的加入量均为15ml；所述步骤(9)中胰酶Trypsin的加入量为3ml，终止消化的生理盐水或培养基的加入量为5-10ml。

4.根据权利要求1所述的一种多联管式脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤(3)和(4)中的胶原酶为I型胶原酶，所述步骤(9)中的胰酶为胰酶Trypsin。

5.根据权利要求1所述的一种多联管式脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述生理盐水含有三抗。