CN110885784B - 一种临床应用级脂肪干细胞及其制备方法 - Google Patents

一种临床应用级脂肪干细胞及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种临床应用级脂肪干细胞及其制备方法，所述制备方法包括将分离的脂肪干细胞进行原代培养后，消化传代筛选出有细胞克隆团的细胞进行传代接种。本发明方法制备脂肪干细胞，获得有核细胞得率高，分离时间短，细胞存活率高，传代可达10代以上。

Description

一种临床应用级脂肪干细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体的涉及干细胞的分离制备方法。
背景技术
脂肪组织在人体内储存丰富，获取方便，通过抽脂从中获得大量的脂肪干细胞不仅在体内外具有多向分化潜能，在不同的诱导因子作用下可以像脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。人脂肪干细胞来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。
但目前已知的脂肪干细胞分离制备方法存在以下几个缺点：1、有核细胞得率低；2、分离制备的时间较长；3.细胞存活率较低。另外，目前传统的传代技术将脂肪干细胞的应用代数限制在6代以内，大大的限制了脂肪干细胞的应用。
为克服上述不足，发明人进一步改进和优化了脂肪干细胞的制备方法。
发明内容
本发明提供一种脂肪干细胞的制备方法，获得有核细胞得率高，分离时间短，细胞存活率高，传代可达10代以上。
本发明第一方面提供一种临床应用级脂肪干细胞的制备方法，所述制备方法包括将分离的脂肪干细胞进行原代培养后，消化传代并从P1代细胞中筛选出有细胞克隆团的细胞进行后续的传代接种。
本发明第二方面提供所述脂肪干细胞的制备方法，该所述制备方法包含步骤：
(1)无菌采集脂肪组织；
(2)使用生理盐水洗涤脂肪组织，离心分离，去除大部分红细胞及肿胀液；
(3)用消化液消化步骤(2)分离获得的脂肪组织；
(4)离心去除上层脂质和消化液，保留沉淀；
(5)加入培养基重悬沉淀，并将细胞悬液转移至培养瓶中进行原代培养；
(6)当细胞融合度达到80％～90％时进行消化传代，并将细胞接种于24孔板内；
(7)筛选出有细胞克隆团的孔，对该孔内细胞进行传代接种；
(8)当细胞融合度达到80％～90％时，继续消化传代到需要的代数。
上述步骤(8)传代培养结束后，将培养扩增的脂肪干细胞用冻存液冻存，所述冻存液组分为：无血清冻存液的浓度为90％～95％，血清替代物HELIOS的浓度为5％～10％，以上为体积百分比。
上述无血清冻存液为CELLBANKER无血清冻存液。
上述步骤(1)中，所述脂肪组织采集后放置在保存液中保存，所述保存液包含：1.5％～5％人血白蛋白溶液、1％～3％青链霉素(10,000Units/ml青霉素和10,000ug/ml链霉素，)、其余为DMEM溶液，以上为体积百分比。
上述步骤(3)中消化液包含二种以上消化酶和白蛋白。
上述消化酶为胶原酶I和DispaseⅡ。
上述消化液组分为：
0.1％～0.5％胶原酶Ⅰ，
0.1％～0.5％DispaseⅡ，
63.47μg/ml～126.94μg/ml氯化镁，
1.5％～3％白蛋白，
其余为DMEM；
以上为质量百分比浓度。
上述步骤(5)中采用下述培养基培养细胞：低糖DMEM、血清替代物、肝素钠。
上述血清替代物为HELIOS，其浓度为10％～20％，所述肝素钠的浓度为100IU/ml～200IU/ml。
本发明第三发明提供上述脂肪干细胞的制备方法制备获得的临床应用级脂肪干细胞。
本发明的目的是提供制备脂肪干细胞的方法，该方法可以使脂肪组织隔天处理而不影响其得率，可以制备出高增殖能力，可多次传代的干细胞，且在冻存复苏后细胞的表型稳定、数量稳定、存活率高，可以改善当前脂肪干细胞在培养过程中遇到的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种临床应用级制备脂肪干细胞的方法，该方法包含：
步骤1：无菌采集脂肪组织样本，将样本转移到装有保存液的采集瓶中，摇晃采集瓶3～5次，使保存液和脂肪组织充分混匀。封口膜封好采集瓶后将其放入移动式摇床中，保证在暂存及运输过程中，脂肪组织可以和保存液充分混匀，避免静置时脂肪组织与保存液分离。在运输过程中，保证温度在2～18℃。
所述的保存液包含：1.5％～5％人血白蛋白溶液、1％～3％青链霉素(10,000Units/ml青霉素和10,000ug/ml链霉素)、DMEM溶液。其中，优选使用：人血白蛋白的浓度为3％，青链霉素的浓度为2％，以上为重量百分比。
步骤2：将样本倒入无菌离心管中，1500rpm离心5min，将上层脂肪组织转入新的50ml离心管中，每管20～25ml。
步骤3：往装有脂肪组织的离心管中加入生理盐水，使终体积为50ml。盖上离心管盖子，上下颠倒混匀后，1500rpm离心5min，离心后分成3层，最上层为脂肪组织，中层为生理盐水，下层为红细胞及碎片。将上层脂肪组织转入新的50ml离心管中，每管20～25ml。
步骤4：配置消化液，该消化液包含：氯化钠注射液、胶原酶Ⅰ、DispaseⅡ(中性蛋白酶)、氯化镁溶液、白蛋白。将配置好的消化液封口后放入37℃水浴锅中预热。
所述的消化液中各组分的浓度为：0.1％～0.5％胶原酶Ⅰ，0.1％～0.5％DispaseⅡ，63.47μg/ml～126.94μg/ml氯化镁，1.5％～3％白蛋白为。其中，优选使用：胶原酶Ⅰ的浓度为0.1％，DispaseⅡ的浓度为0.1％，氯化镁溶液的浓度为63.47μg/ml，白蛋白的浓度为3％。
步骤5:将预热后的消化液按体积比为1:1的比例加入到脂肪组织中，盖好离心管，上下摇晃使消化液和组织充分混合。封口膜密封后，放于37℃水浴锅中消化。消化时每隔5min摇晃一次离心管。
步骤6：待离心管内的组织块松散后，即可停止消化，75％酒精擦拭离心管表面，1500rpm离心5min。
步骤7：将上层脂质及中层液体倒出，剩余沉淀加入生理盐水至终体积50ml，盖好离心管盖子，1500rpm离心5min。
步骤8：离心后将上清倒出，加入适量生理盐水重悬沉淀后合并到一个新的50ml离心管中，取100μl细胞悬液计数，剩余细胞悬液1500rpm离心5min。
步骤9：移液管吸取适量培养基重悬细胞沉淀，以1～2×105/cm2的细胞密度接种于培养瓶中。放于恒温二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2浓度下进行培养。
其中，培养基为：低糖DMEM、5％～10％的血清替代物HELIOS、100IU/ml～200IU/ml的肝素钠。优选使用10％浓度的血清替代物，100IU/ml的肝素钠。
其中，优选使用2×105/cm2的细胞密度进行接种。
步骤10：原代培养期间，定时进行换液。换液时将原培养基倒出，加入预热的培养基。
步骤11：当细胞融合度达到80％～90％时进行消化，消化时，先将原培养基倒入新的离心管中离心备用。用适量生理盐水洗涤培养瓶1次，加入胰蛋白酶进行消化，确保其覆盖瓶底并静置，细胞变圆后轻轻拍打培养瓶两侧至细胞脱落，然后向瓶子中加入不低于胰蛋白酶量的原培养基终止消化。
步骤12：将细胞悬液倒入离心管中，用生理盐水洗涤1次培养瓶，生理盐水和细胞悬液混合后计数。细胞悬液1500rpm离心5min，弃上清保留细胞沉淀。按照100～200个/cm2的密度，计算所需板数和传代培养基量。细胞沉淀用培养基重悬，平均分装到24孔板内。
其中，优选使用100个/cm2的密度进行接种。
步骤13：经过7天的培养时间，筛选出有克隆团的细胞，将其进行消化传代。第二次传代按照3000～8000个/cm2的密度，计算所需培养瓶数和传代培养基量，平均分装到175cm2培养瓶中。
其中，优选使用8000个/cm2的密度进行接种。
步骤14：当细胞融合度达到80％～90％时进行消化传代，或者直接冻存。冻存时将细胞消化后，按照1～2×107/ml的密度，计算冻存管数和冻存液体积，冻存液包含无血清冻存液的浓度为90％～95％，血清替代物HELIOS的浓度为10％～5％。
其中，优选使用1×107/ml的密度进行冻存；
其中，冻存液中无血清冻存液的浓度优选为90％，血清替代物HELIOS的浓度优选为10％。
本发明的制备脂肪干细胞的方法，具有以下优点：
1、使用特定的保存液替代生理盐水保存脂肪组织样本，使脂肪组织可以隔天处理而不影响其有核细胞的得率。
2、对脂肪组织进行预处理时，对样本进行离心去除红细胞。相比使用生理盐水混匀组织后利用组织和红细胞的沉降原理吸取上层组织来去除沉降的红细胞的传统方法时间更短。
3、在2018年发表的文献《Improved GMP compliant approach to manipulatelipoaspirates,to cryopreserve stromal vascular fraction,and to expand adiposestem cells in xeno-free media》(HYPERLINK"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/？term＝Improved+GMP+compliant+approach+to+manipulate+lipoaspirates+％2Cto+cryopreserve+stromal+vascular+fraction+％2C+and+to+expand+adipose+stem+cells+in+xeno-free+media"\o"Stem cell research&therapy."Stem Cell ResTher.2018May 11；9(1):130)中，只使用一种胶原酶作为消化液，且消化时间需要60分钟。而此方法使用胶原酶和Dispase分散酶两种消化酶来消化脂肪组织，加入适量的白蛋白来保护细胞免受过度消化,另外还加入酶激活剂(氯化镁溶液)来促进消化酶的消化作用，。此种方法消化只需20分钟即可。
上述文献方法每毫升得到的有核细胞数为：185.4±19.3×103NC。而此种方法每毫升得到的有核细胞数可为：5.12±0.34×105NC，得到的有核细胞数量更高。
上述文献方法得到的细胞存活率为：77.1±3.9％。而此种方法加入白蛋白来保护细胞，所以得到的存活率更高，可为：93.2±5.9％。
4、在2018年发表的文献《Improved GMP compliant approach to manipulatelipoaspirates,to cryopreserve stromal vascular fraction,and to expand adiposestem cells in xeno-free media》中，冻存后细胞存活率仅为：69.0±3.2％，而此方法用无血清冻存液加入血清替代物，可使冻存后细胞的存活率高达90％±3.1％。
且在专利《用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立》中，所使用的冻存液配方为：无血清培养基+DMSO+KSR，冻存复苏后细胞表面标记CD105仅为73.3％。而此冻存方法可使复苏后细胞表面标记高达95％以上。
5、在专利《一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法》中，干细胞传代时不进行筛选，所有传代就按照1.3×104/cm2的密度来接种，每代的扩增倍数仅为4倍。而此种方法是在第一次传代时对细胞进行低密度接种筛选出具有克隆能力的干细胞后再进行传代，这种方法培养出的细胞扩增能力更强，增殖倍数可达到10倍以上。本发明制备的脂肪干细胞可以直接应用于临床。
附图说明
图1为脂肪干细胞传代后细胞状态图(细胞融合度已经达到80％)。
图2为每代细胞增殖倍数检测图。
图3为细胞流式结果检测图。
图4为本发明的脂肪干细胞的表面抗原检测。
细胞高表达CD73、CD90、CD105；CD34、CD45、HLA-DR阴性表达。
具体实施方式
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。
实施例1脂肪干细胞的制备
一、制备采集瓶
配置脂肪样本保存液，该保存液的组份包含：40ml的DMEM、0.8ml青链霉素(内含10000IU/ml青霉素，10,000μg/ml的链霉素；Gibco公司)。将配置好的保存液加入到采集瓶中，标为A。将同样40ml体积的生理盐水加入到采集瓶中，标为B。
二、对脂肪样本的筛选
对脂肪样本的要求，具体如下：
1、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、CMV、EBV、HTLV病毒检测为阴性，
其检测方法为本领域的常规检测方法。
2、供者身体状态良好，无遗传家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。
3、供者BMI在18～30之间，年龄在20～70之间。
4、共选择3例供者的脂肪组织。
三、脂肪样本的运输
无菌采集脂肪组织后，将脂肪组织平均分配到采集瓶A和B中，运输过程中控制温度在2～18℃，尽快送至实验室。
四、脂肪干细胞的制备方法
1、溶液的配置。
1.1消化液的配置。称取100mg的胶原酶Ⅰ(Sigma公司)于15ml离心管中，移液管吸取10ml生理盐水溶解，溶解后静置15分钟，使粉剂完全溶解于溶液中。称取100mg的DispaseⅡ(Sigma公司)于15ml离心管中，移液管吸取10ml生理盐水溶解，溶解后静置15分钟，使粉剂完全溶解于溶液中。20ml注射器吸取配置好的胶原酶及Dispase混匀后经0.22μm过滤器过滤。使用时，在母液中加入9倍母液体积的DMEM(Gibco公司)，加入原浓度为1M(即95.21mg/mL)的氯化镁溶液(Gibco公司)使终浓度为31.73μg/ml～126.94μg/ml，加入白蛋白(贵州泰邦生物制品有限公司)溶液，使白蛋白的终浓度为3％。1.2培养基的配置。提前将血清替代物(HELIOS公司)放于4℃冰箱溶解，使用时将血清替代物分装在50ml离心管中，每管45ml，3000rpm离心5分钟。离心后吸取50ml上清液加入到500ml的DMEM培养基中。另外加入肝素钠(赛诺菲公司)溶液，使肝素钠浓度在100IU/ml。
1.3冻存液的配置。冻存液现配现用，根据细胞计数结果配置冻存液，冻存液配方为：90％CELLBANKER无血清冻存液以及10％HELIOS血清替代物。(体积百分比)
2、24h后处理脂肪组织，将组织连同保存液一起倒入新的50ml离心管中，1500rpm离心5min。
3、将上层脂肪组织转移至新的离心管中，补加生理盐水到50ml，1500rpm离心5min，收集上层脂肪组织，去除下层液体及杂细胞。反复清洗1～2次。
4、消化前先将配置好的消化液放于37℃水浴锅中预热15分钟。将洗涤后的脂肪组织转移到新的50ml离心管中，每管约20ml～25ml，加入等体积已预热的消化液，拧紧管盖，用封口膜封好，贴好标签，剧烈摇晃混匀后放入37℃恒温水浴槽中，每2～3分钟取出离心管摇晃一次，使脂肪组织与消化液充分混合，消化时间为15～20分钟。消化过程中观察消化进度，至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，即可终止消化。纱布擦干离心管后放入离心机中，1500rpm离心5min。
5、过滤，将离心后上层脂质缓慢倒入废液缸，剩余部分添加生理盐水至40ml，将沉淀重悬混匀，准备好新的50ml离心管和细胞滤网，将重悬液过滤。
6、洗涤，添加生理盐水至50ml，重悬沉淀并混匀，1500rpm离心5min。
7、取样计数。缓慢倒掉上清液，用10ml移液管吸取适量生理盐水，从离心管底部轻轻重悬沉淀细胞，转移到新的50ml离心管中，添加生理盐水至40ml，混匀后取样100μl，用于细胞计数和活力检测。
8、细胞重悬液经1500rpm离心5min后，去除上清液，保留沉淀。
9、以2×105/cm2的细胞密度接种于培养瓶中，在每个175cm2培养瓶中加入30ml培养基，接种后24h内不要移动培养瓶，以免影响细胞贴壁。
10、48h后进行第一次换液。去除培养瓶中培养基，在每个175cm2培养瓶中加入30ml新鲜的培养基。
11、当细胞铺满培养瓶底部约80％面积时，进行消化传代。消化时，将原培养基转入新的50ml离心管中，1500rpm离心5min备用。用生理盐水洗涤培养瓶底部1次，去除底部残留的培养液。每个175cm2培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶4ml，确保其覆盖瓶底。镜下观察，待底面变亮，细胞变圆时，轻轻拍打培养瓶两侧，使细胞脱落，向瓶中加入不低于胰蛋白酶的培养基或原培养基上清终止消化。将瓶中细胞悬液转移至离心管中，用生理盐水再洗涤1次培养瓶，洗涤液和细胞悬液混匀后取细胞悬液与台盼蓝按比例混合，镜下计数。细胞悬液按照400g离心5min，弃上清，保留细胞沉淀。根据计数结果，细胞按照100个/cm2接种于24孔板内，每孔1.5ml培养基。72小时后换液。
12、在细胞培养的第10天，筛选出具有克隆能力的细胞进行消化传代。
13、第二次传代时细胞按照8000个/cm2接种于培养瓶中。
14、当细胞融合度达到80％时，重复13步骤。
15、脂肪干细胞可以连续传代需要的代数，如本发明中可以普遍传代至P10代。
16、当细胞传代至P10代时，将消化下的细胞悬液1500rpm离心5分钟后，弃上清，根据计数结果，计算冻存液用量。冻存密度为1×107/ml。将冻存管密封，并标注批号、日期，经程序降温盒转入-80℃低温冰箱保存至少1天。24h后转入液氮罐进行长期保存。
17、1年后取出细胞冻存管，迅速转入温水中，并快速震荡，或转入金属浴中静置约2分钟。细胞悬液基本溶解时，75％酒精棉球消毒冻存管外表面后，转入生产车间。
18、将冻存管转入超净台，75％酒精棉球轻拭管盖边缘，再将管盖轻轻移除。取1支50ml离心管，并加入少量培养基。将冻存管内细胞悬液转入离心管中，补充培养基，使细胞悬液终体积为5～10ml，轻轻吹匀细胞悬液，取样计数，剩余细胞做流式检测。
实施例2本发明消化液不同组分配比及培养效果(重量百分比)
Figure BDA0001795567900000081
表一：消化液使用的组分配比及效果数据
注：表二中细胞数量单位均为×105NC/mL脂肪实施例3、脂肪干细胞的检测
1、细胞形态的观察
脂肪干细胞一般在第3天可以看到有贴壁细胞析出，在7～10天，细胞可达80％融合度。传代后细胞均匀分布，成梭型生长。如图1所示。
2、每毫升脂肪组织得到的有核细胞的检测
保存液保存的脂肪组织得到的有核细胞数为：5.12±0.34×105NC；
生理盐水保存的脂肪组织得到的有核细胞数为：3.24±0.58×105NC。
3、脂肪干细胞扩增倍数
将每次消化后的细胞进行计数，计算每代的扩增倍数。如图2。每代的扩增倍数都大于10倍，而在专利《一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法》中公开了一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，可以传代至15代，但是其每代的扩增倍数仅为4倍。该专利为广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司2014年11月25日申请，公开号为CN104611292B。
4、细胞表型
采用本领域常规检测方法(如流式细胞仪检测)对每代脂肪干细胞进行表面抗原CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105的检测。其检测结果如图3所示。
对冻存细胞进行表型检测，其检测结果如图所示。间充质干细胞的阳性指标均＞95％，而在专利《用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立》中，所使用的冻存液配方为：无血清培养基+DMSO+KSR，冻存复苏后细胞表面标记CD105仅为73.3％。该专利为臻景生物技术(上海)有限公司,和臻景生物技术(无锡)有限公司于2011年8月9日申请，公开号为CN102550542B。
5、细胞存活率的检测
对消化后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率，存活为：93.2±5.9％。而文献《Improved GMP compliant approach to manipulate lipoaspirates,to cryopreservestromal vascular fraction,and to expand adipose stem cells in xeno-freemedia》的存活率为：77.1±3.9％。
对冻存后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率，存活为：90％±3.1％，而在2018年发表的文献《Improved GMP compliant approach to manipulate lipoaspirates,tocryopreserve stromal vascular fraction,and to expand adipose stem cells inxeno-free media》中，冻存后细胞存活率仅为：69.0±3.2％。
因此，采用本发明的制备方法，可以获得细胞存活率高、有核细胞得率高的脂肪干细胞；而且分离制备的时间较短；脂肪干细胞的传代也可以达到10代以上，且每代扩增倍数也高，有利于大规模处理脂肪干细胞，扩大了脂肪干细胞的应用。采用本发明的冻存液可以获得很高的细胞存活率。采用本发明的保存液，便于更好的保存脂肪组织，保存时间可以达到一天，可以统一送到指定实验室，由更专业的人员操作培养细胞，提高细胞各项指标，便于脂肪干细胞的进一步应用。此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。

Claims (9)

1.一种临床应用级脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，该所述制备方法包含步骤：
(1)无菌采集脂肪组织；
(2)使用生理盐水洗涤脂肪组织，离心分离，去除大部分红细胞及肿胀液；
(3)用消化液消化步骤(2)分离获得的脂肪组织；所述消化液组分为：
0.1％～0.5％胶原酶Ⅰ；
0.1％～0.5％DispaseⅡ；
63.47μg/ml～126.94μg/ml氯化镁；
1.5％～3％白蛋白；
其余为DMEM；
以上为重量百分比；
(4)离心去除上层脂质和消化液，保留沉淀；
(5)加入培养基重悬沉淀，并将细胞悬液转移至培养瓶中进行原代培养；
(6)当细胞融合度达到80％～90％时进行消化传代，并将细胞接种于24孔板内；
(7)筛选出有细胞克隆团的孔，对该孔内细胞进行传代接种；
(8)当细胞融合度达到80％～90％时，继续消化传代到需要的代数。
2.如权利要求1所述脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(8)传代培养结束后，将培养扩增的脂肪干细胞用冻存液冻存，所述冻存液组分为：90％～95％无血清冻存液，5％～10％血清替代物HELIOS。
3.如权利要求2所述脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，所述无血清冻存液为CELLBANKER无血清冻存液。
4.如权利要求1所述脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述脂肪组织采集后放置在保存液中保存，所述保存液包含：1.5％～5％人血白蛋白溶液、1％～3％青链霉素，所述青链霉素为10,000Units/ml青霉素和10,000ug/ml链霉素，其余为DMEM溶液，以上为体积百分比。
5.如权利要求1-4任一权利要求所述脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中采用下述培养基培养细胞：低糖DMEM、血清替代物、肝素钠。
6.如权利要求5所述脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，所述血清替代物为HELIOS，其浓度为10％～20％，所述肝素钠的浓度为100IU/ml～200IU/ml，所述低糖DMEM浓度为80-90％，以上为体积百分比。
7.如权利要求1-4任一权利要求所述脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中采用下述培养基培养细胞：低糖DMEM、血清替代物、肝素钠；所述的血清替代物为HELIOS，其浓度为5％～10％，肝素钠的浓度为100IU/ml～200IU/ml，所述低糖DMEM浓度为80-90％，以上为体积百分比。
8.如权利要求1-4或6任一权利要求所述脂肪干细胞的制备方法制备获得的临床应用级脂肪干细胞。
9.如权利要求7所述脂肪干细胞的制备方法制备获得的临床应用级脂肪干细胞。
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