CN105477017A - 治疗糖尿病足的混合干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

治疗糖尿病足的混合干细胞制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂及其制备方法，该混合干细胞制剂包括胎盘造血干细胞和间充质干细胞，所述胎盘造血干细胞的浓度为1-2×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为5-10×106个/ml。本发明将胎盘造血干细胞与间充质干细胞混合，制成混合的干细胞制剂。由于VEGF是一种促进血管再生的重要因子，在间充质干细胞液中引入胎盘造血干细胞能很好的激活VEGF信号通路，局部注射本发明混合干细胞制剂后，可以提高外周血及局部VEGF浓度，促进糖尿病足溃疡的愈合。而，单纯地注射间充质干细胞后，效果不明显。

Description

治疗糖尿病足的混合干细胞制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞制剂及其制备方法，尤其及一种用于治疗糖尿病足的干细胞制剂及其制备方法。
背景技术
糖尿病足是糖尿病患者由于并发神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和(或)深部组织的破坏，是导致糖尿病患者致残致死的严重慢性并发症之一。糖尿病外周血管病变常常累及双下肢动脉，早期主要表现为间歇性跛行，随着狭窄的加重可出现静息痛甚至丧失行走能力，如缺血伴感染和神经病变可导致局部组织坏死、溃疡和坏疽而形成缺血性糖尿病足。大约有60％的非创伤性小腿截肢是由糖尿病足引起，糖尿病足给社会及家庭造成了沉重的医疗负担。利用干细胞的血管新生机制进行糖尿病双下肢缺血性病变，是近年来的一项崭新的技术，目前，取得了较好的临床效果。
发明内容
本发明需解决的技术问题是提供一种疗效好的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂。
为解决上述的技术问题，本发明设计了一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，其包括胎盘造血干细胞和间充质干细胞，所述胎盘造血干细胞的浓度为1-2×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为5-10×106个/ml。
作为本发明进一步改进，所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。
本发明还提供了一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1：制备间充质干细胞的步骤，其包括：
S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
S12：将组织块接种于培养瓶中，加入MSCs生长培养液，置入37℃、含有体积分数为5％的CO2的细胞培养箱中培养；
S13：当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，利用消化液消化，使消化液覆盖所有细胞表面，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液；
S14：将单细胞悬液置于离心管中，离心，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1：2～1：3的比例传代培养，传至第三代后，得间充质干细胞细胞液；
S2：制备胎盘造血干细胞的步骤，其包括：
S21：获得胎盘组织，用酶溶液消化，得到消化产物，去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；
S22：将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，再得到上层的有核细胞悬液，将所述有核细胞悬液与冻存液混合得到胎盘造血干细胞液；
S3：配制治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的步骤，包括：
将所述胎盘造血干细胞液添加到所述间充质干细胞细胞液中，边添加，边混合，混合均匀。
作为本发明进一步改进，所述消化液包括0.25％WT的胰酶和0.02％WT的EDTA。
作为本发明进一步改进，所述酶溶液包括50-200IU/mL的Ⅰ型胶原酶、10-40IU/mL的DNA酶I、1-4IU/mL的分散酶和400-1000IU/mL的透明质酸酶。
作为本发明进一步改进，所述冻存液包括20-65mL/L的二甲基亚砜、3-30g/L的羟乙基淀粉、30-130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酐、4-6.5g/L的氯化钠、3.5-6g/L的葡萄糖酸钠、3-4.5g/L的醋酸钠、0.2-0.6g/L的氯化钾和0.1-0.5g/L的氯化镁。
本发明将胎盘造血干细胞与间充质干细胞混合，制成混合的干细胞制剂。由于VEGF是一种促进血管再生的重要因子，在间充质干细胞液中引入胎盘造血干细胞能很好的激活VEGF信号通路，局部注射本发明混合干细胞制剂后，可以提高外周血及局部VEGF浓度，促进糖尿病足溃疡的愈合。而，单纯地注射间充质干细胞后，效果不明显。因而，本发明制成混合的干细胞制剂能更好地促进糖尿病足创面的愈合。
具体实施方式
为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
本发明提供一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，将胎盘造血干细胞与间充质干细胞混合在一起，可通过局部注射该混合干细胞制剂的方法来治疗糖尿病足，疗效非常好。
本发明混合干细胞制剂包括胎盘造血干细胞和间充质干细胞，胎盘造血干细胞的浓度为1-2×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为5-10×106个/ml。在本发明的实施方式中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明在间充质干细胞液中引入胎盘造血干细胞能很好地激活VEGF(vascularendothelialgrowthfactor，血管内皮生长因子)的信号通路，局部注射本发明混合的干细胞制剂后，提高外周血及局部VEGF浓度，促进糖尿病足溃疡的愈合。而，单纯地注射间充质干细胞后，效果不明显。
本发明治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备间充质干细胞的步骤，其包括：
S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
S12：将组织块接种于培养瓶中，加入MSCs生长培养液，置入37℃、含有体积分数为5％的CO2的细胞培养箱中培养；
S13：当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，利用消化液消化，使消化液覆盖所有细胞表面，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液；
S14：将单细胞悬液置于离心管中，离心，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1：2～1：3的比例传代培养，传至第三代后，得间充质干细胞细胞液；
S2：制备胎盘造血干细胞的步骤，其包括：
S21：获得胎盘组织，用酶溶液消化，得到消化产物，去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；
S22：将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，再得到上层的有核细胞悬液，将所述有核细胞悬液与冻存液混合得到胎盘造血干细胞液；
S3：配制治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的步骤，包括：
将所述胎盘造血干细胞液添加到所述间充质干细胞细胞液中，边添加，边混合，混合均匀。即得到本发明治疗糖尿病足的混合干细胞制剂。
下面结合具体的实施例对本发明进一步详细说明
1、获取间充质干细胞
在本实施中，间充质干细胞来源于人的脐带。从手术台取正常足月健康婴儿脐带，浸泡于生理盐水(每毫升含25U肝素钠)中，超净台内取出脐带，以含有1％WT的青链霉素的PBS液充分冲洗脐带外表面，20ml注射器冲洗动、静脉管腔后，将其置于1％WT青链霉素的PBS液中10分钟，取出后将其剪切成1mm×1mm×1mm大小的组织块，在剪切时向所操作的组织上滴加1-2滴培养液，以保持组织湿润。将组织块接种于培养瓶中，均匀铺放，上置盖玻片，待2h后，再加入MSCs生长培养液，置入37℃、含有体积分数为5％的CO2的细胞培养箱中培养，在倒置相差显微镜下观察细胞自组织块周边游出、贴壁后，每隔3d更换培养液。
当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，以0.25％WT的胰酶和0.02％WT的EDTA消化，轻轻摇动培养瓶，使消化液覆盖所有细胞表面，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液。将该单细胞悬液置于离心管中，1000rpm，离心3min，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1：3的比例传代培养，每3d换液，倒置相差显微镜下观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增。传至第三代后，剩下形态较为单一的细胞，即得到脐带间充质干细胞细胞液。
2、胎盘造血干细胞：
用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；将所述有核细胞悬液与冻存液混合即得到胎盘造血干细胞液。上述酶溶液包括100IU/mL的Ⅰ型胶原酶、30IU/mL的DNA酶I、3IU/mL的分散酶和600IU/mL的透明质酸酶。上述冻存液包括45mL/L的二甲基亚砜、20g/L的羟乙基淀粉、80g/L的人血白蛋白、25g/L的右旋糖酐、5g/L的氯化钠、4.5g/L的葡萄糖酸钠、4g/L的醋酸钠、0.4g/L的氯化钾和0.3g/L的氯化镁。
3、混合
将上述胎盘造血干细胞添液加到上述脐带间充质干细胞细胞液中，边添加，边混合，并控制胎盘造血干细胞的浓度为1.5×105个/ml，脐带间充质干细胞的浓度为8×106个/ml，混合均匀。
为进一步验证本发明提供的混合干细胞制剂治疗糖尿病足的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。
验证实验：
实验动物分组和模型构建:
Wistar大鼠60只，体质量(200±15)g，实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。随机数字表法分为对照组(即注射单纯的间充质干细胞)、实验组(即注射本发明混合干细胞制剂)，每组30只，高脂饲料喂养。2个月后，禁食16h后腹腔注射由柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH4.4)配制的45mg/kg的链脲佐菌素，第7天测空腹血糖>16mmol/L者入选实验模型，足背部切除3mm×7mm矩形区域全层皮肤，建立糖尿病足溃疡模型，并计为第0天。于创面形成后第1天对照页和实验组分别于大鼠创缘肉膜层多点注射细胞0.4mL。
利用ELISA测定外周血VEGF蛋白水平(取两个组的平均值)：细胞注射后第1，4，8天经内两个组大鼠眦静脉取外周血1.5mL，5000r/min离心4min后，取100μL血浆，进行ELISA检测，取两个组的VEGF蛋白水平测定的平均值，其结果如下表：
天数 对照组(μg/L) 实验组(μg/L)
1d 1.47±0.07 1.47±0.03
4d 1.48±0.06 1.58±0.02
8d 1.50±0.02 1.74±0.09
通过VEGF的测定可判定糖尿病足溃疡存在VEGF分泌不足，从上表的数值可以看出：实验组的大鼠局部注射本发明混合干细胞制剂后提高外周血及局部VEGF浓度，可以促进糖尿病足溃疡的加速愈合；但对照页注射单纯的间充质干细胞后，VEGF浓度提高不明显。VEGF是一种促进血管再生的重要因子，在创面的愈合中发挥着重要的作用，VEGF的缺乏可能对糖尿病足溃疡的难愈性发挥着重要的作用，注射本发明混合干细胞制剂后，外周血的VEGF的浓度增高，本发明混合干细胞制剂通过信号转导作用调动机体产生VEGF，而同时具有旁分泌作用完成自身定居转化过程参与组织修复，在此过程中相对快速激活周围局部VEGF的分泌达到一定的高浓度，从而促进糖尿病足溃疡的加速愈合。
以上仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，其特征在于，包括胎盘造血干细胞和间充质干细胞，所述胎盘造血干细胞的浓度为1-2×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为5-10×106个/ml。
2.根据权利要求1所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。
3.一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备间充质干细胞的步骤，其包括：
S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
S12：将组织块接种于培养瓶中，加入MSCs生长培养液，置入37℃、含有体积分数为5％的CO2的细胞培养箱中培养；
S13：当细胞贴壁生长达70％以上汇合后，弃组织块，利用消化液消化，使消化液覆盖所有细胞表面，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液；
S14：将单细胞悬液置于离心管中，离心，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1：2～1：3的比例传代培养，传至第三代后，得间充质干细胞细胞液；
S2：制备胎盘造血干细胞的步骤，其包括：
S21：获得胎盘组织，用酶溶液消化，得到消化产物，去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；
S22：将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，再得到上层的有核细胞悬液，将所述有核细胞悬液与冻存液混合得到胎盘造血干细胞液；
S3：配制治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的步骤，包括：
将所述胎盘造血干细胞液添加到所述间充质干细胞细胞液中，边添加，边混合，混合均匀。
4.根据权利要求3所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述消化液包括0.25％WT的胰酶和0.02％WT的EDTA。
5.根据权利要求3所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述酶溶液包括50-200IU/mL的Ⅰ型胶原酶、10-40IU/mL的DNA酶I、1-4IU/mL的分散酶和400-1000IU/mL的透明质酸酶。
6.根据权利要求3所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述冻存液包括20-65mL/L的二甲基亚砜、3-30g/L的羟乙基淀粉、30-130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酐、4-6.5g/L的氯化钠、3.5-6g/L的葡萄糖酸钠、3-4.5g/L的醋酸钠、0.2-0.6g/L的氯化钾和0.1-0.5g/L的氯化镁。
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