CN101336932B - 一种低传代猪毛乳头细胞培养上清液冻干粉 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪毛乳头细胞培养上清的药物在治疗秃发中的应用。用含人AB型血清的基础培养基培养低传代猪毛乳头细胞，收集低传代猪毛乳头细胞培养上清，将所收集上清液制备成冻干粉。本发明所制备的药物在治疗秃发中有明显的疗效。猪毛乳头细胞来源广泛，可以有效解决毛乳头细胞来源有限这一瓶颈，为产业化应用于临床治疗秃发奠定了基础。

Description

一种低传代猪毛乳头细胞培养上清液冻干粉

技术领域

本发明涉及治疗秃发的药物，特别是涉及一种猪毛乳头细胞培养上清的药物及其在治疗秃发中的应用。 

技术背景 

秃发是皮肤科临床常见疾病之一，占皮肤科门诊量的10～15％，由于生活节奏的加快，这一数字还有进一步升高的趋势，秃发进一步发展可演变为普秃和全秃，这给患者身心带来严重的负担。一般认为，毛乳头细胞(dermalpapilla cells，DPC)在毛囊的发育及周期性生长调控中起重要作用。要阐明人毛乳头细胞对调节毛囊生长和发育的机制，必须从人毛乳头细胞自身分泌的生物活性成份着手，来建立人毛乳头细胞体外培养模型，应用低传代人毛乳头细胞的培养上清制成条件培养基，观察其对不同传代的人毛乳头细胞生长状态的影响，发现人毛乳头细胞条件培养液(dermal papilla cell conditionalmedium DPCCM)能将非凝集生长的人毛乳头细胞有效诱导为凝集性生长状态，并促进细胞增殖。人毛乳头细胞条件培养液在人体内也证实有生物学活性，可以促进秃发患者秃发区毛发的生长，并取得了良好的疗效。但人毛乳头细胞来源有限，为了产业化，我们用猪毛乳头细胞来替代人毛乳头细胞，为毛乳头细胞条件培养液产业化应用于临床治疗秃发奠定了基础。 

发明内容

为进一步验证猪毛乳头细胞生长活性蛋白的体内生物学活性，并将猪毛乳头细胞条件培养液制成冻干粉，本发明的目的在于提供一种猪毛乳头细胞培养上清的药物。初步应用于秃发患者，发现其有确切的治疗作用。 

本发明的另一目的在于提供制备猪毛乳头细胞培养上清的药物的方法。 

本发明的再一目的在于猪毛乳头细胞培养上清作药物在制备治疗斑秃的 药品中的应用。 

本发明是通过以下技术方案来实现的： 

一种治疗秃发的药物，用含人AB型血清的基础培养基培养低传代猪毛乳头细胞，收集低传代猪毛乳头细胞培养上清，将所收集上清液制备成冻干粉。 

上述低传代猪毛乳头细胞培养上清制备成冻干粉的步骤包括： 

(1)猪皮标本的处理及毛乳头分离： 

a).取健康版纳微型猪躯干部位全层猪皮后保存于4℃生理盐水中，在清洗台上用手术刀剃除猪毛，刮胡刀刮猪皮至发白，自来水冲洗；存放于加80万单位青霉素和100万单位链霉素500mL生理盐水中； 

b).在超净台上将已处理好的猪皮在不锈钢肾形弯盘中用75％酒精泡20min，75％酒精棉球擦洗3遍，然后用生理盐水反复用力冲洗5遍，每遍为5min，每一遍后均需换用新消毒的不锈钢肾形弯盘； 

c).用组织剪剪去标本边缘部分，将猪皮放在已消毒好的木板上，用手术刀分离皮下筋膜层，用眼科剪清理残留的皮下筋膜，随后进行细胞的消化分离； 

d).用组织剪将处理干净的标本剪成0.3～0.5cm宽，3～4cm长的皮条，再将皮条从真皮-皮下脂肪层交界处剪开，将位于脂肪层组织内毛囊的毛乳头置于直径为5cm的平皿中，加入0.5％分离酶浸没，将平皿放入已消毒好的不锈钢饭盒中，4℃过夜10hrs； 

e).次日再将平皿37℃热消化30min，以生理盐水将组织漂洗3次，用眼科镊将脂肪组织内残留毛囊下段挤出，用组织剪将脂肪组织剪成米粒样大小，以0.2％IV型胶原酶于平皿中37℃消化4hrs，中间时间无菌搅动一次，消化时摇动消化平皿，在倒置显微镜下观察，直到真皮鞘消化成游离细胞，而毛乳头尚未开始消化，毛乳头从蒂部游离时即可中止消化； 

f).将尚未消化组织去除，向消化液中加入等量基础培养基混合后移入50ml离心管中，以2000rpm 10min离心，倾去上清液，管底沉淀组织移入含DMEM的平皿中清洗，将其中网络的大量毛乳头洗下，洗下液体再加入50ml离心管中，以1000rpm离心5min； 

g).将清洗液移入10mL的离心管中500rpm低速离心3次，每次3min，每次缓慢吸去上清液弃之，弃去上清液中含游离真皮鞘细胞，底层混悬液中含有大量的毛乳头，少许毛球部杂质，无其他游离细胞，在直径为3cm的平皿中清洗； 

h).最后一次在10mL的离心管中以1000rpm离心5min，去上清后加入含15％胎牛血清的完全培养基后接种； 

j).将猪毛乳头按80～100个/瓶接种于50ml一次性培养瓶中，在37℃5％CO2饱和水气条件下培养，待毛乳头贴壁后，换液即可将不贴壁的毛球部、杂质去除；约2周左右细胞融合后可传代培养； 

(2)猪毛乳头的培养： 

将猪毛乳头按80～100个/瓶接种于50ml一次性培养瓶中，在37℃5％CO₂饱和水气培养箱中培养，待大部分毛乳头贴壁后，更换培养基，同时亦可将不能贴壁或尚未贴壁的毛球部、纤维组织及其他杂质除去，培养瓶中即为纯的毛乳头，约2周后细胞融合后可进行1:3传代培养； 

(3)猪毛乳头细胞条件培养液的收集过程为： 

a).培养时在50ml培养瓶中加入5ml基础培养基(DMEM)，100ml培养瓶中加入7ml基础培养基(DMEM)，3天换一次基础培养基； 

b).开启超净台并用紫外线消毒30分钟，操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上将低传代猪毛乳头细胞培养上清从培养瓶中无菌倒入50ml无菌离心管中，用旋丝口盖盖上离心管并拧紧，在离心机中离心； 

c).在超净台上打开离心管，用无菌吸管吸出离心管中的上清，移入无菌玻璃容器中，加无菌橡皮塞后，作好标记，-20℃冻存备用； 

(4)猪毛乳头细胞条件培养液的冻干过程为： 

a).冻干室紫外线消毒4小时； 

b).操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上用无菌吸管将药物分为3ml/冻干瓶，盖上瓶塞且留出冻干孔； 

c).将冻干瓶放入冻干机中； 

d).连续冻干过程： 

I     -40℃   4小时 

II    -20℃   3小时 

III   -5℃    10小时 

IV    5℃     4小时 

V     15℃    3小时 

VI    25℃    5小时 

e)在真空环境下，用手摇下压力盖，真空封包冻干瓶完成； 

f)打开冻干机冻干室门，取出冻干瓶，加瓶盖并加压封包瓶塞； 

g)贴上标签，注明标识和日期，4℃保存备用。 

治疗秃发的药物的理化特性为： 

颜色：白色； 

形态：粉末状； 

pH值：7.35； 

溶解度：每瓶用3ml生理盐水在3秒钟内可完全溶解，溶解后液体为橙红色。 

本发明的优点和产生的有益效果是： 

猪毛乳头细胞为分泌性细胞，在体外培养时可分泌许多蛋白质，这些蛋白质可促进毛囊的生长和发育，在体外实验已证明其有确切的生物学活性，但其应用于临床还未见报道，本发明在原有培养猪毛乳头细胞的基础上，改进其培养基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培养出猪毛乳头细胞，本发明收集培养过低传代猪毛乳头细胞的基础培养基，用于临床治疗秃发，观察其治疗效果，发现其有确切的治疗作用，取得了良性的经济效益和社会效益。 

应用本发明制备的药物在治疗秃发中有明显的疗效，明显优于其它药物对秃发的治疗效果，本发明用含人AB型血清的基础培养基培养猪毛乳头细 胞，较以前用小牛血清培养猪毛乳头细胞和用含人AB型血清的基础培养基培养人毛乳头细胞在技术上取得了突破，这就为本药物应用于临床奠定了基础。 

附图说明

图1秃发药物治疗前照片 

图2秃发药物治疗后照片 

具体实施方式

实施例1 

低传代猪毛乳头细胞培养上清制备成冻干粉的步骤主要分为人AB型血清制备和猪毛乳头细胞条件培养液的收集： 

(1)人AB型血清制备的步骤为： 

a)采集健康献血员全血200ml入无抗凝剂的血袋； 

b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时； 

c)2000rpm离心30分钟； 

d)用血清分离器分离人AB型血清， 

e)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，注意其上下温差应小于0.5℃； 

f)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干； 

g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中； 

h)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。 

(2)上述人AB型血清制备的步骤也可为： 

a)采集健康献血员全血200ml入无抗凝剂的血袋； 

b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时； 

c)2000rpm离心30分钟； 

d)用血清分离器分离人AB型血清，所分离的AB型血清可放入-20℃冷冻箱备用； 

e)将人AB型血清袋从-20℃冷冻箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小时； 

f)将人AB型血清室温放置2小时； 

g)将人AB型血清在37℃水箱中放置1小时； 

h)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，注意其上下温差应小于0.5℃； 

i)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干； 

j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中； 

k)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。 

(3)上述的基础培养基的制备方法： 

基础培养基：将15ml人AB型血清与85ml低糖培养基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氢钠，0.03g L-谷氨酰胺混匀后，用0.22微米孔径的微孔滤膜过滤除菌，直接使用或-20℃冻存备用。 

上述的低糖培养基(DMEM)：购自Sigma公司。Hepes：购自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清：第三军医大学西南医院输血科提供。 

(4)猪皮标本的处理及毛乳头分离： 

a).取健康版纳微型猪躯干部位全层猪皮后保存于4℃生理盐水中，在清洗台上用手术刀剃除猪毛，刮胡刀刮猪皮至发白，自来水冲洗；存放于加80万单位青霉素和100万单位链霉素500mL生理盐水中； 

b).在超净台上将已处理好的猪皮在不锈钢肾形弯盘中用75％酒精泡20min，75％酒精棉球擦洗2遍，然后用生理盐水反复用力冲洗5遍，每遍为5min，每一遍后均需换用新消毒的不锈钢肾形弯盘； 

c).用组织剪剪去标本边缘部分，将猪皮放在已消毒好的木板上，用3号刀柄和11号一次性无菌刀片手术刀分离皮下筋膜层，用眼科剪清理残留的皮下筋膜，随后进行细胞的消化分离； 

d).用组织剪将处理干净的标本剪成0.3～0.5cm宽，3～4cm长的皮条，再将皮条从真皮-皮下脂肪层交界处剪开，因生长期毛囊的毛乳头大多数位于皮下脂肪层内；将脂肪层组织置于直径为5cm的平皿中，加入0.5％分离酶(分离蛋白酶(Protease/Dispase)：购自Sigma公司，用0.01M pH7.4的PBS缓冲液配制，使用浓度为0.5％，装入无菌三角烧瓶在摇床上以115rpm摇12 小时，0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃冻存备用)浸没，将平皿放入已消毒好的不锈钢饭盒中，4℃过夜10hrs； 

e).次日再将平皿37℃热消化30min，以生理盐水将组织漂洗2次，用眼科镊将脂肪组织内残留毛囊下段挤出，此时毛囊真皮表皮完全相互分离，真皮成份的毛乳头埋藏于脂肪组织中；用组织剪将脂肪组织剪成米粒样大小，以0.2％IV型胶原酶(IV型胶原酶(Collagenase)：购自美国Sigma公司，用DMEM液配制，使用浓度为0.2％，0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃冻存备用)于平皿中37℃消化4hrs，到离心时共6～8hrs，中间时间无菌搅动一次，消化时不时摇动消化平皿，在倒置显微镜下观察，直到真皮鞘消化成游离细胞，而毛乳头尚未开始消化，毛乳头从蒂部游离，即可中止消化； 

f).将尚未消化组织去除，向消化液中加入等量基础培养基混合后移入50ml离心管中，以2000rpm 10min离心，倾去上清液，管底沉淀组织移入含DMEM的平皿中清洗，将其中网络的大量毛乳头洗下，洗下液体再加入50ml离心管中，以1000rpm离心5min； 

g).将清洗液移入10mL的离心管中500rpm低速离心3次，每次3min，每次缓慢吸去上清液弃之，此步的目的在于去除残留的IV型胶原酶，以减少其对毛乳头贴壁的影响，同时用低速离心也可去除游离在真皮鞘中的其他散细胞，因毛乳头体积大，易于沉淀于管底。弃去上清液中含游离真皮鞘细胞，底层混悬液中含有上千计的毛乳头，少许毛球部杂质，无其他游离细胞，在直径为3cm的平皿中清洗； 

h).最后一次在10mL的离心管中以1000rpm离心5min，去上清后加入含15％胎牛血清的完全培养基后接种； 

j).将猪毛乳头按80～100个/瓶接种于50ml一次性培养瓶中，在37℃ 5％CO2饱和水气条件下培养，待毛乳头贴壁后，换液即可将不贴壁的毛球部、杂质去除；约2周左右细胞融合后可传代培养； 

(5)猪毛乳头的培养： 

将猪毛乳头按80～100个/瓶接种于50ml一次性培养瓶中，在37℃ 5％CO₂ 饱和水气培养箱中培养，待大部分毛乳头贴壁后，更换培养基，同时亦可将不能贴壁或尚未贴壁的毛球部、纤维组织及其他杂质除去，培养瓶中即为纯的毛乳头，约2周后细胞融合后可进行1:3传代培养； 

(6)猪毛乳头细胞条件培养液的收集过程为： 

a).培养时在50ml培养瓶中加入5ml基础培养基(DMEM)，100ml培养瓶中加入7ml基础培养基(DMEM)，3天换一次基础培养基； 

b).开启超净台并用紫外线消毒30分钟，操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上将低传代猪毛乳头细胞培养上清从培养瓶中无菌倒入50ml无菌离心管中，用旋丝口盖盖上离心管并拧紧，在离心机中离心； 

c).在超净台上打开离心管，用无菌吸管吸出离心管中的上清，移入无菌玻璃容器中，加无菌橡皮塞后，作好标记，-20℃冻存备用；(7)猪毛乳头细胞条件培养液的冻干过程为： 

b)冻干室紫外线消毒4小时； 

b).操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上用无菌吸管将药物分为3ml/冻干瓶，盖上瓶塞且留出冻干孔； 

c).将冻干瓶放入冻干机中； 

d).连续冻干过程： 

I     -40℃    4小时 

II    -20℃    3小时 

III   -5℃     10小时 

IV    5℃      4小时 

V     15℃     3小时 

VI    25℃     5小时 

e)在真空环境下，用手摇下压力盖，真空封包冻干瓶完成； 

f)打开冻干机冻干室门，取出冻干瓶，加瓶盖并加压封包瓶塞； 

g)贴上标签，注明标识和日期，4℃保存备用。 

(8)临床使用时，冻干粉的溶解过程： 

药物的临床应用 

(1)药物的配制：每瓶用3ml生理盐水溶解(恢复冻干前原始浓度)，溶解后的橙红色溶液即为治疗秃发的药物。 

(2)治疗秃发的药物的临床应用及观察过程： 

选择直径在5厘米以下的秃发患部，常规消毒患部皮肤后皮下多点注射，每周1次，每个患部每次最多3ml，共4次，治疗完成后观察2月。 

试验例 

(1)猪DPCCM治疗组：选择50例年龄在12～64岁的秃发患者，用前作皮内注射试验，对皮试阴性的患者，选择直径在5厘米以下的秃发患部，常规消毒患部皮肤后皮下多点注射，每周1次，每个患部每次最多3ml，共4次，治疗完成后观察2月。 

(2)人DPCCM治疗组：选择50例年龄在12～64岁的秃发患者，选择直径在5厘米以下的秃发患部，常规消毒患部皮肤后皮下多点注射，每周1次，每个患部每次最多3ml，共4次，治疗完成后观察2月。 

(3)空白对照组：选择药物治疗组中多发性秃发患者10例，选择与药物治疗部位距离在5cm以上的患部作为空白自身对照患部，用3mL生理盐水，常规消毒患部皮肤后皮下多点注射，每周1次，共4次，治疗完成后观察2月。 

(4)治疗效判断标准：病损部皮肤新生终毛大于20根/cm²为治愈，少于20根/cm²为有效，治疗后无改变为无效。 

(5)药物治疗秃发的治愈率和有效率比较(见表1) 

表1各组秃发治疗2月后情况(％) 

^*与空白对照组比较，P＜0.05， 

^*与人DPCCM治疗组比较，P＞0.05 

试验例2 

(1)药物的生物安全性实验 

①小鼠急性毒性试验：我们选用7～9周龄、体重为18～22g的昆明种小鼠。按预试验公比0.8设立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。单次腹腔注射，药后立即观察、记录动物的中毒反应、死亡情况及时间，连续观察14天。 

②家兔热原试验：选3只体重为1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳静脉注射给药。测量家兔肛门体温，深度为6厘米，以后每隔1小时测量体温1次，共3次。 

③细菌培养：随机抽取5支冻干瓶，无菌生理盐水溶解，4道划线法接种于普通血平板上，培养48小时后观察结果。 

④真菌培养：随机抽取5支冻干瓶，无菌生理盐水溶解，接种于沙堡氏培养基上，培养10日后观察结果。 

结果：小鼠急性毒性试验显示在腹腔注射不同剂量猪毛乳头细胞条件培养液样品溶液后，各组动物未发现明确的中毒症状，在整个试验期限内无动物死亡或其它异常征象。家兔热原试验显示在耳静脉注射猪毛乳头细胞条件培养液样品溶液后，各动物的体温变化均符合热原试验的要求。细菌和真菌培养均未见细菌和真菌生长。 

(2)典型病例介绍： 

患者XX，女性，26岁，头部出现斑块状秃发1月来我院诊治，图1为治疗前，图2为药物治疗后1月照片，可以看见有大约30根/cm²终毛长出。 

从临床应用中，我们认识到：毛乳头在毛囊的生长发育、周期调控及维持毛发生长中起主导作用。毛乳头的功能障碍是导致毛囊周期失衡和脱发的主要原因。目前对毛乳头细胞的研究已发现一些活性蛋白对毛囊的生长有调节作用。在前期的研究中，我们证实了毛乳头细胞在体外凝集性生长状态下较非凝集性生长状态下其生物学功能及诱导毛囊形成的能力均显著增强，并在裸鼠体内用人头皮凝集性生长状态的毛乳头细胞与毛囊上皮细胞共同移植 成功地诱导了分化成熟的毛囊结构，提示毛乳头细胞在凝集性生长状态下可以表达某种具有诱导毛囊生长的蛋白，而在非凝集性生长状态这种特性则减弱甚至消失。也就是说，毛乳头细胞的凝集性生长状态可能与其调控毛囊生长功能紧密关联，我们在体外试验也证实药物可使非凝集性生长状态的毛乳头细胞向凝集性生长状态转化。我们收集毛乳头细胞在凝集性生长状态下的培养液并制成冻干粉，在确定其生物安全性得到保证且符合伦理的前提下，用于治疗秃发患者，进一步揭示药物是否有促进毛囊生长的作用。在前期的研究工作中，我们用人DPCCM治疗秃发，发现其有确切的治疗作用，但人毛乳头细胞来源有限，要产业化应用于临床比较困难，我们用猪毛乳头细胞来替代人毛乳头细胞，可以有效解决毛乳头细胞来源有限这一瓶颈，为DPCCM产业化应用于临床奠定了基础。 

猪DPCCM在通过生物安全鉴定后，我们在患者知情同意的情况下应用于患部。50例猪DPCCM治疗的秃发患者中，除3例无效外其余均有一定疗效，这与人DPCCM治疗组比较取得了相似的疗效。 

Claims (1)

1.一种低传代猪毛乳头细胞培养上清液冻干粉，其制备步骤是：

(1)猪皮标本的处理及毛乳头分离：

a).取健康版纳微型猪躯干部位全层猪皮后，保存于4℃生理盐水中，在清洗台上用手术刀剃除猪毛，刮胡刀刮猪皮至发白，自来水冲洗；存放于加80万单位青霉素和100万单位链霉素500mL生理盐水中；

b).在超净台上将已处理好的猪皮在不锈钢肾形弯盘中用75％酒精泡20min，75％酒精棉球擦洗3遍，然后用生理盐水反复用力冲洗5遍，每遍为5min，每一遍后均需换用新消毒的不锈钢肾形弯盘；

c).用组织剪剪去标本边缘部分，将猪皮放在已消毒好的木板上，用手术刀分离皮下筋膜层，用眼科剪清理残留的皮下筋膜，随后进行细胞的消化分离；

d).用组织剪将处理干净的标本剪成0.3～0.5cm宽，3～4cm长的皮条，再将皮条从真皮-皮下脂肪层交界处剪开，将位于脂肪层组织内毛囊的毛乳头置于直径为5cm的平皿中，加入0.5％分离酶浸没，将平皿放入已消毒好的不锈钢饭盒中，4℃过夜10hrs；

e).次日再将平皿37℃热消化30min，以生理盐水将组织漂洗3次，用眼科镊将脂肪组织内残留毛囊下段挤出，用组织剪将脂肪组织剪成米粒样大小，以0.2％IV型胶原酶于平皿中37℃消化4hrs，中间时间无菌搅动一次，消化时摇动消化平皿，在倒置显微镜下观察，直到真皮鞘消化成游离细胞，而毛乳头尚未开始消化，毛乳头从蒂部游离，即可中止消化；

f).将尚未消化组织去除，向消化液中加入等量基础培养基混合后移入50ml离心管中，以2000rpm离心10min，倾去上清液，管底沉淀组织移入含DMEM的平皿中清洗，将其中网络的大量毛乳头洗下，洗下液体再加入50ml离心管中，以1000rpm离心5min； 

g).将清洗液移入10mL的离心管中500rpm低速离心3次，每次3min，每次缓慢吸去上清液弃之，弃去上清液中含游离真皮鞘细胞，底层混悬液中含有上千计的毛乳头，少许毛球部杂质，无其他游离细胞，在直径为3cm的平皿中清洗；

h).最后一次在10mL的离心管中以1000rpm离心5min，去上清后加入含15％胎牛血清的完全培养基后接种；

i).将猪毛乳头按80～100个/瓶接种于50ml一次性培养瓶中，在37℃5％ CO₂饱和水气条件下培养，待毛乳头贴壁后，换液即可将不贴壁的毛球部、杂质去除；约2周左右细胞融合后可传代培养；

(2)猪毛乳头的培养：

将猪毛乳头按80～100个/瓶接种于50ml一次性培养瓶中，在37℃5％ CO₂饱和水气培养箱中培养，待大部分毛乳头贴壁后，更换培养基，同时亦可将不能贴壁或尚未贴壁的毛球部、纤维组织及其他杂质除去，培养瓶中即为纯的毛乳头，约2周后细胞融合后可进行1∶3传代培养；

(3)猪毛乳头细胞条件培养液的收集过程为：

a).培养时在50ml培养瓶中加入5ml基础培养基(DMEM)，100ml培养瓶中加入7ml基础培养基(DMEM)，3天换一次基础培养基；

b).开启超净台并用紫外线消毒30分钟，操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上将低传代猪毛乳头细胞培养上清从培养瓶中无菌倒入50ml无菌离心管中，用旋丝口盖盖上离心管并拧紧，在离心机中离心；

c).在超净台上打开离心管，用无菌吸管吸出离心管中的上清，移入无菌玻璃容器中，加无菌橡皮塞后，作好标记，-20℃冻存备用；(4)猪毛乳头细胞条件培养液的冻干过程为：

a).冻干室紫外线消毒4小时； 

b).操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上用无菌吸管将药物分为3ml/冻干瓶，盖上瓶塞且留出冻干孔；

c).将冻干瓶放入冻干机中；

d).连续冻干过程：

I    -40℃    4小时

II   -20℃    3小时

III  -5℃     10小时

IV   5℃      4小时

V    15℃     3小时

VI   25℃     5小时

e)在真空环境下，用手摇下压力盖，真空封包冻干瓶完成；

f)打开冻干机冻干室门，取出冻干瓶，加瓶盖并加压封包瓶塞；

g)贴上标签，注明标识和日期，4℃保存备用。 

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