CN104911142B - 一种鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养方法及应用，属于细胞生物学技术领域。本发明所提供的方法为在体式显微镜下分离鹿皮中的完整毛囊，然后用胶原酶消化毛囊，切下含毛乳头的毛囊球部，剥离毛根鞘，获得毛乳头，收集毛乳头，再用胶原酶消化基底膜，培养后获得毛乳头细胞。本发明方法培养成功率非常高，并且显著提高了毛乳头的贴壁率和细胞产量。利用本发明培养方法可以在4小时左右获得较纯的真皮毛乳头100个左右，将毛乳头进行接种培养7天左右即可获得大量的毛乳头细胞，适用于鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养。

Description

一种鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养方法及应用

技术领域

本发明涉及一种鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养方法及应用，属于细胞生物学技术领域。

背景技术

目前，毛乳头细胞培养技术主要针对人头皮的毛乳头细胞以及鼠胡须的毛乳头细胞，还没有针对鹿皮肤毛乳头细胞的培养技术，与人的毛发、鼠的胡须相比，鹿毛较细，鹿的真皮毛乳头较小，而且鹿的皮肤结构与人的头皮也存在着一定的差异，因此，现有的真皮毛乳头细胞的培养方法不适合于鹿的皮肤。现有的毛乳头细胞培养方法主要有显微解剖法，酶消化法，酶消化过滤法等。显微解剖法分离的毛乳头贴壁率很低，贴壁时间长，培养的成功率也较低。酶消化法对含毛囊的皮肤组织直接消化，产生很多皮肤组织碎片，使毛乳头很难收集，导致对毛乳头的消化程度不均一，影响毛乳头的收集。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养方法，该方法是在体式显微镜下分离鹿皮中的完整毛囊，然后用胶原酶消化毛囊，切下含毛乳头的毛囊球部，剥离毛根鞘，获得毛乳头，收集毛乳头，再用胶原酶消化基底膜，培养后获得毛乳头细胞。

所述方法步骤如下：

1)利用体式显微镜分离鹿皮中的毛囊，获得完整毛囊；

2)利用胶原酶消化步骤1)所得的完整毛囊，切下含毛乳头的毛囊球部，剥离毛根鞘，获得毛乳头；

3)收集步骤2)中所得的毛乳头，再用胶原酶消化基底膜，然后利用添加FBS的DMEM培养基进行培养，获得毛乳头细胞。

优选地，步骤1)所述分离，是将鹿的皮条沿毛囊生长方向切成薄片，从薄片中拔出完整毛囊。

优选地，步骤2)所述胶原酶，为Ⅱ型胶原酶。

优选地，步骤2)所述消化，为37℃消化30min。

优选地，步骤3)所述胶原酶，为Ⅳ型胶原酶。

优选地，步骤3)所述消化，为37℃消化15～20min。

优选地，步骤3)所述培养，是利用添加FBS的DMEM培养基在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下进行培养。

优选地，所述方法具体步骤为：

1)将活体采集的鹿的皮肤切成皮条经过消毒处理后，沿毛囊生长方向切成薄片，在体式显微镜下，从薄片中拔出完整毛囊，获得完整毛囊；

2)利用Ⅱ型胶原酶在37℃下消化步骤1)所得的完整毛囊30min，切下含毛乳头的毛囊球部，剥离毛根鞘，获得毛乳头；

3)收集步骤2)中所得的毛乳头，再用Ⅳ型胶原酶于37℃消化基底膜15～20min，然后利用添加FBS的DMEM培养基在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下进行培养，获得毛乳头细胞。

以上所述任一方法，适用于鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养。

本发明有益效果：

本发明公开了鹿皮肤毛乳头细胞的培养方法，改进了原有的显微解剖法，增加了两步酶消化的过程，将显微解剖与两步酶消化相结合，解决了现有方法的技术缺陷，不仅能够提高分离效率，而且能够提高毛乳头细胞团的贴壁率，从而提高培养的成功率。利用本发明培养方法可以在4小时左右获得较纯的真皮毛乳头100个左右，将毛乳头进行接种培养7天左右即可获得大量的毛乳头细胞。

附图说明

图1完整毛囊。

图2完整毛乳头。

图3毛乳头细胞从毛乳头细胞团中长出。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：利用人头皮毛乳头细胞的方法分离培养鹿皮毛乳头细胞

1、活体采集鹿的皮肤，无菌处理。

2、在真皮一皮下组织交界处剪开。显微镊轻压含有毛囊中下部的皮下脂肪以部分挤出毛囊切缘尖端，然后，用另一把显微镊夹持切缘尖端将毛囊中下部从皮下脂肪中完整拔出。拔出的毛囊置于培养皿中,内盛无菌D一hanks液。

3、显微镜下,在毛囊近毛球上方用显微镊夹持,由于上皮部与真皮部连接较紧密,较松散的毛母质细胞及黑色素细胞等只能向毛球部游走聚集,这使得毛球部形成一内部富含压力的球形。此时用1ml注射器的针尖(针尖已被弯成90度)将毛球近毛乳头根茎部的真皮鞘切开,由于压力的释放将毛乳头完整挤出。最后,用1ml注射器的针尖将毛乳头根茎部完全切断,并用tip头捡拾游离的毛乳头。

4、接种到35mm的培养皿。

5、37℃，5％CO2，饱和湿度的条件下进行培养。

实施例2：

具体步骤如下：

1、将活体采集的鹿的皮肤切成0.5x3cm的皮条1-2块，带到实验室，用PBS清洗掉组织块上的血液，进行消毒处理。

2、将皮条沿毛囊生长方向切成0.7mm的薄片，在体式显微镜下，分别从每个薄片中拔出完整毛囊，并收集到培养皿内(图1)。

3、用100U/ml的Ⅱ型胶原酶于37℃消化毛囊30min。弃掉消化液，加入DMEM培养基。

4、于体式显微镜下，用1mL注射器针尖的楔形面，切下含毛乳头的毛囊球部，用显微镊子翻开毛根鞘，使毛乳头暴露，用注射器针尖切开毛乳头与毛基质和/或毛根鞘的连接(图2)。

5、用电动捡胚针收集分离的毛乳头。

6、用2mg/mL的Ⅳ型胶原酶37℃消化15-20min，至基底膜大部分被消化后，终止消化。

7、并接种于35mm培养皿等培养装置内，每个35mm培养皿接种毛乳头5-10个。

8、利用添加15％FBS的DMEM培养基在37℃，5％CO2，饱和湿度的条件下进行培养。

9、7天后即可获得大量纯度较高的毛乳头细胞(图3)。

将实施例1-2培养方法的效果进行比较，比较结果如表1所示：

表1实施例1和实施例2培养方法效果的对比

	获得细胞数量个	贴壁率％	培养成功率％
				实施例1	5×10<sup>6</sup>	40-50％	80％
实施例2	1×10<sup>7</sup>	90-100％	100％

从表1可以看出，利用本发明所提供的方法，可以获得1×10⁷个细胞，可达百万个，而现有方法仅能获得5×10⁶个细胞，仅几十万个，本发明方法获得细胞数量显著高于现有方法，并且本发明方法贴壁率可达90-100％，而现有方法仅能达到40-50％，本发明方法培养成功率高达100％，而利用现有技术培养的成功率仅为80％，由此可见，本发明方法在获得的细胞数量、贴壁率及培养成功率等方面均明显优于现有方法。

本发明将显微解剖与两步酶消化相结合，不仅能够提高分离效率，而且能够提高毛乳头细胞团的贴壁率，从而提高培养的成功率。利用本发明培养方法可以在4小时左右获得较纯的真皮毛乳头100个左右，将毛乳头进行接种培养7天左右即可获得大量的毛乳头细胞。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种鹿真皮毛乳头细胞的体外分离培养方法，其特征在于，步骤如下：

1)利用体式显微镜分离鹿皮肤中的毛囊，获得完整毛囊；

2)利用Ⅱ型胶原酶消化步骤1)所得的完整毛囊，消化条件为37℃消化30min，切下含毛乳头的毛囊球部，剥离毛根鞘，获得毛乳头；

3)收集步骤2)中所得的毛乳头，再用Ⅳ型胶原酶消化基底膜，消化条件为37℃消化15～20min，然后利用DMEM+15％FBS培养基进行培养，获得毛乳头细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述分离，是将鹿的皮条沿毛囊生长方向切成薄片，从薄片中拔出完整毛囊。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述培养，是在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下进行培养。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤为：

1)将活体采集的鹿的皮肤切成皮条经过消毒处理后，沿毛囊生长方向切成薄片，在体式显微镜下，从薄片中拔出完整毛囊，获得完整毛囊；

2)利用Ⅱ型胶原酶在37℃下消化步骤1)所得的完整毛囊30min，切下含毛乳头的毛囊球部，剥离毛根鞘，获得毛乳头；

3)收集步骤2)中所得的毛乳头，再用Ⅳ型胶原酶于37℃消化基底膜15～20min，然后利用添加FBS的DMEM培养基在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下进行培养，获得毛乳头细胞。