CN110037979B - 含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉，冻干粉的组成成分为：干细胞外泌体、甘露聚糖、透明质酸钠、人参提取物、神经酰胺、烟酰胺和无菌水。本发明采用上述含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法，具有加速皮肤修复、淡化细纹、延缓衰老的功效。
Description
技术领域
本发明涉及医学美容技术领域，特别是涉及一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法。
背景技术
皮肤覆于机体的表面，富含血管、神经、汗腺等组织。皮肤作为第一道天然屏障直接与外界接触，能够防止微生物入侵、紫外线损伤等外部刺激。随着化妆品的过度使用，很多人出现了脸部皮肤角质层变薄，易过敏，红肿，易损伤等症状，然而目前市面上没有一款有效的修护产品。
干细胞疗法在再生医学领域表现出巨大潜力，尤其是脐带间充质干细胞由于其来源广泛，提取方便，低免疫原性等优势受到了越来越多人的关注。但是干细胞疗法由于制备过程繁琐、保存困难、有创移植等因素限制其大规模的推广使用。
外泌体属于天然的脂质体，与人体具有良好的生物相容性。外泌体直径为30-100nm，是由细胞分泌的一种囊泡，可以直接被靶细胞摄入，广泛参与细胞间的交流活动。但外泌体种类繁多，成分和作用机制目前仍不明确。最新研究发现表达CD63、CD81的间充质干细胞外泌体囊泡能够通过Wnt4促进b-连环蛋白核转移和增强皮肤细胞的增殖和迁移活性，促进皮肤细胞增殖并抑制细胞凋亡。同时，还能促进血管新生，调节炎症反应，抑制瘢痕形成。
发明内容
本发明的目的是提供一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法，具有加速皮肤修复、淡化细纹、延缓衰老的功效。
为实现上述目的，本发明提供了一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉，冻干粉的组成成分为：干细胞外泌体、甘露聚糖、透明质酸钠、人参提取物、神经酰胺、烟酰胺和无菌水。
优选的，冻干粉的组成成分及比例为：0.01-0.05％干细胞外泌体、6-8％甘露聚糖、0.5-1％透明质酸钠、0.1-1％人参提取物、0.1-1％神经酰胺、0.1-1％烟酰胺、其余成分为无菌水。
优选的，干细胞外泌体从培养过间充质干细胞的培养液中提取而得。
优选的，间充质干细胞从羊脐带中提取，细胞培养方式为组织贴壁法培养，操作步骤如下：
1)无菌收集检验检疫合格的羊脐带；
2)清洗羊脐带上的残留血液，小心剔除羊脐带中的两条动脉和一条静脉后分离出华通氏胶，将华通氏胶剪成大小为2mm左右的小块；
3)将华通氏胶的小块接种于无血清羊脐带间充质干细胞培养液中，放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，三天后半量换液，此后根据细胞生长情况更换培养基；
4)15天后，间充质干细胞从华通氏胶小块中爬出，记为P0代，当细胞达到90％融合度时，用0.25％胰酶消化并1：2传代，记为P1代，以此类推。
优选的，将步骤4)获得的间充质干细胞培养液通过800g，离心30min，得到去除细胞碎片的间充质干细胞上清液。
优选的，步骤4)中传代培养的间充质干细胞代数小于5代。
优选的，获得干细胞外泌体的方法为将去除细胞碎片的间充质干细胞上清液用标记有抗CD63、CD81的磁珠分选，然后洗脱除去磁珠即得，操作步骤如下：
1)间充质干细胞上清液与标记有CD63、CD81的磁珠共孵育，加入磁珠分选柱；
2)流下的细胞上清为阴性外泌体，吸附在分选柱上的为阳性外泌体。然后使用推塞冲出分选柱中的外泌体。
3)加入磁珠洗脱液重新孵育后再次通过磁珠分选柱，收集流下的细胞上清即为分选得到的阳性外泌体。
一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，步骤如下：将干细胞外泌体、甘露聚糖、透明质酸钠、人参提取物、神经酰胺和烟酰胺混合后，采用真空冷冻干燥技术冻干。
优选的，按国家相关标准进行检验，合格后封装。
本发明采用上述含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法，具有加速皮肤修复、淡化细纹、延缓衰老的功效。通过磁珠分选技术分选出表达CD63、CD81的外泌体，分选出的外泌体能够携带信号物质轻易穿透皮肤发挥良好的皮肤修复作用，此外，通过制成冻干粉达到了长时间保护外泌体生物活性的目的。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是本发明含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法实施例中收集的羊脐带(A)、华通氏胶(B)、间充质干细胞从华通氏胶中爬出(C)的示意图；
图2是本发明含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法实施例中获取的干细胞上清及磁珠分选得到的外泌体电镜图；
图3是本发明含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法实施例中制作的冻干粉的形态。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施方式做进一步的说明。
一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉，冻干粉的组成成分为：干细胞外泌体、甘露聚糖、透明质酸钠、人参提取物、神经酰胺、烟酰胺和无菌水。
冻干粉的组成成分及比例为：0.01-0.05％干细胞外泌体、6-8％甘露聚糖、0.5-1％透明质酸钠、0.1-1％人参提取物、0.1-1％神经酰胺、0.1-1％烟酰胺、其余成分为无菌水。
干细胞外泌体从培养过间充质干细胞的培养液中提取而得。
图1是本发明含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法实施例中收集的羊脐带(A)、华通氏胶(B)、间充质干细胞从华通氏胶中爬出(C)的示意图，如图1所示，间充质干细胞从羊脐带中提取，细胞培养方式为组织贴壁法培养，操作步骤如下：
1)无菌收集检验检疫合格的羊脐带；
2)清洗羊脐带上的残留血液，小心剔除羊脐带中的两条动脉和一条静脉后分离出华通氏胶，将华通氏胶剪成大小为2mm左右的小块；
3)将华通氏胶的小块接种于无血清羊脐带间充质干细胞培养液中，放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，三天后半量换液，此后根据细胞生长情况更换培养基；
4)15天后，间充质干细胞从华通氏胶小块中爬出，记为P0代，当细胞达到90％融合度时，用0.25％胰酶消化并1：2传代，记为P1代，以此类推。
将步骤4)获得的间充质干细胞培养液通过800g，离心30min，得到去除细胞碎片的间充质干细胞上清液。
步骤4)中传代培养的间充质干细胞代数小于5代。
图2是本发明含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法实施例中获取的干细胞上清及磁珠分选得到的外泌体电镜图，图3是本发明含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法实施例中制作的冻干粉的形态，如图所示，获得干细胞外泌体的方法为将去除细胞碎片的间充质干细胞上清液用标记有抗CD63、CD81的磁珠分选，然后洗脱除去磁珠即得，操作步骤如下：
1)间充质干细胞上清液与标记有CD63、CD81的磁珠共孵育，加入磁珠分选柱；
2)流下的细胞上清为阴性外泌体，吸附在分选柱上的为阳性外泌体，然后使用推塞冲出分选柱中的外泌体。
3)加入磁珠洗脱液重新孵育后再次通过磁珠分选柱，收集流下的细胞上清即为分选得到的阳性外泌体。通过流式分析可知阳性外泌体具有干性。
一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，步骤如下：将干细胞外泌体、甘露聚糖、透明质酸钠、人参提取物、神经酰胺和烟酰胺混合后，采用真空冷冻干燥技术冻干。按国家相关标准进行检验，合格后封装。
实施例一
冻干粉的组成成分及比例为：0.01％干细胞外泌体、6％甘露聚糖、0.5％透明质酸钠、0.1％人参提取物、0.1％神经酰胺、0.1％烟酰胺、其余成分为无菌水。
实施例二
冻干粉的组成成分及比例为：0.05％干细胞外泌体、8％甘露聚糖、1％透明质酸钠、1％人参提取物、1％神经酰胺、1％烟酰胺、其余成分为无菌水。
实施例三
冻干粉的组成成分及比例为：0.04％干细胞外泌体、7％甘露聚糖、0.8％透明质酸钠、0.7％人参提取物、0.6％神经酰胺、0.8％烟酰胺、其余成分为无菌水。
下面用试验数据说明本发明含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法取得的技术效果。
(1)在体外培养27盘角质细胞(接种6代细胞)，分成三组，第一组、第二组和第三组中所用冻干粉均以实施例三为基础进行试验。其中，第一组添加含有干细胞外泌体的冻干粉，第二组添加不含干细胞外泌体的冻干粉，第三组不做处理。将第一组、第二组和第三组分别在培养1天、3天、5天进行细胞计数，数据如下：
| 组别 | 1天 | 3天 | 5天 |
| 第一组 | 8万 | 16.5万 | 28.5万 |
| 第二组 | 6万 | 12.3万 | 15万 |
| 第三组 | 6.5万 | 11万 | 15.5万 |
将得到的实验数据使用t检验进行组间比较，并使用SPSS 20.0软件进行统计学处理。通过计算表明上述实验数据具有明显的统计学差异，含干细胞外泌体的冻干粉对角质细胞具有良好的增殖作用。
(2)选取SPF级6周龄雄性C57BL/6小鼠12只，用烙铁分别在耳朵上烫伤，制作小鼠烫伤模型。随后将含外泌体的冻干粉涂抹在一侧烫伤耳朵处，另一侧不做处理并做好标记。每天早晚各涂抹一次。分别在涂抹后0、2、4、6d观察创面愈合情况，并应用实时荧光定量PCR法检测伤口处的IFN-γ、TNF-α和TGF-β、VEGF的表达。
荧光定量PCR显示在0、2、4、6天，涂抹含有外泌体冻干粉一侧的耳朵生长因子TGF-β、VEGF的表达量明显高于对照侧，并且在第6天涂抹含有外泌体冻干粉侧的耳朵基本愈合。结果表明该冻干粉具有良好的促进行口愈合的功效。
因此，本发明采用上述含羊间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法，具有加速皮肤修复、淡化细纹、延缓衰老的功效。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，冻干粉的组成成分为：干细胞外泌体、甘露聚糖、透明质酸钠、人参提取物、神经酰胺、烟酰胺和无菌水；将干细胞外泌体、甘露聚糖、透明质酸钠、人参提取物、神经酰胺和烟酰胺混合后，采用真空冷冻干燥技术冻干；
冻干粉的组成成分及比例为：0.01-0.05％干细胞外泌体、6-8％甘露聚糖、0.5-1％透明质酸钠、0.1-1％人参提取物、0.1-1％神经酰胺、0.1-1％烟酰胺、其余成分为无菌水；
间充质干细胞从羊脐带中提取，细胞培养方式为组织贴壁法培养，操作步骤如下：
1)无菌收集检验检疫合格的羊脐带；
2)清洗羊脐带上的残留血液，小心剔除羊脐带中的两条动脉和一条静脉后分离出华通氏胶，将华通氏胶剪成大小为2mm的小块；
3)将华通氏胶的小块接种于无血清羊脐带间充质干细胞培养液中，放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，三天后半量换液，此后根据细胞生长情况更换培养基；
4)15天后，间充质干细胞从华通氏胶小块中爬出，记为P0代，当细胞达到90％融合度时，用0.25％胰酶消化并1：2传代，记为P1代，以此类推；
获得干细胞外泌体的方法为将去除细胞碎片的间充质干细胞上清液用标记有抗CD63、CD81的磁珠分选，然后洗脱除去磁珠即得，操作步骤如下：
1)间充质干细胞上清液与标记有CD63、CD81的磁珠共孵育，加入磁珠分选柱；
2)流下的细胞上清为阴性外泌体，吸附在分选柱上的为阳性外泌体，然后使用推塞冲出分选柱中的外泌体；
3)加入磁珠洗脱液重新孵育后再次通过磁珠分选柱，收集流下的细胞上清即为分选得到的阳性外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，干细胞外泌体从培养过间充质干细胞的培养液中提取而得。
3.根据权利要求1所述的一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，传代培养的间充质干细胞代数小于5代。
4.根据权利要求3所述的一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于：将步骤4)获得的间充质干细胞培养液通过800g，离心30min，得到去除细胞碎片的间充质干细胞上清液。
5.根据权利要求1所述的一种含羊间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于：按国家相关标准进行检验，合格后封装。
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