CN114053336B - 一种nk细胞冻干粉制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用分离获得的PBMC进行诱导培养获得NK细胞，扩大培养后提取NK细胞外泌体，与土霉素与龙仙草提取液混合，通过冷冻真空干燥获得冻干粉，所述的冻干粉可以显著抑制VSV的侵染，减少带状疱疹的病灶，缩短病程，改善预后，达到了传统治方法预料不到的效果。

Description

一种NK细胞冻干粉制备方法及其应用
技术领域
本发明为免疫治疗领域，具体涉及NK细胞外泌体的冻干粉用于制备治疗病毒感染的医药领域。
背景技术
带状疱疹是由水痘带状疱疹病毒(VZV)引起的一种病毒性皮肤病。患处常首先出现潮红斑，很快出现粟粒至黄豆大小的丘疹，簇状分布而不融合，继之迅速变为水疱，疱壁紧张发亮，疱液澄清，外周绕以红晕，各簇水疱群间皮肤正常；皮损沿某一周围神经呈带状排列，多发生在身体的一侧，一般不超过正中线。带状疱疹会有明显的疼痛感，影响正常生活，如果不及时控制，会有细菌感染、后遗神经痛、发角膜炎、角膜溃疡、结膜炎、毒性脑炎和脑膜炎等并发症。
人类的免疫系统是非常复杂的，它有着大量不同的细胞具有各种各样的功能，这确保侵入的微生物如病毒或细菌能够迅速地使之无害并保持整个机体的健康。自然杀伤细胞（Natural killercell，NK细胞）是天然免疫系统中最重要的细胞，发挥着举足轻重的作用。NK细胞承担着人体第一道天然防线的作用，可清除受感染细胞，防止病毒扩散。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。机体抗VZV感染的免疫中，细胞免疫起重要作用，NK细胞可特异性杀死VZV感染细胞；在抗体参予下，介导ADCC效应亦可将VZV感染细胞裂解。NK细胞外泌体由NK细胞释放，具有NK细胞的特性和功能，NK细胞外泌体制备成冻干粉，可以长期储存，保持功能特性不受影响。
现治疗带状疱疹的药物主要为广谱抗病毒药物阿昔洛韦等。广谱抗病毒药物，治疗效果较差、治疗周期长、对肾功能有影响。急性炎症期可配合使用大剂量糖皮质激素抑制炎症过程，但对慢性疼痛基本无效，且大剂量激素可导致很多并发症。现有的治疗方法存在疗效差、愈后差、易导致后遗症如神经痛的发生等问题。针对现有技术存在的上述问题，本发明将开发一种利用NK细胞冻干粉治疗带状疱疹的新产品和方法。
发明内容
本发明第一个方面提供一种包含NK细胞外泌体的冻干粉，所述的冻干粉还包括土霉素以及龙仙草提取液。
本发明的第二个方面是提供一种NK细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的NK细胞冻干粉制剂包括NK细胞外泌体、土霉素以及龙仙草提取液。
在一个具体的实施例中，所述的NK细胞外泌体的提取方式为：1）CD16单抗和RetroNctin预处理培养瓶；2）分离PBMC；3）用含有IFN-γ、IL-2、IL-21、IL-15和灭活血浆的培养基诱导培养；4）扩增培养后收集培养上清中的外泌体。在另外一个具体的实施例中，所述的预处理包括将CD16单抗与RetroNctin溶于 D-PBS中，转移至T75培养瓶中，37℃避光放置3小时，或4℃放置过夜；
在另外一个具体的实施例中，所述PBMC的分离步骤为1）：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用；2）将血液倒入50ml离心管内，配平，700g/min 离心 20 min（降速最慢），收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用；3）上述血液离心后的下层加入D-PBS混匀，定容50ml，各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min（缓升缓降）后，离心管中由上至下分为四层，其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层； 4）收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
在另外一个具体的实施例中， NK细胞的诱导培养步骤为：1）NK细胞培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、IL-2、IL-21和IL-15及5ml上述灭活的血浆；2）NK细胞培养：将上述得到的细胞用NK细胞培养液重悬，置于恒温培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养；3）视生长情况，适量的补充新鲜的NK细胞培养液进行培养。
在另外一个具体的实施例中，所述的龙仙草提取液制备方法为：步骤一：取龙仙草研磨至粉末，加入粉末质量2倍的60％的乙醇溶剂浸泡4小时以上，加热回流提取1个小时，过滤，合并提取液，获得初次提取液。 步骤二：初次提取液加水稀释至2倍量体积，调节pH值至8，离心机离心，4000rpm，60min,离心后收集上清，用0 .2um的微孔滤膜过滤，获得龙仙草提取液。
在另外一个具体的实施例中，所述的NK细胞冻干粉的制备方法为：1）每1000毫升NK细胞外泌体加入50克土霉素和100毫升龙仙草提取液，混匀；2）将步骤5的溶液灌装于无菌的西林瓶内，每瓶4ml；3）：将产品从常温降至-80±2℃；4）：至产品完全冻结，抽真空；5）逐渐升华干燥，温度升至35℃左右，水分控制在5%以下；6）检验包装。
本发明的第三个方面提供NK细胞冻干粉在制备治疗病毒感染的药物中的应用；在一个具体的实施中，所述的NK细胞冻干粉为本发明第一个方面的所述的NK细胞冻干粉或本发明第二个方面所述的方法制备获得的冻干粉；在另外一个具体的实施例中，所述的病毒感染为水痘带状疱疹病毒。
本发明的有益效果是利用分离获得的PBMC进行诱导培养获得NK细胞，扩大培养后提取细胞外泌体，与土霉素与龙仙草提取液混合，通过冷冻真空干燥获得冻干粉，所述的冻干粉可以显著抑制VSV的侵染，减少带状疱疹的病灶，缩短病程，改善预后，达到了传统治方法预料不到的效果。
附图说明
图1为NK外泌体粒径分布图。
图2为NK外泌体蛋白含量检测图。
图3为病毒增值抑制对比效果图。
图4为豚鼠皮肤感染VZV治疗试验治愈天数与出疹数量对比曲线图。
图5为家兔皮肤感染VZV治疗试验体温变化对比曲线图。
图6为家兔皮肤感染VZV治疗试验止痛时间、消肿时间、结痂时间、痊愈时间对比图。
图7为病例1使用NK细胞外泌体冻干粉前。
图8为病例1使用NK细胞外泌体冻干粉第三天。
图9为病例1使用NK细胞外泌体冻干粉七天后。
图10为病例2使用NK细胞外泌体冻干粉前。
图11为病例2使用NK细胞外泌体冻干粉第三天。
图12为病例2使用NK细胞外泌体冻干粉七天后。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，需明确：本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1 NK细胞冻干粉的制备
步骤1：NK细胞培养瓶预处理：将CD16单抗与RetroNctin溶于 D-PBS中，转移至T175培养瓶中，37℃避光放置3小时，或4℃放置过夜。
步骤2：PBMC分离
子步骤2.1：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。
子步骤2.2：将血液倒入50ml离心管内，配平，700g/min 离心 20 min（降速最慢），收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用。
子步骤2.3：上述血液离心后的下层加入D-PBS混匀，定容50ml。各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min（缓升缓降）后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
子步骤2.4：收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
子步骤2.5：NK细胞培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、IL-2、IL-21和IL-15及5ml上述灭活的血浆。
子步骤2.6：NK细胞培养：将步骤2.4得到的细胞用NK细胞培养液重悬，置于恒温培养箱（37℃、5.0% CO2、饱和湿度）中培养。
步骤3：视生长情况，适量的补充新鲜的NK细胞培养液进行培养。
步骤4：收集NK细胞外泌体：当NK细胞增值到4×109/L,活率98%以上，CD3-CD56+大于95%时，将NK细胞液倒入离心管内，2000rpm×10min离心，离心后吸取上清液，将上清液70um无菌细胞筛过滤至新的离心管，4℃保存备用。
步骤5：龙仙草提取液制备
子步骤5.1：取龙仙草研磨至粉末，加入粉末质量2倍的60％的乙醇溶剂浸泡4小时以上，加热回流提取1个小时，过滤，合并提取液，获得初次提取液。子步骤5.2：初次提取液加水稀释至2倍量体积，调节pH值至8，离心机离心，4000rpm，60min,离心后收集上清，用0.2um的微孔滤膜过滤，获得龙仙草提取液。
步骤6：将步骤4获得的NK细胞外泌体1000ml加入50克土霉素和步骤5获得的龙仙草提取液100ml，混匀。
步骤7：将步骤6的溶液灌装于无菌的西林瓶内，每瓶4ml。
步骤8：将产品从常温降至-80±2℃。
步骤9：至产品完全冻结，抽真空。
步骤10：逐渐升华干燥，温度升至35℃左右，水分控制在5%以下。
步骤11：检验合格。
步骤12：包装。
实施例2：NK细胞外泌体含量检测
按照实施例1的方法，制备三批次NK细胞外泌体，检测三批次NK细胞外泌体。具体步骤如下：
将实施例1方法获得的NK细胞外泌体进一步纯化，首先，利用0 .45μm mPES中空纤维过滤柱去除液体中的细胞碎片；滤出液进一步通过截留分子量在300-kDa 的mPES中空纤维过滤柱进行浓缩，获粗制品；再用3倍体积的PBS粗制品进行稀释，并采用截留分子量在300-kDa的mPES中空纤维过滤柱进行浓缩，得到检测用外泌体。
将获取的检测用外泌体用PBS稀释100倍，利用Zetasizer Nano ZSE系统检测外泌体的粒径分布，并用Dispersion Technology Software对检测结果进行分析，结果显示，三批次NK外泌体分布均在50-160nm，峰值分布在70nm。结果见图1。
用BCA蛋白定量试剂盒对检测用外泌体进行蛋白定量，并用裂解液释放外泌体中的蛋白，采用Werstern blot方法对外泌体CD63蛋白、颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素、TSG101、GNLY进行检测。结果显示，三批次NK外泌体蛋白含量一致。结果见图2。
实施例3：病毒增值抑制对比实验
疱疹病毒VZV的扩增 ：将Vero细胞均匀铺在24孔板中，培养至汇合度70%-80%，吸弃Vero细胞中的上清，将病毒稀释液加到Vero细胞中，每孔300微升，放置37℃培养箱中吸附2h。培养72h后，细胞层80%以上的病变，反复冻融3次，收集细胞及上清液，低温离心，4000rpm,10min，吸取上清液分装，-80℃备用。
制备琼脂糖：用水配制2%的琼脂糖，高压灭菌并使之溶化，然后将琼脂糖置于42°C水浴中使之保持在熔解状态。将细胞培养基预热至37°C。
感染细胞单层：每孔按1 x 106将Vero细胞均匀铺在24孔板中，培养至汇合度70%-80%，分别将五组药物（本发明NK细胞外泌体冻干粉(实验组)、NK细胞外泌体（对照组1）、NK细胞外泌体+土霉素（对照组2）、NK细胞外泌体+龙仙草提取液（对照组3）、阿昔洛韦软膏（对照组4）。）加入孔板内，然后每孔分别加入VZV病毒液，孵育2h，移除病毒液，D-PBS洗涤三次，去除游离的病毒。
覆盖琼脂糖：1h后，小心吸去病毒液，避免碰到细胞。将2%的琼脂糖和预热的培养基按1:1的比例混匀后加轻轻地加1.5mL至每孔细胞上，室温静置20min使其冷却凝固成覆盖层。将培养板37℃，5%CO2，培养3 天。
空斑观察和计数：用光从45度角照射培养板，或者可以将培养板倒置在一个黑色背景上，计数空斑数量。为了更易于观察，也可以每孔加入1mL 0.03%的中性红（用水或PBS稀释），室温或27°C 孵育2-3h，未被病毒感染的细胞会被中性红染上而中间未被着色的小区域即为空斑（直径约为0.5-3mm）。计数每孔的空斑数量并按以下方法计算病毒滴度：病毒滴度（pfu/ml）=空斑数×(1 ml / 0.1 ml)/稀释倍数。
结果感染3天后的病毒量，实验组明显低于对照组，所以实验组较对照组显示出更强的病毒增殖抑制效果，结果见图3。
实施例4：豚鼠皮肤感染VZV治疗试验
选取实验豚鼠30只，雌雄各半。试验药物分组：本发明NK细胞外泌体冻干粉(实验组)、NK细胞外泌体（对照组1）、NK细胞外泌体+土霉素（对照组2）、NK细胞外泌体+龙仙草提取液（对照组3）、阿昔洛韦软膏（对照组4）。将30只豚鼠，按性别体重随机分为5组，每组6只，分别为NK细胞外泌体冻干粉组、NK细胞外泌体组、NK细胞外泌体+土霉素组、NK细胞外泌体+龙仙草提取液组、阿昔洛韦软膏组。豚鼠背部脱毛，脱毛区皮肤等分为5块。碘伏消毒后，用40μLVZV病毒原液滴于刺伤皮肤上，用无菌玻棒摩擦使其进入豚鼠体内产生感染。4小时后，按编组使用不同的药物与无菌水，分别均匀涂在豚鼠背部5个脱毛区。每天涂药3次，记录疱疹出疹个数，所有的疱疹患处结痂后且无新水疱长出即判断为痊愈。结论：豚鼠使用药物以后，实验组比对照组愈合天数有明显减少，实验组出疹数量比对照组出疹数量明显少。结果见图4。
实施例5：家兔皮肤感染VZV治疗试验
选取实验家兔10只，雌雄各半，体重2kg左右。试验药物分组：本发明NK细胞外泌体冻干粉(实验组)、NK细胞外泌体（对照组1）、NK细胞外泌体+土霉素（对照组2）、NK细胞外泌体+龙仙草提取液（对照组3）、阿昔洛韦软膏（对照组4）。将10只家兔，按性别体重随机分为5组每组2只，分别为NK细胞外泌体冻干粉组、NK细胞外泌体组、NK细胞外泌体+土霉素组、NK细胞外泌体+龙仙草提取液组、阿昔洛韦软膏。家兔背部脱毛，脱毛区皮肤等分为2块。碘伏消毒后，用50μLVZV病毒原液滴于刺伤皮肤上，用无菌玻棒摩擦使其进入家兔体内产生感染。4小时后，按编组使用不同的药物，分别均匀涂在家兔背部2个脱毛区。每天涂药3次，以覆盖全部疱疹为标准。
疗效观察：观察体温变化、止痛时间、消肿时间、疱疹结痂时间、痊愈时间。止痛时间为治疗开始到家兔神经症状（以家兔活动度为标准）明显缓解；消肿时间为治疗时间到红肿消失；结痂时间为治疗开始到水疱、血疱全部结痂；痊愈时间为治疗开始到实验症状全部消失，恢复到接种前状态。
结果：实验组未出现体温升高，对照组均出现不同程度的体温升高；实验组止痛时间、消肿时间、结痂时间、痊愈时间均低于对照组。这说明实验组具有抗带状疱疹病毒效果，我们推测其抗病毒的效果可能会随着浓度提高有更显著的提高。结果见图5、图6。
实施例5 病例验证
病例1
女，年龄41岁，胸前和腰部可见水疱，疱壁紧张发亮，疱液澄清，静脉输液半月，疼痛难忍，无缓解。使用NK细胞外泌体冻干粉后三天疼痛减轻，水泡减少。使用一周后水泡结痂，疼痛完全缓解，无后遗症。图7为使用NK细胞外泌体冻干粉前。图8为使用NK细胞外泌体冻干粉第三天。图9为使用NK细胞外泌体冻干粉一周后。
病例2
男，年龄44岁，颈部与面部可见疱疹，疱疹之间色红，静脉输液一个月，未见好转，疼痛难忍，使用NK细胞外泌体冻干粉后三天疼痛减轻，疱疹减少，红色消失。使用七天后疱疹结痂，疼痛完全缓解，无后遗症。图10为使用NK细胞外泌体冻干粉前。图11为使用NK细胞外泌体冻干粉第三天。图12为使用NK细胞外泌体冻干粉七天后。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的 比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。

Claims (6)

1.一种NK细胞冻干粉，所述冻干粉由NK细胞外泌体溶液、土霉素以及龙仙草提取液组成；所述的NK细胞冻干粉由以下方法制备获得：
1）提取NK细胞上清液的外泌体；2）制备龙仙草提取液；3）取步骤1）获得的1000mL外泌体溶液、100mL龙仙草提取液、50mg土霉素混合，经过真空冷冻干燥制备获得；
其中步骤1）NK细胞上清液的外泌体的具体方法包括：a）CD16单抗和RetroNctin预处理培养瓶；b）分离PBMC；c）用含有IFN-γ、IL-2、IL-21、IL-15和灭活血浆的培养基诱导培养；d）扩增培养后收集培养上清中的外泌体；
所述PBMC的分离步骤为a）：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用；b）将血液倒入50ml离心管内，配平，700g/min 离心 20 min，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用；c）上述血液离心后的下层加入D-PBS混匀，定容50ml，各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min后，离心管中由上至下分为四层，其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层； d）收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液；
其中NK细胞的诱导培养步骤为：a）NK细胞培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、IL-2、IL-21和IL-15及5ml上述灭活的血浆；b）NK细胞培养：将上述得到的细胞用NK细胞培养液重悬，置于37℃、5.0% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养；c）视生长情况，适量的补充新鲜的NK细胞培养液进行培养；
其中分离NK细胞外泌体的具体方法为：收集NK细胞外泌体：当NK细胞增值到4×109/L,活率98%以上，CD3-CD56+大于95%时，将NK细胞液倒入离心管内，2000rpm×10min离心，离心后吸取上清液，将上清液70μm无菌细胞筛过滤至新的离心管，4℃保存备用；
其中步骤2）制备龙仙草提取液的具体方法为：步骤一：取龙仙草研磨至粉末，加入粉末质量2倍-4倍的60％的乙醇溶剂浸泡1-4小时以上，加热回流提取1个小时，过滤，合并提取液，获得初次提取液；
步骤二：初次提取液加水稀释至1倍-3倍量体积，调节pH值至3-8，离心机离心，4000rpm，60min,离心后收集上清，用0.2μm的微孔滤膜过滤，获得龙仙草提取液。
2.一种权利要求1所述的NK 细胞 冻干粉的制备方法，其特征在于，提取NK细胞培养上清中的外泌体，以每1000mL外泌体溶液添加50g土霉素以及100mL龙仙草提取液，经过真空冷冻干燥制备获得；
所述的方法具体操作为：1）提取NK细胞上清液的外泌体；2）制备龙仙草提取液；3）取步骤1）获得的1000mL外泌体溶液、100mL龙仙草提取液、50mg土霉素混合，经过真空冷冻干燥制备获得；
其中步骤1）NK细胞上清液的外泌体的具体方法包括：a）CD16单抗和RetroNctin预处理培养瓶；b）分离PBMC；c）用含有IFN-γ、IL-2、IL-21、IL-15和灭活血浆的培养基诱导培养；d）扩增培养后收集培养上清中的外泌体；
所述PBMC的分离步骤为a）：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用；b）将血液倒入50ml离心管内，配平，700g/min 离心 20 min，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用；c）上述血液离心后的下层加入D-PBS混匀，定容50ml，各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min后，离心管中由上至下分为四层，其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层； d）收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液；
其中NK细胞的诱导培养步骤为：a）NK细胞培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、IL-2、IL-21和IL-15及5ml上述灭活的血浆；b）NK细胞培养：将上述得到的细胞用NK细胞培养液重悬，置于37℃、5.0% CO2、饱和湿度的恒温培养箱,中培养；d）视生长情况，适量的补充新鲜的NK细胞培养液进行培养；
其中分离NK细胞外泌体的具体方法为：收集NK细胞外泌体：当NK细胞增值到4×109/L,活率98%以上，CD3-CD56+大于95%时，将NK细胞液倒入离心管内，2000rpm×10min离心，离心后吸取上清液，将上清液70μm无菌细胞筛过滤至新的离心管，4℃保存备用；
其中步骤2）制备龙仙草提取液的具体方法为：步骤一：取龙仙草研磨至粉末，加入粉末质量2倍-4倍的60％的乙醇溶剂浸泡1-4小时以上，加热回流提取1个小时，过滤，合并提取液，获得初次提取液；
步骤二：初次提取液加水稀释至1倍-3倍量体积，调节pH值至3-8，离心机离心，4000rpm，60min,离心后收集上清，用0.2μm的微孔滤膜过滤，获得龙仙草提取液。
3.根据权利要求1所述的NK细胞冻干粉，其中所述的冷冻干燥操作为1）将NK细胞外泌体溶液、龙仙草提取液、土霉素混合后的溶液灌装于无菌的西林瓶内，每瓶4mL；2）：将产品从常温降至-80±2℃；3）：至产品完全冻结，抽真空；4）逐渐升华干燥，温度升至35℃左右，水分控制在5%以下；5）检验包装。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述的冷冻干燥的具体操作为：1）将NK细胞外泌体溶液、龙仙草提取液、土霉素混合后的溶液灌装于无菌的西林瓶内，每瓶4mL；2）：将产品从常温降至-80±2℃；3）：至产品完全冻结，抽真空；4）逐渐升华干燥，温度升至35℃左右，水分控制在5%以下；5）检验包装。
5.一种NK细胞冻干粉在制备治疗病毒感染的药物中的应用；其中所述的NK细胞冻干粉为权利要求1或3所述的NK细胞冻干粉，所述的病毒为水痘带状疱疹病毒。
6.权利要求2或4所述的方法制备得到的 NK 细胞冻干粉 在制备治疗病毒感染的药物中的应用，所述的病毒为水痘带状疱疹病毒。
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