CN102151290B - 一种禽用特异性转移因子的制备方法 - Google Patents
一种禽用特异性转移因子的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102151290B CN102151290B CN2009103036343A CN200910303634A CN102151290B CN 102151290 B CN102151290 B CN 102151290B CN 2009103036343 A CN2009103036343 A CN 2009103036343A CN 200910303634 A CN200910303634 A CN 200910303634A CN 102151290 B CN102151290 B CN 102151290B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- spleen
- tissue
- cell
- preparation
- transfer factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
一种禽用特异性转移因子的制备方法涉及医药领域，特别涉及到一种禽用特异性转移因子的制备方法。本发明以猪脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养淋巴细胞，然后用聚肌胞和鸡传染性支气管炎病毒诱导培养，体外生产出大量抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子。本发明的方法体外制备的抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子用于治疗鸡传染性传染性支气管炎病，同时提高禽类的免疫力。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及到一种禽用特异性转移因子的制备方法。
背景技术
鸡传染性支气管炎氏病是鸡常见的一种传染性疾病，是由传染性支气管炎病毒引起的具有高度传染性的疾病，死亡率很高。鸡传染性支气管炎氏病目前还没有有效的药物治疗。控制办法应以防疫、检疫、消毒为主。
转移因子是从淋巴细胞中提取的一种低分子多肽与核酸复合物，能特异性或非特异性地提高机体免疫功能，传递免疫信息，被誉为细胞免疫激活剂。它无种属特异性，可在种属间传递，动物来源可用于人类。转移因子是由动物免疫防御系统产生的可对抗外源性病原体的防御性肽类活性物质，分子量小、具有抗细菌、真菌、病毒和原虫作用，作为具有特异性与非特异性的免疫活性细胞调节因子，广泛应用于治疗任何动物病毒性疾病、真菌感染。
转移因子常规的制备方法是将动物新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结用组织捣碎机破碎细胞，制成匀浆，加适量纯化水，混匀，置-20℃反复冻融5～8次；将冻融的匀浆离心(离心温度4℃)，去沉淀，留上清液备用；上清液装透析袋，半成品过滤除菌；成品的配置与检验。常规制备转移因子活性不高，没有特性性。
转移因子是经诱导，由动物免疫防御系统产生的可对抗外源性病原体的防御性肽类活性物质，分子量小、活性强，具有抗细菌、真菌、病毒和原虫作用，甚至对癌细胞也具有杀伤作用，应用十分广泛。转移因子作为具有特异性与非特异性的免疫活性细胞调节因子，广泛应用于治疗任何动物病毒性疾病、真菌感染、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤的辅助治疗，并有好的疗效。但制备转移因子的工艺繁琐复杂、回收率低、无特异性。
聚肌胞是一种人工合成的双链核糖核酸，可诱导低水平的干扰素具有一定的抗病毒作用；此外还有调节机体免疫功能，促进人体非特异性免疫功能和某些特异性免疫功能。聚肌胞能刺激单核巨噬细胞系统，增强吞噬细胞的吞噬功能，增加抗体的形成，刺激同种移植反应及迟发型过敏反应等。本发明通过体外制备抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子特异性强、回收率高。
发明内容
本发明的目的是通过提供一种禽用特异性转移因子的制备方法，克服现有技术中制备的转移因子针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点。本发明方法特异性强、成本低、回收率高、效果更好。聚肌胞能刺激单核巨噬细胞系统，增强吞噬细胞的吞噬功能，增加抗体的形成。淋巴细胞经聚肌胞和鸡传染性支气管炎病毒混合诱导培养后，抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子的活性更高。
为实现本发明的目的所采用的技术方案如下：
一种禽用特异性转移因子的制备方法，由如下步骤组成：
(1)无菌采取实验猪脾脏或抗凝血，用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；
(2)对淋巴细胞单层进行传代培养；
(3)当淋巴传代细胞长成单层后，用聚肌胞和鸡传染性支气管炎病毒诱导培养，即获得体外抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子。
刺激猪脾细胞和猪血淋巴细胞增殖的聚肌胞的质量浓度为200-500mg/L。
本发明制备方法中使用的各项成分均为市售品，规格为药用级。
本发明的有益效果是：
本发明以较少的猪脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养，然后用聚肌胞和鸡传染性支气管炎病毒诱导培养诱导淋巴细胞单层即可体外生产出大量抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子的混合体，本发明的方法制备的抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子无需进一步的提纯，直接将混合体用于禽类，即可起到抗鸡传染性支气管炎病毒及抗菌的作用，同时提高禽类的免疫力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
一种禽用特异性转移因子的制备方法，具体步骤是：
(1)无菌采取猪的抗凝血，用外周血制备淋巴细胞单层，步骤为：
无菌静脉采取猪全血25毫升，加0.8％肝素溶液0.3ml抗凝，静置45分钟，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤2～3次，离心速度800～1200转/分，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞培养，均匀混合后分装于容量100毫升培养方瓶或砖瓶中，塞紧瓶塞，置37℃恒温箱中或砖瓶机中培养，经2～3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层。
(2)对淋巴细胞单层进行传代培养；
在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下观察，以确定细胞已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
(3)当淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入聚肌胞(终浓度为350mg/L)和鸡传染性支气管炎病毒(终浓度为640血凝单位/ml)诱导培养。
当淋巴细胞传代长成单层后，聚肌胞和鸡传染性支气管炎病毒诱导培养。
(4)经培养2～3天，离心细胞培养液，收集上清，上清液在4℃下磁力搅拌透析，超滤除菌，即制成抗鸡鸡传染性支气管炎特异型转移因子。
转移因子浓度的测定、抑菌实验的方法、半成品和成品的检验项目均同实施例1。本方法生产的的转移因子为黄色澄明液体，多肽含量0.32g/L，核糖含量0.27g/L。
实施例2
一种禽用特异性转移因子的制备方法，具体步骤是：
(1)无菌采取实验猪脾脏，用脾脏制备淋巴细胞单层，步骤为：
A、处理猪脾脏
取新鲜猪脾脏置于无菌容器中，加入PBS(pH为7.2)溶液浸泡半小时或浸于质量百分浓度为1％的新洁尔灭溶液中，取出以酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用PBS(pH为7.2)液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成lmm3小块，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2-3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；
B、消化及分散组织块
将上步清洗过的PBS(pH7.2)液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按组织块体积的5倍量加入0.25％胰蛋白酶液(pH为7.6～7.8)，置37℃水浴中消化20～40分钟。每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2～3次，用0.5％水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；
C、细胞计数
采用血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数相同；
D、细胞悬液的分装和培养
按细胞计数结果，将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万个细胞/毫升。将细胞悬液分装入细胞培养瓶(100ml)和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1/5，盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；
E、观察
置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察。若细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段直至形成淋巴细胞单层。
(2)对淋巴细胞单层进行传代培养
在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下现察，以确定细胞已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
(3)当淋巴传代细胞长成单层后，用聚肌胞和鸡传染性支气管炎病毒诱导培养
当脾淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入聚肌胞(终浓度为420mg/L)和鸡传染性支气管炎病毒(终浓度为640血凝单位/ml)诱导培养。
(4)诱导培养24小时，将细胞培养物经超声破碎后取样检测转移因子和的浓度。
转移因子浓度的测定：对转移因子的定量多以多肽含量定量：用Folin酚法或分光光度法测定多肽含量，以多肽含量1mg为一个转移因子单位。本方法生产的的转移因子为黄色澄明液体，多肽含量0.48g/L，核糖含量0.34g/L。
半成品和成品的检验：
半成品检定：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测。
成品检定：成品分别作转移因子和的鉴别试验、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒性等项检验。
实施例3
一种禽用特异性转移因子的制备方法，具体步骤是：
(1)取新鲜猪脾脏置于无菌玻璃容器中，加入PBS(pH为7.2)溶液浸泡半小时或浸于质量百分浓度为1％的新洁尔灭溶液中，取出以酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用PBS(pH为7.2)液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成lmm3小块，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2-3次；
(2)将上步清洗过的PBS(pH7.2)液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按组织块体积的5倍量加入0.25％胰蛋白酶液(pH为7.6～7.8)，置37℃水浴中消化20～40分钟。每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2～3次，用0.5％水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；
(3)将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液，然后分装入细胞培养瓶和细胞转瓶，分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；
(4)经2～3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，可进行细胞的传代培养。当长成单层后，更换维持液同时用聚肌胞(终浓度为150mg/L)和鸡传染性支气管炎病毒(终浓度为2560血凝单位/ml)诱导培养。
(5)经培养1～2天，离心细胞培养液，收集上清，上清液透析，超滤除菌，上清液即为特异型转移因子。
应用实例：
200只20日龄只40日龄肉鸡(经过健康检查无菌)分为A、B、C、D、E共5组，B、C、D、E组经过人工感染0.5ml鸡传染性支气管炎病毒强毒攻毒后作实验。A组为健康组，不感染病毒，不给药；B组阴性对照组，感染病毒，不给药；C组本发明为药物(实施例1)低剂量组，按禽0.5ml/只鸡/天肌肉注射；D组为本发明药物高剂量组，按禽1.0ml/只鸡/天注射；E组为黄芪多糖组(天津艾森生物公司)，按禽0.5g/只鸡/天注射。结果表明，采用本发明药物治疗鸡传染性传染性支气管炎病毒病有着明显的疗效。
本发明天然药物组合物实验结果如下：
| 编号 | 组别 | 死亡率％ | 治愈率％ | 有效率％ |
| A | 健康组 | 0 | 100.0(40/40) | 100.(40/40) |
| B | 阴性对照组 | 62.5(25/40) | 0(0/40) | 30.0(12/40) |
| C | 低剂量治疗组 | 20(8/40) | 50(20/40) | 80(32/40) |
| D | 高剂量治疗组 | 5(2/40) | 77.5(31/40) | 95(38/40) |
| E | “黄芪多糖”治疗组 | 12.5(5/40) | 45(18/40) | 77.5(31/40) |
本次试验结果表明，该药物低、高剂量治疗组与对照组差异非常显著(P＜0.05)，说明本发明药物对病毒引起的鸡传染性支气管炎病毒病具有显著的治疗作用， 且与“黄芪多糖”组疗效相当(P＞0.01)。
上述参照实施例对抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种禽用特异性转移因子的制备方法，其特征在于：具体步骤是：
(1)取新鲜猪脾脏置于无菌玻璃容器中，加入pH为7.2的PBS溶液浸泡半小时或浸于质量百分浓度为1%的新洁尔灭溶液中，取出以酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用pH为7.2的PBS液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成1mm3小块，再用pH为7.2的PBS液洗涤2-3次；
(2)将步骤（1）清洗过的pH为7.2的PBS液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按组织块体积的5倍量加入pH为7.6～7.8的0.25%胰蛋白酶液，置37℃水浴中消化20～40分钟；每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用pH为7.2的PBS液洗涤2～3次，用0.5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；
(3)将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液，然后分装入细胞培养瓶和细胞转瓶，分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；
(4)经2～3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，可进行细胞的传代培养；当长成单层后，更换维持液同时用终浓度为150mg/L的聚肌胞和终浓度为2560血凝单位/ml的鸡传染性支气管炎病毒诱导培养；
(5)经培养1-2天，离心细胞培养液，收集上清，上清液透析，超滤除菌，上清液即为特异型转移因子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009103036343A CN102151290B (zh) | 2009-06-25 | 2009-06-25 | 一种禽用特异性转移因子的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009103036343A CN102151290B (zh) | 2009-06-25 | 2009-06-25 | 一种禽用特异性转移因子的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102151290A CN102151290A (zh) | 2011-08-17 |
| CN102151290B true CN102151290B (zh) | 2013-07-24 |
Family
ID=44433179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009103036343A Expired - Fee Related CN102151290B (zh) | 2009-06-25 | 2009-06-25 | 一种禽用特异性转移因子的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102151290B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105396130A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-03-16 | 林海祥 | 皮氨钙佐剂及含有皮氨钙佐剂的疫苗 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1408367A (zh) * | 2001-09-28 | 2003-04-09 | 诸城市信得药业有限责任公司 | 一种鸡脾转移因子的生产工艺及其提取方法 |
| CN1766093A (zh) * | 2005-09-12 | 2006-05-03 | 大连三仪动物药品有限公司 | 体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法 |
| CN1864742A (zh) * | 2005-08-23 | 2006-11-22 | 天津市润拓生物技术有限公司 | 在畜禽上应用的转移因子溶液及其制备方法及在畜禽上的应用 |
| CN101293913A (zh) * | 2008-06-17 | 2008-10-29 | 天津生机集团股份有限公司 | 一种抗鸡传染性支气管炎病毒转移因子的制备方法 |
-
2009
- 2009-06-25 CN CN2009103036343A patent/CN102151290B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1408367A (zh) * | 2001-09-28 | 2003-04-09 | 诸城市信得药业有限责任公司 | 一种鸡脾转移因子的生产工艺及其提取方法 |
| CN1864742A (zh) * | 2005-08-23 | 2006-11-22 | 天津市润拓生物技术有限公司 | 在畜禽上应用的转移因子溶液及其制备方法及在畜禽上的应用 |
| CN1766093A (zh) * | 2005-09-12 | 2006-05-03 | 大连三仪动物药品有限公司 | 体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法 |
| CN101293913A (zh) * | 2008-06-17 | 2008-10-29 | 天津生机集团股份有限公司 | 一种抗鸡传染性支气管炎病毒转移因子的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102151290A (zh) | 2011-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106109496B (zh) | 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法 | |
| CN104258385B (zh) | Bhk-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用 | |
| CN102120768B (zh) | 利用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法 | |
| CN101757027A (zh) | 一种体外制备抗鸡传染性支气管炎病毒特异性转移因子的制备方法 | |
| CN101880651A (zh) | 番鸭细小新型疫苗的制备方法 | |
| CN106591231B (zh) | 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 | |
| CN107904215A (zh) | 一种禽流感病毒的全悬浮培养方法 | |
| CN105664150B (zh) | 一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗 | |
| CN103436583A (zh) | 一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞 | |
| CN104338127A (zh) | 一种h9n2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品 | |
| CN101684140A (zh) | 抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法 | |
| CN104587460A (zh) | 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN105535958B (zh) | 一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗 | |
| CN105039474A (zh) | 一种重组鸡干扰素α标准品的制备方法 | |
| CN101759765A (zh) | 一种体外制备抗鸡法氏囊病毒特异性转移因子的制备方法 | |
| CN103386127B (zh) | 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法 | |
| CN102151290B (zh) | 一种禽用特异性转移因子的制备方法 | |
| CN103599130A (zh) | 抗鸡新城疫病毒特异性转移因子及口服液制备方法和用途 | |
| CN109207436A (zh) | 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用 | |
| CN103143007A (zh) | 一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法 | |
| CN103977400B (zh) | 一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法 | |
| CN101759764A (zh) | 一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法 | |
| CN102697808B (zh) | 一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法 | |
| CN101684142A (zh) | 抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法 | |
| CN101684141A (zh) | 抗鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130724 Termination date: 20150625 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |