CN104338127A - 一种h9n2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品，属于H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产及应用领域。本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，包括：(1)利用细胞工厂培养MDCK细胞；(2)接种H9N2亚型禽流感病毒，在细胞工厂中增殖病毒；其中，所述H9N2亚型禽流感病毒微生物保藏编号为：CGMCC No.9325；(3)收获病毒，制备灭活疫苗。免疫保护实验表明，本发明方法生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗保护率达100％，且各时间点细胞毒免疫组的抗体水平均比胚毒免疫组高，抗体水平上升也较快。本发明方法生产的病毒液能用于制备预防或治疗H9N2亚型禽流感药物或试剂。

Description

一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品

技术领域

本发明涉及一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用细胞工厂生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法，还涉及该生产方法制备得到的H9N2亚型禽流感灭活疫苗及其在制备预防或治疗H9N2亚型禽流感药物或试剂中的用途，属于H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产及应用技术领域。

背景技术

禽流行性感冒(Avain Influenza,AI)，简称禽流感，是由A型流感病毒引起的一种禽类(包括家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病，被世界动物卫生组织确立为A类传染病。H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。虽然该亚型禽流感病毒对禽群呈低致病力，主要临床表现仅为轻度呼吸道症状，但由于易与其他致病微生物发生协同作用，造成继发感染，从而引起了禽群的高发病率和致死率，对各国养禽业的危害也很大。

过去中国一直通过鸡胚培养生产禽流感疫苗。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制，而且每只受精鸡蛋一次只能注射一个病毒菌株，因此这种生产方法效率很低，不利于应对大规模的流感爆发。

以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。细胞工厂培养技术可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，具有低污染风险，节省空间等优点。但是，至今尚无利用细胞工厂生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用细胞工厂生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法，在使用细胞培养方法的同时生产出高滴度的病毒，满足免疫生产要求，即避免生物安全的隐患又克服了疫苗的大量生产受制于鸡胚的供应。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先分离了一株H9N2亚型禽流感病毒(Avain InfluenzaVirus)NJ13-8毒株。

本发明将分离的H9N2亚型禽流感病毒NJ13-8毒株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9325；分类命名为：禽流感病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年6月20日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明分离的病毒NJ13-8毒株在MDCK细胞增殖良好，表明该毒株对MDCK细胞具有高度适应性。

在此基础上，本发明进一步提供了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，包括以下步骤：(1)利用细胞工厂培养MDCK细胞；(2)接种H9N2亚型禽流感病毒，在细胞工厂中增殖病毒；其中，所述H9N2亚型禽流感病毒毒株的微生物保藏编号为：CGMCC No.9325；(3)收获病毒液，制备灭活疫苗。

其中，步骤(1)培养MDCK细胞至细胞密度达0.8×10⁵细胞/ml。

步骤(2)中H9N2亚型禽流感病毒按病毒感染复数MOI＝0.8进行接种；在细胞工厂中增殖病毒，病毒维持液为不含血清的DMEM；优选的，病毒维持液中加入终浓度1.0％BSA和2.0μg/ml的TPCK-胰酶；37℃培养60-72h。

步骤(3)中灭活疫苗的制备包括，将病毒液5000r/min离心30min，取上清；加入灭活剂甲醛溶液，其终浓度为病毒液上清总量的0.2％；37℃灭活24h。将灭活的病毒上清液与进口油佐剂按照体积比1：3混合乳化后，即可用于动物免疫。

本发明方法生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗可实现对H9N2亚型禽流感的有效防治。

本发明利用细胞工厂生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法适用于任何一种可以获得的H9N2亚型禽流感病毒毒株。

本发明还提供了所述生产方法制备得到的H9N2亚型禽流感灭活疫苗。安全性检验试验证明，本发明方法制备的禽流感灭活疫苗对鸡只安全。

本发明还提供了所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗在制备预防或治疗禽流感药物或试剂中的用途。

免疫保护实验表明，本发明方法生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗与国内2个厂家生产的H9亚型禽流感疫苗预防禽流感的效果相比，攻毒后，本发明方法生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗免疫组的保护率达100％，明显优于2个同类型产品免疫组，可实现对H9N2亚型禽流感的有效防治。

本发明利用细胞工厂生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗与鸡胚培养病毒制备的灭活疫苗免疫效果比较证明，在各个时间点细胞毒免疫组的抗体水平均要比胚毒免疫组高，抗体水平上升也较快。

本发明对禽流感病毒在细胞工厂中的增殖条件进行了优化，综合考虑细胞密度、病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、BSA浓度和病毒培养时间五个因素对禽流感病毒(AIV)增殖的影响，比较AIV病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异。

结果表明，H9N2亚型AIV病毒在细胞工厂中增殖的最佳条件为：细胞密度0.8×10⁵细胞/ml；AIV病毒按MOI＝0.8进行接种；病毒维持液中含1.0％BSA；同时含2.0μg/ml的TPCK-胰酶；37℃培养60-72h，生产出高滴度的病毒，最高血凝价达11log2。

由于多数禽流感病毒入侵细胞过程中需要使用少量胰酶，而血清中含有胰酶抑制物，因此在接种和繁殖禽流感病毒过程中不添加血清；本发明在病毒维持液中加入1.0％BSA，保持了胰酶的活性，明显的提高了禽流感病毒滴度，生产出高滴度的病毒，满足免疫生产要求。

本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明应用细胞工厂技术生产H9N2亚型禽流感疫苗，首先避免了采用鸡胚的病毒繁殖方法，既避免了生物安全隐患的问题，又克服了疫苗的大量生产受制于鸡胚的供应，节省培养空间、减少污染风险、缩短操作时间；另外，本发明提供的细胞工厂培养病毒的方法中，细胞密度为0.8×10⁵细胞/ml，按MOI＝0.8接种病毒，并在病毒维持液中加入1.0％BSA和2.0μg/ml的TPCK-胰酶增殖病毒，生产出高滴度的病毒，最高血凝价达11log2，用于H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备，满足免疫生产要求。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“疫苗”意指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。

术语“佐剂”意指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

术语“抗体”意指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

术语“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半数致死量(LD₅₀)，其中以LD₅₀最常用，它是指在一定时间内能使半数试验动物致死的病毒量；然而，病毒对试验动物的致病作用不一定都以死亡为标志，例如以感染发病作指标，则可以半数感染量(ID₅₀)测定；此外，当试验的材料是鸡胚时则用鸡胚半数致死量(ELD₅₀)或鸡胚半数感染量(EID₅₀)表示；试验的材料是细胞时则用组织细胞培养半数感染量(TCID₅₀)表示。

附图说明

图1为细胞工厂上MDCK细胞的生长情况；其中，A为12h MDCK细胞形态；B为24h MDCK细胞形态；C为48h MDCK细胞形态。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

禽流感灭活疫苗(H9亚型，F株)购自乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂；禽流感灭活疫苗(H9亚型，SD696株)购自扬州威克生物工程有限公司；MDCK细胞由哈尔滨兽医研究所提供。

DMEM培养基购自Gibco公司；进口胎牛血清购自Hyclone；TPCK-胰酶购自Washington公司；Nunc EasyFill细胞工厂(10层，培养面积6320cm²，工作容量2000ml)购自Thermo Fisher。

实施例1 H9N2亚型禽流感病毒NJ13-8株的分离与鉴定

1、实验方法

1.1病毒的分离

2013年从江苏省南京某养鸡场发病送检死亡病鸡中采集肺脏和肝脏，剪碎，按1：5加入灭菌生理盐水，无菌研钵研磨后，反复冻融3次，经3000r/min离心15min，取上清液，备用。

将上述病料上清液通过0.22μm一次性滤器除菌，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚接种0.1ml，共接种5枚。37℃孵育；弃去24h内死胚，无菌收集24-120h死亡鸡胚尿囊液，-70℃保存备用。

病毒分离后需要在SPF鸡胚上进行3次终点有限稀释克隆纯化，即每一次均取最高稀释度有血凝价的鸡胚尿囊液作为下一次传代纯化的种毒，如此经三次纯化后，以10^-4稀释接种9-11日龄SPF胚，72h后收取鸡胚尿囊液，经菌检证明无污染，分装于小管中作为种毒，贮存于-70℃。

1.2分离病毒株的鉴定

1.2.1血清学鉴定

将无菌收集的鸡胚尿囊液以1.0％鸡红细胞悬液采用β－微量法进行HA试验，以HA价≥4log2为试验阳性。对有血凝性的胚液进行HI(血凝抑制试验)。分别用禽流感(H9)标准阳性血清、禽流感(H5)标准阳性血清、鸡新城疫及鸡产蛋下降综合征阳性血清进行抑制试验。

1.2.2RT－PCR鉴定

根据GenBank已发表的H9N2毒株的基因序列，用Primer 5.0软件设计分别针对HA(血凝素基因)、NA(神经氨酸酶基因)的两对引物，对分离毒株进行RT－PCR鉴定。

通用引物：5′-AGCRAAAGCAGG-3′；

HA基因扩增引物：

上游引物5′-AGCRAAAGCAGGGGAATTTCACAAC-3′；

下游引物5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGCCAA-3′。

NA基因扩增引物：

上游引物5′-AGCRAAAGCAGGAGTAAAAATGAAT-3′；

下游引物5′-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCTAAAA-3′。

PCR反应体系：25mmol/L MgCl₂1.5μl，10×EX Taq DNA聚合酶buffer 2.5μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，EX Taq DNA聚合酶0.25μl，灭菌H₂O 14μl，上、下游引物25pmol/μl 1μl，反转录产物/阳性、阴性对照2.75μl，总体积25μl。

PCR反应程序：94℃3min，然后进入循环94℃30s，52℃30s，72℃90s，30个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。

2、实验结果

2.1病毒分离

病料上清液经过4代鸡胚培养后，HA血凝价逐渐稳定，鸡胚死亡数开始增长，胚体病变逐渐明显。种毒经适当稀释后，接种SPF鸡胚尿囊腔，收集接种后24-72h鸡胚的尿囊液，-70℃保存备用。

2.2病毒的鉴定

2.2.1血清学鉴定

血清学鉴定结果见表1，表明：分离病毒尿囊液的血凝性只被禽流感(H9)标准阳性血清抑制，不能被鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、禽流感(H5)标准阳性血清所抑制，说明分离病毒为H9亚型禽流感病毒。

表1HI试验结果

2.2.2RT-PCR鉴定

通过RT-PCR试验获得了NJ13-8株血凝素基因和神经氨酸酶基因片断，测得的HA和NA基因序列与Genbank中的流感病毒基因序列比对显示，该毒株的HA基因属于A型流感病毒H9亚型，NA基因属于A型流感病毒N2亚型。本发明将该分离株命名为A/Chicken/NanJing/08/2013(H9N2)毒株，简称NJ13-8。

本发明将病毒NJ13-8株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9325。

实施例2 分离病毒NJ13-8株的致病性测定及其在MDCK细胞中的增殖

1、实验方法

1.1分离病毒NJ13-8株的致病性测定

通过鸡胚半数感染量(EID₅₀)、脑内致病指数(ICPI)和静脉接种指数(IVPI)试验来检测实施例1分离的病毒NJ13-8株的致病性。

1.1.1病毒EID₅₀测定

将分离病毒用灭菌生理盐水作10^-6～10^-9稀释，并设立空白对照组，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，弃24h死亡胚，于接种120h后4℃过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液，测定其HA效价，并参考Reed-Muench方法计算出病毒EID₅₀。

1.1.2脑内致病指数(ICPI)测定

取1日龄SPF雏鸡10只，脑内注射1∶10稀释的新鲜病毒液，每只注射0.05ml(接种针头直径0.45mm，长5mm)，另取2只，各注射生理盐水0.05ml，接种后观察8日，每日在与注射相同时间观察、记录每只鸡的情况。分为正常(活动灵活，行动无共齐失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡。

观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0，发病为1，死亡为2)累计总分数。

ICPI为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数的平均值。

1.1.3静脉接种致病指数(IVPI)的测定

取6周龄非免疫鸡8只，按中华人民共和国兽用生物制品质量标准的方法测定IVPI。引起禽流感的A型流感病毒对6周龄鸡的静脉致病指数(IVPI)大于1.2即确定为高致病性禽流感病毒。

1.1.4病毒对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)测定

用无菌生理盐水将新收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度分别接种10日龄鸡胚，上午8点每稀释度接种5个鸡胚，每胚尿囊腔内注射0.1ml，作记号“A”。接种后剩余的病毒稀释液4℃保存；下午5点每个稀释度分别再接种剩余的5个鸡胚，作记号“B”。接种后，每日上午8点，下午5点，A、B组各照蛋1次，记录每一鸡胚的死亡时间，并测定每胚血凝(HA)活性。观察7日后，将所有活胚冷却，测定每胚HA活性。上午和下午接种的鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量，然后计算最小致死量的平均死亡时间。

1.2分离病毒NJ13-8株在MDCK细胞中的增殖及TCID₅₀测定

1.2.1NJ13-8株在MDCK细胞中的增殖

将实施例1纯化的分离病毒NJ13-8株用灭菌生理盐水稀释后接种80％长成单层后的MDCK细胞，37℃培养48～72h，直至出现病变达75％以上放入-70℃中反复冻融3次，收获病毒液。传代，直至病毒在MDCK细胞增值良好。取传至第10代的毒液，测定其TCID₅₀。

1.2.2病毒TCID₅₀测定

(1)将状态良好的MDCK细胞以2-3×10⁵个/孔接种96孔细胞培养板，置37℃，6％CO₂培养箱培养12～24h。

(2)用超纯水配制的无菌PBS(pH7.2)将病毒液进行10倍梯度稀释，设置10^-3-10^-108个稀释梯度。

(3)弃去培养基，用无菌PBS洗涤已培养成单层的MDCK细胞三遍，以去除培养基中的血清成分，避免血清对病毒吸附的影响。

(4)将每个稀释度的病毒接种于MDCK细胞，每个稀释度接种8孔，100μL/孔，37℃吸附1h左右。

(5)弃去吸附液，用灭菌PBS洗涤MDCK细胞一遍，加入含终浓度2μg/ml的TPCK-trypsin的细胞维持液(无抗无血清的DMEM培养基置35℃，6％CO₂培养箱培养，每隔12h观察1次。

(6)待到细胞病变(CPE)和HA效价不再发生变化时，用Reed-Muench公式计算TCID₅₀。

2、实验结果

2.1分离病毒NJ13-8株的致病性测定

NJ13-8株的病毒含量、静脉致病指数(IVPI)、脑内致病指数(ICPI)、对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)测定结果见表2。

表2分离毒病毒含量、IVPI指数、ICPI指数、MDT/MLD测定结果

结果表明：NJ13-8毒株的病毒含量为10^8.12EID₅₀/0.1ml；静脉致病指数(IVPI)为0.12；脑内致病指数为0.24；对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)为85.6h/10^-6，属于低致病力的H9N2亚型禽流感病毒。

2.2病毒NJ13-8株在MDCK细胞上的增殖

经过传代后病毒NJ13-8株在MDCK细胞增殖良好，表明该毒株对MDCK细胞具有高度适应性。取传至第10代的毒液，测得其TCID₅₀为10^8.5TCID₅₀/0.1ml。

实施例3 利用细胞工厂培养H9N2亚型禽流感病毒制备灭活疫苗

1、实验方法

1.1细胞培养

首先复苏种细胞MDCK到T75细胞瓶中，生长48h左右，按照1：4的比例进行传代；然后把6个长满细胞的T75细胞瓶中的细胞传到1个10L转瓶进行培养；48h左右按照1：3的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为DMEM，血清为胎牛血清，使用量为10％。

将转瓶中所得细胞用PBS洗涤2次，然后加入浓度为0.25％胰酶-EDTA溶液125ml消化，收获转瓶中的细胞。

收获的细胞经计数后，采用Thermo Scientific Nunc细胞工厂对MDCK细胞进行培养，所用的培养基是DMEM培养基。细胞接种后在12h、24h、48h取样，观察细胞在细胞工厂上的生长状况。

1.2禽流感病毒在细胞工厂中增殖

培养至细胞密度达0.8×10⁵细胞/ml，按MOI＝0.8接种实施例1分离鉴定的AIV病毒，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9325。病毒维持液中BSA浓度为1.0％，TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml，37℃培养60-72h。

1.3收获病毒

培养至80％以上的细胞出现致细胞病变效应(CPE)时，即可收获病毒。分别检测病毒滴度及HI效价，并与转瓶培养生产的病毒收获物进行比较。

1.4病毒灭活与配苗

灭活前调整至每0.1ml的病毒含量≥10^8.0EID₅₀，HA滴度≥2⁹，符合配苗要求。

病毒液5000r/min离心30min，去除死细胞和碎片，取上清；采用甲醛溶液灭活，使灭活剂终浓度为病毒液上清总量的0.2％，37℃灭活24h，可以完全灭活；经过无菌性检验之后，将灭活病毒分别与进口油佐剂按体积比(1：3)混合，乳化后用于动物免疫。

1.5免疫实验

设计实验，比较本发明生产的经检查合格的H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗与国内2个厂家生产的H9亚型禽流感疫苗预防禽流感的效果。

1.5.1安全性检验

本发明方法生产的各批次疫苗用40日龄SPF鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗2羽份，观察14日。

1.5.2免疫与攻毒

将4周龄的SPF鸡随机分成A、B和C试验组，每组10只；D组为阴性对照组，SPF鸡5只。将本发明制备的H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫A试验组；国内2个厂家生产的H9亚型禽流感疫苗分别免疫B和C试验组，其中，禽流感灭活疫苗(H9亚型，F株)免疫B试验组，禽流感灭活疫苗(H9亚型，SD696株)免疫C试验组；每组疫苗颈部皮下接种试验鸡10只，接种剂量0.3mL/只；对照组不免疫。

免疫后第7、14、21天，采集每只鸡血清，按现行《中国兽药典》附录方法测定试验组和阴性对照组每只鸡的HI抗体效价。

免疫3周后，用10倍稀释的H9N2亚型禽流感病毒分离株(CGMCCNo.9325)病毒液静脉注射攻击试验组和对照组鸡，攻击5天后，采集喉头棉拭子，用10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。以从喉头没有分离到病毒判定为免疫攻毒保护。

2实验结果

2.1细胞观察

细胞接种12h、24h和48h后，观察细胞在细胞工厂上的生长状况，细胞形态观察结果如图1所示。细胞接种48h后，细胞层更紧密、均一。

2.2细胞工厂与转瓶培养主要参数比较

细胞工厂与转瓶培养的主要参数比较结果见表3。

表3细胞工厂与转瓶培养主要参数比较

从表3可以看出，细胞工厂培养可以有效节省培养空间，扩大培养面积；细胞工厂培养所得的病毒，病毒HI效价为2^10-11；病毒滴度比转瓶培养的有显著提高，TCID₅₀/0.1ml达4.78×10⁷。

2.3H9N2亚型禽流感灭活疫苗的安全性检验

安全性检验结果表明，接种2羽份本发明方法制备的各批次疫苗的鸡只无全身反应，注射部位吸收较好，无眼观病变。证明，本发明方法制备的疫苗对鸡只安全。

2.4免疫实验结果

3种疫苗接种试验鸡3周后，采血检测抗体效价，结果表明(表4)，对照鸡几何平均效价均低于2log2；免疫鸡HI抗体几何平均效价在7.8log2～10.4log2之间。攻毒后，A组的保护率达100％，明显优于同类型产品免疫的B组和C组。表明，本发明方法制备的疫苗能对H9N2亚型禽流感病毒的攻击实现100％免疫保护。

表43组疫苗的免疫保护试验结果

实施例4细胞工厂培养H9N2亚型禽流感病毒与鸡胚培养病毒制备灭活疫苗的免疫效果比较

1、实验方法

1.1病毒的扩增

将实施例1分离的病毒NJ13-8株(微生物保藏编号为：CGMCC No.9325)分别经细胞工厂培养扩增(收集细胞培养上清)及接种SPF鸡胚扩增(收集尿囊液)，制备灭活疫苗；具体方法同实施例3。

1.2免疫保护试验

为了排除免疫抗原量对免疫效果的影响，将细胞工厂培养和鸡胚扩增的两种病毒液分别调整为具有相同HA效价、EID₅₀的病毒液；并与原液三组病毒液，分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同的剂量后，观察免疫及保护效果。

1.2.1实验动物分组

NC/NE—表示原始细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

HC/HE—表示经稀释得到的具有相同HA效价的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

EC/EE—表示经稀释得到的具有相同EID₅₀的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

每组10只SPF鸡，同时留5只不免疫作为对照组。

1.2.2免疫及抗体的测定

所有试验SPF鸡均于负压隔离器内饲养，至4周龄时进行免疫。以每只0.3m1的剂量经颈背部皮下注射免疫。首免后第7、14、21天采血，测定各组抗体效价。

2、实验结果

将分离病毒NJ13-8株油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡，并排除了免疫时抗原量对各组免疫保护效果的影响，在免疫后1周鸡群就可检测到低水平的HI抗体；免疫后2周免疫组所有鸡群都产生明显的抗体，平均HI抗体水平达71og2以上；免疫后3周各试验组的HI抗体平均效价达81og2以上(见表5)，表明分离病毒NJ13-8株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平；且从抗体检测结果可以看出，在各个时间点细胞毒免疫组的抗体水平均要比胚毒免疫组高，尤其原液组，因细胞增殖培养的病毒含量高，抗体滴度较胚毒组高出平均11og2以上，抗体水平上升也较快。

表5不同试验组在免疫后不同时间的抗体水平(1og2)

试验例1H9N2亚型禽流感病毒在细胞工厂中增殖条件的优化

本发明分别研究了细胞密度、病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、BSA浓度和病毒培养时间五个因素对禽流感病毒NJ13-8株(CGMCCNo.9325)增殖的影响，比较AIV病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异。

1、细胞密度对禽流感病毒增殖的影响

在不同细胞密度(表6)，按MOI＝0.2接种病毒，37℃培养，在不同时间点收获病毒，比较AIV病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异，结果见表6。

表6不同细胞密度接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表6中可以看出，细胞密度为0.8×10⁵细胞/ml时，AIV病毒HA达到7log2，显著优于其它处理。因此，本发明利用细胞工厂增殖AIV病毒的细胞密度确定为0.8×10⁵细胞/ml。

2、病毒感染复数(MOI)对禽流感病毒增殖的影响

在细胞密度为0.8×10⁵细胞/ml，按MOI＝0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5分别接种AIV病毒，37℃培养，在不同时间点收获病毒。比较AIV病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异，结果见表7。

表7不同病毒感染复数接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表7中可以看出，病毒感染复数MOI为0.8时，AIV病毒HA达到8log2；优于另外几种处理。病毒感染量过低使增值速度降低，无法达到较高的血凝价。因此，本发明利用细胞工厂增殖AIV病毒的病毒感染复数MOI为0.8，病毒增殖速度较快，且达到较高的血凝价。

3、TPCK-胰酶浓度对禽流感病毒增殖的影响

在细胞密度为0.8×10⁵细胞/ml，按MOI＝0.8接种AIV病毒，TPCK-胰酶浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0和4.0μg/ml，37℃培养，每隔12h，收获病毒，测定血凝价(HA)，结果见表8。

表8不同TPCK-胰酶浓度接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表8中可以看出，TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml时，培养60-72h时AIV病毒最高血凝价从8log2提高到9.6log2，显著优于其它处理。因此，本发明利用细胞工厂增殖AIV病毒的病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml。

4、BSA浓度及培养时间对禽流感病毒增殖的影响

在细胞密度为0.8×10⁵细胞/ml，按MOI＝0.8接种AIV病毒，病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml，BSA浓度分别设为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％，37℃培养，不同时间点收获病毒。比较AIV病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异，结果见表9。

表9不同BSA浓度接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表9中可以看出，BSA浓度为1.0％时，培养60-72h，AIV病毒HA达到最高值11log2；明显优于其它处理。因此，本发明利用细胞工厂增殖AIV病毒的病毒维持液中BSA浓度确定为1.0％；37℃培养60-72h。

5、禽流感病毒在细胞工厂中增殖条件的优化结果

综上，确定H9N2亚型禽流感病毒在细胞工厂中增殖的最佳条件为：细胞密度0.8×10⁵细胞/ml；按MOI＝0.8接种AIV病毒；病毒维持液中BSA浓度为1.0％；病毒维持液中同时含2.0μg/ml的TPCK-胰酶；37℃培养60-72h。

Claims (10)

1.一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用细胞工厂培养MDCK细胞；(2)接种H9N2亚型禽流感病毒，在细胞工厂中增殖病毒；其中，所述H9N2亚型禽流感病毒毒株的微生物保藏编号为：CGMCC No.9325；(3)收获病毒液，制备灭活疫苗。

2.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤(1)中培养MDCK细胞至细胞密度为0.8×10⁵细胞/ml。

3.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤(2)H9N2亚型禽流感病毒按病毒感染复数MOI＝0.8进行接种。

4.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤(2)在细胞工厂中增殖病毒，病毒维持液为不添加血清的DMEM；其中，病毒维持液中加入终浓度1.0％BSA；37℃培养60-72h。

5.按照权利要求4所述的生产方法，其特征在于：步骤(2)中病毒维持液中还含有2.0μg/ml的TPCK-胰酶。

6.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(3)中制备灭活疫苗包括：将病毒液5000r/min离心30min，取上清；加入灭活剂甲醛溶液，其终浓度为病毒液上清总量的0.2％；加入佐剂，混合乳化后，即得。

7.按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于：步骤(3)中病毒液上清于37℃灭活24h。

8.按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤(3)中将灭活的病毒上清液与进口油佐剂按照体积比1：3混合乳化后，即得。

9.权利要求1-8任何一项所述生产方法制备得到的H9N2亚型禽流感灭活疫苗。

10.权利要求9所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗在制备预防或治疗H9N2亚型禽流感的药物或试剂中的用途。