CN102114243B - 流行性感冒原代地鼠肾细胞多价疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备流感疫苗的方法，包括步骤：a)将流感病毒原始毒种通过无特定病原鸡胚适应性传代，作为主代种子；b)原代地鼠肾细胞的制备及利用培养瓶或细胞生物反应器进行培养；c)用主代种子感染原代地鼠肾细胞，并进行适应性传代，直至得到病毒血凝效价不低于1∶640的毒种作为疫苗的工作种子；d)用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增，直至病毒血凝效价不低于1∶320为疫苗单价原液；e)疫苗单价原液经浓缩、灭活、纯化后，将不同型别的单价病毒液进行混合，分装成成品。原代地鼠肾细胞来源充足，易于大规模生产，制备的疫苗中不含对人或动物体具有致瘤性的可复制的DNA，安全性高。

Description

流行性感冒原代地鼠肾细胞多价疫苗的制备方法

本申请是中国专利申请CN200610112125.9的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备流行性感冒原代地鼠肾细胞疫苗的方法以及制备的疫苗。

背景技术

流行性感冒简称流感，是一种严重的呼吸道传染病。在1918-1919年的流感大流行中，由于感染了流感病毒而死亡的人数比持续4年的第二次世界大战中死亡人数还要多。流感的特征往往是反复流行，突然发生，迅速传播，小则局部流行，大则遍及全球。婴儿和老人病死率高，每年数以万计。目前流感仍是影响世界公众健康的重要问题，而最近高致病的禽流感又大有侵袭人类的危险，所以接种疫苗仍是当前预防流感和禽流感传播感染的重要手段之一。

作为流感的病原体，流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)型流感病毒。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒常常引起流感局部暴发，不会引起世界性流感大流行，至今尚未找到它存在于人之外的其它动物中的确凿证据。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。过去一直认为人是丙型流感病毒唯一的天然宿主，但近年来这种看法已得到了彻底纠正，郭元吉等人于1981～1982年从我国猪群中分离出多株丙型流感病毒，并已得到了世界公认。所有流感病毒均为正粘病毒，分三个型别，即甲、乙和丙型流感病毒。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的差异又可分为不同亚型，迄今甲型流感病毒HA有15个亚型(H1-H15)，NA有9个亚型(N1-N9)，H和N均为糖蛋白，H、N的变异是独立的。

根据1980年世界卫生组织公布的流感病毒的命名如下：甲型流感病毒命名法可用下列公式表示之：型别/宿主/分离地点/毒株序号(指采样时标本号)/分离年代(血凝素亚型、神经氨酸酶亚型)，其中宿主为人的可以忽略不写。乙型和丙型流感病毒的命名法和甲型相同，但无亚型划分。

流感是一种古老性疾病，至今在防治方面尚未找到真正的突破口。由于流感病毒的抗原性，尤其HA蛋白的抗原性，能经常不断地发生变异，这不仅给疫苗制备增加了难度，更主要的是能很快使疫苗免疫接种效果下降，甚至无效，所以人类一直不断地在开发新的疫苗，以应对新一轮次流感的袭击。

本世纪30年代初，流感病毒灭活疫苗就开始进行动物实验。当时用受染的小鼠肺所制成匀液中的流感病毒，经甲醛灭活接种动物，然后用流感野毒株皮下和腹腔内攻击，以了解是否有免疫保护。显然这种疫苗不能用于人体。

1937年，鸡胚培养流感病毒获得成功，使大量生产疫苗成为可能。流感病毒灭活疫苗于1941年在美国首次被批准使用。1943年美国开始在军队中使用，并证实有效；1945年在美国开始广泛应用。这种早期粗制的疫苗，是用含流感病毒粒的鸡胚尿囊液，经红细胞吸附和释放有限的纯化，然后甲醛灭活。接种疫苗后，局部和全身反应都很强。

本世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使毒粒纯化操作能力大大提高，制成了全毒粒疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。后来经过进一步用裂解剂裂解病毒并进行纯化制备出流感裂解疫苗，使用时不良反应就大为减少。前后研制出多种裂解剂，如乙醚，3-N-丁基磷酸盐(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate 80)，脱氧胆酸钠(Sodiumdeoxycholate)，三硝基甲苯X-100(Triton X-100)等。流感裂解疫苗1968年在美国首次被批准使用。

本世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位和表面抗原(HA和NA)疫苗。英国在临床疫苗试用中，证实了免疫效果与裂解疫苗相同，并可用于儿童。1980年英国首次批准使用，而后扩展到其它国家。在我国，以朱既明教授为首的一批科研工作者的辛勤工作下，建立了我国流感研究中心，并组织开发了超速离心提纯的甲型流感单价灭活疫苗。随着流感流行病学研究的深入，发现在流感流行中，常常有甲、乙型流感同时流行，特别是1976年以来，又形成了甲₁(H₁N₁)及甲₃(H₃N₂)同时流行的局面。因此，为了有效的预防流感，对流感灭活疫苗抗原的组成，不仅要求含有当前流行株的同类抗原，而且必须含有同时流行的各种型或亚型的抗原成份。所以，我国先是研究生产了双价及三价(甲₁、甲₃、乙型)流感灭活疫苗，并在长春生物制品研究所投入生产。在预防和控制流感的流行中取得了比较满意的防病效果。

最初的流感灭活全病毒疫苗是从感染的鸡胚尿囊液中分离流感病毒颗粒制成的。其工艺中单纯的超速离心虽然收集了大部分的流感病毒，但有大量的宿主蛋白，这是流感灭活疫苗引起副反应的主要原因之一。为了提高流感灭活疫苗的免疫原性，降低其副反应，许多工作者致力于疫苗生产工艺的研究。目前，国内外许多制造流感全病毒灭活疫苗的厂家，通常使用离心法和柱层析法从感染的鸡胚尿液中分离流感病毒，用此种技术生产的病毒制品，纯度是比较高的，疫苗接种后的副反应性也有减弱。

随着人们对流感疫苗免疫研究的深入，发现流感病毒的表面抗原，即血凝素和神经氨酸酶所产生的抗体，对同型的流感病毒攻击具有保护作用，而两种表面抗原中产生抵抗力的主要是血凝素抗原。

血凝素抗原和神经氨酸酶的抗原所赋予的免疫性在机制上是不同的。血凝素抗体中和病毒的感染性，并抑制最初的感染，而神经氨酸酶抗体则限制病毒在感染个体中的散播，因而，限制了病毒自呼吸道扩散并减少了疾病的严重性。目前，没有证据表明流感病毒颗粒的主要内部抗原，即核蛋白(NP)和基质蛋白(M)具有免疫性。由于以上的基础研究工作的进展，使人们在考虑疫苗的安全性和有效性的基础上，进一步对工艺进行了改进，开发出了流感裂解疫苗和流感亚单位疫苗。在开发过程中，很多科学工作者对裂解工艺进行了改进，如裂解剂的种类、浓度、裂解时间、裂解的时段等等，并且纯化方法也有所提高。而不同的工艺使得最终病毒原液的性能也有所区别。这些研究成果，不仅为流感裂解疫苗明确了质控指标，而且为流感病毒灭活疫苗的新剂型和新技术打下了一定基础。

由于在鸡胚上流感病毒具有即强又快的适应性，使得目前人们一直沿用鸡胚来作为流感疫苗生产过程中病毒培养和增殖的基质，这也使得在流感疫苗生产过程中，一直要严格控制生产用鸡胚的质量，使之不能受到各种病毒(尤其是逆转录病毒)污染。而与此同时，由于鸡胚的扩大生产受到多方面的影响，诸如禽流感、禽白血病等等，使得近年来国内外加速研究用细胞作为流感病毒传代增殖的基质。目前美国使用一种传代细胞，即MDCK细胞(一种狗肾细胞)进行流感病毒的传代取得突破，该细胞制备的疫苗正在进行临床试验；而加拿大和我国的一些公司也在进行传代细胞为基质的流感疫苗的研究。他们是在Vero细胞中培养流感病毒，并且取得了一些进展，其中进展快一些的加拿大公司已经进入临床实验阶段。然而，用这两种传代细胞作为培养基质，都存在的共同问题是适应期长，收获的病毒滴度偏低等不足，而且传代细胞DNA很难通过纯化的方法去除，因此利用传代细胞制备的疫苗具有致瘤性的潜在危险。而原代细胞作为流感病毒增殖传代的基质细胞来制备流感疫苗，不仅解决了鸡胚来源不足和疫苗易受逆转录病毒污染的问题，还解决了流感病毒在传代细胞适应慢和病毒滴度弱的不足的问题，同时由于原代地鼠肾细胞不具有传代性，即细胞DNA不具有复制性，所以制备出来的疫苗不具有致瘤性的危险。自80年代，我国的一些单位已经将原代地鼠肾细胞应用于狂犬疫苗制备，也有利用原代地鼠肾细胞来制备出血热疫苗，如中国专利申请第99107985.X号公开的技术。这说明原代地鼠肾细胞可以应用于疫苗的生产。然而，不同的病毒在原代细胞上的适应性也不同，对原代细胞的不同培养方式以及病毒适应时期都需要做大量的试验摸索，以促进病毒的适应性和病毒在原代细胞上的稳定增殖性。国内外还没人有报道过利用原代地鼠肾细胞制备流感疫苗的先例。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的流行性感冒疫苗的制备方法。该方法采用原代地鼠肾细胞作为流感病毒的增殖基质，解决了鸡胚来源不足和疫苗易受逆转录病毒污染的问题，还解决了流感病毒在传代细胞适应慢和病毒滴度弱的不足的问题。由此制备的疫苗中不含有可复制的DNA成分，简化了疫苗工艺，并且提高了疫苗的安全性。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种制备流行性感冒疫苗的方法，包括如下步骤：

a)将流行性感冒病毒原始毒种通过无特定病原鸡胚进行适应性传代，制备主代种子；

b)制备原代地鼠肾细胞，利用培养瓶或细胞生物反应器进行细胞扩增；

c)用主代种子感染原代地鼠肾细胞，并进行适应性传代，制备工作种子；

d)用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增，制备疫苗原液。

e)将疫苗原液经浓缩、灭活、纯化后，获得流行性感冒病毒疫苗。

上述步骤a)中的流行性感冒病毒原始毒种可以是世界卫生组织(WHO)每年推荐的或国家相关部门批准的人流行性感冒病毒毒种或禽流行性感冒病毒毒种；所述流行性感冒病毒原始毒种优选通过1～3代SPF鸡胚适应性传代，取血凝效价(HA)达到1∶320以上的鸡胚尿囊液作为主代种子。

步骤b)中的原代地鼠肾细胞可以是新制备的原代地鼠肾细胞，也可以是经过培养的原代地鼠肾细胞；优选为经过培养的原代地鼠肾细胞，以增加细胞的量，有利于在病毒感染后提高病毒收获液的血凝滴度，并且与传代细胞制备流感疫苗工艺相比，在制备过程中没有去除DNA的纯化工序。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，原代地鼠肾细胞优选取自10～14日龄的地鼠，将地鼠进行消毒处理后，无菌取肾、剪碎、用胰蛋白酶和EDTA组成的消化液将组织小块消化分散成为单个细胞悬液，其细胞浓度优选为约1.0×10⁷～5.0×10⁸个/ml。

步骤c)中的主代种子到工作种子在原代地鼠肾细胞适应性传代的次数为1～10代，优选为3～8代，更优选为3～6代。

原代地鼠肾细胞进行扩增培养或者用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增时，培养方式选自玻璃瓶贴壁培养、生物反应器微载体悬浮培养或生物反应器片状载体篮式培养。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，步骤b)中原代地鼠肾细胞培养时，采用基础培养基中另外加入一定浓度的促生长剂作为生长液；步骤c)中用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增时，采用基础培养基中另外加入一定浓度促生长剂作为细胞维持液(包括I和II)。

所述基础培养基选自M199、MEM、DMEM、IMDM、IPM1640和Ham F₁₂培养基中的一种或多种的组合，其配方根据培养的不同阶段采取不同浓度配比。所述促生长剂能促细胞生长和促病毒增殖，其成分为小牛或胎牛血清、人血白蛋白、胰蛋白酶、胰岛素、半胱氨酸和多聚赖氨酸中的一种或多种的组合。当使用的基础培养基为液体时，所述促生长剂的加量与基础培养基按重量与体积(g/ml)比为1∶1000到1∶10，当培养基为干粉时，取相当量，余量为水。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的另一个优选方案，不论是在毒种制备还是在疫苗生产时，原代地鼠肾细胞的培养阶段，所用生长液中促生长剂的量与液体基础培养基按重量与体积(g/ml)比为1∶50到1∶10；原代地鼠肾细胞感染流感病毒后采用的维持液中促生长剂的量与液体基础培养基按重量与体积(g/ml)比为1∶1000到1∶50；当培养基为干粉时，取相当量，余量为水。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，原代地鼠肾细胞培养时加入的促生长剂优选为小牛血清、胰岛素和多聚赖氨酸，每100ml生长液中含有基础培养基IMDM或者DMEM为90～95ml(或相当量的干粉培养基，余量为水)、小牛或胎牛血清为5～10克(相当于5～10ml)、胰岛素为0.005～0.05克、多聚赖氨酸为0.001～0.05克，更优选小牛血清、胰岛素和多聚赖氨酸的重量份之比为80∶0.2∶0.1；原代地鼠肾细胞感染流感病毒后所用维持液I中加入的促生长剂优选为人血白蛋白、半胱氨酸和胰岛素，每100ml的维持液I含有基础培养基IMDM或者DMEM为75～97.5ml(或相当量的干粉培养基，余量为水)、人血白蛋白0.5～5克(相当于20％(质量/体积)的人血白蛋白为2.5～25ml)、半胱氨酸0.05～0.5克以及胰岛素为0.005～0.05克，更优选人血白蛋白、半胱氨酸和胰岛素的重量份之比为20∶1∶0.1；所用维持液II中加入的促生长剂优选为人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶，100ml的维持液II含有基础培养基为90～99ml(或相当量的干粉培养基，余量为水)、人血白蛋白0.2～2克(相当于20％(质量/体积)的人血白蛋白为1～10ml)、半胱氨酸为0.05～0.5克以及胰蛋白酶0.01～0.1克，更优选人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶的重量份之比为10∶1∶0.5。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，将肾组织消化下来的细胞接种于培养瓶或细胞生物反应器中，接种后培养容器中的细胞初始浓度为约1.0×10⁵～1.0×10⁶个/ml，采用生长液培养60～80小时，换成维持液进行病毒感染。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，原代地鼠肾细胞培养达到细胞浓度为约1.0×10⁷～1.0×10⁸个/ml时，或者原代地鼠肾细胞在培养瓶(包括细胞培养瓶、转瓶等可用于细胞培养的器皿)中培养达到占据培养面的约60％～80％或生物反应器培养中细胞在载体上的贴壁率达到约70％～90％时，进行流感病毒的感染。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，在用工作种子感染原代地鼠肾细胞时，原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子用维持液I稀释10²～10⁴倍，然后感染原代地鼠肾细胞，并在37℃适应吸附于细胞1～6小时，改变成32～35℃维持培养，感染后的1～2天，更换成维持液II，继续维持培养1～3天，收获细胞感染液及细胞。

按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，单价病毒液经检定合格后进行离心、超滤浓缩、灭活、超速离心、凝胶层析以及不同型别的单价病毒液的混合后，分装成成品。

本发明的另一个目的是提供根据上述方法制备的流行性感冒疫苗。

所述制备的疫苗可以是人、禽或其它动物的流感全病毒疫苗、流感裂解疫苗或流感亚单位疫苗，优选为流感裂解疫苗。

本发明的流感疫苗的制备艺方法与现有技术相比具有明显的优势：

1)原代地鼠肾细胞能够很好地应用于流感疫苗毒种的适应传代，并能使该适应株很好地保持原病毒株的毒力，且该病毒株可以在培养瓶或生物反应器中培养的原代地鼠肾细胞上增殖，解决了流感病毒在传代细胞适应慢和病毒滴度弱的问题；

2)地鼠繁殖能力强，生长快，其肾脏来源充足，原代地鼠肾细胞作为流感病毒培养和增殖的基质细胞，解决了鸡胚来源受限的问题，并且与鸡胚相比，不易受到其他病毒，尤其是逆转录病毒的污染；尤其在禽流感爆发，由于鸡的禽流感病毒感染的可能性使鸡胚的来源中断时，本发明为流感疫苗的生产提供了一种有效的培养基质和可以产业化的工艺；

3)本发明采用的原代地鼠肾细胞直接来自地鼠的肾脏组织，这种细胞传代能力很弱，即细胞中DNA复制很差，细胞个体分生2～3次后，其DNA就不具有复制能力了，因此制备的疫苗中不含可复制的DNA成分，不具有致瘤性的危险，而且可以简化了疫苗的纯化步骤，降低流感疫苗的生产成本，有利于大规模生产；而传代细胞在体外培养时能够传5代以上，在1次传代过程中，细胞个体一般分生2～4次，例如现行开发的Vero细胞或MDCK细胞制备的流感疫苗，Vero细胞可以传代150次以上，MDCK细胞可以传代80次以上，这两种细胞的DNA在体外培养过程中复制能力是非常强的，制备的流感疫苗具有致肿瘤的危险；

4)根据本发明的方法制备的流感疫苗不含有对人体或其他动物具有致瘤性的可复制的DNA，消除了逆转录病毒进入机体导致肿瘤的危险，提高了疫苗的安全性，消除使用者的恐惧心理。

具体实施方式

一、流行性感冒病毒原代地鼠肾细胞适应的毒种制备

1.流行性感冒病毒毒种的获取

原始毒种甲₁(H₁N₁)型为IVR-116，系鸡胚8代尿囊液冻干保存毒种；甲₃(H₃N₂)型为NYMC X-15F，系鸡胚8代尿囊液冻干保存毒种；乙型为B/Jiangsu/10/2003，系鸡胚6代尿囊液冻干保存毒种。上述三种毒种均购自英国国家生物制品及标准化控制研究所(NIBSC)，为WHO推荐的流感疫苗株。

2.主代病毒种子库的建立

将上述三种毒种分别在专用的无菌室内启封，在SPF鸡胚上进行1～3次适应性传代。将收获的病毒尿囊液分别进行无菌试验、血凝效价的测定。无菌试验合格，选择血凝效价(HA效价)达到1∶320以上的作为生产用主代种子。并对其进行EID50、HI及中和试验等指标进行检定，建立主代病毒种子库。

3.原代地鼠肾细胞的培养

选10～14日龄健康的金黄地鼠(Mesocricetus auratus，简称地鼠)，用饮用水杀死并清洗1～2次，用1‰新洁尔灭消毒1～3次，每次3～8分钟。在无菌环境下，用无菌剪子解剖地鼠并取出肾脏，剪碎后加入含0.1％～0.5％的胰蛋白酶和0.01％～0.05％的EDTA组成的消化液，置于2-8℃冷消化15～20小时，弃掉消化液，加入生长液分散细胞，并制备成1.0×10⁷～1.0×10⁸个/ml的悬液。取1～2ml细胞悬液接种于玻璃方瓶中，用生长液加至10ml，放置于37℃的CO2培养箱中培养24～48小时，培养瓶中培养达到占据培养面的60％～80％时弃掉生长液，用生理盐水轻轻地漂洗1～3次细胞面，然后换成病毒感染液。生长液由基础培养基IMDM或者DMEM加入小牛(胎牛)血清、胰岛素、多聚赖氨酸制成，其中每100ml生长液中含有基础培养基IMDM或者DMEM为90～95ml、小牛(胎牛)血清为5～10ml、胰岛素为0.005～0.05克、多聚赖氨酸为0.001～0.05克。

4.用主代流感病毒种子感染原代地鼠肾细胞

用维持液I将主代流感病毒种子液稀释10²～10⁴倍作为病毒感染液感染制备好了的细胞。维持液I是由基础培养基IMDM或者DMEM加入人血白蛋白、半胱氨酸和胰岛素组成。其中每100ml的维持液I含有基础培养基IMDM或者DMEM为75～97.5ml、20％(质量/体积)的人血白蛋白为2.5～25ml、半胱氨酸0.05～0.5克以及胰岛素为0.005～0.05克。

5.原代地鼠肾细胞感染后培养(工作种子库的建立)

将感染后的培养瓶放于37℃的CO₂培养箱中，使病毒吸附1～5小时，然后改变温度为32～35℃维持培养1～2天，更换一次维持液I。继续维持培养1～2天，收获病毒液。然后分别进行无菌试验、血凝效价的测定。如无菌试验合格，血凝效价在1∶640以下，则用病毒液继续感染培养好了的地鼠肾细胞，同样在32～35℃维持培养2～4天，收获病毒液，再进行无菌试验、血凝效价(HA效价)的测定。当无菌试验合格，血凝效价(HA效价)达到1∶640或以上时，将病毒液作为流行性感冒原代地鼠肾细胞纯化疫苗生产用的工作种子。对其进行EID₅₀、HI及中和试验等指标的检定。

如收获的病毒液无菌试验不合格，则重新利用主代病毒种子在原代地鼠肾细胞上适应传代。主代种子到工作种子，在地鼠肾细胞上适应性传代为8代以内，一般为3～8代，更优选3～6代，其毒株的抗原性、毒力、毒性与原始毒株应当保持一致。

二、疫苗原液的生产

1.地鼠肾细胞的制备

选10～14日龄健康的金黄地鼠，饮用水杀死并清洗1～2次，用1‰新洁尔灭消毒1～3次，每次3～8分钟。在无菌环境下，用无菌剪子解剖地鼠并取出肾脏，剪碎后加入由0.1％～0.5％的胰蛋白酶和0.01％～0.05％的EDTA组成的消化液，置于2～8℃冷消化15～20小时，弃掉消化液，加入生长液分散细胞，制备成1.0×10⁷～1.0×10⁸个/ml的细胞悬液。取该原代细胞悬液，按照细胞悬液∶生长液为1∶20～1∶100的比例接种于3L、10L转瓶中或者接种于细胞生物反应器中，再加入生长液，使细胞的初始浓度为1.0×10⁵～5.0×10⁶个/ml。转瓶在37℃有CO₂的环境下进行细胞培养，而细胞生物反应器则设定好培养条件进行培养，其培养条件为：转速为50～80rpm，温度为36℃～38℃，pH为6.5～7.5，溶氧为15％～85％。

2.种子病毒的接种和疫苗原液的收获

当细胞培养浓度达到1.0×10⁷～1.0×10⁸个/ml时；或者原代地鼠肾细胞在转瓶中培养达到占据培养面的60％～80％或生物反应器培养中细胞在载体上的贴壁率达到70％～90％时，用生理盐水漂洗1～3次，换成维持液I。将原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子用维持液I稀释10³～10⁵倍，然后进行感染，并在37℃适应吸附于细胞1～6小时，改变成32～35℃维持培养，感染后的1～2天，更换成维持液II。继续维持培养1～3天，收获细胞感染液及细胞，置于-60℃冻溶融2～3次后，取样做无菌试验和血凝效价(HA效价)测定。其中，维持液II是由基础培养基M199或者MEM加入人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶组成。100ml的维持液II含有基础培养基为90～99ml、20％(质量/体积)的人血白蛋白为1～10ml、半胱氨酸为0.05～0.5克以及胰蛋白酶0.01～0.1克。

三.疫苗原液的处理纯化及疫苗的配制

当无菌试验合格，血凝效价达到1∶320以上时，则将单价病毒液，离心后进行超滤浓缩，然后按灭活剂和单价病毒液的体积比1∶4000加入灭活剂进行灭活，灭活剂为甲醛溶液或者β-丙内酯溶液。然后进行1000～2000rpm低速离心，取上清，经过超滤，可使样品浓缩20倍以上，同时去除相当的杂质。经超速离心和Sepharose 4FF凝胶过滤层析纯化，经平衡、上样、清洗和洗脱后，总回收可达80-90％，纯化后的单价病毒液过滤除菌，并抽样进行单价病毒液检定。然后根据不同单价原液血凝素抗原含量的相应比例进行混合(合并)，即为疫苗半成品。检定合格后分装成为成品。

实施例一：流行性感冒病毒原代地鼠肾细胞适应的毒种制备

原始毒种甲₁(H₁N₁)型为IVR-116，系鸡胚8代尿囊液冻干保存毒种；甲₃(H₃N2)型为NYMC X-15F，系鸡胚8代尿囊液冻干保存毒种；乙型为B/Jiangsu/10/2003，系鸡胚6代尿囊液冻干保存毒种。

将上述三种毒种在专用的无菌室内启封，分别在SPF鸡胚上进行2次适应性传代。最终收获的病毒尿囊液，分别进行无菌试验、血凝效价(HA效价)的测定。无菌试验合格，甲1和甲3的血凝效价均为1∶640，乙型的血凝效价为1∶320，从而建立生产用主种子库。并对其进行EID₅₀、HI及中和试验等指标的检定。其结果见表1。

表1.流感主代毒种的检定结果

单价主代毒种

EID50

HI效价

中和指数

甲1(IVR-116)	10-90	1∶640	9.0logEID50/0.2ml
				甲3(NYMC X-15F)	10-9.0	1∶640	9.0logEID50/0.2ml
乙型(B/Jiangsu/10/2003)	10-9.25	1∶640	9.25logEID50/0.2ml

取11日龄健康的金黄地鼠，用饮用水杀死并清洗2次，用1‰新洁尔灭消毒2次，每次5分钟。在无菌环境下，用无菌剪子解剖地鼠并取出肾脏，剪碎后加入含0.15％胰蛋白酶和0.01％EDTA的消化液，置于2-8℃冰箱中冷消化18小时，弃掉消化液，用生理盐水洗涤2次，加入生长液分散细胞，制备成4.0×10⁷个/ml的悬液。生长液为基础培养基IMDM加入8％(以生长液为100的重量百分比)小牛血清、0.02％胰岛素、0.01％多聚赖氨酸等细胞生长促进剂。取2ml细胞悬液接种于玻璃方瓶中，再加入生长液8ml，放于37℃的CO₂培养箱中培养。

培养40小时后，培养瓶中的细胞达到占据培养面的60％～80％时，弃掉生长液，用生理盐水轻轻地漂洗2次细胞面，换成维持液I。其组成为每100ml维持液I中加入基础培养基IMDM 1克(培养基为干粉时)、人血白蛋白2克、半胱氨酸0.1克、胰岛素0.01克，其余的为水。同时，将主代单价的流感病毒种子用维持液I按10³倍稀释，分别进行感染。感染后的培养瓶放于37℃的CO₂培养箱中，使病毒吸附4小时，然后改变温度为34℃维持培养2天，将维持液I吸出换成新鲜的维持液I，继续培养2天，收获病毒液，分别进行无菌试验、血凝效价(HA效价)。其无菌试验合格，血凝效价分别均为1∶320，收获病毒液，并将其病毒液继续感染培养好了的地鼠肾细胞，同样34℃维持培养，4天时收获病毒液，然后进行无菌试验、血凝效价的测定。无菌试验合格，甲1和乙型的血凝效价分别为1∶320，甲3的血凝效价为1∶640。保存病毒收液，同时也将收获的病毒液接种于已换成维持液的培养瓶中(细胞达到占据培养面的60％～80％时)，接种比例为4∶6(病毒收液∶维持液)34℃维持培养2天，收获病毒液，进行无菌试验、血凝效价的测定。其检定结果为：无菌试验合格，可复制的DNA为阴性，血凝效价均为1∶640。将各单价收液分别分成两部分，一部分冷冻干燥成冻干粉剂，一部分不冻干，并分别储存于-70℃的超低温冰箱中备用。

实施例二：流行性感冒病毒原代地鼠肾细胞适应的毒种制备

原始毒种甲₁(H₁N₁)型为IVR-116，系鸡胚8代尿囊液冻干保存毒种：甲₃(H₃N₂)型为NYMC X-15F，系鸡胚8代尿囊液冻干保存毒种；乙型为B/Jiangsu/10/2003(2004年WHO推荐)，系鸡胚6代尿囊液冻干保存毒种。

主代种子为实施例一制备的三个型别的流感主代种子。

地鼠肾解剖、制备细胞悬液以及接种玻璃瓶培养均同实施例一。

当培养瓶中细胞达到占据培养面的60％～80％时，漂洗后换成维持液I，并分别用维持液I按10³倍稀释各型别的主代流感病毒种子进行感染。将感染后的培养瓶放于37℃的CO₂培养箱中，使病毒吸附6小时，然后改变温度为34℃维持培养2天，收获病毒液，分别进行无菌试验、血凝效价。其无菌试验合格，血凝效价均为1∶320，收获病毒液，并将其病毒液继续感染培养好了的地鼠肾细胞，同样34℃维持培养3天，收获病毒液，然后进行无菌试验、血凝效价(HA效价)的测定。无菌试验合格，甲1和甲3的血凝效价(HA效价)为1∶640，乙型的血凝效价(HA效价)为1∶320。保存病毒收液，同时也将收获的病毒液接种于已换成维持液的培养瓶中(细胞达到占据培养面的60％～80％时)，接种比例为2∶3(病毒收液∶维持液)34℃维持培养3天，收获病毒液，进行无菌试验、血凝效价(HA效价)的测定。其检定结果为：无菌试验合格，血凝效价(HA效价)为1∶640，保存病毒收液，同时再将收获的病毒液接种于已换成维持液的培养瓶中(细胞达到占据培养面的60％～80％时)，接种比例为1∶5(病毒收液∶维持液)34℃维持培养2天，收获病毒液，进行无菌试验、血凝效价的测定。其检定结果为：无菌试验合格，甲1和乙型的血凝效价分别为1∶640，甲3的血凝效价(HA效价)为1∶1280。将此收液分成两部分，一部分冷冻干燥成冻干粉剂，一部分不冻干，并分别储存于-70℃的超低温冰箱中作为工作种子备用。

实施例三：流感全病毒灭活疫苗的制备

毒种为实施例二的原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子。

取11日龄健康的金黄地鼠，饮用水杀死并清洗2次，用1‰新洁尔灭消毒2次，每次5分钟。在无菌环境下，用无菌剪子解剖地鼠并取出肾脏，剪碎后加入含0.15％胰蛋白酶和0.01％EDTA的消化液，置于2-8℃冷消化16小时，弃掉消化液，加入生长液分散细胞，并制备成5.0×10⁷个/ml的细胞悬液。取该原代细胞悬液15ml接种于3L转瓶中，补加285ml的生长液，使细胞的初始浓度为2.5×10⁶个/ml。转瓶在37℃有CO₂的环境下进行细胞培养。2天后，原代地鼠肾细胞在转瓶中培养已达到占据培养面的80％时，弃去细胞生长夜，用生理盐水漂洗细胞培养面2次，换成维持液I，其换液量为270ml，同时分别感染30ml已制备好(用维持液I进行10³倍稀释)的三个型别的单价流感地鼠肾细胞适应的病毒工作种子。在37℃适应吸附3小时，改变成34℃维持培养，感染后2天，换成维持液II。维持液II是由基础培养基M199加入1％(以维持液II为总量100计)的人血白蛋白、0.1％的半胱氨酸、0.05％的胰蛋白酶组成。继续维持培养3天，收获细胞获感染液，再将细胞撞下，置于-60℃冻溶融后再与收获液混合，并取样做无菌试验和血凝效价测定。检定结果为：甲1、乙型为1∶640，甲3为1∶1280。

将上述检定合格的单价病毒液合并，1000～2000rpm低速离心后，上清进行超滤浓缩，浓缩液再经超速离心取沉淀，并用PBS溶解后按1∶4000加入灭活剂进行甲醛溶液灭活。灭活的病毒液经离子交换和凝胶过滤纯化。其病毒回收率可达到90％以上，同时可使样品浓缩20倍以上。纯化后的单价病毒液过滤除菌，并抽样进行单价病毒液的检定。其检定结果为：甲1、乙型为1∶10240，甲3为1∶20480。根据不同单价原液血凝素抗原含量，按2∶2∶1的比例进行混合，加入硫柳汞至终浓度0.008％作为防腐剂，即为疫苗半成品。检定合格后分装成为成品。

实施例四：流感裂解疫苗的制备

毒种为实施例二的原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子。

取肾制备的细胞悬液的过程同实施例三。取该原代细胞悬液(细胞浓度为5.0×10⁷个/ml)70ml接种于5L生物反应器中，生物反应器中事先经过灭菌以及装有Cytodex 1(或Cytodex 3)的微载体，接种细胞后补加生长液至3.5L，使细胞的初始浓度为1.0×10⁶个/ml。设定培养条件为，温度37℃，pH6.7，溶氧35％。2天后取样观察并计数细胞，细胞的满球率达到85％，细胞浓度为2.4×10⁷个/ml。将带有细胞的微载体自然沉降，排出生长液，用生理盐水漂洗1次，然后更换成维持液I。将甲1型原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子用维持液I1000倍稀释，然后加入100ml于生物反应器中进行感染。并在不改变培养条件下，适应吸附5小时，然后改设温度为34℃，pH7.2，溶氧45％维持培养。感染后2天，换成维持液II，继续维持培养2天，收获细胞获感染液，并将细胞从微载体上撞下，置于-60℃冻溶融后再与收获液混合，2000rpm离心去沉淀，并取样做无菌试验和血凝效价测定。

同样的方法，利用生物反应器培养原代地鼠肾细胞，而分别再感染甲3型和乙型的工作毒种，分别取样测定无菌试验和血凝效价测定。

测定的结果：无菌试验均合格，甲1、甲3的血凝效价均为1∶1280，乙型为1∶640。

将上述检定合格的单价病毒液分别以1000～2000rpm低速离心后，上清进行超滤浓缩，浓缩液再经超速离心取沉淀，并用PBS溶解沉淀后按1∶4000加入甲醛溶液对单价病毒液进行灭活。灭活的单价病毒液加入Triton X100裂解液裂解1～2小时，再经离子交换和凝胶过滤纯化。收集抗原液，经过滤除菌后成为单价病毒裂解液，并抽样进行的检定。其检定结果为：甲1、甲3为1∶40960，乙型为1∶20480。根据不同单价疫苗血凝素抗原含量，按1∶1∶2的比例进行混合，加入硫柳汞至终浓度0.008％作为防腐剂，即为裂解疫苗的半成品。检定合格后分装成为成品。

实施例五：流感亚单位疫苗的制备

毒种为实施例二的原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子。

原代地鼠肾细胞的制备同实施例二，细胞制备成5.0×10⁷个/ml的细胞悬液。取该原代细胞悬液35ml接种于5L篮式生物反应器中，生物反应器以及其中的聚酯纤维片状载体事先经过灭菌处理并浸泡于生长液中，接种细胞后补加生长液至3.5L，使细胞的初始浓度为5.0×10⁵个/ml。设定培养条件为，温度37℃，pH6.8，溶氧40％。2天后取样观察并计数细胞，细胞浓度为1.5×10⁷个/ml。然后更换成维持液I，并感染已稀释好的(1000倍稀释)甲1型原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子100ml。在不改变培养条件下，适应吸附4小时，然后改设温度为34℃，pH7.2，溶氧50％维持培养。感染后2天，换成维持液II，设温度为33℃，pH7.4，溶氧50％继续维持培养3天，收获感染液，同时将载体和部分维持液在无菌条件下取出，置于-60℃冻溶融后再与收获液混合，2000rpm离心去沉淀，并取样做无菌试验和血凝效价测定。

同样的方法，利用篮式生物反应器培养原代地鼠肾细胞，而分别再感染甲3型和乙型的工作毒种，分别取样测定无菌试验和血凝效价测定。

测定的结果：无菌试验均合格，三型血凝效价均为1∶1280。

将上述检定合格的单价病毒液上清分别进行超滤浓缩，浓缩液再经超速离心取沉淀，并用PBS溶解沉淀后按1∶4000加入甲醛溶液对单价病毒液进行灭活。灭活的单价病毒液用Triton X100裂解液裂解和高压匀质机匀质后，经离子交换和凝胶过滤，并收集HA和NA的抗原峰。再经过滤除菌成为单价流感病毒亚单位疫苗的原液，并抽样进行无菌试验，DNA检测以及血凝效价测定。

其检定结果：无菌试验合格，可复制的DNA为阴性，甲1、甲3、乙型均为1∶20480，所以按1∶1∶1的比例进行混合，并加入硫柳汞至终浓度0.008％作为防腐剂，即为裂解疫苗的半成品。检定合格后分装成为成品。

试验实施例一：工作种子检定的相关试验

(一)实验材料：

病毒株：主代种子为实施例一所制备的三个型别的流感主代种子，工作种子为实施例二所制备的流感工作种子。

稀释液：等渗的磷酸盐缓冲液(PBS)。

阳性对照：为实施例一所制备的主种子。

阴性对照：PBS。

血球：鸡的红血球，深圳市孚沃德生物技术有限公司制备。

鸡胚：11日龄的普通受精的鸡胚，市售。

动物：小白鼠，市售。

(二)实验方法：

1.血凝效价测定试验：

1)在V型96孔板的12孔中，各加1滴约25μl的PBS；

2)用微量稀释棒蘸取待测病毒，依次与孔中的PBS混合稀释。同时设标准阳性和阴性对照。

3)每孔中加2滴1％的鸡红血球，混匀，4℃、60分钟后观察并判定结果。

2.工作毒种的EID50测定试验：

采用固定血清稀释病毒法，将病毒稀释成10-6、10-7、10-8、10-9，与等量的血清混合作用适当时间后，接种鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种4个鸡胚。孵化72hr后，收获尿囊液，分别测定血凝效价。同时设标准阳性和阴性对照。按照Reed和Muench法计算待测病毒的EID50。

3.工作毒种血凝抑制(HI)试验：

1)在96孔凝板的12孔中，各加一滴约25μL PBS；

2)用微量稀释棒蘸到待测抗血清或标准血清，依次与孔中的PBS混合稀释。再滴加等量的标准抗原或待测抗原；

3)每孔中加1滴1％的鸡红血球，用微量震荡仪混匀，4℃、60分钟后，观察并判定结果。同时设标准阳性和阴性对照。

4.工作毒种的中和试验：

采用固定血清稀释病毒法，同时设标准阳性和阴性对照。接种鸡胚尿囊腔，每个稀释度0.2ml接种4个鸡胚。孵化72小时后，收获尿囊液，分别测定血凝效价。按照Reed和Muench法计算待测病毒的中和指数。

5.工作毒种的传代限度试验：

用原代地鼠肾细胞对三个型别的流感病毒株主代种子进行连续适应性传代，并同时进行毒种的HA测定、EID₅₀及小白鼠安全试验。其结果见表2，说明流感病毒在原代地鼠肾细胞上连续传递10代内毒力稳定。

(三)实验结果：

1.经血凝效价测定，甲1、甲3和乙型三型地鼠肾细胞已适应的流感病毒工作毒种的血凝效价均在640～1280之间。

2.测定经按照Reed和Muench法计算，甲1、甲3和乙型三个毒株工作毒种的EID₅₀分别为：10^-9.0、10^-9.25和10^-9.25

3.甲1、甲3和乙型三个毒株工作毒种的HI效价均大于640。

4.甲1、甲3和乙型三个毒株工作毒种的中和指数分别为9.0logEID₅₀/0.2ml、9.25logEID₅₀/0.2ml和9.25logEID₅₀/0.2ml。

5.生产毒种毒力、传代限度及稳定性见表2。

表2.毒种毒力、传代限度及稳定性结果

由上表可见，上述三株原代地鼠肾细胞适应的流行性感冒病毒的工作种子，其血凝效价均在640以上，型别及亚型完全正确。其EID50分别为10-9.0/0.2ml、10-9.25/0.2ml和10-9.25/0.2ml，与原始毒种具有相似的免疫原性。试验实施例二：流感病毒原代地鼠肾细胞适应株稳定性试验

(一)实验材料：

病毒种子：实施例二中制备的三个型别的原代地鼠肾细胞适应的流感工作种子。

(二)实验方法：

根据《中华人民共和国药典》2005年版三部附录XF的方法，对以上样品定期进行活性测定。

(三)实验结果：

-70℃条件下保存的冻干种子及液体种子，在不同的保存时间，对其EID₅₀以及HA的稳定性进行检测，结果见表4、表5。

表3.主代种子库

表4.地鼠肾细胞适应的流感病毒株工作种子在-70℃保存不同时间EID50的稳定性结果

表5.地鼠肾细胞适应的流感病毒株工作种子在-70℃保存不同时间HA的稳定性结果

试验实施例三：疫苗免疫原性或效力试验

本试验的目的是观察流行感冒病毒亚单位疫苗免疫小鼠后免疫原性是否良好，产生中和抗体能力如何。为判断疫苗效果提出一个试验依据或参考标准。

(一)试验材料

1.疫苗为实施例三所制备的三批流感疫苗疫苗产品，分别为20050601，20050602和20050603。疫苗的血滴度均为1∶2560。

2.小白鼠：深圳光明卫武制品公司提供。体重18～20克健康小白鼠。

3.病毒株：实施例二所制备的工作种子，每个毒株分别制成含有100～1000个EID₅₀的新鲜病毒液备用。

4.鸡胚为9～11日龄健康鸡胚。

5.1％鸡血球，深圳市孚沃德生物技术有限公司自行配制。

6.稀释疫苗的稀释液为生理盐水或PBS，病毒稀释液为维持液II。

(二)实验方法

将疫苗两倍连续稀释，由1∶40至1∶280各稀释度分别免疫体重18～20克小白鼠12只，腹腔注射每支0.5ml，同时任选12只不予免疫，并与免疫组小白鼠置相同条件下饲养，作为对照。

免疫14天后，每个稀释度及对照各取10只小鼠，分别采血，同一稀释度者混于一个试管中，分离血清后，立即置56℃水浴中灭活30分钟，然后与疫苗毒种100～1000EID₅₀病毒量相混合，置37℃水浴中和30分钟。

中和后立即接种9-11日龄鸡胚，每个稀释度及对照至少接种四个鸡胚，每胚尿囊腔0.1ml。置35℃培育，48-72小时后冷胚，收获尿囊液每胚0.25ml，加入1％鸡血球0.25ml，做直接血凝。对照组血清中和结果均为HA阳性，免疫组按Reed和Muench氏法计算50％中和效价。

(三)试验结果

三批价流行性感冒病毒疫苗免疫小白鼠，其血清对甲1(IVR-116)，甲3(NYMC X-15F)，乙型(B/Jiangsu/10/2003)地鼠肾适应毒株由原代地鼠肾细胞生产的疫苗中和试验结果见表6。

表6.流行性感冒病毒疫苗效力试验结果

注：分子为中和试验鸡胚尿囊液直接血凝阳性数。

从上表的结果可以看出，三批疫苗的50％保护稀释度在1∶320～1∶640之间。使用该工艺生产的流感灭活疫苗的50％中和效价均在1∶640以上，与进口样品效果相当。

试验实施例四：疫苗抗原性试验

(一)试验材料

抗原：疫苗批号为20050601，20050602和20050603，深圳市孚沃德生物技术有限公司生产。

动物：小白鼠，体重16～18克。深圳光明卫武制品公司提供。

(二)实验方法

将三批疫苗分别免疫小白鼠各10只，每只小鼠皮下接种0.2ml，另取10只小白鼠皮下接种生理盐水，置相同条件下饲养。免疫后21天，分别采血分离血清，用血凝及血凝抑制试验方法测定抗体效价。

(三)试验结果

抗原性试验结果见表7。

表7.抗原性试验结果

从上表可以看到，使用本工艺制备的裂解型流感灭活疫苗接种小鼠后，针对各亚型抗原产生的抗体水平均在1∶480以上，可以认为我们的疫苗接种是有效的。

试验实施例五：疫苗的过敏性试验

(一)试验材料

(1)疫苗：实施例三制备的流感疫苗。

(2)豚鼠：体重300～400克。

(3)标准过敏原(阳性对照)：牛血清白蛋白，分析纯。

(4)阴性对照：无菌的生理盐水。

(二)实验方法

按照现行的中华人民共和国药典要求的方法进行。取流感疫苗各6ml，皮下接种3只豚鼠，每只接种1ml，间隔一周，进行第二次注射，每只皮下1ml，使豚鼠致敏。第二次注射后三周，再以相同样品静脉注射，每只0.5ml。观察豚鼠有无过敏性反应出现。同时设阴性和阳性对照。

(三)试验结果

第三次注射后当天及三天内观察结果：9只豚鼠未见鼻痒、喷嚏、烦躁不安或呼吸困难或休克、痉挛等过敏反应症状，全部试验动物健康存活。而阳性对照均有不同程度的过敏反应症状：喷嚏、烦躁不安、呼吸困难或休克、痉挛等。见下表。

表8.疫苗过敏原性试验结果

可见，本疫苗样品接种豚鼠进行过敏原性试验，最后一次注射后连续观察三天，全部豚鼠均一切正常。说明本疫苗对豚鼠过敏原性试验为阴性。

试验实施例六：异常毒性试验

(一)试验材料

(1)疫苗：实施例三制备的流感疫苗。

(2)试验动物：小白鼠：18～20克。共10只。豚鼠：300g左右，10只。

(二)实验方法

腹腔注射法。小白鼠，2ml/只；豚鼠，5ml/只。将小白鼠和豚鼠分别随机均分为两组：一组为实验组，另一组为对照。小白鼠为皮下接种，接种剂量0.5ml/只；豚鼠为腹腔接种，接种剂量5ml/只。注射前称量体重，注射后逐日观察精神状态、食欲和体温等变化，并于结束前再称体重。以精神状态、食欲和体温等正常，结束前体重由所增加为无异常毒性试验，即为合格。

(三)试验结果

表9.疫苗异常毒性试验结果

14日后，各实验组受试动物均存活，同时体重均有不同程度的增加，可见疫苗没有异常毒性反应，疫苗是安全的。

试验实施例七：过敏原性试验

(一)试验材料

(1)疫苗：实施例三制备的流感疫苗。

(2)对照：阳性对照为小牛血清；阴性对照为生理盐水。

(3)试验动物：健康豚鼠，体重为300～400克，9只。

(二)实验方法

取疫苗10ml，同时以小牛血清作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照。皮下接种三只豚鼠，每只接种1ml，间隔一周后进行第二次注射，每只皮下1ml，使豚鼠致敏，致敏三周后再以相同样品静脉注射每只0.5ml，观察豚鼠有无过敏性反应出现。

(三)试验结果

表10.观察的结果记录

备注：疫苗组1、2、3，阴性对照组4、5、6，阳性对照组7、8、9。

静脉注射后当天及三天内观察可见：接种疫苗组三只豚鼠未出现鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏反应症状，全部实验动物健康存活；阳性对照组的三只实验动物中有三只出现呼吸困难、轻度休克。试验说明，此工艺制备的流感疫苗动物不会发生过敏反应。

Claims (1)

1.一种流行性感冒疫苗，其特征在于，所述疫苗由如下方法制备，包括以下步骤：

(a)将流行性感冒病毒原始毒种在无特定病原鸡胚进行1～3次适应性传代，病毒血凝效价达到1∶320以上的鸡胚尿囊液，作为主代种子；所述流行性感冒病毒原始毒种为甲₁(H₁N₁)型IVR-116、甲₃(H₃N₂)型NYMC X-15F或乙型B/Jiangsu/10/2003；

(b)取10～14日龄的地鼠的原代肾细胞，利用培养瓶或细胞生物反应器进行培养；

(c)用主代种子感染原代地鼠肾细胞，并进行适应性传代3～6代，直至得到病毒血凝效价不低于1∶640的毒种作为疫苗的工作种子；

(d)用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增，直至病毒血凝效价不低于1∶320为疫苗单价原液；

(e)疫苗单价原液经浓缩、灭活、纯化后，将不同型别的单价病毒液进行混合，分装成成品。